Summary
Zebrafisk är en naturlig Vibriocholerae värd och kan användas för att sammanfatta och studera hela smittsamma cykeln från kolonisationen till överföring. Här visar vi hur du bedöma V. cholerae colonization nivåer och kvantifiera diarré hos zebrafiskar.
Abstract
Vibriocholerae är känd som det smittämne som orsakar den mänskliga sjukdomen kolera. Utanför den mänskliga värden finns V. cholerae främst i vattenmiljön, där det interagerar med en mängd högre vattenlevande arter. Ryggradsdjur fisk är kända för att vara en miljö värd och är en potentiell V. cholerae reservoar i naturen. Både V. cholerae och de lever fiskarter Danio rerio, allmänt känd som zebrafisk, påbörjar från den indiska subkontinenten, vilket tyder på en långvarig interaktion i vattenmiljöer. Zebrafisk är en ideal modellerar organism för att studera många aspekter av biologi, inklusive infektionssjukdomar. Zebrafiskar kan vara enkelt och snabbt koloniserats av V. cholerae efter exponering i vatten. Intestinal koloniseringen av V. cholerae leder till produktion av diarré och utsöndring av replikerade V. cholerae. Dessa utsöndras bakterier kan sedan gå på att kolonisera nya fisk-värdarna. Här visar vi hur du bedöma V. cholerae-intestinal kolonisationen i zebrafiskar och hur att kvantifiera V. cholerae-inducerad zebrafiskar diarré. Colonization modellen bör vara användbart för forskare som studerar om gener av intresse kan vara viktigt för värd koloniseringen och/eller miljömässiga överlevnad. Kvantifiering av zebrafisk diarré bör vara användbar för forskare som studerar någon intestinal patogen som är intresserade av att utforska zebrafiskar som modellsystem.
Introduction
Vibriocholerae är en vattenlevande, gramnegativ bakterie som orsakar den mänskliga sjukdomen kolera liksom sporadiska diarré1,2. V. cholerae återfinns i miljön i många områden av världen, ofta i samband med andra vattenlevande organismer. Dessa förbindande organismer omfattar plankton, insekter ägg massorna, skaldjur och ryggradsdjur fisk arter3,4,5,6,7. Flera studier har isolerat V. cholerae från de intestinala skrifter av fisk i olika geografiska områden7,8,9,10. Förekomsten av V. cholerae i fisk visar att fisk kan fungera som en miljömässig reservoar. Fisk kan också vara inblandad i överföra sjukdomen till människor och i den geografiska fördelningen av V. cholerae stammar6.
För att bättre förstå hur V. cholerae samverkar med fisk, utvecklades Danio rerio, bättre känd som zebrafisk, som modellsystem för att studera V. kolerae11. Zebrafisk är infödda till södra Asien, inklusive bengaliska regionen, som tros vara den tidigaste reservoaren av V. cholerae. Före första kolera pandemin början 1817 hade kolera inte rapporterats utanför vad som nu är Indien och Bangladesh. Därför zebrafiskar och V. cholerae nästan säkert samband med varandra över evolutionära tidsskalor, tyder på att zebrafiskar är en V. cholerae värd i naturlig miljö12.
Zebrafisk modellen för V. cholerae är enkel att köra och kan användas för att studera hela patogena V. cholerae livscykel. Fisken exponeras för V. cholerae av badning i vatten som har varit inokuleras med ett känt antal av V. cholerae. Inom några timmar sker intestinal colonization, följt av produktionen av diarré. Diarré består av mucin, proteiner, utsöndrade bakterier och andra tarminnehållet. Graden av diarré kan kvantifieras med hjälp av några enkla mätningar13. V. cholerae som har varit utsöndras av infekterade fisk kan sedan gå att infektera naiva fisk, att fylla den smittsamma cykeln. Därför, zebrafisk modellen recapitulates V. cholerae mänskliga sjukdomar process12,14.
Till de vanligaste V. cholerae djurmodeller har historiskt möss och kaniner14,15,16,17,18. Dessa modeller har varit avgörande för att lägga till vår kunskap om V. cholerae patogenes. Men eftersom möss och kaniner inte är naturliga V. cholerae värdar, det finns begränsningar för vilka aspekter av V. cholerae livscykel kan studeras. V. cholerae koloniseringen av möss och kaniner kräver normalt avsaknad av tarmens bakterieflora eller en förbehandling med antibiotika till skador i tarmens bakterieflora. Båda modellerna kräver antingen sondmatning införa bakterier till mag-tarmkanalen eller kirurgisk manipulation att direkt injicera bakterierna i tarmen. Zebrafisk har en fördel i att vuxna fiskar med en intakt tarmens bakterieflora är lätt koloniserade och smittsamma processen sker naturligt utan någon manipulation som krävs.
Detta arbete visar att utnyttja zebrafiskar som modell i V. cholerae infektion. Smittan, dissektion, uppräkning av kolonisera V. choleraeoch kvantifiering av diarré orsakad av V. cholerae blir beskrivna12,13. Denna modell är sannolikt att vara till nytta för forskare som är intresserade av både sjukdomsprocessen V. cholerae och V. cholerae miljömässiga livsstil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Wayne State University. Denna metod beskrevs första gången Runft o.a. 12
1. bestämning av Intestinal Colonization nivåer
Obs: Intestinal colonization är det mest användbara måttet i zebrafisk modellen eftersom den kan användas för att jämföra olika V. cholerae stammar relativ lämplighet eller effekterna av mutationer eller gen knockouts.
- Inokulering av zebrafisk genom nedsänkning
Obs: Detta innebär exponering liknar det naturliga förloppet av infektion.- Beredning av V. cholerae
- Inokulera 5 mL lysogeny buljong (LB) med en isolerad V. cholerae koloni från en LB skylt och inkubera vid 37 ° C under skakning (180 rpm) det i 6 – 8 h (övernattning kultur).
- Inokulera 25 mL färsk Ånghärdad LB medium i en 250 mL e-kolv med 50 µL av den ovan övernattning kulturen. Inkubera det i 16 – 18 timmar vid 37 ° C under skakning (150 rpm).
- Avläs Optisk Densitet vid 600 nm (OD600) av en 1/10 utspädning av övernattning kultur att uppskatta antalet bakterier per mL (OD600 = 1 är ~ 109 CFU/mL.)
- Skörda cellerna genom centrifugering vid 6 000 g i 10 min. ta bort media med en pipett eller häll upp det i en desinficerande lösning. Att resuspendera cellerna i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning till önskad koncentration, normalt mellan 1 x 107 till 1 x 1010 per ml PBS.
Obs: Här, hänvisar vi till Ånghärdad omvänd-osmos vatten som innehåller 60 mg/L havssalt som steril infektion vatten.
-
Inympningen och inkubation
- Placera fyra eller fem zebrafiskar till en 400 mL-bägare som innehåller 200 mL steril infektion vatten.
- Tillsätt 1 mL av V. cholerae (från steg 1.1.1.4.) för att få önskad infektion koncentrationen (vanligtvis 5 x 104 till 5 x 107 CFU/mL) i 200 mL infektion vatten.
- Täck bägaren med ett perforerat lock för att förhindra fisken från att hoppa ut; toppen av en 200 µL tip låda fungerar bra för detta.
- Märk varje bägare och placera dem i en glas-front inkubator inställd på 28 ° C under hela försöket.
-
Förfarande för övergående exponering
Obs: En övergående exponering för V. cholerae (vanligtvis 6 h) följt av borttagning av inoculating bakterier är användbar för att studera överföring och för mer exakt kvantifiering av utsöndrade bakterier.- Efter 6 h exponering, Häll ut bägare vatten genom en fishnet att samla fisk. Kassera det infektera vattnet i en behållare av blekmedel att döda den V. cholerae.
- Placera den borttagna fisken i en bägare 200 ml steril infektion vatten. Låt fisken simma i denna rent vatten för 5 min att ta bort de ytan bakterierna från fisken.
- Upprepa förfarandet netto (1.2.2 steg) och placera fisken i en ny bägare 200 mL steril infektion vatten. Håll fisken i denna bägare för varaktigheten av experimentet.
- Beredning av V. cholerae
- Dödshjälp
- När experimentet har nått dess önskad slutpunkt, ta ett prov av infektionen vatten (15 mL är vanligen tillräckligt) att möjliggöra utsöndrade bakteriell räknas och mätning av diarré (t.ex. mucin assay, proteinhalten eller OD), om önskas (avsnitt 2).
- Häll ut resten av vattnet genom en Nätstrumpor (att samla fisk) i blekmedel att döda den V. cholerae i vattnet.
- Placera fisken i en bägare som innehåller infektion vatten plus 336 µg/mL etyl 3-aminobensoat methanesulfonate (tricaine) och inkubera fisken i denna tricaine lösning för 20 min på RT.
Obs: Fisknät var steriliserad med en 10% blekmedel lösning.
- Dissektion
- Beredning av fisk
- Ösa en fisk ur den tricaine lösningen med en disponibel plast sked och placera den på dissekera ytan.
- Ställning fisken med dess ventrala sidan vänd uppåt och fäst det genom underkäken, med den trubbiga änden av klämma fast vinklad från centrum av kroppen. Placera en annan pin bara posteriort anus, också vinklad från kroppen.
- Exponering av tarmkanalen
- Svabba ventrala ytan av fisken med en luddfri torka doppad i 70% etanol.
- Sterilisera en skalpell och Vännäs sax genom att doppa dem i 70% etanol och flammande dem.
- Göra ett litet snitt på längden i magen precis under huden av genomträngande skalorna och med en skalpell. Var noga med att inte skära alltför djupt, eftersom tarmkanalen ligger precis under huden.
- Med sax, förlänga snittet noga längs kroppen, skär inte djupare än huden nivå och undvika anus.
- Göra två laterala nedskärningar med saxen mot huvudet av fisken till tillåta en öppning av snittet.
- Fästa huden på varje sida av de laterala snitt att dissekera ytan, angling stiften ut, bort från kroppen.
Obs: Tips på stiften var tidigare steriliserad av flammande dem med alkohol.
-
Borttagning av tarmkanalen
Obs: Tarmkanalen bör vara synlig som en blek, mycket tunn slang ovanpå de andra organen.- Lågan-sterilisera tången och sedan använda dem för att ta bort hela tarmkanalen (normalt 12 – 15 mm i längd). Placera tarmen till en homogenisering rör innehållande glaspärlor (se steg 1.4.1–1.4.2) och 1 mL 1 x PBS eller LB, på is.
- Beredning av fisk
- Homogenisering
- Förbereda homogenisering rören i förväg genom att hälla ~1.5 g av 1 mm glaspärlor i 2 mL skruvlock rör (Fyll dem ungefär halvvägs) och sedan sterilisera dem genom autoklavering.
- Tillsätt 1 mL steril LB eller 1 x PBS.
- När zebrafiskar tarmarna har varit extra (steg 1.3.3.1) rören, skruv kapsyler på väldigt hårt, och sedan säkra rören i vortex homogenisatorn.
- Homogenisera proverna för 1 min på den högsta inställningen, sedan cool dem på is för 1 – 2 min. Upprepa denna homogenisering cykel gång för en fullständig homogenisering.
Obs: Flera alternativa metoder för homogenisering fungerar också.
- Kvantifiera intestinal colonization nivåer
- Förbereda rör (små glas provrör eller 1,5 mL mikrocentrifugrör) för seriell utspädning av Homogenatet genom att lägga 900 µL LB eller 1 x PBS till varje rör. För varje fisk, förbereda 5 – 6 rör och göra 10-faldig seriespädningar av intestinal Homogenatet genom att lägga till 100 µL av Homogenatet första röret, vortexa det till mixen, och sedan lägga till 100 µL från första röret det andra röret.
- Upprepa proceduren tills alla utspädningar har upprättats.
- Tallrik 100 – 200 µL av varje utspädning på LB agarplattor som innehåller 100 µg/mL streptomycin (om du använder Streptomycin resistenta stammar) och 40 µg/mL X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). Inkubera plattorna vid 30 ° C i 16 – 18 h.
- Efter den natten inkubationen, räkna V. cholerae kolonier på plattorna, antingen med hjälp av en automatiserad kolonin räknare eller manuellt räkning av kolonierna; Det är bra att markera de räknade kolonierna med en markör spets.
- Bestämma CFU per fisk tarmen genom att multiplicera plattspridning med utspädningsfaktorn för fjädringen, med hänsyn till volymen som var klädd.
2. mätning av fisk diarré
Obs: Fyra olika mått användes för att bedöma fisk diarré: mucin nivåerna i vattnet, de totala utsöndrade proteinnivåerna i vattnet, OD600 av vattnet, och den V. cholerae CFU i vatten13. Diarré normalt blir visuellt tydlig ungefär 6 h efter exponeringen av zebrafiskar V. cholerae som beskrivs ovan.
-
Fastställa mucin nivåer
Obs: Mucin sekretion induceras under V. cholerae koloniseringen och är ett bra mått på utsöndring nivåer, särskilt tidigt i infektion13. Mucin analysen är en variant av mikrotiter periodisk syra Schiff assay19.- Förbereda följande material: 50% (w/v) perjodsyra stamlösning och 0,1% perjodsyra arbetslösning (10 µL av 50% perjodsyra beståndet tillsätts 5 mL 7% ättiksyra — Använd omedelbart efter making), mucin standarder, 96 brunnar mikrotiter plattor, Schiff's reagens.
- Förbereda mucin standarder genom att avbryta följande belopp av mucin (från en svin magen typ III) i en natrium acetatbuffert (100 mM natrium acetat, 5mM EDTA, pH 5,5 med isättika): 400 µg/mL, 300 µg/mL, 200 µg/mL, 150 µg/mL , 100 µg/mL, 75 µg/mL, 50 µg/mL, 25 µg/mL och 10 µg/mL.
Förbereda plattan genom att lägga till 100 µL av infektion vatten till varje brunn som ska användas i analysen som följer: Tom 1 x PBS; mucin standarder som beskrivs ovan, eller ett vattenprov från fisk infektion. Göra varje prov i tre exemplar.
- Förbereda mucin standarder genom att avbryta följande belopp av mucin (från en svin magen typ III) i en natrium acetatbuffert (100 mM natrium acetat, 5mM EDTA, pH 5,5 med isättika): 400 µg/mL, 300 µg/mL, 200 µg/mL, 150 µg/mL , 100 µg/mL, 75 µg/mL, 50 µg/mL, 25 µg/mL och 10 µg/mL.
- Tillsätt 50 µL av färska 0,1% periodisk syra lösningen till varje brunn med en flerkanalspipett och blanda det genom pipettering upp och ner flera gånger.
- Linda plattan hårt i plastfolie och inkubera det vid 37 ° C i 1-1,5 h.
- Cool plattan ner till rumstemperatur i 5 – 10 min. Tillsätt 100 µL Fuchsin lösning (Schiff's reagens) till varje brunn och Pipettera upp och ner för att blanda.
- Linda in plattan i plastfolie och odla det i rumstemperatur på en gungande plattform tills färgen har utvecklat; färgen är generellt utvecklade inom 20 min. Läs absorbansen vid 560 nm med en spektrofotometer.
- Rita en mucin standardkurvan (OD560vs. µg/mL mucin standard). Bestämma mucin nivåerna av okända genom att identifiera där OD560 för varje okända faller på standardkurvan och läsa motsvarande mucin koncentrationen för det värdet.
- Förbereda följande material: 50% (w/v) perjodsyra stamlösning och 0,1% perjodsyra arbetslösning (10 µL av 50% perjodsyra beståndet tillsätts 5 mL 7% ättiksyra — Använd omedelbart efter making), mucin standarder, 96 brunnar mikrotiter plattor, Schiff's reagens.
-
Bestämma proteinnivåer
Obs: Bortsett från mucin, övergripande proteinnivåer i vattnet är en annan proxy för nivåer av diarré (molnigt, flytande avföring) producerad av fisken. Proceduren använder en standard Bradford-analysen för att uppskatta proteinnivåer. Proteinnivåer beräknas utifrån en bovint serumalbumin (BSA) standardkurva.- Blanda 100 µL av en av BSA standarderna (se not nedan) eller 100 µL av infektion vatten (från bägaren som innehåller infekterade fisken) med 900 µL av Bradford assay reagens (Pierce protein assay reagensen fungerar bra för detta) i en disponibel kyvetten. Inkubera alla prover i rumstemperatur i 2 min.
Obs: Följande BSA standarder användes: 1 800 µg/mL, 1000 µg/mL, 750 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL, 50 µg/mL och 25 µg/mL. Standarderna som BSA späddes i Ånghärdad destillerat vatten. - Läs den OD660 i varje standard eller prova dem med en spektrofotometer.
- Rita BSA standardkurvan (OD660vs µg/mL). Bestämma proteinnivåerna av okända genom att identifiera där den OD660 för varje okända faller på BSA standardkurvan och läsa motsvarande mucin koncentrationen för det värdet.
- Blanda 100 µL av en av BSA standarderna (se not nedan) eller 100 µL av infektion vatten (från bägaren som innehåller infekterade fisken) med 900 µL av Bradford assay reagens (Pierce protein assay reagensen fungerar bra för detta) i en disponibel kyvetten. Inkubera alla prover i rumstemperatur i 2 min.
-
Åtgärd OD600
Obs: Förekomsten av diarré (molnigt, flytande avföring) är synligt uppenbart efter flera h och en enkel OD600 beslutsamhet kan användas för att kvantifiera detta.- Vänd röret som innehåller infektion vattnet flera gånger att jämnt fördela innehållet. Tillsätt 1 mL vatten provet till en disponibel kyvetten. Använd 1 mL steril infektion vatten som den negativa kontrollen.
- Utföra en ”tom” mätning med spektrofotometer vid 600 nm med det negativa kontrollprovet. Läs varje vattenprov på 600 nm och registrera resultaten.
-
Bestämning av utsöndras V. cholerae CFU/mL efter infektion
Obs: En huvudkomponent i den diarré som produceras av zebrafiskar utsöndras V. cholerae. Bestämning av den CFU/mL kan användas för ändamål såsom uppskatta bakteriell replikeringen i tarmkanalen fisk och som en åtgärd av en infektiös dos i överföring experiment. Denna åtgärd görs bäst när en övergående infektion har ägt rum. Om en 24 h-infektion används, sedan mäter denna analys det kombinerade inokulatet plus den utsöndrade V. cholerae.- Ta ett vattenprov till önskad tidpunkt och seriellt spädas som tidigare beskrivits.
- Tavla de seriella utspädningarna på selektiva medier (LB agar som innehåller streptomycin eller ett annat lämpligt antibiotikum eller Dataanslutningsbibliotek) och inkubera dem vid 30 ° C under 24 h.
- Räkna kolonierna. Beräkna CFU per mL vatten som beskrivs i steg 1,5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
V. cholerae koloniseringen av zebrafisk intestinal skrifter
För att ge ett exempel på typiska colonization nivåerna vi observerar, inokuleras vi 5 x 106 CFU av EL Tor V. cholerae pandemistammen N16961 i 200 mL vatten i en bägare som innehåller flera zebrafiskar. Efter 6 h av infektion, var fisken tvättas i sötvatten och överförs till en bägare 200 ml Ånghärdad infektion vatten som beskrivs i protokollet. 18 h efter överföring (eller 24 h efter den primära infektionen), fisken var euthanized, och deras tarmar togs colonization halter. Ca 105 106 V. cholerae celler per fisk tarmen observerades normalt i tarmkanalen 24 h efter infektion (hpi) (figur 1) med 5 x 106 inokulum storlek.
Kvantifiering av fisk diarré
Diarré var kvantifieras med hjälp av de fyra enkla analyser som beskrivs ovan. Första analysen, CFU av utsöndrade V. cholerae, visas i figur 1. Seriespädningar av vatten 24 bostadsprisindexet var klädd för att räkna den V. cholerae CFU. Relativt höga nivåer av utsöndrade V. cholerae är vanligen observeras; i detta exempel, ca 105 V. cholerae per mL vatten upptäcktes. Oinfekterade fisk producerar inte spårbar V. cholerae (inga data anges).
Den andra analysen används för att kvantifiera diarré är utsöndras mucin. Figur 2 visar effekterna av tre olika V. cholerae infektiösa doser på mucin nivåer i vatten 24 hpi. En högre infektiös dos är korrelerad med en högre utsöndring av mucin i vattnet. Som en kontroll, fyra fiskar placerades i en identisk bägare med vatten, men PBS lades i stället för V. cholerae suspensionen. Kontroll fisken utsöndras mycket lite mucin.
Den tredje diarrheal kvantifiering analysen är OD600 av vatten 24 bostadsprisindexet. Som visas i figur 3, var OD600 vattnet betydligt högre i bägaren som innehåller zebrafiskar som angripits av V. cholerae än i bägaren som innehåller icke-infekterade zebrafiskar.
Slutligen uppmättes de totala proteinnivåerna i vattnet. Vatten som innehåller infekterade fisken innehöll totalt proteinnivåer nästan två gånger som observerats i vattnet som innehåller icke-infekterade fisken (figur 4). Sammantaget illustrera dessa fyra analyser de effekter V. cholerae infektion har på zebrafiskar utsöndring.
Figur 1: Intestinal koloniseringen av zebrafisk av V. cholerae. Fisken var smittad för 6 h, sedan tvättas och inkuberas i 24 h totalt. Till vänster i figuren illustrerar den totala CFU per inälvan av fyra fiskar (svarta prickar). Till höger i figuren visar den V. cholerae CFU per mL mätt i vatten 24 hpi (svarta fyrkanter.) Medel för både datamängder visas med en stor horisontell linje och standardavvikelsen indikeras av felstaplar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Mucin assay. Tre olika V. cholerae infektiösa doser användes, tillsammans med en icke-infekterade kontroll, som anges under x-axeln. Medelvärdena för de mucin som upptäckts i vattnet av den modifierade Perjodsyra Schiff (PAS) assay indikeras av de svarta fält ovanför varje infektiös dos. Felstaplar visar standardavvikelsen. Asteriskerna visar p < 0,05 som bestäms av Student är oparade t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: OD600 assay som en proxy för diarré. OD600 1 ml vatten från de bägare som innehåller antingen V. cholerae infekterade eller angripen fisk mättes. De svarta staplarna visar medelvärdet och felstaplarna visar standardavvikelsen. Asteriskerna visar p < 0,05 som bestäms av Student är oparade t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Diagram 4: totalt proteinnivåer i vatten. Det totala proteinet uppskattades av en Bradford-analysen som beskrivs. De svarta staplarna visar medelvärden och felstaplarna visar standardavvikelsen. Asteriskerna visar p < 0,05 som bestäms av Student är oparade t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafiskar är en relativt ny modell för att studera V. cholerae men rymmer mycket löfte för framtida upptäckten av tidigare okända aspekter av V. cholerae biologi och patogenes11,12,13 . Adult zebrafisk modellen har fördelar av att vara både en naturlig V. cholerae värd som innehåller intakt, Mogen tarmens bakterieflora och miljömässiga modellen. Nackdelarna med modellen är att de två stora mänskliga virulensfaktorer, kolera toxin och toxin-coregulated pilus, inte krävs för zebrafiskar Kolonisation eller patogenes12. Detta kunde dock alternativt ses som en annan fördel som kunde möjliggöra identifiering av romanen V. cholerae colonization faktorer och underlätta studiet av andra V. cholerae gifter. Detta är särskilt relevant för den stora majoriteten av icke-O1/O139 ”miljö” V. cholerae stammar, av vilka de flesta gör inte producera kolera toxin eller toxin-coregulated pilus och ännu kan fortfarande orsaka sjukdom20,21.
Problem som är mest sannolikt att uppstå med denna modell är relaterade till den rikliga tarmens bakterieflora. Plätering på icke-selektiva medier gör denna modell huvudsakligen obrukbar eftersom det blir omöjligt att identifiera V. cholerae kolonierna. Även med hjälp av selektiv eller delvis selektiv media som LB plus streptomycin eller Dataanslutningsbibliotek, kommer en bakgrund av kolonier från tarmens bakterieflora att närvara. Det är viktigt att kontrollera att kolonierna som räknas som är bona fide V. cholerae vid lapp kolonierna produceras av bordläggning på mindre selektiva medier på ett mycket selektivt medium såsom TCBS. Alternativt skulle införandet av en bättre selektiva markör i genomet hos en stam av intresse underlättar identifiering av V. cholerae från intestinal homogenates.
Fördelen med de analyser som används för att kvantifiera zebrafiskar diarré är att de är enkla och billiga att köra13. Nackdelen är att dessa analyser är till stor del ospecifik, bortsett från räknar utsöndrade V. cholerae CFU direkt, och det kan bli svårt att avgöra om diarrén är direkt på grund av V. cholerae patogenes, eller några andra stressfaktor . Utvecklingen av variationer av dessa eller andra analyser att förbättra deras specificitet kommer sannolikt stöd i framtiden mätningar av V. cholerae patogenes i zebrafiskar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Tack vare Melody Neely, Jon Allen, Basel Abuaita och Donna Runft för deras ansträngningar att hjälpa att utveckla zebrafisk modellen. Den forskning som redovisas här stöddes av det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar av det nationella Institutes of Health under award nummer R21AI095520 och R01AI127390 (till Jeffrey H. Withey). Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Shaker incubator | New Brunswick Scientific, Edison, NJ | Excella E25 | |
| Incubator | NUAIRE, Plymouth, MN | Auto Flow | |
| Spectrophotometer | Thermo, Waltham, MA | Geaesys 6 | |
| Vortex homogenizer | Minibeadbeater24 | 112011 | |
| Weighing Machine | Ohaus, Columbia, MD | Adventurer Pro | |
| Heat Stirer | Corning, Corning, NY | PC-420D | |
| Burner | |||
| automated colony counter | REVSCI | 120417B | |
| Materials | |||
| 400 ml glass beakers | Pyrex | ||
| perforated lids | Microtip holder with holes from tip box | ||
| disposable plastic spoons | Office Depot, Boca Raton, FL | D15-25-7008 | |
| Fish Tank System | Aquaneering, San Diego, CA | ||
| RO Water Purifier | Aqua FX | TK001 | |
| Fish net | Marina | ||
| fish food | Tetra fin | ||
| Brine Shrimp | Red jungle brand | O.S.I. pro 80 | |
| Styrofoam board | |||
| Pins | |||
| Scalpels | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 10000-10 | |
| Forceps | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 11223-20 | |
| Vannas scissors | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 15000-11 | |
| 2 ml screw cap tubes | Fisher Scientific, Hampton, NH | 02-681-375 | |
| 1 mm glass beads | Bio Spec | 11079110 | |
| Glass beads for spreading | Sigma, St. Louis, MO | 18406-500G | |
| Petri plate | Fisher Brand, Hampton, NH | FB0875713 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Midsci, Valley Park, MO | AVSS1700 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning Falcon, Corning, NY | 352098 | |
| Test tubes | Pyrex | 9820 | |
| Glass Pipette | Fisher Brand, Hampton, NH | 13675K | |
| Micro pipettes | Sartorius Biohit, Göttingen, Germany | m1000/m200/m20 | |
| Tips | Genesee Scientific, San Diego, CA | 24-150RS/24-412 | |
| Chemicals | |||
| Instant Ocean salts | |||
| phosphate buffered saline | VWR Life Science, Radnor, PA | K813-500ml | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma, St. Louis, MO | A5040 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | Sigma, St. Louis, MO | 10651745001 | |
| Schiff’s reagent | Sigma, St. Louis, MO | 84655-250 mL | |
| periodic acid | Fisher Scientific, Hampton, NH | 10450-60-9 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma, St. Louis, MO | M2378-100G | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific, Hampton, NH | 9046-46-8 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Reagent | Thermo, Waltham, MA | 22660 | |
| LB medium | |||
| Trypton | BD Biosciences, San Jose, CA | 211705 | |
| Teast Extract | BD Biosciences, San Jose, CA | 212750 | |
| NACL | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP358-212 | |
| Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 214010 | |
| TCBS Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 265020 | |
| DCLS Agar | Sigma, St. Louis, MO | 70135-500gm | |
| Software | |||
| Microsoft office | |||
| Prism 5 |
References
- Harris, J. B., LaRocque, R. C., Qadri, F., Ryan, E. T., Calderwood, S. B. Cholera. The Lancet. 379 (9835), 2466-2476 (2012).
- Dutta, D., et al. Vibrio cholerae non-O1, non-O139 serogroups and cholera-like diarrhea, Kolkata, India. Emerging Infectious Diseases. 19 (3), 464-467 (2013).
- Huq, A., et al. Ecological relationships between Vibrio cholerae and planktonic crustacean copepods. Applied and Environmental Microbiology. 45 (1), 275-283 (1983).
- Halpern, M., Landsberg, O., Raats, D., Rosenberg, E. Culturable and VBNC Vibrio cholerae: interactions with chironomid egg masses and their bacterial population. Microbial Ecology. 53 (2), 285-293 (2007).
- Broza, M., Halpern, M. Pathogen reservoirs. Chironomid egg masses and Vibrio cholerae. Nature. 412 (6842), 40 (2001).
- Halpern, M., Izhaki, I. Fish as hosts of Vibrio cholerae. Frontiers in Microbiology. 8 (282), (2017).
- Senderovich, Y., Izhaki, I., Halpern, M. Fish as reservoirs and vectors of Vibrio cholerae. PLoS ONE. 5 (1), e8607 (2010).
- Traore, O., et al. Occurrence of Vibrio cholerae in fish and water from a reservoir and a neighboring channel in Ouagadougou, Burkina Faso. The Journal of Infection in Developing Countries. 8 (10), 1334-1338 (2014).
- Booth, L. V., Lang, D. A., Athersuch, R. Isolation of Vibrio cholerae non-01 from a Somerset farmworker and his tropical fish tank. Journal of Infection. 20 (1), 55-57 (1990).
- Torres-Vitela, M. A., et al. Incidence of Vibrio cholerae in fresh fish and ceviche in Guadalajara, Mexico. Journal of Food Protection. 60 (3), 237-241 (1997).
- Rowe, H. M., Withey, J. H., Neely, M. N. Zebrafish as a model for zoonotic aquatic pathogens. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 96-107 (2014).
- Runft, D. L., et al. Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).
- Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model. Applied and Environmental Microbiology. , (2017).
- Klose, K. E. The suckling mouse model of cholera. Trends in Microbiology. 8 (4), 189-191 (2000).
- Formal, S. B., Kundel, D., Schneider, H., Kunevn,, Sprinz, H. Studies with Vibrio cholerae in the ligated loop of the rabbit intestine. British Journal of Experimental Pathology. 42, 504-510 (1961).
- Williams, E. M., Dohadwalla, A. N., Dutta, N. K. Diarrhea and accumulation of intestinal fluid in infant rabbits infected with Vibrio cholerae in an isolated jejunal segment. The Journal of Infectious Diseases. 120 (6), 645-651 (1969).
- Spira, W. M., Sack, R. B., Froehlich, J. L. Simple adult rabbit model for Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea. Infection and Immunity. 32 (2), 739-747 (1981).
- Ritchie, J. M., Rui, H., Bronson, R. T., Waldor, M. K. Back to the future: studying cholera pathogenesis using infant rabbits. mBio. 1 (1), (2010).
- Kilcoyne, M., Gerlach, J. Q., Farrell, M. P., Bhavanandan, V. P., Joshi, L. Periodic acid-Schiff's reagent assay for carbohydrates in a microtiter plate format. Analytical Biochemistry. 416 (1), 18-26 (2011).
- Balaji, V., Sridharan, G., Jesudason, M. V. Cytotoxicity of non O1, non O139 Vibrios isolated from fresh water bodies in Vellore, south India. Indian Journal of Medical Research. 110, 155-159 (1999).
- Hasan, N. A., et al. Nontoxigenic Vibrio cholerae non-O1/O139 isolate from a case of human gastroenteritis in the U.S. Gulf Coast. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 9-14 (2015).
