Summary
Hier, laten we zien hoe een nabijheid afbinding Assay (PLA) gebruiken om te visualiseren van MST1/MST2 heterodimerization in vaste cellen met hoge gevoeligheid.
Abstract
Gereglementeerde eiwit-eiwitinteractie zijn een leidend beginsel voor veel signalering gebeurtenissen, en de opsporing van dergelijke evenementen is een belangrijk element in het begrip van hoe dergelijke trajecten zijn georganiseerd en hoe zij functioneren. Er zijn vele methoden voor de opsporing van eiwit-eiwitinteractie in cellen, maar relatief weinig kunnen worden gebruikt voor het detecteren van interactie tussen endogene eiwitten. Een dergelijke methode, de nabijheid van afbinding assay (PLA), heeft verschillende voordelen aan het gebruik ervan. Vergeleken met andere gemeenschappelijke analysemethoden eiwit-eiwit interactie, PLA heeft relatief hoge gevoeligheid en specificiteit, met minimale cel manipulatie, en, in het protocol hierin beschreven kan worden uitgevoerd, slechts twee doelgroepen gerichte requires antistoffen afkomstig van verschillende soorten (bv., van muis en konijn) en één gespecialiseerde reagens: een aantal secundaire antilichamen die covalent gekoppeld aan specifieke oligonucleotides dat toen bracht in de nabijheid van elkaar, maken een amplifiable platform voor in situ PCR of rollende cirkel versterking. In deze presentatie tonen we hoe toe te passen op de PLA-techniek om wijzigingen in de nabijheid van de MST1 en MST2 in vaste cellen zichtbaar maken. De techniek wordt beschreven in dit manuscript is met name van toepassing voor de analyse van cel signalering van studies.
Introduction
Verstoring van het MST1/Hippo signalering is verbonden met ontwikkelingsstoornissen en carcinogenese1. Bij zoogdieren, activeren de kinases MST1 en MST2 (phosphorylate) MOB1 en LATS1/2, de laatste kinaseenzym en inactiveert de transcriptionele co activator ja-geassocieerde proteïne (YAP)2. In zijn actieve vorm (unphosphorylated) heeft YAP oncogene activiteit, verbetering van de transcriptie van cel proliferatie genen; omgekeerd, wanneer YAP wordt geïnactiveerd door het traject van Hippo, celproliferatie wordt onderdrukt en apoptosis bevorderd3. In de weefsels, MST1 en MST2 bestaan voornamelijk als actieve homodimers, maar oncogene prikkels kunnen verhogen van MST1/MST2 heterodimers, en dergelijke heterodimers zijn inactief4. Het blijft echter slecht begrepen hoe MST1/MST2 heterodimerization wordt geregeld. Zowel homo- als heterodimers zijn gemedieerde via interacties tussen C-terminal spiraalsnoer-spoel regio's MST1 en MST2, bekend als SARAH domeinen5. Met behulp van een in situ PLA aangetoond in dit artikel tonen we de aanwezigheid van MST1/MST2 heterodimers in menselijke Schwann cellen (HSC) en menselijke embryonale nier cellen (HEK-293). PLA heeft een voordeel ten opzichte van andere proteïne/eiwit interactie detectiemethoden, omdat het mogelijk maakt het opsporen van endogene eiwit-eiwitinteractie, die kunnen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd zonder de noodzaak van transgenic meningsuiting of het gebruik van epitoop tags 6.
Transductie signaalroutes worden grotendeels bepaald door de voorwaardelijke associatie van component eiwitten. Bijvoorbeeld, leidt stimulatie van de meeste receptor tyrosine kinases tot hun homo - of hetero-dimerisatie en latere vereniging met extra intracellulaire signalering eiwitten, die zelf vorm verder complexen. Het doel van de PLA-methode is om te visualiseren van de afstand tussen de eiwitten in cellen, mits de eiwitten minder dan 30-40 nm uit elkaar zijn. De nabijheid van het eiwit is meestal gedetecteerd door eerste het broeden van de cellen met passende primaire antilichamen groeide op in verschillende soorten (bv., konijn en muis) tegen elke interactie eiwit, vervolgens toe te voegen soortspecifieke secundaire antilichamen, vooraf gekoppelde naar kort DNA-sondes. Als de DNA-sondes in de nabijheid zijn, kunt gelijktijdig een specifieke oligonucleotide voor koppelen DNA binden, zowel van deze sondes, vorming van een platform voor amplificatie door in situ PCR of door het walsen van cirkel mechanisme. Fluorescerende tags toegevoegd aan de amplificatie reactie kun visualisatie van de interacterende eiwitten, die als tl stippen die gemakkelijk kunnen worden gekwantificeerd en gelokaliseerd op bepaalde regio's in de cel7,8 verschijnen,, 9 , 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van de oplossingen
- Bereid kleefpoeders oplossing: 4% paraformaldehyde (PFA) in 1 x PBS. Neem voor 10 mL, 2,5 mL van 16% PFA en voeg 7,5 mL 1 x PBS.
Risico's: PFA is kankerverwekkend zijn bij lage doseringen. Rook en contact met de huid zijn gevaarlijk. Winkel bij-20 ° C. - Bereid permeabilization oplossing: 0,1% Triton X-100 in 1 x PBS. Voeg 100 µL van Triton X-100 in 100 mL 1 x PBS voor 100 mL van de oplossing. Bewaren bij kamertemperatuur (RT).
- Bereiden was Buffer: 1 x TBST. Voor 1 liter, neem 100 mL 10 x TBS, 890 dH2O mL en 10 mL van tween-20 (10%).
- Bereid blokkerende oplossing zoals geleverd door kit. U kunt ook gebruik 1 x PBS oplossing met 2% BSA.
- De antilichaam-verdunningsmiddel bereiden zoals geleverd door kit. U kunt ook gebruik 1 x PBS oplossing met 1% BSA.
2. de beplating van cellen
Opmerking: In deze studie gebruikten we vereeuwigd menselijke Schwann cellen (iHSC) en menselijke embryonale 293 van de nier cellen (HEK 293); Deze methode kan echter worden gebruikt voor vele soorten Adherente cellen.
- Cultuur HEK 293 in DMEM aangevuld met 10% FBS, 0.2% Glucose, 2 mM L-Glutamine, 100 U/mL penicilline G en 100 µg/mL streptomycine op Weefselkweek behandeld platen bij 37 ° C in 5% CO,2. IHSC in 10% FBS/DMEM aangevuld met Pen/Strep en 2 µM forskolin handhaven. Routinematig testen cellen voor mycoplasma. Geen cel lijn verificatie werd uitgevoerd.
- Jas van een dia 16-well kamer met 50 µL van 10 µg/mL natuurlijke muis laminin of 0,01% poly-L-lysine oplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C in 5% CO2. Hiermee splitst u cellen met behulp van 0,04% trypsine-EDTA.
- Plaat iHSC en HEK-293 in 100 µL van medium aan 80% samenvloeiing (15.000-25.000 cellen per putje).
- Incubeer de cellen voor 12-24 uur bij 37 ° C in een bevochtigde, 5% CO2 incubator.
3. fixatie en Permeabilization
- Verwijder het medium van de putten en wassen met 100 µL van 1 x PBS. Gecombineerd met een micropipet tot een minimum beperken van het risico van het verwijderen van het monster.
- Fix cellen door 50 µL van 4% PFA per goed en incubeer gedurende 10 min op RT, zonder agitatie toe te voegen. Cellen zijn gevoelig voor detachement, dus vermijd pipetteren de oplossingen direct op de cellen.
- Wassen van de cellen met 0,05% TBST drie keer voor elke 5 min. Gecombineerd met een micropipet tot een minimum beperken van het risico van het verwijderen van het monster.
- De cellen met permeabilization oplossing (0,1% Triton x-100 in 1 x PBS) behandelen gedurende 10 minuten zonder agitatie op RT.
- Wassen van cellen met TBST driemaal voor 5 min met agitatie.
4. blokkeren
- Tik op uit de TBST (heel voorzichtig met een micropipet). Visualiseren van de dia in een microscoop te zien als cellen aangesloten blijven.
- Voeg één druppel (50-60 µL) 1 x blokkeren oplossing aan elk monster.
- Verwarm op een kamer (lege tip doos met water) van de vochtigheid bij 37 ° C en Incubeer de dia's in het gedurende 1 uur bij 37 ° C.
5. primaire antilichamen
- Verdun de primaire antilichamen (1:100) in het antilichaam verdunningsmiddel (Zie Tabel van materialen). Bereid 40 antilichaam-oplossing van µL per putje.
- Blokkerende oplossing uit dia's verwijderen door te onttrekken uit de vloeistof. Niet toestaan cellen te drogen.
- Vortex en 40 µL van de antilichaam-oplossingen toe te voegen aan elk putje.
- Incubeer 1 uur bij 37 ° C in een voorverwarmde vochtigheid kamer.
6. nabijheid afbinding Assay sondes
Opmerking: PLA sondes worden geleverd als onderdeel van een kit (Zie Tabel van materialen). De keus aan sondes zal afhangen van de soorten primaire antilichamen gebruikt om te ontdekken de proteïnen van belang.
- De twee PLA sondes (anti-muis MINUS en anti-konijn PLUS) verdunnen 1:5 in het antilichaam verdunningsmiddel. Voor elk monster, 40 µL van PLA sonde te bereiden. Incubeer het mengsel gedurende 20 minuten op RT.
- Tik op uit de primair antilichaam-oplossing van de dia's. Wassen van de dia's tweemaal voor elke 5 min met wassen Buffer op RT.
- Zachtjes Tik op van de Buffer van de was uit de dia's en breng de verdunningsmiddel PLA sonde oplossing in putjes (40 µL per putje).
- Incubeer de dia's in een voorverwarmde vochtigheid kamer voor 1 uur bij 37 ° C.
7. afbinding
Opmerking: De in situ Detection reagentia Red, Ligase en Afbinding oplossing worden geleverd als onderdeel van een kit (Zie Tabel van materialen).
- Gebruik de in situ Detection reagentia Red.
- Onmiddellijk vóór gebruik, vortex en de vereiste omvang van de 5 x afbinding voorraad 1:5 in zuiver water verdunnen.
Opmerking: Bewaar niet verdunde reagentia. - Tik op uit de PLA sonde oplossing van de dia's. Wassen van de dia's in 1 x wassen Buffer tweemaal voor elke 5 min op RT.
- Onmiddellijk vóór toevoeging aan de monsters, vortex en Ligase toe te voegen aan de afbinding oplossing om 1:40 verdunning en vortex opnieuw.
- Tik op uit de Buffer van de was uit de dia's en de afbinding/Ligase-oplossing toevoegen aan elk putje (40 µL per putje).
- Incubeer de dia's in een voorverwarmde vochtigheid kamer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
8. de versterking
Opmerking: De versterking voorraad worden verstrekt als onderdeel van een kit (Zie Tabel van materialen). Reagentia zijn licht gevoelig; dus Vermijd blootstelling van de dia's aan het licht.
- Vortex en Verdun de vereiste hoeveelheden de 5 x amplificatie voorraad 1:5 in zuiver water en meng.
- Tik op uit de afbinding/Ligase oplossing van de dia's. Wassen van de dia's in 1 x wassen Buffer tweemaal voor elke 2 min op RT.
- Vortex en de polymerase opnieuw toevoegen aan de oplossing van de versterking op 1:80 verdunning en vortex.
- Tik op uit was Buffer van de dia's en de versterking/Polymerase-oplossing toevoegen aan elk putje (40 µL per putje). Incubeer de dia's in een voorverwarmde vochtigheid kamer voor 100 min bij 37 ° C.
9. voorbereiding voor Imaging
Opmerking: Dit zijn lichte gevoelige reagentia. Houd de dia's beschermd tegen licht.
- Tik op uit de versterking-Polymerase-oplossing van de dia's en wassen tweemaal voor 10 min elke in 1 x wassen Buffer op RT.
- De kamers en de siliconen rond de putten van de dia volledig verwijderen. Schraap de resterende bits van siliconen met een scheermes. Tekent een raster op de dia scheiden van elk goed.
- Voeg ~ 40 µL van het medium van de montage met DAPI. Wees voorzichtig om te voorkomen dat overvullen luchtbellen onder de slip van de cover. De randen van de cover slip kunnen worden verzegeld met nagellak.
- Wacht minstens 20 min voordat het uitvoeren van de analyse van de afbeelding met behulp van een confocal microscoop.
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. - Na imaging, opslaan van de dia's op-20 ° C in het donker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We gebruikten de PLA-assay voor het testen van de interactie tussen MST1 en MST2 in HEK-293 en iHSC. De cellen waren vaste permeabel en gekleurd met verschillende antilichamen, gevolgd door in situ versterking volgens het PLA-protocol (Figuur 1). Om het document op het niveau van de MST1/MST2 heterodimerization, werden cellen gekleurd met MST1 en MST2 antilichamen (figuur 1Aen 1 C, 1 G). Als positieve controle, we gebruikten ook ERK en pERK antilichamen die worden verwacht in de nabijheid in cellen met ERK (figuur 1B en 1F) geactiveerd. Cellen ontbreken MST1 en MST2 tonen geen signaal PLA (Figuur 1 c). Cellen gekleurd met slechts één van de twee antilichamen Toon ook geen signaal PLA (figuur 1G). Deze resultaten suggereren dat HEK-293 cellen en iHSC cellen MST1/MST2 heterodimers, consistent met de eerdere bevindingen van onze laboratorium-4 bevatten. Als een extra negatieve controle geïncubeerd we cellen met ERK en MST2 primaire antilichamen te tonen van de specificiteit van signalen (Figuur 1 d en 1 H).
Controleer de niveaus van MST1 en MST2 meningsuiting, haalt uit WT en MST1/MST2 knock-out HEK-293 cellen, respectievelijk werden geanalyseerd door immunoblot met de aangegeven antilichamen (figuur 1I).
Figuur 1 : Vertegenwoordiger PLA gegevens. (A-H) Cellen werden vastgesteld en bevlekt met de aangegeven antilichamen, gevolgd door de PLA-procedure. Blauw: DAPI, rood: PLA signaal. Photomicrographs werden verkregen met een Leica SP5 confocal microscoop. (I) Immunoblot voor MST1 en MST2. De bar van de schaal is 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We vonden het nuttig te gebruiken glas kamer dia's voor dit experiment, zoals het is erg handig voor het uitvoeren van experiment met verschillende cellijnen van (14-16) en er is geen behoefte om te veranderen van de steekproef telkens tijdens de microscopie analyse. Een paar complicaties voordoen, zoals een verhoogd risico op kruisbesmetting met antilichamen. Wij stellen daarom voor elke goed wassen individueel in plaats van met behulp van een Coplin pot, ondanks de toegenomen duur van het experiment. Daarnaast zijn de verwijdering van siliconen invoegen is een delicate aangelegenheid en moet gebeuren met zorg en geduld. Zelfs met nauwgezette techniek is het soms mogelijk om te zien van kleine hoeveelheden van siliconen puin na verwijdering het invoegen. Om deze reden moet een verwijderen het siliconen inzetstuk nauwgezet, met behulp van een razorblade indien nodig, zoals teveel unremoved silicone kan het veranderen van de confocal afstand tijdens microscopie. Het kan ook zinvol zijn om lijnen te tekenen als grenzen van putten na het verwijderen van de silicon invoegen om te helpen bij het vinden van cellen onder de Microscoop.
Het is noodzakelijk om het gebruik van niet-cross reactieve primaire antilichamen dat elk slechts één lid van de heterodimer herkennen (bijvoorbeeld de MST1 antilichamen moeten niet ook herkend MST2 en vice versa). Ook is het belangrijk om te onthouden om gebruik verschillende tips voor het voorkomen van kruisbesmetting van primaire antilichamen en PLA sondes, om te voorkomen dat de bodem van de put aan te raken en om te voorkomen dat pipetteren direct boven monsters. We vonden dat voor iHSC, is het beter om de vacht kamer dia's met 0,01% poly-L-lysine oplossing, en voor HEK-293 het beter om de vacht met de muis 10 µg/mL laminin is.
Zoals bij elke procedure, zijn er enkele beperkingen van deze methode. De assay van PLA, wordt terwijl een krachtige methode om alle redenen die hierboven wordt genoemd, beperkt door de specificiteit en de gevoeligheid van de antistoffen. Bovendien moeten antilichaam concentraties en cel kweekomstandigheden fijn afgestemd voordat laboratoriumexperimenten zijn ingesteld om de kosten van de tests. In dat opzicht is een alternatief om de kosten van de tests het gebruik van ongecoat 35-mm glazen-bodem schotel in plaats van kamer dia's.
Een voordeel van de bepaling is die intensiteit en aantal fluorescerende dots kan worden gekwantificeerd aan de hand van verschillende computer software programma's zoals de Blob-finder software Duolink Image Tool en th Olink Bioscience.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Wij danken het hele Chernoff laboratorium voor het bijdragen tot de optimalisatie en validatie van dit protocol, met name Maria Radu en Galina Semenova. Wij danken ook Andrey Efimov van de cel Imaging faciliteit op Fox Chase Cancer Center. Dit werk werd gesteund door een subsidie van de NIH (R01 CA148805) naar JC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
References
- Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
- Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation. Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
- Rawat, S. J., et al. H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization. Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).
- Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain. Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).
- Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome. Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).
- Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
- Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
