Summary
Данио рерио являются естественным Vibrio cholerae принимающей и могут быть использованы для пилки и изучить весь инфекционных цикл от колонизации до передачи. Здесь мы продемонстрируем оценить V. cholerae уровни колонизации и количественно понос в данио рерио.
Abstract
Холерный вибрион наиболее известен как инфекционный агент, который вызывает человеческие заболевания холерой. За пределами человека-хозяина V. cholerae главным образом существует в водной среде, где он взаимодействует с целым рядом высших водных видов. Позвоночных рыбы известны как экологические хост и являются потенциальным V. cholerae водохранилище в природе. V. cholerae и костистых рыб данио рерио, широко известный как данио рерио, происходят из Индийского субконтинента, предлагая давно взаимодействия в водной среде. Данио рерио являются организма идеальная модель для изучения многих аспектов биологии, включая инфекционные заболевания. Данио рерио может быть легко и быстро колонизирована V. cholerae после выдержки в воде. Кишечные колонизации V. cholerae приводит к производства понос и экскрецию реплицированных V. cholerae. Эти экскретируется бактерии могут затем перейти к колонизировать новые хозяева рыбы. Здесь, мы демонстрируем как оценить V. cholerae-кишечные колонизации в данио рерио и как количественно V. cholerae-индуцированной данио рерио понос. Колонизация модель должна быть полезной для исследователей, которые обучаются ли гены интереса может быть важно для принимающих колонизации и/или окружающей среды выживания. Количественная оценка данио рерио диареи должно быть полезным для исследователей, изучения любых кишечных патогенов, которые заинтересованы в изучении данио рерио как модель системы.
Introduction
Холерный вибрион является водной, грамотрицательные бактерия, которая вызывает человеческие заболевания холерой, а также спорадических понос1,2. V. cholerae встречается в окружающей среде во многих районах земного шара, часто ассоциируется с других водных организмов. Эти связывая организмы включают планктона, массы яйца насекомых, моллюсков и позвоночных рыбы видов3,4,5,6,7. Несколько исследований изолированные V. cholerae от кишечных участки рыбы в различных географических районах7,8,9,10. Присутствие V. cholerae рыб указывает, что рыбы могут выступать в качестве экологической водохранилище. Рыбы может быть причастны также в передачи заболевания людей и географическое распространение V. cholerae штаммов6.
Чтобы лучше понять, как V. cholerae взаимодействует с рыбой, данио рерио, более известный как данио рерио, был разработан в качестве модельной системы для изучения против холерыe11. Данио рерио родным для Южной Азии, в том числе Бенгальского региона, которая считается первой водохранилище V. cholerae. До первой начала пандемии холеры в 1817, холеры не было сообщено за пределами Индии и Бангладеш. Таким образом данио рерио и V. cholerae почти наверняка связанные друг с другом над эволюционной временных масштабах, предполагая, что у рыбок данио являются V. cholerae хост в природной среды12.
Данио рерио модель V. cholerae простой для выполнения и могут быть использованы для изучения всех патогенной V. cholerae жизненного цикла. Рыбы подвергаются воздействию V. cholerae , купание в воде, которые были привиты с известным количеством V. cholerae. В течение нескольких часов происходит колонизация кишечника, следуют производство понос. Понос состоит из муцина, белки, экскретируется бактерий и других кишечного содержимого. Степень понос может быть определена количественно с помощью нескольких простых измерений13. V. cholerae , был экскретируется зараженных рыб может потом заразить наивные рыбы, завершая цикл инфекционных. Таким образом в zebrafish модель резюмирует V. cholerae болезней человека процесса12,14.
Наиболее часто используемые V. cholerae Животные модели были исторически мышей и кроликов14,,1516,17,18. Эти модели важную роль в добавление к нашему знанию V. cholerae патогенеза. Однако потому что мышей и кроликов не природные V. cholerae хостов, существуют ограничения на какие аспекты V. cholerae жизненного цикла могут быть изучены. V. cholerae колонизации мышей и кроликов обычно требуется отсутствие кишечной микробиоты или предварительной обработки с помощью антибиотиков ущерб кишечной микробиоты. Обе модели требуют затравки ввести бактерий в желудочно-кишечный тракт или хирургические манипуляции непосредственно вводить бактерии в кишечнике. Данио рерио имеют преимущество в том, что легко колонизировали взрослых рыб с нетронутыми кишечную микрофлору и инфекционный процесс происходит естественно, без каких-либо манипуляций требуется.
Настоящая работа демонстрирует использование данио рерио как модель в V. cholerae инфекции. Инфекции, рассечение, перечисление колонизации V. choleraeи количественная оценка диареи, вызванной V. cholerae будет описано12,13. Эта модель может быть полезным для ученых, заинтересованных как в процессе болезни V. cholerae , так и в V. cholerae экологического образа жизни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Уэйн государственного университета. Этот метод впервые был описан в Runft и др. 12
1. Определение уровня колонизации кишечника
Примечание: Колонизации кишечника является наиболее полезным метрики в zebrafish модель, как он может использоваться для сравнения относительной фитнес различные штаммы V. cholerae или последствия мутации или гена нокауты.
- Прививка данио рерио методом погружения
Примечание: Это означает воздействия напоминает естественный ход инфекции.- Подготовка V. cholerae
- Прививать 5 мл бульона (LB) lysogeny с изолированной V. cholerae колонии от LB пластины и проинкубируйте его при 37 ° C при встряхивании (180 об/мин) для 6-8 ч (ночь культуры).
- Прививать 25 мл свежего газобетона LB среды в коническую колбу 250 мл с 50 мкл выше ночь культуры. Инкубируйте 16 – 18 ч при 37 ° C при встряхивании (150 об/мин).
- Читайте оптическая плотность 600 Нм (600OD) 1/10 разведение ночь культуры оценить количество бактерий / мл (OD600 = 1 составляет ~ 109 кое/мл.)
- Урожай клетки центрифугированием при 6000 g 10 мин удалить СМИ с пипеткой или слить в дезинфицирующий раствор. Ресуспензируйте клетки в стерильных PBS для желаемой концентрации, как правило, от 1 x 10-7 до 1 x 1010 мл ФСБ.
Примечание: Здесь, мы ссылаемся на газобетона воды обратноосмотические, содержащие 60 мг/Л морской соли как стерильные заражения воды.
-
Прививки и инкубации
- Поместите четыре или пять данио рерио в 400 мл стакан, содержащие 200 мл стерильного инфекции воды.
- Добавьте 1 мл V. cholerae (из шага 1.1.1.4.) для получения желаемого инфекции концентрации (обычно 5 х 104 -5 x 107 кое/мл) в 200 мл воды инфекции.
- Обложка стакан с перфорированной крышкой для предотвращения рыба выскочила; в верхней части коробки кончик 200 мкл работает хорошо для этого.
- Пометить каждый стакан и поместите их в стекла передней инкубатор набор на 28 ° C в течение всего эксперимента.
-
Процедура для временной экспозиции
Примечание: Временное воздействие на V. cholerae (обычно 6 h) последующим удалением пересевать бактерий является полезным для изучения передачи и для более точного количественного определения экскретируется бактерий.- После 6 h воздействия Налейте стакан воды через ажурные собирать рыбу. Отказаться от зараженной воды в контейнер отбеливателя убить V. cholerae.
- Место снятые рыбы в стакан 200 мл стерильного инфекции воды. Разрешить рыбы плавают в этой чистой воде на 5 минут, чтобы удалить поверхности бактерии из рыбы.
- Повторите процедуру чистой (шаг 1.2.2) и место рыбы в новый стакан воды 200 мл стерильного инфекции. Сохранить рыбу в этот стакан в течение всего эксперимента.
- Подготовка V. cholerae
- Эвтаназия
- Когда эксперимент достигла требуемой конечной точки, взять образец инфекции воды (15 мл обычно достаточно) для обеспечения выделяющегося бактериальной графов и измерения понос (например, пробирного муцина, содержание белка, или OD), если требуется (раздел 2).
- Слейте оставшуюся воду через ажурные (для сбора рыбы) в отбеливатель, чтобы убить V. cholerae в воде.
- Место рыбы в стакан, содержащие инфекции воды плюс 336 мкг/мл 3-аминобензоат этиловый метансульфонат (tricaine) и инкубировать рыба в это tricaine решение для 20 мин на RT.
Примечание: Рыболовные сети были стерилизованы с раствором отбеливателя 10%.
- Рассечение
- Подготовка рыбы
- Совок рыбы из tricaine раствора с одноразовой пластиковой ложкой и поместите его на поверхность рассечения.
- Позиция рыба с его вентральной стороне перед вверх и ПИН-код его через нижнюю челюсть, с тупым концом ПИН под углом от центра тела. Другой контактный просто сместите в анус, также под углом от тела.
- Воздействия кишечного тракта
- Вентральной поверхности рыбы с ворса протрите тампоном смоченным в 70% этиловом спирте.
- Стерилизуйте беззаботными ножницы и скальпеля путем погружения их в 70% этанола и пылающий их.
- Сделайте небольшой надрез вдоль пополам в живот под кожу проникающим шкал и с помощью скальпеля. Будьте осторожны, чтобы не отрезать слишком глубоко, как желудочно-кишечного тракта расположен под кожу.
- С помощью ножниц, расширяют разрез тщательно по длине тела, резка не глубже, чем уровень кожи и избегая ануса.
- Сделайте два боковых порезов ножницами сторону голову рыбы, чтобы разрешить открытие разрез.
- Контакт кожа на каждой стороне боковые разрезы на поверхность рассечения, рыбалка булавки, от тела.
Примечание: Советы контакты были ранее стерилизована пылающий их с алкоголем.
-
Удаление кишечного тракта
Примечание: Кишечного тракта должно быть видно, как бледный, очень тонкая трубка поверх других органов.- Пламя стерилизуйте щипцы и затем использовать их для удаления всего желудочно-кишечного тракта (обычно 12-15 мм в длину). Поместите intestine в гомогенизации трубка, содержащая стеклянные бусины (см. шаги 1.4.1–1.4.2) и 1 мл раствора 1 x PBS или фунтов, на льду.
- Подготовка рыбы
- Гомогенизация
- Подготовить гомогенизации трубы заранее, проливной ~1.5 g 1 мм бисер в 2 мл трубы колпачок (заполнить их примерно на полпути) и затем стерилизовать их путем автоклавирования.
- Добавьте 1 мл стерильного LB или ПБС.
- Как только данио рерио кишечника был добавлен (шаг 1.3.3.1) трубы, винт крышки на очень плотно и закрепите труб в гомогенизатор вихря.
- Однородности выборок за 1 мин на максимальной скорости, а затем прохладной их на льду на 1 – 2 мин повторять этот цикл гомогенизации еще раз для полной гомогенизации.
Примечание: Несколько альтернативных методов для гомогенизации также будет работать.
- Количественная оценка уровня колонизации кишечника
- Подготовьте трубы (небольшие стеклянные пробирки или 1,5 мл microcentrifuge трубы) для последовательного растворения огневки, добавив 900 мкл LB или ПБС к каждой трубе. Для каждой рыбы, подготовить 5 – 6 трубок и сделать десятикратного серийных разведений кишечных огневки, добавив 100 мкл огневки первой трубки, vortexing его в смесь, а затем добавить 100 µL из первой трубки на вторую трубу.
- Повторите эту процедуру до тех пор, пока все разведения были подготовлены.
- Пластина 100 – 200 мкл каждого разведения на плиты агара LB, содержащие 100 мкг/мл стрептомицина (если используется стрептомицин резистентных штаммов) и 40 мкг/мл X-Гал (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). Инкубируйте пластины при 30 ° C для 16 – 18 ч.
- После ночи инкубации граф V. cholerae колоний на тарелках, либо с помощью автоматизированных колонии счетчика или вручную подсчета колоний; Это полезно для обозначения подсчет колоний с кончиком маркера.
- Определите кое в кишечнике рыбы путем умножения пластины счетчик на коэффициент разбавления суспензии, принимая во внимание объем, который был покрытием.
2. Измерение рыб понос
Примечание: Четыре различные метрики были использованы для оценки рыбы понос: муцина уровней воды, уровни общего экскретируется белка в воде, ОД600 воды и V. cholerae кое в воды13. Диарея, как правило, становится очевидным, визуально приблизительно в 6 ч после воздействия данио рерио V. cholerae как описано выше.
-
Определить уровни муцина
Примечание: Секрета муцина индуцируется в период колонизации V. cholerae и является хорошей мерой уровня экскреции, особенно в начале в инфекции13. Муцина assay является вариацией на микротитровальных кислоты периодической Шифф пробирного19.- Подготовьте следующие материалы: 50% (w/v) периодической кислоты раствор и 0,1% раствор кислоты периодической рабочей (10 мкл 50% акций периодической кислоты, добавляется 5 мл 7% уксусной кислоты — использовать сразу после приготовления), стандарты муцина, 96-луночных микротитровальных плиты, Шифф Реагент.
- Подготовка стандартов муцина, приостановив следующие количества муцина (от свиного желудка типа III) в буфере ацетат натрия (100 мм натрия ацетата, ЭДТА 5 мм, pH 5.5 с уксусной кислоты кристаллизированной): 400 мкг/мл, 300 мкг/мл, 200 мкг/мл, 150 мкг/мл , 100 мкг/мл, 75 мкг/мл, 50 мкг/мл, 25 мкг/мл и 10 мкг/мл.
Подготовить пластину, добавив 100 мкл заражения воды для каждой скважины, которая будет использоваться в assay следующим: пустой ПБС; муцина стандартов как описано выше, или образец воды от рыбы-инфекции. У каждого образца в трех экземплярах.
- Подготовка стандартов муцина, приостановив следующие количества муцина (от свиного желудка типа III) в буфере ацетат натрия (100 мм натрия ацетата, ЭДТА 5 мм, pH 5.5 с уксусной кислоты кристаллизированной): 400 мкг/мл, 300 мкг/мл, 200 мкг/мл, 150 мкг/мл , 100 мкг/мл, 75 мкг/мл, 50 мкг/мл, 25 мкг/мл и 10 мкг/мл.
- Добавьте 50 мкл свежие периодические кислоты 0,1% раствора каждый хорошо с многоканальные пипетки и смешайте его закупорить вверх и вниз несколько раз.
- Плотно заверните пластину в полиэтиленовой пленкой и инкубировать при 37 ° C на 1 – 1,5 ч.
- Прохладный пластины до комнатной температуры для 5 – 10 минут добавить 100 мкл раствора (Шифф 's реагент) фуксин для каждой скважины и накапайте вверх и вниз, чтобы смешать его.
- Обернуть тарелку в полиэтиленовой пленкой и инкубировать его при комнатной температуре на качающейся платформе, пока не разработал цвет; Цвет обычно развивается в течение 20 мин, читать поглощения на 560 Нм, с помощью пластины читателя.
- Участок муцина калибровочной кривой (OD560против мкг/мл муцина стандарт). Определите уровни муцина неизвестных путем выявления, где ОД560 каждого неизвестного падает на калибровочной кривой и чтения соответствующего муцина концентрации для этого значения.
- Подготовьте следующие материалы: 50% (w/v) периодической кислоты раствор и 0,1% раствор кислоты периодической рабочей (10 мкл 50% акций периодической кислоты, добавляется 5 мл 7% уксусной кислоты — использовать сразу после приготовления), стандарты муцина, 96-луночных микротитровальных плиты, Шифф Реагент.
-
Определить уровни белка
Примечание: Помимо муцина, общий уровень белков в воде являются другой прокси для уровней понос (пасмурно, жидкий стул) производства рыбы. Эта процедура использует стандартный assay Брадфорд для оценки уровня белка. Уровни белка оцениваются основе бычьим сывороточным альбумином (БСА) калибровочной кривой.- Смешайте 100 мкл одного из стандартов BSA (см. Примечание ниже) или 100 мкл воды (вода из стакан, содержащие зараженные рыбы) инфекции с 900 мкл Брэдфорд реагента assay (Реагент assay белка Пирс работает хорошо для этого) в одноразовых кювет. Инкубируйте все образцы при комнатной температуре на 2 мин.
Примечание: Следующие стандарты BSA были использованы: 1800 мкг/мл, 1000 мкг/мл, 750 мкг/мл, 500 мкг/мл, 250 мкг/мл, 125 мкг/мл, 50 мкг/мл и 25 мкг/мл. BSA стандартов разводили газобетона дистиллированной воды. - Читайте ОД660 каждого стандарта или образец их с помощью спектрофотометра.
- Сюжет, BSA калибровочной кривой (OD660против мкг/мл). Определите уровни белка неизвестных путем выявления где ОД660 каждого неизвестного падает на BSA калибровочной кривой и прочитать соответствующие муцина концентрации для этого значения.
- Смешайте 100 мкл одного из стандартов BSA (см. Примечание ниже) или 100 мкл воды (вода из стакан, содержащие зараженные рыбы) инфекции с 900 мкл Брэдфорд реагента assay (Реагент assay белка Пирс работает хорошо для этого) в одноразовых кювет. Инкубируйте все образцы при комнатной температуре на 2 мин.
-
Мера ОД600
Примечание: Наличие понос (пасмурно, жидкий стул) явно очевидно, после нескольких h и простое определение600 ОД может использоваться для количественного определения это.- Инвертируйте трубка, содержащая заражения воды несколько раз, чтобы равномерно распределить содержимое. Добавьте 1 мл пробы воды в одноразовых кювет. Используйте 1 мл стерильного инфекции воды в качестве отрицательного контроля.
- «Пустой» измерения с помощью спектрофотометра 600 нм с использованием образца отрицательного контроля. Читать каждый образец воды на 600 Нм и записывать результаты.
-
Определение экскретируется V. cholerae кое/мл после инфекции
Примечание: Одним из основных компонентов понос, производимые данио рерио экскретируется V. cholerae. Определение кое/мл может использоваться для таких целей, как оценка бактериальной репликации в желудочно-кишечном тракте рыбы и в качестве меры инфекционного дозы в экспериментах передачи. Эта мера лучше всего сделать, когда временное инфекции имело место. Если используется 24 h инфекции, то этот assay будет измерять комбинированные посевные плюс экскретируется V. cholerae.- Взять образец воды в точке желаемое время и серийно разбавить его, как описано ранее.
- Пластина серийных разведений на выборочной СМИ (LB агар, содержащие стрептомицина или другой соответствующий антибиотик или DCLS) и инкубировать их в 30 ° C в течение 24 ч.
- Подсчет колоний. Вычислить кое / мл воды, как описано на шаге 1.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
V. cholerae колонизации кишечного тракта данио рерио
Чтобы дать пример типичного колонизации уровней, мы наблюдаем, мы прививку 5 х 106 CFU штамма пандемического Эль-Тор V. cholerae N16961 в 200 мл воды в стакан, содержащий несколько рыбок данио. После 6 h инфекции рыбы были вымыты в пресной воде и переведены в стакан 200 мл воды газобетона инфекции, как описано в протоколе. 18 ч после передачи (или 24 ч после первичной инфекции), рыбы были умерщвлены, и их кишечника были доставлены для определения уровней колонизации. Приблизительно 105 – 106 V. cholerae клеток в кишечнике рыбы обычно наблюдались в 24 h послеоперационные инфекции желудочно-кишечного тракта (hpi) (рис. 1) с размером 5 х 106 посевным материалом.
Количественная оценка рыбы понос
Понос был количественно с помощью четырех простых анализов, описанных выше. Первая проба, кое о экскретируется V. cholerae, показан на рисунке 1. Серийных разведений 24 hpi воды были позолоченными подсчитать V. cholerae кое. Как правило, наблюдается относительно высокий уровень экскретируется V. cholerae ; в этом примере, примерно 105 V. cholerae мл воды были обнаружены. Неинфицированным рыбы не производят хрусталику V. cholerae (данные не показаны).
Вторая проба используется для количественного определения диарея является экскретируется муцина. Рисунок 2 показывает последствия трех различных V. cholerae инфекционных дозы на уровне муцина в воде 24 ХПИ. Более высокие дозы инфекционных соотносится с выше экскрецию муцина в воду. Как элемент управления четыре рыбы были помещены в идентичных стакан воды, но вместо V. cholerae подвеска была добавлена PBS. Управления рыбы экскретируется очень мало муцина.
Третий диарейных квантификация assay является од600 24 hpi воды. Как показано на рисунке 3, ОД600 этой воды в стакан, содержащие инфицированные V. cholerae чем в стакан, содержащий неинфицированных данио рерио данио рерио был значительно выше.
Наконец уровень общего белка были измерены в воде. Воды, содержащие зараженные рыбы содержат общего белка уровнях почти в два раза, которые замечены в воде, содержащей неинфицированных рыбы (рис. 4). Вместе эти четыре анализов иллюстрируют влияния, которое V. cholerae инфекции на данио рерио экскрецию.
Рисунок 1: Кишечные колонизации данио рерио, V. cholerae. Рыбы были инфицированы за 6 ч, а затем промывают и инкубированы для в общей сложности 24 h. В левой части рисунок иллюстрирует общее кое в кишечнике четыре рыбы (черных точек). В правой части рисунка указывает на V. cholerae кое / мл измеряется в воде 24 hpi (черные квадраты). Средства обоих наборов данных отображаются с большой горизонтальной линии и стандартное отклонение обозначаются погрешностей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: муцина пробирного. Три различные V. cholerae инфекционных дозы были использованы наряду с неинфицированным управления, как указано в x-оси. Средние значения муцина, обнаруженных в воде модифицированных периодической кислоты, пробирного Шифф (ССА) обозначаются черные полосы над каждой инфекционных дозы. Планки погрешностей указать стандартное отклонение. Звездочки показывают p < 0,05 определяется студента непарные t теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: OD600 пробирного как прокси для понос. OD600 1 мл воды из емкости, содержащие либо V. cholerae инфицированы или неинфицированных рыба была измерена. Черные полосы указывают среднее значение и погрешностей указать стандартное отклонение. Звездочки показывают p < 0,05 определяется студента непарные t теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: общий уровень белков в воде. Общий белок был оценен assay Брадфорд как описано. Черные полосы указывают средние значения и погрешностей указать стандартное отклонение. Звездочки показывают p < 0,05 определяется студента непарные t теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Данио рерио — это относительно новая модель для изучения V. cholerae , но очень перспективным для будущего открытие ранее неизвестных аспектов V. cholerae биологии и патогенез11,12,13 . Взрослый zebrafish модель имеет преимущества обеих природных V. cholerae узел, содержащий нетронутыми, Зрелые кишечную микрофлору и экологической модели. Недостатки модели являются, что два главных человека вирулентности факторов, холера токсин и coregulated токсин pilus, не требуются для данио рерио колонизации или патогенеза12. Однако, это также можно рассматривать как еще одно преимущество, что может позволить выявление Роман V. cholerae колонизации факторы и облегчить изучение других V. cholerae токсинов. Это особенно актуально для подавляющего большинства не O1/O139 «экологических» V. cholerae штаммов, большинство из которых не производят холеры токсин или токсин coregulated pilus и еще по-прежнему может вызывать заболевание20,21.
Скорее всего, возникают с помощью этой модели проблемы связаны с обильным кишечную микрофлору. Покрытий на неселективных СМИ сделает эта модель практически непригодным для использования, как это будет невозможно определить колоний V. cholerae . Даже с помощью селективного или частично селективной СМИ как LB плюс стрептомицина или DCLS, фон колоний от кишечной микробиоты будет присутствовать. Важно убедиться, что колоний, которые засчитываются bona fide V. cholerae путем латать колоний, производимые покрытий на менее селективным СМИ на очень избирательно носитель например ТХБ. Кроме того включение более селективного маркера в геном штамм интерес бы значительно упростить выявление V. cholerae от кишечных гомогенатах.
Преимуществом анализов используется для количественного определения данио рерио диарея является, что они являются простой и недорогой для выполнения13. Недостатком является, что эти анализы основном неспецифические, помимо подсчета экскретируется V. cholerae CFU непосредственно, и он может стать трудно определить, если диарея является непосредственно связано с V. cholerae патогенеза, или некоторые другие стрессор . Развитие вариации этих или других анализов для улучшения их специфичность-вероятно в будущем помощи измерения V. cholerae патогенеза в данио рерио.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Благодаря Мелодия Нили, Джон Аллен, Базель Abuaita и Донна Runft за их усилия в разработке zebrafish модель. Исследования, сообщили здесь была поддержана национального института аллергии и инфекционных заболеваний национального института здравоохранения под награду номерами R21AI095520 и R01AI127390 (для Джеффри х. Уитей). Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Shaker incubator | New Brunswick Scientific, Edison, NJ | Excella E25 | |
| Incubator | NUAIRE, Plymouth, MN | Auto Flow | |
| Spectrophotometer | Thermo, Waltham, MA | Geaesys 6 | |
| Vortex homogenizer | Minibeadbeater24 | 112011 | |
| Weighing Machine | Ohaus, Columbia, MD | Adventurer Pro | |
| Heat Stirer | Corning, Corning, NY | PC-420D | |
| Burner | |||
| automated colony counter | REVSCI | 120417B | |
| Materials | |||
| 400 ml glass beakers | Pyrex | ||
| perforated lids | Microtip holder with holes from tip box | ||
| disposable plastic spoons | Office Depot, Boca Raton, FL | D15-25-7008 | |
| Fish Tank System | Aquaneering, San Diego, CA | ||
| RO Water Purifier | Aqua FX | TK001 | |
| Fish net | Marina | ||
| fish food | Tetra fin | ||
| Brine Shrimp | Red jungle brand | O.S.I. pro 80 | |
| Styrofoam board | |||
| Pins | |||
| Scalpels | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 10000-10 | |
| Forceps | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 11223-20 | |
| Vannas scissors | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 15000-11 | |
| 2 ml screw cap tubes | Fisher Scientific, Hampton, NH | 02-681-375 | |
| 1 mm glass beads | Bio Spec | 11079110 | |
| Glass beads for spreading | Sigma, St. Louis, MO | 18406-500G | |
| Petri plate | Fisher Brand, Hampton, NH | FB0875713 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Midsci, Valley Park, MO | AVSS1700 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning Falcon, Corning, NY | 352098 | |
| Test tubes | Pyrex | 9820 | |
| Glass Pipette | Fisher Brand, Hampton, NH | 13675K | |
| Micro pipettes | Sartorius Biohit, Göttingen, Germany | m1000/m200/m20 | |
| Tips | Genesee Scientific, San Diego, CA | 24-150RS/24-412 | |
| Chemicals | |||
| Instant Ocean salts | |||
| phosphate buffered saline | VWR Life Science, Radnor, PA | K813-500ml | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma, St. Louis, MO | A5040 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | Sigma, St. Louis, MO | 10651745001 | |
| Schiff’s reagent | Sigma, St. Louis, MO | 84655-250 mL | |
| periodic acid | Fisher Scientific, Hampton, NH | 10450-60-9 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma, St. Louis, MO | M2378-100G | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific, Hampton, NH | 9046-46-8 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Reagent | Thermo, Waltham, MA | 22660 | |
| LB medium | |||
| Trypton | BD Biosciences, San Jose, CA | 211705 | |
| Teast Extract | BD Biosciences, San Jose, CA | 212750 | |
| NACL | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP358-212 | |
| Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 214010 | |
| TCBS Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 265020 | |
| DCLS Agar | Sigma, St. Louis, MO | 70135-500gm | |
| Software | |||
| Microsoft office | |||
| Prism 5 |
References
- Harris, J. B., LaRocque, R. C., Qadri, F., Ryan, E. T., Calderwood, S. B. Cholera. The Lancet. 379 (9835), 2466-2476 (2012).
- Dutta, D., et al. Vibrio cholerae non-O1, non-O139 serogroups and cholera-like diarrhea, Kolkata, India. Emerging Infectious Diseases. 19 (3), 464-467 (2013).
- Huq, A., et al. Ecological relationships between Vibrio cholerae and planktonic crustacean copepods. Applied and Environmental Microbiology. 45 (1), 275-283 (1983).
- Halpern, M., Landsberg, O., Raats, D., Rosenberg, E. Culturable and VBNC Vibrio cholerae: interactions with chironomid egg masses and their bacterial population. Microbial Ecology. 53 (2), 285-293 (2007).
- Broza, M., Halpern, M. Pathogen reservoirs. Chironomid egg masses and Vibrio cholerae. Nature. 412 (6842), 40 (2001).
- Halpern, M., Izhaki, I. Fish as hosts of Vibrio cholerae. Frontiers in Microbiology. 8 (282), (2017).
- Senderovich, Y., Izhaki, I., Halpern, M. Fish as reservoirs and vectors of Vibrio cholerae. PLoS ONE. 5 (1), e8607 (2010).
- Traore, O., et al. Occurrence of Vibrio cholerae in fish and water from a reservoir and a neighboring channel in Ouagadougou, Burkina Faso. The Journal of Infection in Developing Countries. 8 (10), 1334-1338 (2014).
- Booth, L. V., Lang, D. A., Athersuch, R. Isolation of Vibrio cholerae non-01 from a Somerset farmworker and his tropical fish tank. Journal of Infection. 20 (1), 55-57 (1990).
- Torres-Vitela, M. A., et al. Incidence of Vibrio cholerae in fresh fish and ceviche in Guadalajara, Mexico. Journal of Food Protection. 60 (3), 237-241 (1997).
- Rowe, H. M., Withey, J. H., Neely, M. N. Zebrafish as a model for zoonotic aquatic pathogens. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 96-107 (2014).
- Runft, D. L., et al. Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).
- Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model. Applied and Environmental Microbiology. , (2017).
- Klose, K. E. The suckling mouse model of cholera. Trends in Microbiology. 8 (4), 189-191 (2000).
- Formal, S. B., Kundel, D., Schneider, H., Kunevn,, Sprinz, H. Studies with Vibrio cholerae in the ligated loop of the rabbit intestine. British Journal of Experimental Pathology. 42, 504-510 (1961).
- Williams, E. M., Dohadwalla, A. N., Dutta, N. K. Diarrhea and accumulation of intestinal fluid in infant rabbits infected with Vibrio cholerae in an isolated jejunal segment. The Journal of Infectious Diseases. 120 (6), 645-651 (1969).
- Spira, W. M., Sack, R. B., Froehlich, J. L. Simple adult rabbit model for Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea. Infection and Immunity. 32 (2), 739-747 (1981).
- Ritchie, J. M., Rui, H., Bronson, R. T., Waldor, M. K. Back to the future: studying cholera pathogenesis using infant rabbits. mBio. 1 (1), (2010).
- Kilcoyne, M., Gerlach, J. Q., Farrell, M. P., Bhavanandan, V. P., Joshi, L. Periodic acid-Schiff's reagent assay for carbohydrates in a microtiter plate format. Analytical Biochemistry. 416 (1), 18-26 (2011).
- Balaji, V., Sridharan, G., Jesudason, M. V. Cytotoxicity of non O1, non O139 Vibrios isolated from fresh water bodies in Vellore, south India. Indian Journal of Medical Research. 110, 155-159 (1999).
- Hasan, N. A., et al. Nontoxigenic Vibrio cholerae non-O1/O139 isolate from a case of human gastroenteritis in the U.S. Gulf Coast. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 9-14 (2015).
