Summary
כאן, אנו מראים כיצד להשתמש Assay מצדו קרבה (PLA) כדי להמחיש את MST1/MST2 heterodimerization בתאים קבוע עם רגישות גבוהה.
Abstract
אינטראקציות חלבון מוסדר כעיקרון המנחה לאירועים איתות רבים, זיהוי אירועים כאלה הוא מרכיב חשוב בהבנת כמה מסלולים כאלה מאורגנים, כיצד הן פועלות. ישנן שיטות רבות לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון בתאים, אבל יחסית מעטים ניתן להשתמש כדי לזהות אינטראקציות בין חלבונים אנדוגני. אחד שיטה כזו, הקרבה מצדו וזמינותו (PLA), יש מספר יתרונות להמליץ על השימוש בו. לעומת שיטות נפוצות אחרות של ניתוח אינטראקציית חלבון-חלבון, פלה יש רגישות גבוהה יחסית, ניתן לבצע עם מניפולציה תא מינימלי, ו, ב פרוטוקול המתוארים בזאת, מחייב רק שני במטרה נוגדנים נגזר מינים שונים (למשל., עכבר, ארנב), ריאגנט מתמחה אחד: ערכה של נוגדנים משניים שאינם oligonucleotides covalently מקושר ספציפי זה, הביאה בסמיכות אחד לשני, ליצור פלטפורמת amplifiable בחיי עיר PCR או מתגלגל מעגל ההגברה. במצגת זו, אנו מציגים כיצד ליישם את הטכניקה PLA להמחיש שינויים בסמיכות MST1 ו- MST2 בתאים קבוע. בטכניקה המתוארת בכתב היד ישימה במיוחד לניתוח של התא איתות מחקרים.
Introduction
שיבוש MST1/היפו איתות חובר ל הפרעות התפתחותיות carcinogenesis1. ביונקים, להפעיל kinases MST1 ו- MST2 (phosphorylate) MOB1 ו- LATS1/2, הצופות על phosphorylates ואז חלבונית תעתיק שיתוף activator חלבונים הקשורים כן (הפה)2. (Unphosphorylated) בצורתו הפעילה, הפה יש פעילות oncogenic, שיפור שעתוק של גנים התפשטות תאים; לעומת זאת, כאשר הפה הוא מומת על ידי השביל היפו, התפשטות תאים מדוכא, אפופטוזיס בדרגה3. ברקמות, MST1 ו- MST2 קיים בעיקר בתור homodimers פעיל, אבל גירויים oncogenic יכול להגביר את רמות של MST1/MST2 heterodimers, ויש כאלה heterodimers לא פעיל4. עם זאת, כמה heterodimerization MST1/MST2 מוסדר נשאר ממעטים להבין. גם הומו - וגם heterodimers הם בתיווך דרך אינטראקציות בין C-מסוף סליל מפותל מחוזות MST1 MST2 הידועה בשם שרה תחומים5. באמצעות יישום בחיי עיר PLA הפגינו במאמר זה, נוכל להציג את הנוכחות של MST1/MST2 heterodimers בתאים תאי שוואן אנושי (HSC) וכליות עובריים אנושיים (HEK-293). PLA יש יתרון על פני אחרים/חלבון עצבו זיהוי משום שהיא מאפשרת הגילוי של אינטראקציות חלבון אנדוגני, אשר ניתן לזהות לכמת ללא הצורך של ביטוי transgene או את השימוש epitope תגיות 6.
התמרה חושית איתות המסלולים נשלטים במידה רבה על ידי האגודה מותנה של רכיב חלבונים. לדוגמה, גירוי של רוב קולטן טירוזין kinases מוביל שלהם הומו - או הטרו-dimerization הבאים שיוך נוספים חלבונים איתות תאיים, אשר עצמם מתחמי טופס נוסף. המטרה של שיטת ה-PLA היא להמחיש את הקרבה בין סוגי החלבונים בתאים, ובלבד החלבונים נמצאים פחות מ 30-40 ננומטר בנפרד. חלבון קרבה לרוב מאותרים על ידי הראשון המקננת התאים עם נוגדנים הראשי המתאים העולות מינים שונים (למשל., ראביט, עכבר) נגד כל חלבון אינטראקציה, ואז הוספת נוגדנים תלויי מין משניים, DNA מראש בשילוב כדי קצר רגשים. אם הגששים DNA בסמיכות, oligonucleotide דנ א קישור ספציפי באפשרותך לאגוד בו זמנית הן של אלה הגששים, ויצרו פלטפורמה עבור הגברה באמצעות בחיי עיר PCR או על ידי גלגול מנגנון מעגל. תגיות פלורסנט נוספו התגובה הגברה לאפשר ויזואליזציה של החלבונים אינטראקציה, אשר מופיעים כנקודות פלורסנט שניתן בקלות לכמת או מקומית אזורים מסוימים ב-7,תא8, 9 , 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת פתרונות
- להכין מקבע פתרון: 4% paraformaldehyde (PFA) ב 1 x PBS. 10 מ"ל, סעו 2.5 מ של 16% PFA ולהוסיף 7.5 mL ל- PBS 1 x.
סכנות: כדורגלן הוא מסרטנים במינון נמוך. אדי במגע עם העור הם מסוכנים. חנות ב-20 ° C. - להכין פתרון permeabilization: 0.1% טריטון X-100 ב 1 x PBS. עבור 100 מ של פתרון, להוסיף 100 µL של טריטון X-100 100 מ של 1 x PBS. לאחסן בטמפרטורת החדר (RT).
- להכין מאגר שטיפת: 1 x TBST. 1 ליטר, סעו 100 מ של 10 x TBS מ"ל 890 של dH2O, 10 מ של Tween 20 (10%).
- להכין פתרון חסימה כפי שסופק על-ידי ערכת. לחלופין, השתמש פתרון PBS x 1, המכיל 2% BSA.
- הכינו את diluent נוגדנים כפי שסופק על-ידי ערכת. לחלופין, השתמש 1 x PBS פתרון המכיל 1% BSA.
2. ציפוי של תאים
הערה: במחקר זה, השתמשנו מונצחים האנושי תאי שוואן (iHSC) ותאים 293 כליות עובריים אנושיים (HEK 293); עם זאת, שיטה זו יכול לשמש עבור סוגים רבים של תאים חסיד.
- תרבות HEK 293 ב DMEM בתוספת 10% FBS, 0.2% גלוקוז, 2 מ מגלוטמין, U/mL 100 פניצילין G ו µg 100/mL סטרפטומיצין על צלחות תרביות רקמה שטופלו ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2. לשמור על iHSC ב- 10% FBS/DMEM בתוספת אפשרות למצוא עט ו forskolin 2 מיקרומטר. בודק את התאים עבור mycoplasma. בוצעה ללא אימות השורה של התא.
- מעיל שקופית 16-ובכן קאמרית עם 50 µL של 10 µg/mL העכבר טבעי laminin או 0.01% פולי-L-ליזין פתרון, תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2. פצל תאים באמצעות 0.04% טריפסין-EDTA.
- IHSC צלחת, HEK-293 ב 100 µL בינוני ב 80% הנהרות (15,000-25,000 תאים/טוב).
- דגירה התאים 12 עשרים וארבע שעות ב- 37 מעלות צלזיוס ב humidified, 5% CO2 מיכלים.
3. קיבוע ו- Permeabilization
- הסר את המדיום מן הבארות, לשטוף עם µL 100 ל- 1 x PBS. האחות עם micropipette כדי למזער את הסיכון של הסרת הדגימה.
- לתקן תאים על-ידי הוספת µL 50% 4 מחברים לכל תקופת דגירה של 10 דקות-RT, בלי עצבנות ואוהבים. תאים רגישים ניתוק, כדי להימנע pipetting את הפתרונות ישירות על גבי התאים.
- לשטוף את התאים עם 0.05% TBST שלוש פעמים במשך 5 דקות. האחות עם micropipette כדי למזער את הסיכון של הסרת הדגימה.
- לטיפול תאי עם פתרון permeabilization (0.1% x-100 Triton ב- 1 x PBS) למשך 10 דקות בלי עצבנות-RT.
- רחץ תאים עם TBST שלוש פעמים במשך חמש דקות כל עם עצבנות.
4. חסימת
- הקש את TBST (בעדינות עם micropipette). דמיינו את השקופית במיקרוסקופ כדי לראות אם התאים יישארו מצורפים.
- הוסף טיפה אחת (µL 50-60) של 1 x פתרון חסימת כל דגימה.
- מראש בחום תא לחות (קופסה ריקה עצה עם מים) ב 37 מעלות צלזיוס, דגירה בשקופיות זה עבור h 1-37 מעלות צלזיוס.
5. ראשי נוגדנים
- לדלל הנוגדנים הראשי (1: 100) ב- Diluent נוגדנים (ראה טבלה של חומרים). להכין פתרון נוגדן µL 40 לכל טוב.
- הסר חסימה פתרון השקופיות על-ידי הקשה את הנוזל. אל תאפשר תאים להתייבש.
- מערבולת ולהוסיף µL 40 של פתרונות נוגדן כל טוב.
- דגירה h 1 ב 37 מעלות צלזיוס בתוך תא לחות טרופה.
6. הקרבה מצדו Assay הגששים
הערה: ה-PLA הגששים ניתנים כחלק ערכת (ראה טבלה של חומרים). הבחירה של הגששים תלויות המינים של נוגדנים ראשי להשתמש כדי לזהות את החלבונים של ריבית.
- לדלל PLA שני רגשים (אנטי-העכבר מינוס, ארנב אנטי פלוס) 1:5 ב Diluent נוגדן. עבור כל דגימה, להכין µL 40 של ה-PLA בדיקה. דגירה את התערובת למשך 20 דקות ב- RT.
- הקש את הפתרון נוגדן ראשוני מהשקופיות. לשטוף את השקופיות פעמיים במשך חמש דקות כל עם מאגר לשטוף-RT.
- בעדינות הקש על המאגר שטיפת מהשקופיות ולהוסיף את הפתרון בדיקה PLA diluent וולס (40 µL טוב).
- דגירה השקופיות תא לחות מחומם מראש עבור h 1-37 מעלות צלזיוס.
7. מצדו
הערה: בחיי עיר זיהוי ריאגנטים אדום ליגאז, הפתרון מצדו ניתנים כחלק ערכת (ראה טבלה של חומרים).
- השתמש את בחיי עיר זיהוי ריאגנטים אדום.
- מיד לפני השימוש, מערבולת, לדלל את אמצעי האחסון הדרושים של 5 x מצדו מלאי מים טוהר גבוהה בתוך 1:5.
הערה: אל תאחסן ריאגנטים מדולל. - הקש את הפתרון בדיקה PLA מהשקופיות. לשטוף את השקופיות 1 x מאגר לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל-RT.
- מיד לפני תוספת הדגימות, מערבולת, הוספת ליגאז הפתרון מצדו בשעה 1:40 דילול ו מערבולת שוב.
- הקש את המאגר שטיפת מהשקופיות ולהוסיף את הפתרון מצדו/ליגאז מכל קידוח (40 µL טוב).
- דגירה השקופיות בחדר מחומם מראש לחות למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
8. הגברה
הערה: המניה הגברה מסופק כחלק ערכת (ראה טבלה של חומרים). ריאגנטים הם רגיש אור; ובכך למנוע חשיפת שהשקופיות אור.
- מערבולת, לדלל את אמצעי האחסון הדרושים של 5 x הגברה מניות 1:5 במים טוהר גבוהה ומערבבים.
- הקש את הפתרון מצדו/ליגאז מהשקופיות. לשטוף את השקופיות 1 x מאגר לשטוף פעמיים למשך 2 דקות כל-RT.
- מערבולת ולהוסיף את פולימראז הפתרון הגברה דילול 1:80 ו מערבולת שוב.
- הקש את מאגר שטיפת מהשקופיות ולהוסיף את הפתרון הגברה/פולימראז מכל קידוח (40 µL טוב). דגירה השקופיות תא לחות מחומם מראש עבור 100 דקות ב 37 º C.
9. הכנה הדמיה
הערה: אלה ריאגנטים רגיש אור. שמור את השקופיות מוגן מפני אור.
- הקש את הפתרון הגברה-פולימראז מהשקופיות ולשטוף פעמיים במשך 10 דקות כל ב 1 x שטיפת מאגר-RT.
- להסיר את תאי סיליקון מסביב הבארות משקופית לחלוטין. לגרד את הסיביות הנותרות של סיליקון עם סכין גילוח. לצייר רשת בשקופית הפרדת כל טוב.
- להוסיף ~ 40 µL של המדיום הרכבה עם דאפי. להיות זהירים כדי למנוע השמנה בועות אוויר תחת תגית כיסוי. הקצוות של תגית הכיסוי ניתן לחתום עם לק.
- להמתין לפחות 20 דקות לפני ביצוע ניתוח התמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול פה. - לאחר דימות, לאחסן את השקופיות ב-20 ° C בחושך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השתמשנו וזמינותו PLA לבחון את האינטראקציה בין MST1 לבין MST2 HEK-293, iHSC. התאים היו קבועים, permeabilized, מוכתם נוגדנים שונים, ואחריו בחיי עיר הגברה לפי הפרוטוקול פלה (איור 1). לתעד את רמת heterodimerization MST1/MST2, התאים היו מוכתמים נוגדנים MST1 ו- MST2 (איור 1 א', 1 ג, 1 G). כפקד חיובית, השתמשנו גם טיפשה, נוגדנים ההטבות צפויים להיות בסמיכות בתאים עם הפעלת טיפשה (איור 1B ו- 1F). תאים חסר MST1 ו- MST2 מציגים אין אות פלה (איור 1C). תאים צבעונית אחת בלבד של שני נוגדנים להראות באופן דומה אין אות פלה (איור 1 ג'י). תוצאות אלו מראים כי HEK-293 תאים ותאים iHSC מכילים heterodimers MST1/MST2, בקנה אחד עם ממצאים קודמים במעבדה שלנו4. כפקד של שליליות נוספות אנחנו מודגרות תאים עם נוגדנים העיקרי טיפשה, MST2 להראות ירידה לפרטים של אותות (איור 1D ו- 1 H).
כדי לאשר רמות ביטוי MST1, MST2, מחלצת WT, MST1/MST2 נוקאאוט HEK-293 תאים, בהתאמה, היו טוענים immunoblot עם נוגדנים המצוין (איור 1I).
איור 1 : PLA נציג נתונים. (א-ח) התאים היו קבועים, צבעונית עם נוגדנים המצוין ואחריו ההליך פלה. כחול: דאפי, אדום: האות ה-PLA. Photomicrographs התקבלו עם מיקרוסקופ קונפוקלי Leica SP5. (א) Immunoblot MST1, MST2. סולם בר הוא 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מצאנו את זה שימושי כדי להשתמש זכוכית קאמרית שקופיות עבור הניסוי זה מאוד נוח לבצע ניסוי עם מספר שורות תאים (14-16), אין צורך לשנות את הדגימה בכל פעם במהלך ניתוח מיקרוסקופ. כמה סיבוכים שעלולים להתעורר, כגון סיכון מוגבר זיהום, עם נוגדנים. לכן, אנו ממליצים לשטוף כל טוב בנפרד במקום להשתמש צנצנת Coplin, למרות משך מוגברת של הניסוי. בנוסף, הסרת סיליקון הוספה הוא רומן עדין, חייב להיעשות עם טיפול וסבלנות. אפילו עם טכניקה מוקפד, זה לפעמים ניתן לראות כמויות קטנות של סיליקון פסולת לאחר הסרת תותב. מסיבה זו, אחד עליך להסיר את תותב סיליקון בקפדנות מרובה, באמצעות סכין גילוח במידת הצורך, כפי מדי סיליקון unremoved ניתן לשנות את המרחק קונאפוקלית במהלך מיקרוסקופ. זה גם יכול להיות שימושי לצייר קווים כגבולות של בארות לאחר הסרת את תותב סיליקון כדי לעזור למצוא את התאים במיקרוסקופ.
זה הכרחי להשתמש נוגדנים העיקרי תגובתי הלא-צלב, כי כל מכירה רק אחד מאנשי heterodimer (למשל, MST1 נוגדנים צריך גם מזהה MST2 ואת ולהיפך). כמו כן, חשוב לזכור להשתמש טיפים שונים כדי למנוע זיהום צולב של נוגדנים העיקרי וזונדים PLA, כדי להימנע מלגעת בתחתית הבאר וכדי למנוע pipetting ישירות על דגימות. מצאנו כי עבור iHSC, עדיף מעיל שקופיות קאמרית עם פתרון פולי-L-ליזין 0.01%, עבור HEK-293 עדיף מעיל עם העכבר laminin 10 µg/mL.
כמו עם כל נוהל, ישנן כמה מגבלות של שיטה זו. PLA וזמינותו, בעוד שיטה חזקה מכל הסיבות שפורטו לעיל, מוגבל על ידי ירידה לפרטים רגישות של הנוגדנים. יתר על כן, ריכוז נוגדן ותנאים התרבות התא צריך להיות מכוונן לפני שמוכר מוגדרים כדי להפחית את העלויות של מבחני. בהקשר הזה, חלופה כדי להפחית את העלות של מבחני היא להשתמש צלחת זכוכית 35 מ מ ללא ציפוי-התחתון במקום שקופיות קאמרית.
היתרון וזמינותו הוא את העוצמה ואת מספר הנקודות פלורסנט ניתן לכמת באמצעות תוכנות מחשב שונות כגון התוכנה בועה-finder, כלי תמונה Duolink ו- th Olink Bioscience.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים המעבדה Chernoff כל תורם אופטימיזציה של אימות של פרוטוקול זה, מריה ראדו, גלינה Semenova מסוים. אנו מודים גם אנדריי Efimov מתקן הדמיה תא ב- Fox Chase Cancer Center. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של NIH (R01 CA148805) לשם פורשים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
References
- Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
- Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation. Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
- Rawat, S. J., et al. H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization. Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).
- Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain. Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).
- Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome. Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).
- Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
- Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
