Summary
Vi viser her, hvordan en nærhed ligatur Assay (PLA) til at visualisere MST1/MST2 heterodimerization i faste celler med høj følsomhed.
Abstract
Reguleret protein-protein interaktioner er et ledende princip for mange signalering begivenheder, og påvisning af sådanne begivenheder er et vigtigt element i forståelsen af hvordan sådanne veje er organiseret og hvordan de fungerer. Der er mange metoder til at opdage protein-protein interaktioner i celler, men relativt få kan bruges til at registrere interaktioner mellem endogene proteiner. En sådan metode, nærhed ligatur assay (PLA), har flere fordele ved at anbefale dets anvendelse. Sammenlignet med andre almindelige metoder til analyse af protein-protein interaktion, PLA har relativt høj følsomhed og specificitet, kan udføres med minimal celle manipulation, og i den protokol, der er beskrevet heri, kræver kun to mål-specifikke antistoffer fremstillet af forskellige arter (fx., fra mus og kanin) og én specialiseret reagens: et sæt af sekundære antistoffer, der er kovalent knyttet til specifikke oligonukleotider, når bragt i umiddelbar nærhed af hinanden, skabe en amplifiable platform for i situ PCR eller rullende cirkel forstærkning. I denne præsentation viser vi hvordan du anvender PLA teknik til at visualisere ændringer i MST1 og MST2 nærhed i faste celler. Den teknik beskrevet i dette håndskrift er især relevante for analysen af celle signalering undersøgelser.
Introduction
Afbrydelse af MST1/Hippo signalering har været tilsluttet udviklingsforstyrrelser og carcinogenese1. I pattedyr, aktivere kinaser MST1 og MST2 (phosphorylate) MOB1 og LATS1/2, hvor sidstnævnte derefter phosphorylates og inaktiverer transcriptional Co aktivator ja-forbundet protein (YAP)2. I sin aktive (unphosphorylated) form har YAP mutationer aktivitet, forbedre transskription af celle spredning gener; omvendt, når YAP er inaktiveret ved Hippo pathway, celledelingen er undertrykt og apoptose forfremmet3. I væv, MST1 og MST2 findes hovedsageligt som aktiv homodimers, men muterede stimuli kan øge niveauet af MST1/MST2 heterodimers og sådanne heterodimers er inaktive4. Men hvordan MST1/MST2 heterodimerization er reguleret forbliver dårligt forstået. Både homo- og heterodimers er medieret via interaktioner mellem C-terminale rullet coil regioner af MST1 og MST2 kendt som SARAH domæner5. Ved hjælp af en i situ demonstreret PLA i denne artikel vil vi vise tilstedeværelsen af MST1/MST2 heterodimers i menneskelige Schwann celler (HSC) og menneskelige embryonale nyre celler (HEK-293). PLA har en fordel frem for andre protein/protein interaktion påvisningsmetoder, fordi det giver mulighed for påvisning af endogene protein-protein interaktioner, som kan identificeres og kvantificeres uden brug af transgenet udtryk eller brug af epitop tags 6.
Signaling transduktion veje er i vid udstrækning kontrolleret af sammenslutningen betinget af komponent proteiner. For eksempel, fører stimulering af de fleste receptor tyrosin kinaser til deres homo - eller hetero-dimerization og efterfølgende association med yderligere intracellulær signalering proteiner, der selv form yderligere komplekser. Formålet med metoden PLA er at visualisere nærhed mellem proteiner i cellerne, forudsat at proteinerne er mindre end 30-40 nm fra hinanden. Protein nærhed er normalt påvises ved første inkubere cellerne med passende primære antistoffer rejst i forskellige arter (fx., kanin og mus) mod hver interagerende protein, derefter tilføje artsspecifikke sekundære antistoffer, pre koblet til korte DNA sonder. Hvis DNA-sonder er tæt på, kan en specifik forbinder DNA oligonukleotid samtidigt binde begge disse sonder, danner en platform for forstærkning af i situ PCR eller rullende cirkel mekanisme. Fluorescerende tags tilføjet til forstærkning reaktion tillade visualisering af de interagerende proteiner, som vises som fluorescerende prikker, der let kan kvantificeres og lokaliseret til bestemte regioner i celle7,8, 9 , 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af løsninger
- Forberede Fikseringsvæske løsning: 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 1 x PBS. Til 10 mL, tage 2,5 mL af 16% PFA og tilsættes 7,5 mL af 1 x PBS.
Farer: PFA er kræftfremkaldende ved lave doser. Dampe og hudkontakt er farlige. Opbevares ved-20 ° C. - Forberede permeabilization opløsning: 0,1% Triton X-100 i 1 x PBS. 100 mL af opløsningen, tilføje 100 µL af Triton X-100 i 100 mL 1 x PBS. Opbevares ved stuetemperatur (RT).
- Forberede Wash Buffer: 1 x TBST. For 1 L, tage 100 mL af 10 x TBS, 890 mL dH2O og 10 mL af Tween 20 (10%).
- Forberede blokerende løsning, som leveres af kit. Alternativt kan du bruge 1 x PBS løsning indeholdende 2% BSA.
- Forberede antistof fortyndingsmiddel, som leveres af kit. Alternativt kan du bruge 1 x PBS løsning indeholdende 1% BSA.
2. plating af celler
Bemærk: I denne undersøgelse brugte vi udødeliggjort menneskelige Schwann celler (iHSC) og menneskelige embryonale nyre 293 celler (HEK 293); men denne metode kan bruges til mange former for vedhængende celler.
- Kultur HEK 293 i DMEM suppleret med 10% FBS, 0,2% glukose, 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penicillin G og 100 µg/mL streptomycin på vævskultur-behandlede plader ved 37 ° C i 5% CO2. Opretholde iHSC i 10% FBS/DMEM suppleret med Pen/Strep og 2 µM forskolin. Rutinemæssigt teste celler for mycoplasma. Ingen celle linje godkendelse blev udført.
- Coat et 16-godt kammer dias med 50 µL af 10 µg/mL naturlige mus laminin eller 0,01% poly-L-lysin løsning og Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C i 5% CO2. Opdel celler ved hjælp af 0,04% trypsin-EDTA.
- Plade iHSC og HEK-293 i 100 µL af medium på 80% confluence (15.000-25.000 celler/brønd).
- Inkuber celler til 12-24 timer ved 37 ° C i en fugtig, 5% CO2 inkubator.
3. fiksering og Permeabilization
- Fjern mediet fra brøndene og vaskes med 100 µL 1 x PBS. Opsug med en mikropipette til at minimere risikoen for at fjerne prøven.
- Fix celler ved at tilføje 50 µL af 4% PFA pr. godt og inkuberes i 10 min. ved RT, uden agitation. Celler er følsomme over for udstationering, så undgå pipettering løsninger direkte på cellerne.
- Cellerne vaskes med 0,05% TBST tre gange i 5 min. Opsug med en mikropipette til at minimere risikoen for at fjerne prøven.
- Behandling af celler med permeabilization løsning (0,1% Triton x-100 i 1 x PBS) i 10 min uden agitation på RT.
- Vaske cellerne med TBST tre gange for 5 min med agitation.
4. blokering
- Tryk på off TBST (meget forsigtigt med en mikropipette). Visualisere dias i et mikroskop for at se, hvis celler forbliver knyttet.
- Tilføje en dråbe (50-60 µL) 1 x blokering løsning til hver prøve.
- Præ-varme et fugtigt kammer (Tom tip box med vand) ved 37 ° C og glassene inkuberes i det i 1 timer ved 37 ° C.
5. primære antistoffer
- Fortynd de primære antistoffer (1: 100) i antistof fortyndingsmiddel (Se Tabel af materialer). Forberede 40 µL antistof løsning pr. brønd.
- Fjern blokering løsning fra dias ved at trykke ned af væsken. Tillad ikke celler til tørre.
- Vortex og tilføje 40 µL antistof løsninger til hver brønd.
- Inkubér 1 h ved 37 ° C i en forvarmet fugtigt kammer.
6. nærhed ligatur Assay sonder
Bemærk: PLA sonder leveres som en del af et kit (Se Tabel af materialer). Valget af sonder vil afhænge af arterne af primære antistoffer bruges til at registrere proteiner af interesse.
- Fortyndes de to PLA sonder (anti-mus MINUS og anti-kanin PLUS) 1:5 i antistof fortyndingsmiddel. For hver prøve, forberede 40 µL af PLA sonde. Inkuber blanding i 20 min. på RT.
- Tryk på fra den primære antistof løsning fra dias. Vaske dias to gange for 5 min med vaske Buffer på RT.
- Forsigtigt tryk af vaskebuffer fra dias og tilføje den fortyndende PLA sonde løsning til brønde (40 µL/brønd).
- Glassene inkuberes i en forvarmet fugtigt kammer i 1 timer ved 37 ° C.
7. ligatur
Bemærk: Den i situ påvisning reagenser rød, Ligase og ligatur løsning leveres som en del af et kit (Se Tabel af materialer).
- Brug i situ påvisning reagenser rød.
- Umiddelbart før brug, vortex og fortyndes de nødvendige mængder af 5 x ligatur stock 1:5 in høj renhed vand.
Bemærk: Opbevar ikke fortyndede reagenser. - Tryk på off PLA sonde løsning fra dias. Vask dias i 1 x vaskebuffer to gange for 5 min på RT.
- Umiddelbart før tilføjelse til prøver, vortex og tilføje Ligase ligatur løsning på 1:40 fortynding og vortex igen.
- Tryk på off vaskebuffer fra dias og tilføje ligatur/Ligase løsning til hver brønd (40 µL/brønd).
- Glassene inkuberes i en forvarmet fugtigt kammer i 30 minutter ved 37 ° C.
8. forstærkning
Bemærk: Forstærkning bestanden er fastsat som en del af et kit (Se Tabel af materialer). Reagenser er lysfølsomt; dermed undgå at udsætte dias til lys.
- Vortex og fortyndes de nødvendige mængder af 5 x forstærkning stock 1:5 i høj renhed vand og blandes.
- Tryk på off ligatur/Ligase løsning fra dias. Vask dias i 1 x vaskebuffer to gange i 2 min på RT.
- Vortex og tilføje polymerasen til forstærkning løsning på 1:80 fortynding og vortex igen.
- Tryk på off vaskebuffer fra dias og tilføje forstærkning-Polymerase løsning til hver brønd (40 µL/brønd). Glassene inkuberes i en forvarmet fugtigt kammer i 100 minutter ved 37 ° C.
9. forberedelse til billedbehandling
Bemærk: Disse er let følsomme reagenser. Holde de dias, beskyttet mod lys.
- Tryk på off forstærkning-Polymerase løsning fra dias og vaskes to gange i 10 min hver i 1 x vaskebuffer på RT.
- Fjerne kamre og silikone omkring brøndene fra diaset helt. Skrabe ned de resterende bit i silikone med en barberkniv. Tegne et gitter på diasset adskillelse hver godt.
- Tilføje ~ 40 µL af montering medium med DAPI. Vær omhyggelig med at undgå luftbobler under cover slip diffusering i RIP. Kanterne af dækslet slip kan forseglet med neglelak.
- Vent i mindst 20 min. før du udfører billedanalyse ved hjælp af en Konfokal mikroskop.
Bemærk: Protokollen kan være midlertidigt her. - Efter imaging, skal du gemme dias ved-20 ° C i mørke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi brugte PLA analysen for at teste samspillet mellem MST1 og MST2 i HEK-293 og iHSC. Cellerne var fast, permeabilized og farves med forskellige antistoffer, efterfulgt af i situ forstærkning efter PLA protokol (figur 1). For at dokumentere niveau af MST1/MST2 heterodimerization, blev celler plettet af MST1 og MST2 antistoffer (figur 1A, 1 C og 1 G). Som positiv kontrol, vi brugte også ERK og kvikke antistoffer, der forventes at være tæt på i celler med aktiveret ERK (figur 1B og 1F). Celler mangler MST1 og MST2 vise ikke PLA signal (figur 1 c). Celler farves med kun én af de to antistoffer viser heller ingen PLA signal (figur 1 g). Disse resultater tyder på, at HEK-293 celler og iHSC celler indeholder MST1/MST2 heterodimers, i overensstemmelse med tidligere fund fra vores laboratorium4. Som en yderligere negativ kontrol rugede vi celler med ERK og MST2 primære antistoffer til at vise specificiteten af signaler (fig. 1 d og 1 H).
For at bekræfte niveauer af MST1 og MST2 udtryk, ekstrakter fra WT og MST1/MST2 knockout HEK-293 celler, henholdsvis blev analyseret af immunblot med de angivne antistoffer (figur 1I).
Figur 1 : Repræsentant PLA data. (A-H) Celler var fast og farves med de angivne antistoffer efterfulgt af PLA procedure. Blå: DAPI, rød: PLA signal. Mikrofotografier blev fremstillet med en Leica SP5 Konfokal mikroskop. (I) immunblot MST1 og MST2. Skalalinjen er 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har fundet det nyttigt at bruge glas kammer dias til dette eksperiment, da det er meget praktisk at udføre eksperimentet med flere (14-16) cellelinjer og der er ingen grund til at ændre prøven hver gang under mikroskopi analyse. Et par komplikationer kan opstå, såsom en øget risiko for krydskontaminering med antistoffer. Vi foreslår derfor, vask hver brønd individuelt i stedet for at bruge en Coplin krukke, trods øget varigheden af forsøget. Hertil kommer, fjernelse af silikone Indsæt er et delikat anliggende og skal gøres med omhu og tålmodighed. Selv med omhyggelig teknik er det nogle gange muligt at se små mængder silicone snavs efter fjernelse skæret. Af denne grund, skal man fjerne silikone indsætte samvittighedsfuldt, ved hjælp af en razorblade hvis det er nødvendigt, da for meget unremoved silikone kan ændre Konfokal afstanden under mikroskopi. Det kan også være nyttigt til at tegne linjer som grænser af brønde efter fjernelse af silicium Indsæt for at hjælpe med at finde celler under mikroskop.
Det er bydende nødvendigt at bruge ikke-cross reaktive primære antistoffer at hver genkender kun ét medlem af heterodimer (f.eks. MST1 antistoffer bør ikke også genkende MST2 og vice-versa). Det er også vigtigt at huske at bruge forskellige tips til at undgå krydskontaminering af primære antistoffer og PLA sonder, at undgå at røre bunden af brønden og undgå pipettering direkte over prøver. Vi fandt, at for iHSC, det er bedre at pelsen kammer dias med 0,01% poly-L-lysin løsning, og for HEK-293 er det bedre at frakke med musen 10 µg/mL laminin.
Som med enhver procedure, er der visse begrænsninger ved denne metode. PLA assay, er mens en kraftfuld metode af alle grundene, der er anført ovenfor, begrænset af specificiteten og følsomheden af antistofferne. Derudover bør antistof koncentrationer og celle kultur betingelser være fintunet før laboratorieforsøg er indstillet til at reducere omkostningerne ved assays. I henseende er et alternativ til at reducere omkostningerne ved assays bruge ubestrøget 35-mm glas-bund fad i stedet for chamber dias.
En fordel af analysen er at intensiteten og antallet af fluorescerende prikker kan kvantificeres ved hjælp af forskellige computer softwareprogrammer som Blob-finder software, Duolink billed værktøj og th Olink Bioscience.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker hele Chernoff laboratoriet for at bidrage til optimering og validering af denne protokol, navnlig Maria Radu og Galina Semenova. Vi takker også Andrey Efimov af celle Imaging facilitet på Fox Chase Cancer Center. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra NIH (R01 CA148805) at JC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
References
- Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
- Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation. Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
- Rawat, S. J., et al. H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization. Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).
- Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain. Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).
- Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome. Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).
- Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
- Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
