Den gigantiske randhårede, Stentor coeruleus, er et fremragende system til at studere regenerering og sårheling. Vi præsenterer procedurer for oprettelse af Stentor cellekulturer fra enkelt celler eller celle fragmenter, inducerende regenerering af skæring celler, kemisk inducerende regenerering af membranellar band og oral apparater, billedbehandling og analyse af celle regenerering.
Cellerne behøver for at kunne regenerere deres dele til at inddrive fra eksterne forstyrrelser. Den encellede randhårede Stentor coeruleus er en fremragende model organisme at studere sårheling og efterfølgende celle regenerering. Stentor genom blev tilgængelig for nylig, sammen med moderne molekylærbiologiske metoder, såsom RNAi. Disse værktøjer gør det muligt at studere enkelt celle regenerering på molekylært niveau. Den første del af protokollen omfatter etablering af Stentor cellekulturer fra enkelt celler eller celle fragmenter, sammen med generelle retningslinjer for at opretholde Stentor kulturer. Dyrkning Stentor i store mængder giver mulighed for brug af værdifulde værktøjer som biokemi, sekventering og massespektrometri. Efterfølgende afsnit af protokollen dække forskellige tilgange til at inducere regenerering i Stentor. Manuelt skære celler med en glas nål giver mulighed for at studere regenerering af store celle dele, mens behandling af celler med enten saccharose eller urea giver mulighed for at studere regenerering af specifikke strukturer placeret i den forreste ende af cellen. En metode til billedbehandling individuelle regenererende celler tilbydes sammen med en rubrik for iscenesættelse og analysere dynamikken i regenerering. Hele processen med regenerering er opdelt i tre faser. Ved at visualisere dynamikken i progression af en population af celler gennem faser, godtgøres heterogenitet i regenerering timing.
Celler er ikke simpel poser af enzymer, men temmelig meget komplekse maskiner hvis komponenterne er omhyggeligt skaleret til den korrekte størrelse og arrangeret i veldefinerede stillinger. Morfogenese af individuelle celler repræsenterer en vigtig proces i celle og udviklingsmæssige biologi, men dens molekylære mekanisme er ukendt1,2. Mens nogle kulturperler celler ligner klatter, kan encellede organismer have ekstremt kompliceret arkitekturer, eksemplificeret ved de komplekse kortikale mønstre set i infusionsdyr3,4.
Måske er det mest ekstreme eksempel på en meget struktureret celle Stentor coeruleus, en kæmpe heterotrichous randhårede fjernt beslægtede Tetrahymena og Paramecium. Stentor er 1 mm lange og er dækket med mere end 100 langsgående striber i blå pigment skiftevis med rækker af cilier arrangeret af parallelle stakke af mikrotubulus bånd, der kører længden af hele cellen. Cellen er trompet-formet (figur 1), med et membranellar band og en oral apparater (OA) på sin forreste ende, og en holdfast, der tillægger substrat i den bageste ende af cellen. Ud over klare anterior-posterior polaritet viser cellen også en karakteristisk chiral mønstre, således at afstanden mellem ciliaere rækker gradvist øges i urets retning. Dette resulterer i en diskontinuitet, hvor den smalleste række møder den bredeste række, og denne region af cellens overflade, kendt som hjemsted for stribe kontrast, kan inducere dannelse af det andet sæt af forreste ende strukturer når podet på en anden celle5, gør det formelt svarende til Spemann’s Organizer. Alle centrale processer af udviklingsmæssige biologi har således deres analoger i Stentor: axiation, mønster dannelse og induktion. I et embryon, disse processer er drevet af skæbne forskelle mellem forskellige celler, men i Stentor, de skal være drevet af skæbne forskelle mellem forskellige regioner inden for en enkelt celle. Hvad definerer forskellene mellem regionerne inden for Stentor er et mysterium.
Hvis nogen del af Stentor er afskåret, kan den manglende brik i cellen regenerere for at give en normal celle i løbet af få timer. Hvis en celle er skåret i halve, eller selv i meget små stykker, hvert stykke reorganiserer i en normal udseende, men mindre celle og gendanner korrekt proportionalitet mellem celle dele6,7. Selv små fragmenter, 1/64th størrelsen af den oprindelige celle, er i stand til at regenerere i en lille, men normalt velproportioneret celle, og derefter vokse til fuld størrelse6. Stentor præsenterer således en enestående mulighed for at studere mekanismerne af organelle størrelse skalering og celle vækst forordning ved hjælp af kirurgiske metoder, der anvendes som regel på niveauet af væv eller hele organismer.
En af egenskaberne for Stentor der gør det muligt at regenerere fra en lang række kirurgiske indgreb er, at det indeholder en enkelt nodulated macronucleus (figur 1) med ca. 50.000 eksemplarer af hele genom8. Så længe en celle fragment indeholder mindst én macronuclear node, har det evnen til at regenerere fuldt ud. En anden ejendom underliggende Stentorregeneration evne er uhyre sårheling evne. Selv om mange celletyper er i stand til at healing deres sår9, er Stentor stand til at inddrive fra en usædvanlig række fysiske forstyrrelser. Et eksempel på Stentor inddrivelse fra en drastisk undertrykkelse af netbårne, sammen med metoder til at visualisere cytoplasmatisk flow i Stentor10 blev tidligere rapporteret. Disse metoder giver mulighed for undersøgelse af hvordan såret og efterfølgende regenerering påvirker den fysiske tilstand af cytoplasma.
Stentorenorme størrelse, ekstraordinære regeneration evne, og det faktum, at det manifesterer sig mange af de udviklingsmæssige fænomener set i flercellede embryoner (som arrangører, axiation og mønstre) tiltrak mange udviklingsmæssige biologer under Drej af det sidste århundrede, herunder Thomas Hunt Morgan7. I løbet af 50 ‘s og 60 ‘s viste microsurgical metoder en overraskende vifte af regenerativ og morfogenetiske processer i denne encellet organisme11. Men, Stentor er blevet udviklet som en molekylær biologi modelsystem for nylig. I løbet af de sidste mange år, Stentor genom blev sekventeret og samlet8, og metoden til at forurolige genekspression ved hjælp af RNAi af fodring var udviklede12.
En af grundene til at Stentor blev udviklet i en model organisme for moderne Molekylærbiologi kun for nylig var vanskeligheden ved voksende store kulturer på grund af sin lange celle cyklus (3 til 5 dage). Men moderne genomisk og proteom metoder kræver mindre materiale end de plejede, og omfanget af en enkelt Stentor celle er tilstrækkelig til disse metoder, selv uden at ty til ultrasensitive metoder, der er blevet udviklet til analyse af single celler, der er meget mindre end Stentor. § 1 i protokollen detaljer proceduren for etablering af en stor kultur fra et enkelt Stentor celle. Den samme tilgang kan bruges til at etablere en stor kultur fra en celle fragment opnået ved at skære en celle. Afdeling 1 giver også retningslinjerne for at opretholde sunde Stentor kulturer over lange perioder. Afsnit 2 i protokollen giver metoden for at fremkalde celle regenerering ved at skære cellerne manuelt med et glas nål. Afsnit 3 i protokollen er dedikeret til to metoder af inducerende regenerering af specifikke cellestrukturer (membranellar band og oral apparater): behandling af celler med enten saccharose eller urea fører til afgivelse af disse strukturer, efterfulgt af deres regenerering. Afsnit 4 i protokollen beskriver en metode til billeddannelse af enkelte regenererende celler over lange perioder. Afsnit 4 ender med beskrivelse af faser af regenerering og tips om analyse af regenerering dynamics.
Dyrkning Stentor præsenterer en række udfordringer. Først, for at udføre eksperimenter, der kræver store mængder af celler, er man nødt til at opretholde et stort antal Stentor kulturer, som kulturer blive usund når Stentor koncentration overstiger 20 celler/mL. For det andet de organismer, der kan forurene Stentor kulturer ofte opdele hurtigere end Stentor og overvælde kultur (en fælles forurenende er hjuldyr). Det er således nødvendigt at inspicere kultur under et mikroskop med jævne mellemrum og fjerne de forurenende stoffer. Lejlighedsvis, skal en ny kultur startes fra et lille antal celler reddet manuelt fra en forurenet kultur. Dette øger den tid, der kræves for at opretholde sunde Stentor kulturer. Tredje, ekspanderende en enkelt celle til et 400 mL kultur kræver mindst en måned, fordi Stentor cellecyklus er 3-5 dage. Fjerde, i modsætning til andre model infusionsdyr, Stentor sjældent gå ind cyste form og de kan ikke fryses.
Et vigtigt aspekt af dyrkning Stentor er udvælgelsen af en passende mad organisme. Forskellige metoder til dyrkning Stentor var tidligere beskrevet. En af dem foreslår for at bruge skummetmælk til kultur bakterier, som derefter fodre Stentor. En sådan teknik er effektiv i dyrkning Stentor; anvendelse af genomisk teknikker kræver dog ren prøver at undgå forvirring som følge af genomisk læsninger fra udefineret mad organismer. Ved hjælp af den aktuelle protokol Stentor kan dyrkes i massen og, fordi deres mad, Chlamydomonas, er blevet sekventeret, tilstedeværelsen af genomisk forurening fra mad organisme kan registreres og kontrolleres. Af ukendte årsager havde tandsten at genopbygge hans aktier ved at vende tilbage til hvor han fandt Stentor før. Med den nuværende protokol har vi kunnet holde Stentor i år.
Regenerering eksperimenter med Stentor er generelt ligetil, men der er et par vigtige oplysninger at huske. Med hensyn til afsnit 2, skære Stentor celler i halvdelen kan håndteres i minutter. Mastering mere avancerede mikrokirurgi procedurer af Stentor kan kræve en uge i praksis. Mens udfører en saccharose eller urea behandling (afsnit 3), hvis i begyndelsen af imaging de fleste celler stadig har deres membranellar bands, øge inkubationstiden af 10-30 s for Hvornår saccharose behandling udføres næste. Øge ikke tidspunktet for saccharose behandling udover 3 min inkubation, fordi det vil resultere i celledød.
Imaging af Stentor kræver regenerering metoder til image store celler over lange perioder. Billedbehandling metode beskrevet i afsnit 4 kan kun bruges med en opretstående mikroskop. Hvis en inverteret mikroskop er tilgængelige i stedet, kan så cellerne placeres på et dias eller coverslip i små kamre. Én metode er at oprette en afdeling af vaseline og dække med en anden coverslip at forhindre fordampning. Alternativt, et kammer for en særskilt celle kan gøres ved at gøre et hul med en hulning i den ønskede størrelse i en 1 x 1 cm2 firkantede af silicium spacer (Table of Materials), placere spacer på en coverslip, at sætte celler i salen , og som dækker kammer med en anden coverslip. Når imaging, hvis Stentor ikke er i den korrekte orientering til at observere de karakteristiske træk ved hver fase af regenerering, tryk pladen fast for at gøre den celle kontrakt. Se cellen udvide til at identificere stadiet af regenerering (fuld udvidelse tager ca 45 s). Hvis cellen ikke er stadig i den forkerte retning, skal du gentage aflytning. Billeder vist i figur 1 og figur 6 er taget af en stereo zoom mikroskop; men alle eksperimenter detaljerede kan udføres ved hjælp af et 5 X dissekere stereo-mikroskop.
En anden udfordring udover dyrkning og imaging Stentor er sporing af regenerering, specifikt mængden af tid, der kræves til at identificere faser. Hvis cellen regenererende er perfekt orienteret med regionen i den mundtlige primordium klart synlige, tager identifikation af fase et par sekunder. Nogle gange, men er Stentor celle i en orientering forhindre klar tildeling af regenerering fase, således at tage mere tid til at identificere. Den betydelig mængde af tid, der kræves til fase individuelle regenererende celler kan forsinke kvantificering af alle regenererende celler, derfor faldende de tidsmæssige præcision iscenesættelse og kræver observatør til at vente og re-billed cellen efter den er flyttet til en ny orientering. Dette eksperiment er derfor både tid og arbejdskraft intensiv. Af disse grunde ville det være ønskeligt at udvikle automatiserede metoder til at opdage Stentor celler og tildele stadier af regenerering i video mikroskopi data. Disse vil også give mulighed for mere reproducerbare eksperimenter, øger i prøvestørrelse, og fjernelse af menneskelige bias.
Fremkomsten af meget følsomme genomisk og proteom metoder er begyndt at sætte undersøgelser af enkelt celler i reach. For sådanne én celle analyser gør den gigantiske størrelse af en Stentor celle det et ønskeligt testpersonen til proof of concept eksperimenter. For sådanne forsøg skal være muligt, dyrkning Stentor er grundlæggende, og så de metoder, der beskrives her bør spille en rolle i yderligere udvikling af mere avancerede teknikker, én celle.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH grant R01 GM113602 (WFM) og NSF 1144247 (AL). Vi anerkender Mark Slabodnick og Natalie Kirkland for udvikling af de oprindelige versioner af nogle af disse protokoller og oplysende diskussioner. Vi takker Karina Perlaza og Greyson Lewis for kritisk læsning af manuskriptet.
Stentor coeruleus live culture | Carolina Biological Supply | 131598 | |
Chlamydomonas reinhardtii on agar | Carolina Biological Supply | 152040 | |
Pasteurized springwater, 1-quart bottle | Carolina Biological Supply | 132458 | |
Methyl cellulose, 1500 cP | Millipore Sigma | M0387 | |
Pyrex glass spot plate | Fisher Scientific | 13748B | |
Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL | Carolina Biological Supply | 715740 | |
2-cup glass container with glass lid | Pyrex | 1095600 | |
CultureWell silicone sheet material | Grace Bio Labs | 664475 | |
Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 | |
Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
Cover Glass | Fisher finest | 12-548-B | |
TAP Growth Media, optimized for Chlamydomonas culture | ThermoFisher | A1379801 | |
Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio Labs | 664475 | |
Petrolatum, Petroleum Jelly, White | Spectrum | P1037 | |
Borosilicate glass capillary tubes. OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm. |
Sutter Instrument | B120-90-10 | |
Needle puller P-87 | Sutter Instrument | ||
Stemi 2000 stereo microscope | Zeiss | ||
Axiozoom V16, stereo zoom microscope | Zeiss |