巨大的纤毛, Stentor 斑, 是一个优秀的系统来研究再生和伤口愈合。我们提出了从单细胞或细胞片段中建立Stentor细胞培养的程序, 通过切割细胞诱导再生, 化学诱导 membranellar 带的再生和口腔器具, 影像学和细胞分析再生。
细胞需要能够再生他们的部分, 以恢复从外部扰动。单细胞纤毛Stentor 斑是研究创面愈合和后续细胞再生的优良模型生物。Stentor基因组最近获得了, 以及现代分子生物学方法, 如 rna 干扰。这些工具使得在分子水平上研究单细胞再生成为可能。该协议的第一部分包括从单个细胞或细胞片段中建立Stentor细胞文化, 以及维护Stentor文化的一般准则。大量培养Stentor允许使用有价值的工具, 如生物化学、测序和质谱。该协议的后续部分涵盖了诱导Stentor再生的不同方法。用玻璃针手工切割细胞可以研究大细胞部分的再生, 而用蔗糖或尿素处理细胞则允许研究位于细胞前端的特定结构的再生。给出了一种成像个体再生细胞的方法, 以及分期和分析再生动力学的一个专栏。再生的整个过程在三阶段被划分。通过对细胞的发育过程的动态可视化, 证明了再生时间的异质性。
细胞不是简单的酶袋, 而是高度复杂的机器, 其组件被仔细地缩放到正确的尺寸, 并安排在定义良好的位置。单个细胞的形态发生是细胞和发育生物学的关键过程, 但其分子机制未知1、2。虽然一些培养的细胞类似斑点, 单细胞有机体可以有极其复杂的结构, 以纤毛虫3,4所见的复杂皮层模式为例。
也许一个高度结构化细胞的最极端的例子是Stentor 斑, 一个巨大 heterotrichous 纤毛远亲与嗜和草履虫相关。Stentor是1毫米长, 覆盖着超过100条纵向条纹的蓝色颜料交替与行纤毛组织由平行栈的微管丝带, 运行长度的整个细胞。细胞是喇叭状 (图 1), 与 membranellar 带和口腔设备 (OA) 在其前端, 和一个霍尔德法斯特, 将细胞附着在基底上的后端。除了明显的前后极性, 细胞也显示了一个独特的手性模式, 这样, 睫状行之间的间距逐渐增加顺时针方向。这就导致了一个不连续的地方, 最窄的行满足最宽的行, 而这个区域的细胞表面, 称为条纹对比的轨迹, 可以诱导形成第二套前端结构时, 移植到另一个细胞5,使它正式等同于 Spemann 的组织者。因此, 发育生物学的所有关键过程都有类似的Stentor: axiation、模式形成和诱导。在胚胎中, 这些过程是由不同细胞之间的命运差异驱动的, 但在Stentor中, 它们必须由单个细胞内不同区域之间的命运差异驱动。定义Stentor内各区域之间的差异是一个谜。
如果Stentor的任何一部分被切断, 细胞中缺失的部分就可以再生, 在几个小时内产生正常细胞。如果一个细胞被切成两半, 甚至更小的片断, 每个片断重组成一个正常的, 但更小的细胞, 并恢复适当比例之间的细胞部分6,7。即使是微小的碎片 , 1/64 大小的原始细胞, 能够再生成一个小的, 但正常比例的细胞, 然后增长到全尺寸6。Stentor因此提供了一个独特的机会, 研究的机制, 细胞的大小和生长调节使用的外科方法, 通常适用于组织或整个有机体的水平。
Stentor的特性之一, 允许它从广泛的外科手术中再生是它包含一个单一的结节样线粒体 (图 1) 与大约5万拷贝整个基因组8。只要单元格片段包含至少一个 macronuclear 节点, 它就有能力完全再生。Stentor再生能力的另一个属性是它巨大的创伤愈合能力。虽然许多细胞类型能够愈合他们的伤口9, Stentor能够恢复从一个特殊的范围内的物理扰动。Stentor从剧烈扰动中恢复的一个例子, 以及Stentor10中细胞质流动的可视化方法。这些方法允许研究创伤和随后的再生如何影响细胞质的物理状态。
Stentor的巨大体积, 非凡的再生能力, 以及它体现了许多多细胞胚胎 (如组织者, axiation 和模式) 的发展现象, 吸引了许多发展生物学家在上个世纪的转折, 包括托马斯狩猎摩根7年。在50和60的过程中, 显微外科方法显示了一个惊人的阵列的再生和形态发生过程在这个单细胞生物11。然而, Stentor已经发展成为一个分子生物学模型系统, 只是最近。在过去的几年中, Stentor基因组的序列和组装8, 并提出了扰乱基因表达的方法, 利用 rna 干扰的喂养被开发12。
Stentor被发展成一个现代分子生物学模型有机体的原因之一是, 由于其长的细胞周期 (3 到5天), 生长大的文化是困难的。然而, 现代基因组和蛋白质蛋白方法要求的材料比以前少, 而且单个Stentor细胞的体积足够用于这些方法, 即使不诉诸超灵敏的方法来分析单个比Stentor小得多的细胞。协议1节详细介绍了从单个Stentor单元格中建立大型区域性的过程。同样的方法可以用来建立一个大的文化从细胞片段获得通过切割细胞。1节还提供了长期保持健康Stentor文化的指导方针。《议定书》2节提供了通过用玻璃针手工切割细胞来诱导细胞再生的方法。《议定书》3节专门讨论两种诱导特定细胞结构再生的方法 (membranellar 带和口服器械): 用蔗糖或尿素治疗细胞导致这些结构脱落, 其次是其再生。《议定书》4节详细介绍了在很长一段时间内对个体再生细胞进行成像的方法。第4节结束与再生阶段的描述和提示的再生动力学分析。
培养Stentor提出了许多挑战。首先, 要进行需要大量细胞的实验, 你需要维持大量的Stentor文化, 因为当Stentor浓度超过20细胞/毫升时, 它们的培养会变得不健康。第二, 可以污染Stentor文化的有机体往往比Stentor的分裂更快, 压倒了文化 (一种常见的污染物是轮虫)。因此, 有必要定期检查显微镜下的培养物, 去除污染物。有时, 需要从被污染的文化中手动解救出来的少量细胞开始新的文化。这增加了维持健康Stentor文化所需的时间。第三, 将单个细胞扩展到400毫升培养中需要至少一个月, 因为Stentor细胞周期为 3-5 天。第四, 不像其他模型纤毛虫, Stentor很少进入囊肿形式, 他们不能被冻结。
培养Stentor的一个重要方面是选择合适的食物有机体。以前描述了各种培养Stentor的方法。其中一个建议使用脱脂牛奶培养细菌, 然后喂养Stentor。这种技术在培养Stentor中是有效的;然而, 基因组技术的应用需要纯样本来避免从未定义的食物有机体中的基因组读数引起的混淆。使用目前的协议, Stentor可以生长在质量和, 因为他们的食物,衣藻, 已经排序, 存在的基因组污染的食物有机体可以检测和控制。由于未知的原因, 鞑靼人不得不补充他的股票, 回到他发现Stentor之前。通过目前的协议, 我们已经能够保持Stentor多年。
Stentor的再生实验一般都很简单, 但是有一些关键的细节要记住。关于2节, 切割Stentor细胞的一半可以掌握在几分钟内。掌握更先进的显微外科手术Stentor可能需要一周的练习。当执行蔗糖或尿素治疗 (第3节), 如果在成像开始大部分细胞仍然有他们的 membranellar 带, 增加孵化时间 10-三十年代, 当蔗糖治疗下一步执行。不要增加蔗糖治疗的时间超过3分钟孵化, 因为它会导致细胞死亡。
Stentor再生的影像学需要在长时间内对大细胞进行成像。4节详述的成像方法只能与直立显微镜一起使用。如果相反的显微镜是可用的, 那么细胞可以放在一个幻灯片或盖玻片在小室。一种方法是用石油果冻制造出一个腔室, 并盖上另一盖玻片以防止蒸发。另外, 单个单元格的腔室可以通过在 1 x 1 厘米2平方的硅间隔 (材料表)上制造一个孔, 并在一个盖玻片上放置间隔, 将单元格置于腔内, 并覆盖了另一个盖玻片室。当成像时, 如果Stentor不正确的方向来观察每一个再生阶段的特征特征, 则要牢牢地敲击板材使细胞收缩。观察细胞扩展以确定再生阶段 (完全延长需要大约四十五年代)。如果单元格仍处于错误的方向, 请重复敲击。图 1和图 6所示的图像由立体声变焦显微镜拍摄;然而, 所有的实验细节都可以使用5X 解剖立体显微镜进行。
除了培养和成像Stentor的另一个挑战是更新的跟踪, 特别是确定阶段所需的时间。如果再生细胞是完全地面向与口头普利摩顿的区域清楚地看见, 阶段的证明需要几秒钟。然而, 有时, Stentor细胞是在一个方向, 以防止明确分配的再生阶段, 从而花更多的时间来识别。培养个体再生细胞所需的大量时间可能会延缓所有再生细胞的量化, 从而降低分期的时间精度, 并要求观察者在移动到一个新的方向。因此, 这个实验既是时间又是劳动密集型的。基于这些原因, 很有必要开发自动检测Stentor细胞的方法, 并在视频显微数据中指定再生阶段。这些也将允许更多的重现性实验, 增加样本量, 并消除人类的偏见。
高度敏感的基因组和蛋白质学方法的出现已经开始将单个细胞的研究达到目的。对于这种单细胞分析, Stentor细胞的巨大大小使得它成为概念验证实验的理想测试对象。为了使这些实验成为可能, 培养Stentor是根本的, 因此这里所描述的方法应该在进一步发展更先进的单细胞技术方面发挥作用。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到 NIH 赠款 R01 GM113602 (WFM) 和 NSF 1144247 (AL) 的支持。我们承认马克 Slabodnick 和娜塔莉柯克兰开发的一些协议的初始版本和信息讨论。我们感谢卡丽娜 Perlaza 和格雷松刘易斯对手稿的批判性阅读。
Stentor coeruleus live culture | Carolina Biological Supply | 131598 | |
Chlamydomonas reinhardtii on agar | Carolina Biological Supply | 152040 | |
Pasteurized springwater, 1-quart bottle | Carolina Biological Supply | 132458 | |
Methyl cellulose, 1500 cP | Millipore Sigma | M0387 | |
Pyrex glass spot plate | Fisher Scientific | 13748B | |
Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL | Carolina Biological Supply | 715740 | |
2-cup glass container with glass lid | Pyrex | 1095600 | |
CultureWell silicone sheet material | Grace Bio Labs | 664475 | |
Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 | |
Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
Cover Glass | Fisher finest | 12-548-B | |
TAP Growth Media, optimized for Chlamydomonas culture | ThermoFisher | A1379801 | |
Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio Labs | 664475 | |
Petrolatum, Petroleum Jelly, White | Spectrum | P1037 | |
Borosilicate glass capillary tubes. OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm. |
Sutter Instrument | B120-90-10 | |
Needle puller P-87 | Sutter Instrument | ||
Stemi 2000 stereo microscope | Zeiss | ||
Axiozoom V16, stereo zoom microscope | Zeiss |