Summary
Здесь мы покажем, как использовать Assay лигирование близости (НОАК) для визуализации MST1/MST2 heterodimerization в фиксированных ячейках с высокой чувствительностью.
Abstract
Регулируемые белок белковых взаимодействий являются руководящим принципом для многих событий, сигнализации, и обнаружение таких событий является важным элементом в понимании того, как организованы такие пути и как они функционируют. Есть много методов для обнаружения белок белковых взаимодействий в клетках, но относительно немногие может использоваться для определения взаимодействия между эндогенного белков. Один из таких методов, близость лигирование пробирного (НОАК), имеет несколько преимуществ рекомендовать ее использование. По сравнению с другими общие методы анализа взаимодействия протеин протеина, PLA имеет относительно высокую чувствительность и специфичность, могут выполняться с минимальными клеток манипуляции и в протоколе, описанные здесь, требует только два целевых антитела, полученных от разных видов (например., от мыши и кролика) и одно специализированное реагента: набор вторичных антител, которые являются ковалентно связан с конкретным олигонуклеотиды, когда принес в непосредственной близости друг от друга, создать Мы платформа в situ ПЦР или подвижного круга амплификации. В этой презентации мы покажем как применять технику НОАК визуализировать изменения в MST1 и MST2 близости в стационарных клетках. Метод, описанный в этой рукописи особенно применима для анализа клеток сигнализации исследования.
Introduction
Нарушение MST1/Бегемот сигнализации были связаны с отклонениями и канцерогенеза1. В млекопитающих, активировать киназы MST1 и MST2 (фосфорилировать) MOB1 и LATS1/2, последний из которых затем фосфорилирует и инактивирует транскрипционный анализ совместного активатор да связанные белком (YAP)2. В его активную форму (unphosphorylated) Яп имеет онкогенных активность, повышение транскрипцию генов распространения клеток; и наоборот когда YAP инактивированная Бегемот дорожка, пролиферацию клеток подавляется и апоптоз передовой3. В тканях существуют главным образом в качестве активного homodimers, MST1 и MST2 но онкогенных раздражителей может увеличить уровни гетеродимерами MST1/MST2, и такие гетеродимерами являются неактивными4. Однако как регулируется MST1/MST2 heterodimerization по-прежнему осознаются. Гомо - и гетеродимерами, опосредованное через взаимодействия между регионами биспиральных C-терминала MST1 и MST2, известная как Сара домены5. Использование в situ PLA продемонстрировал в этой статье, мы покажем присутствие гетеродимерами MST1/MST2 в клетках человека Шванновские клетки (HSC) и человеческих эмбриональных почек (ГЭС-293). PLA имеет преимущество перед другими методами обнаружения взаимодействия протеин/потому что она позволяет обнаруживать эндогенного белок белковых взаимодействий, которые могут быть определены и количественно без необходимости трансген выражения или использование epitope тегов 6.
Сигнальных путей значительной степени контролируется ассоциацией условного компонента белков. К примеру стимуляция большинства рецепторов тирозин киназ приводит к их гомо - и гетеро димеризации и последующего объединения с дополнительной внутриклеточных сигнальных белков, которые сами формы дальнейшего комплексов. PLA метод предназначен для визуализации близости между белков в клетках, условии, что белки не менее 30-40 Нм друг от друга. Близость белка обычно определяется первой инкубации клеток с соответствующей первичной антител, поднятые в различных видов (например., кролик и мышь) против каждый протеин, затем добавляя вегетационных вторичные антитела, предварительно спаренных к краткости ДНК зонды. Если ДНК-зонды находятся в непосредственной близости, конкретных ссылок ДНК олигонуклеотида одновременно можно связать оба эти зонды, формирование платформы для усиления в situ ПЦР или подвижного круга механизм. Флуоресцентный теги, добавленные к реакции амплификации позволяют визуализация взаимодействия белков, которые появляются как люминесцентные точки, которые могут быть легко количественно и локализованы в отдельных регионах в ячейке7,,8, 9 , 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка решений
- Подготовить фиксирующие решение: параформальдегида 4% (PFA) в однократном ПБС. По 10 мл, принимать 2,5 мл 16% PFA и добавить 7,5 мл ПБС.
Опасности: PFA канцерогенных при низких дозах. Опасных дымов и контакт с кожей. Хранить при температуре от-20 ° C. - Приготовляют раствор permeabilization: 0.1% тритон X-100 в однократном ПБС. 100 мл раствора добавьте 100 мкл Тритон X-100 100 мл ПБС. Хранить при комнатной температуре (RT).
- Подготовить мыть буфер: 1 x TBST. На 1 Л принимать 100 мл 10 x TBS, 890 dH2O до 10 мл 20 анимации (10%).
- Подготовьте блокирования решения как поставляется комплект. Альтернативно используйте 1 x PBS раствор, содержащий 2% BSA.
- Подготовка разбавителя антитела, как поставляется комплект. Альтернативно используйте 1 x PBS раствора, содержащего 1% BSA.
2. покрытие клеток
Примечание: В этом исследовании мы использовали увековечен Шванновские клетки человека (iHSC) и клеток человеческого эмбриона почек 293 (ГЭС 293); Однако этот метод может использоваться для многих типов адэрентных клеток.
- Культура 293 ГЭС в DMEM дополнена 10% FBS, 0,2% глюкозы, 2 мм L-глютамином, 100 ед/мл пенициллин G и 100 мкг/мл стрептомицина на культуре ткани лечение пластины при 37 ° C в 5% CO2. Сохранить iHSC в 10%, которые FBS/DMEM с пером/воспаление и 2 мкм Форсколин. Обычно тест клетки для микоплазмы. Была выполнена без аутентификации линии клеток.
- Слой слайд 16-ну камеры с 50 мкл раствора 10 мкг/мл природные мышь Ламинин или 0,01% поли L-лизин и Инкубируйте 30 минут при 37 ° C в 5% CO2. Разбиение ячеек с помощью 0,04% трипсина ЭДТА.
- Плита iHSC и ГЭС-293 в 100 мкл среды на 80% слияния (15000-25000 клеток/хорошо).
- Инкубировать клетки для 12-24 часа при 37 ° C в увлажненные, 5% CO2 инкубатора.
3. Фиксация и Permeabilization
- Удалите носитель из скважин и мыть с 100 мкл ПБС. Аспирационная с микропипеткой свести к минимуму риск удаления образца.
- Исправьте клетки, добавляя 50 мкл 4% ПФА за хорошо и проинкубируйте втечение 10 мин на RT, без агитации. Клетки чувствительны к отряда, поэтому избегайте закупорить решения непосредственно на клетки.
- Вымыть клетки с 0,05% TBST три раза за 5 мин. Аспирационная с микропипеткой свести к минимуму риск удаления образца.
- Лечить клетки с permeabilization раствором (0,1% тритон x-100 в ПБС) для 10 мин без агитации на RT.
- Вымойте клетки с TBST три раза за 5 мин с перемешиванием.
4. Блокировка
- Кран TBST (очень осторожно с микропипеткой). Визуализируйте слайд в Микроскоп, чтобы увидеть, если клетки остаются присоединенными.
- Добавьте по одной капле (50-60 мкл) 1 x блокирование решение для каждого образца.
- Предварительно нагрейте влажность палата (пустой кончик коробка с водой) при 37 ° C и инкубировать слайды в нем за 1 ч при 37 ° C.
5. первичные антитела
- Разбавить первичного антитела (1: 100) в антитела разбавителя (см. Таблицу материалы). Подготовьте раствор 40 мкл антител в колодец.
- Удалите блокирующий решение из слайдов, нажав жидкости. Не позволяют клеткам для просушки.
- Вортекс и 40 мкл антител решений для каждой скважины.
- Инкубируйте 1 час при 37 ° C в предварительно разогретой влажность камере.
6. близость лигирование Assay зонды
Примечание: PLA зонды предоставляются как часть комплекта (см. Таблицу материалы). Выбор датчиков будет зависеть от вида первичных антител, используется для определения белков интерес.
- Разбавить двух зондов PLA (анти мыши минус и плюс анти кролик) 1:5 в антитела разбавителя. Для каждого образца Подготовьте 40 мкл PLA зонда. Инкубировать смесь для 20 мин на RT.
- Кран основное антитело решение от слайды. Вымойте слайды дважды за 5 мин с мыть буфера на RT.
- Аккуратно коснитесь мыть буфера от слайды и разбавителя PLA зонд решение добавить скважин (40 мкл/хорошо).
- Инкубируйте слайды в камере подогретую влажность за 1 ч при 37 ° C.
7. Перевязка
Примечание: на месте обнаружения реагентов красный, лигаза и перевязка решения предоставляются как часть комплекта (см. Таблицу материалы).
- Использование на месте обнаружения реагентов красный.
- Непосредственно перед употреблением, вихрь и разбавленных необходимых объемов 5 x лигирование фондовой 1:5 в высокой чистоты воды.
Примечание: Не хранить разбавленные реагентов. - Кран НОАК зонд решение от слайды. Вымойте слайды в 1 x стирки буфер дважды за 5 мин на RT.
- Непосредственно перед добавлением к образцам вихрь и добавьте лигаза лигирование решение в 1:40 разрежения и вихрь снова.
- Кран мытья буфер из слайдов и добавить лигирование/лигаза решение для каждой скважины (40 мкл/хорошо).
- Инкубируйте слайды в предварительно нагретой влажность камеру для 30 минут при 37 ° C.
8. усиление
Примечание: Усиление Фонда предоставляется как часть комплекта (см. Таблицу материалы). Реагенты являются светочувствительный; Таким образом, Избегайте разоблачения слайды к свету.
- Вортекс и разбавить необходимых объемов 5 x фондовой усиления 1:5 в высокой чистоты воды и перемешать.
- Кран лигирование/лигаза решение от слайды. Вымойте слайды в 1 x стирки буфер дважды для 2 мин на RT.
- Вортекс и добавьте полимеразы амплификации решение на 1:80 разрежения и вихрь снова.
- Кран мытья буфер из слайдов и добавить усилители/полимеразы решение для каждой скважины (40 мкл/хорошо). Инкубируйте слайды в предварительно нагретой влажность камеру для 100 мин при 37 ° C.
9. Подготовка изображений
Примечание: Это легкие чувствительных реагентов. Держите слайды, защищенном от света.
- Кран усилители-полимеразы решение от слайды и мыть дважды в течение 10 минут каждый в 1 x мыть буфера на RT.
- Камеры и силикона вокруг лунки полностью удалите из слайда. Соскрести оставшиеся биты силикона с бритвой. Нарисовать сетку на слайде, отделяя каждый хорошо.
- ~ 40 мкл монтажа среды с DAPI. Будьте осторожны избежать захвата воздушных пузырей под крышку выскальзования. Края крышки выскальзования могут быть герметизированы с ногтей.
- Подождите по крайней мере 20 минут перед выполнением анализа изображений с помощью конфокального микроскопа.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. - После съемки, храните слайды при температуре-20 ° C в темноте.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы использовали НОАК assay для тестирования взаимодействия между MST1 и MST2 ГЭС-293 и iHSC. Клетки были исправлены, permeabilized и витражи с различных антител, следуют в situ амплификации согласно протоколу PLA (рис. 1). Для документирования уровня MST1/MST2 heterodimerization, клетки окрашивали MST1 и MST2 антител (рис. 1A, 1 C и 1 G). Как позитивный элемент мы также использовали Эрк и воспрянуть духом антитела, которые, как ожидается, будут находиться в непосредственной близости в клетках с активированного Эрк (Рисунок 1B и 1F). Клетки не хватает MST1 и MST2 показывают сигнал не PLA (рис. 1 c). Клетки окрашивали только один из двух антител также показывают сигнал не PLA (рис. 1 g). Эти результаты показывают, что ГЭС-293 клетки и iHSC клетки содержат гетеродимерами MST1/MST2, в соответствии с предыдущими выводами из нашей лаборатории4. Как дополнительный отрицательный контроль мы инкубировали клетки с Эрк и MST2 первичного антитела, чтобы показать специфику сигналов (рис. 1 d и 1 H).
Для подтверждения уровня MST1 и MST2 выражение, извлекает из WT и MST1/MST2 нокаут ГЭС-293 клетки, соответственно, были проанализированы immunoblot с указанных антител (Рисунок 1I).
Рисунок 1 : Представитель PLA данных. (A-H) Клетки были исправлены и витражи с указанных антител, следуют процедуре PLA. Синий: DAPI, красный: PLA сигнал. Микрофотографиями были получены с Конфокальный микроскоп Leica SP5. (I) Immunoblot для MST1 и MST2. Шкалы бар-10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы нашли его полезным использовать стекло камеры слайды для этого эксперимента, как это очень удобно для выполнения эксперимент с несколькими линиями клетки (14-16), и нет необходимости изменить образец каждый раз во время анализа в микроскопии. Несколько осложнения могут возникать, например, повышенный риск перекрестного загрязнения с антителами. Поэтому, мы предлагаем мойки каждый хорошо индивидуально вместо опарник Coplin, несмотря на увеличение продолжительности эксперимента. Кроме того Удаление силиконовые вставки является деликатным делом и должно быть сделано с осторожностью и терпение. Даже при тщательной технику иногда можно увидеть небольшое количество силиконовой мусора после удаления вставки. По этой причине один необходимо удалить силиконовую вставку скрупулезно, используя razorblade, при необходимости, как слишком много оставленных силикон может изменить конфокальный расстояние при микроскопии. Она также может быть полезным рисовать линии границы скважин после удаления кремния Вставка, чтобы помочь найти клетки под микроскопом.
Важно, чтобы использовать-крест реактивной первичных антител, что каждый признает только один член гетеродимера (например, MST1 антитела не должно также признавать MST2 и наоборот). Кроме того важно помнить использовать различные советы, чтобы избежать перекрестного загрязнения первичного антитела и PLA зонды, не прикасайтесь к нижней части скважины и избежать закупорить непосредственно над образцов. Мы обнаружили, что для iHSC, это лучше для пальто палата слайды с 0,01% раствором поли L-лизин, и для ГЭС-293 он лучше пальто с мыши Ламинин 10 мкг/мл.
Как и в случае с любой процедурой, существуют некоторые ограничения этого метода. PLA assay, в то время как мощный метод для всех причин, перечисленных выше, ограничивается специфичность и чувствительность антител. Кроме того концентрации антител и условий культуры клеток должен быть тонко настроен до лабораторных экспериментов для снижения затрат анализов. В этой связи, является альтернативой снижения стоимости анализов использовать блюдо немелованной 35-мм стекло дно вместо камеры слайды.
Преимуществом assay является что интенсивности и количество флуоресцентные точек может быть определена количественно с помощью различных компьютерных программ Blob-finder программное обеспечение, Duolink Image Tool и th Olink Bioscience.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим весь Чернова лаборатории для содействия оптимизации и проверки этого протокола, в частности Мария Раду и Семенова Галина. Мы также благодарим Андрей Ефимов визуализации объекта ячейки на рака Фокс Чейз центр. Эта работа была поддержана гранта NIH (R01 CA148805) для JC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
References
- Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
- Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation. Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
- Rawat, S. J., et al. H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization. Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).
- Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain. Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).
- Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome. Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).
- Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
- Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
