Summary
Här visar vi hur du använder en närhet Ligation Assay (PLA) för att visualisera MST1/MST2 heterodimerization i fasta celler med hög känslighet.
Abstract
Reglerade protein-protein interaktioner är en vägledande princip för många signalering händelser, och upptäckt av sådana händelser är en viktig del i att förstå hur sådana vägar är organiserade och hur de fungerar. Det finns många metoder att upptäcka protein-protein interaktioner i celler, men relativt få kan användas för att upptäcka interaktioner mellan endogena proteiner. En sådan metod, den närhet ligation assay (PLA), har flera fördelar att rekommendera dess användning. Jämfört med andra vanliga analysmetoder protein-protein interaktioner, PLA har relativt hög känslighet och specificitet, kan utföras med minimal cell manipulation, och, i det protokoll som beskrivs häri, kräver endast två mål-specifikt antikroppar som härrör från olika arter (t.ex., från mus och kanin) och en specialiserad reagens: en uppsättning av sekundära antikroppar som är kovalent länkade till specifika oligonukleotider som, när kommer i närheten av varandra, skapa en amplifiable plattform för i situ PCR eller rullande cirkel förstärkning. I denna presentation visar vi hur man tillämpa den PLA-tekniken för att visualisera förändringar i MST1 och MST2 närhet i fasta celler. Tekniken som beskrivs i detta manuskript är särskilt lämpligt för analys av cell signalering studier.
Introduction
Störningar av MST1/Hippo signalering har varit ansluten till utvecklingsstörningar och carcinogenes1. Hos däggdjur, aktivera kinaser MST1 och MST2 (fosforylera) MOB1 och LATS1/2, varav den senare då phosphorylates och inaktiverar transkriptionell samtidig aktivare Ja-associerade protein (YAP)2. I sin aktiva (unphosphorylated) form har YAP onkogen aktivitet, ökad transkription av cell spridning gener; omvänt, när YAP inactivateds av Hippo vägen, cellproliferation dämpas och apoptos främjas3. I vävnader, MST1 och MST2 finns huvudsakligen som aktiva homodimers, onkogena stimuli kan öka nivåer av MST1/MST2 heterodimerer men sådana heterodimerer är inaktiva4. Men fortfarande hur MST1/MST2 heterodimerization regleras dåligt förstådd. Både homo- och heterodimerer är medierade via interaktioner mellan C-terminal dubbeltvinnade regioner av MST1 och MST2 känd som SARAH domäner5. Med en i situ visat PLA i denna artikel, vi visar förekomsten av MST1/MST2 heterodimerer i mänskliga Schwann celler (HSC) och mänskliga embryonala njure celler (HEK-293). PLA har en fördel över andra protein och protein interaktion detektionsmetoder eftersom det möjliggör upptäckt av endogen protein-protein interaktioner, som kan identifieras och kvantifieras utan behov av transgenens uttryck eller användning av epitop Taggar 6.
Transduktion signalvägar styrs till stor del av föreningen villkorad av komponenten proteiner. Till exempel leder stimulering av de flesta receptortyrosinkinaser till sin homo - eller hetero-dimerization och efterföljande association med ytterligare Intracellulär signalering proteiner, som själva formuläret ytterligare komplex. Syftet med metoden PLA är att visualisera närhet mellan proteiner i celler, förutsatt att proteinerna är mindre än 30-40 nm apart. Protein närhet upptäcks oftast av första ruvning cellerna med lämplig primär antikroppar tas upp i olika arter (t.ex., kanin och mus) mot varje samverkande protein, sedan lägga till artspecifika sekundära antikroppar, Pre kopplat till korta DNA-prober. Om DNA sonderna finns i närheten, kan en specifik länka DNA oligonukleotiden samtidigt binda både av dessa sonder, bildar en plattform för förstärkning av i situ PCR eller rullande cirkel mekanism. Fluorescerande tags tillsätts förstärkning reaktionen kan visualisering av samverkande proteiner, som visas som fluorescerande prickar som lätt kan kvantifieras och lokaliserad till vissa regioner i cell7,8, 9 , 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av lösningar
- Förbereda fixativ lösning: 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 1 x PBS. För 10 mL, ta 2,5 mL av 16% PFA och tillsätt 7,5 mL 1 x PBS.
Faror: PFA är cancerframkallande vid låga doser. Ångor och kontakt med huden är farliga. Förvaras vid-20 ° C. - Förbereda permeabilisering lösning: 0,1% Triton x-100 i 1 x PBS. För 100 mL lösning, tillsätt 100 µL av Triton x-100 till 100 mL 1 x PBS. Förvara i rumstemperatur (RT).
- Förbered tvättbufferten: 1 x TBST. För 1 L, ta 100 mL 10 x TBS, dH2O 890 mL och 10 mL av Tween-20 (10%).
- Förbereda blockerande lösning som levereras av kit. Alternativt använda 1 x PBS lösning innehållande 2% BSA.
- Förbereda antikropp spädningsvätskan som levereras av kit. Alternativt använda 1 x PBS lösning innehållande 1% BSA.
2. plätering av celler
Obs: I denna studie använde vi förevigade mänskliga Schwann celler (iHSC) och mänskliga embryonala njure 293 celler (HEK 293); dock kan denna metod användas för många typer av vidhäftande celler.
- Kultur HEK 293 i DMEM kompletteras med 10% FBS, 0.2% glukos, 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penicillin G och 100 µg/mL streptomycin på vävnadsodling-behandlade plattorna vid 37 ° C i 5% CO2. Upprätthålla iHSC i 10% FBS/DMEM kompletteras med penna/Strep och 2 µM forskolin. Rutinmässigt testa celler för mycoplasma. Ingen cell linje autentisering utfördes.
- Coat en 16-väl kammaren bild med 50 µL 10 µg/mL naturliga mus laminin eller 0,01% poly-L-lysin lösning och inkubera i 30 minuter vid 37 ° C i 5% CO2. Dela celler använder 0,04% trypsin-EDTA.
- Plattan iHSC och HEK-293 i 100 µL av medium på 80% confluence (15.000-25.000 celler per brunn).
- Inkubera cellerna för 12-24 timmar vid 37 ° C i en fuktad, 5% CO2 inkubator.
3. fixering och permeabilisering
- Ta bort mediet från brunnarna och tvätta med 100 µL av 1 x PBS. Aspirera med en mikropipett för att minimera risken för att ta bort provet.
- Fixa celler genom att lägga till 50 µL av 4% PFA per väl och inkubera i 10 min vid RT, utan agitation. Cellerna är känsliga för avlossning, så undvik pipettering lösningar direkt på cellerna.
- Tvätta cellerna med 0,05% TBST tre gånger för 5 min varje. Aspirera med en mikropipett för att minimera risken för att ta bort provet.
- Behandla cellerna med permeabilisering lösning (0,1% Triton x-100 i 1 x PBS) i 10 min utan agitation på RT.
- Tvätta cellerna med TBST tre gånger för 5 min varje skakning.
4. blockering
- Tryck på av TBST (mycket försiktigt med en mikropipett). Visualisera bilden i ett mikroskop för att se om celler kvar.
- Tillsätt en droppe (50-60 µL) 1 x blockering lösning till varje prov.
- Förvärm en fuktkammare (tom tip box med vatten) vid 37 ° C och inkubera bilder i det för 1 h vid 37 ° C.
5. primära antikroppar
- Späd de primära antikropparna (1: 100) i den antikropp spädningsvätska (se Tabell för material). Bered 40 µL antikropp per brunn.
- Ta bort blockering lösning från bilderna genom att trycka ut vätskan. Tillåt inte celler att torka.
- Vortex och tillsätt 40 µL av antikropp lösningar till varje brunn.
- Inkubera i 1 timme vid 37 ° C i en förvärmd fuktkammare.
6. närhet Ligation Assay sonder
Obs: PLA sonder tillhandahålls som en del av ett kit (se Tabell för material). Valet av sonder beror på arten av primära antikroppar används för att upptäcka proteinerna av intresse.
- Späd de två PLA-sonderna (antimus MINUS och anti-kanin PLUS) 1:5 i den antikropp spädningsvätska. För varje prov, förbereda 40 µL av PLA sonden. Inkubera blandningen i 20 min på RT.
- Tryck på av primär antikropp lösningen från glasen. Tvätta bilderna två gånger för 5 min varje med tvätta buffert på RT.
- Försiktigt tryck av tvättbuffert från bilderna och lägga till spädningsvätska PLA sonden lösningen i brunnar (40 µL per brunn).
- Inkubera bilder i en förvärmd fuktkammare för 1 h vid 37 ° C.
7. ligering
Obs: i situ upptäckt reagenser rött, Ligase, och Ligation lösning tillhandahålls som en del av ett kit (se Tabell för material).
- Använda i situ upptäckt reagenser Red.
- Omedelbart före användning, vortex och späd den nödvändiga mängden av 5 x ligering lager 1:5 i hög renhet vatten.
Obs: Förvara inte utspädda reagenser. - Tryck på av PLA sonden lösningen från glasen. Tvätta bilderna i 1 x Tvättbuffert två gånger för 5 min varje på RT.
- Omedelbart före tillägg prov vortex och lägga till Ligase Ligation lösningen vid 1:40 utspädning och vortex igen.
- Tryck på av tvättbuffert från bilderna och lägga ligering/Ligase lösningen till varje brunn (40 µL per brunn).
- Inkubera bilder i en förvärmd fuktkammare under 30 minuter vid 37 ° C.
8. förstärkning
Obs: Förstärkning beståndet tillhandahålls som en del av ett kit (se Tabell för material). Reagenserna är ljuskänsligt; därmed undvika att utsätta bilder för ljus.
- Vortex och späd den nödvändiga mängden av 5 x förstärkning lager 1:5 i hög renhet vatten och blanda.
- Tryck på av ligering/Ligase lösningen från glasen. Tvätta bilderna i 1 x Tvättbuffert två gånger i 2 min varje på RT.
- Vortex och lägga till polymerasen förstärkning lösningen vid 1: 80 utspädning och vortex igen.
- Tryck på av tvättbuffert från bilderna och lägga förstärkning/polymeras lösningen till varje brunn (40 µL per brunn). Inkubera bilder i en förvärmd fuktkammare under 100 minuter vid 37 ° C.
9. förberedelser inför Imaging
Obs: Dessa är ljus känsliga reagenser. Hålla bilderna skyddas från ljus.
- Tryck på av förstärkning-polymeras lösningen från glasen och tvätta två gånger under 10 min varje i 1 x Tvättbuffert på RT.
- Ta bort chambers och silikon runt brunnarna från bilden helt. Skrapa bort de återstående bitarna av silikon med en rakhyvel. Rita ett rutnät på bilden separera varje väl.
- Tillsätt ~ 40 µL av monteringsmedium med DAPI. Var noga med att undvika svällning luftbubblor under täckglaset. Kanterna på täckglaset kan förseglas med nagellack.
- Vänta minst 20 min innan du utför bildanalys med confocal Mikroskop.
Obs: Protokollet kan pausas här. - Efter imaging, lagra bilder på-20 ° C i mörker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi använde PLA analysen för att testa samspelet mellan MST1 och MST2 i HEK-293 och iHSC. Cellerna var fast, permeabilized och färgas med olika antikroppar, följt av i situ förstärkning enligt protokollet PLA (figur 1). För att dokumentera nivån av MST1/MST2 heterodimerization, var celler fläckade av MST1 och MST2 antikroppar (figur 1A, 1 C och 1 G). Som positiv kontroll, vi använde också ERK och piggna antikroppar som förväntas finnas i närheten i celler med aktiverat ERK (figur 1B och 1F). Celler som saknar MST1 och MST2 visar ingen PLA signal (figur 1 c). Celler som färgas med endast en av de två antikropparna visar jämväl ingen PLA signal (figur 1 g). Dessa resultat tyder på att HEK-293 och iHSC celler innehåller MST1/MST2 heterodimerer, överensstämmer med tidigare fynd från våra laboratorium4. Som en ytterligare negativ kontroll inkuberas vi celler med ERK och MST2 primära antikroppar att Visa specificitet av signaler (figur 1 d och 1 H).
För att bekräfta nivåer av MST1 och MST2 uttryck, extrakt från WT och MST1/MST2 knockout HEK-293 celler, analyserades respektive av immunoblot med de angivna antikropparna (figur 1I).
Figur 1 : Representant PLA data. (A-H) Cellerna var fixeras och färgas med angivna antikropparna följt av förfarandet för PLA. Blå: DAPI, röd: PLA signal. Mikrofotografier erhölls med Leica SP5 confocal Mikroskop. (I) Immunoblot för MST1 och MST2. Skalstapeln är 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi fann det lämpligt att använda kammaren objektglas för detta experiment, som det är mycket bekvämt att utföra experimentet med flera (14-16)-cellinjer och det finns ingen anledning att ändra urvalet varje gång under mikroskopi analys. Några komplikationer kan uppstå, till exempel en ökad risk för korskontaminering med antikroppar. Därför föreslår vi att tvätta varje brunn individuellt istället för att använda en Coplin-burk, trots ökad varaktighet av experimentet. Dessutom, borttagning av silikon infoga är en delikat affär och måste göras med omsorg och tålamod. Även med minutiös teknik är det ibland möjligt att se små mängder silikon skräp efter borttagning skäret. Därför man måste ta bort silikon skäret noggrant, med ett rakblad vid behov som alltför unremoved silikon kan förändra confocal avståndet under mikroskopi. Det kan också vara användbart för att rita linjer som gränser av brunnar efter bort silicon skäret för att hitta celler under mikroskop.
Det är absolut nödvändigt att använda icke-cross reaktiva primära antikroppar att var och en känner igen endast en medlem av heterodimer (t.ex. MST1 antikroppar bör inte också känner igen MST2 och vice versa). Dessutom är det viktigt att komma ihåg att använda olika tips för att undvika korskontaminering av primära antikroppar och PLA sonder, Undvik att vidröra botten av brunnen och undvika pipettering direkt över prover. Vi hittade att det är bättre att pälsen avdelningen bilder med 0,01% poly-L-lysin lösning för iHSC, och för HEK-293 är det bättre att kappa med mus 10 µg/mL laminin.
Som med alla ingrepp, finns det vissa begränsningar med denna metod. PLA analysen, begränsas medan en kraftfull metod för alla skäl som anges ovan, av den specificitet och känslighet av antikroppar. Dessutom bör antikropp koncentrationer och cell odlingsbetingelser vara noggrant lyhörd innan laboratorieexperiment inrättas för att minska kostnaderna för analyserna. Härvid är ett alternativ till att minska kostnaderna för analyserna att använda obestruket 35 mm glasbotten maträtt istället för kammaren diabilder.
En fördel med analysen är att intensiteten och antal fluorescerande prickar kan kvantifieras med hjälp av olika dator-program såsom programvaran Blob-finder, Duolink bild redskap och th bolagen Olink Bioscience.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi tackar hela Chernoff laboratoriet för bidrar till optimering och validering av detta protokoll, särskilt Maria Radu och Galina Semenova. Vi tackar också Andrey Efimov Cell Imaging anläggningen vid Fox Chase Cancer Center. Detta arbete stöds av ett bidrag från NIH (R01 CA148805) till JC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
References
- Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
- Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation. Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
- Rawat, S. J., et al. H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization. Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).
- Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain. Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).
- Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome. Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).
- Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
- Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
