Kvantifisere Vibrio cholerae kolonisering og diaré i voksen sebrafisk modell

Summary

Sebrafisk er en naturlig Vibrio cholerae vert og kan brukes å recapitulate og studere hele smittsomme syklusen fra kolonisering overføring. Her viser vi hvordan du vurdere V. cholerae kolonisering nivåer og kvantifisere diaré i sebrafisk.

Abstract

Vibrio cholerae er best kjent som den smittsomme agenten som forårsaker menneskelig sykdom kolera. Utenfor menneskelig verten finnes V. cholerae hovedsakelig i vannmiljøet, hvor den kommuniserer med en rekke høyere dyrearter. Virveldyr fisken er kjent for å være en miljømessig vert og er en potensiell V. cholerae reservoaret i naturen. Både V. cholerae og de teleost Fiskene Danio rerio, kjent som sebrafisk, kommer fra det indiske subkontinentet, antyder en langvarig interaksjon i akvatiske miljøer. Sebrafisk er en ideell modell organisme for å studere mange aspekter av biologi, inkludert infeksjonssykdommer. Sebrafisk kan være enkelt og raskt kolonisert av V. cholerae etter eksponering i vann. Intestinal kolonisering av V. cholerae fører til produksjon av diaré og utskillelse av replikerte V. cholerae. Disse utskilles bakterier kan deretter gå på å kolonisere nye fisk verter. Her viser vi hvordan du vurdere V. cholerae-intestinal kolonisering i sebrafisk og hvordan kvantifisere V. cholerae-indusert sebrafisk diaré. Kolonisering modellen bør være nyttig for forskere som studerer om gener av interesse kan være viktig for verten kolonisering og/eller for miljømessige overlevelse. Kvantifisering av sebrafisk diaré bør være nyttig for forskere studere enhver intestinal patogen som er interessert i å utforske sebrafisk som modellsystem.

Introduction

Vibrio cholerae er en aquatic, Gram-negative bakterien som forårsaker menneskelig sykdom kolera samt sporadisk diaré^1,2. V. cholerae finnes i miljøet i mange områder av verden, ofte assosiert med andre vannlevende organismer. Organismene associating inkluderer plankton, insekt egg massene, skalldyr og virveldyr fisk arter^3,4,5,6,7. Flere studier har isolert V. cholerae fra de tarmen traktater fisk i ulike geografiske områder^7,8,9,10. Tilstedeværelsen av V. cholerae i fisk angir at fisk kan fungere som en miljømessig reservoaret. Fisken kunne også innblandet i overføring sykdom til mennesker og geografisk spredning av V. cholerae stammer⁶.

For bedre å forstå hvordan V. cholerae kommuniserer med fisk, ble Danio rerio, bedre kjent som sebrafisk, utviklet som et modellsystem for å studere V. kolerae¹¹. Sebrafisk som er innfødt til Sør-Asia, inkludert regionen Bengalbukta, som antas å være det tidligste reservoaret av V. cholerae. Før den første kolera pandemi begynnelsen i 1817, blitt kolera ikke rapportert utenfor det som nå India og Bangladesh. Derfor sebrafisk og V. cholerae nesten helt sikkert forbundet med hverandre over evolusjonær tidsskalaer, antyder at sebrafisk er en V. cholerae vert i naturen¹².

Sebrafisk modell for V. cholerae er enkel å kjøre og kan brukes til å studere hele patogene V. cholerae livssyklus. Fisk er utsatt for V. cholerae med bading i vann som har blitt inokulert med et kjent antall V. cholerae. Innen et par timer finner intestinal kolonisering sted, etterfulgt av produksjonen av diaré. Diaré består av mucin, proteiner, utskilles bakterier og andre intestinal innholdet. Graden av diaré kan kvantifiseres ved hjelp av noen enkle mål¹³. V. cholerae som har vært utskilles av infiserte fisk kan deretter gå på å infisere naive fisken, fullfører smittsomme syklusen. Derfor viser sebrafisk-modellen V. cholerae menneskelig sykdom prosess^12,14.

De mest brukte V. cholerae dyremodeller har historisk sett vært mus og kaniner^{14,15,16,17,18}. Disse modellene har vært medvirkende i å legge til vår kunnskap om V. cholerae patogenesen. Men fordi mus og kaniner ikke er naturlig V. cholerae verter, finnes begrensinger for hvilke aspekter av livssyklusen V. cholerae kan studeres. V. cholerae koloniseringen av mus og kaniner krever vanligvis fravær av tarmen bakterieflora eller en forbehandling med antibiotika for å skade på tarmen bakterieflora. Begge modeller krever enten gavage å innføre bakterier til fordyelseskanal eller kirurgisk manipulasjon å injisere direkte bakterier i tarmen. Sebrafisk ha en fordel i at voksne fisk med en intakt tarmen bakterieflora er lett kolonisert og smittsomme prosessen skjer naturlig, uten manipulasjon kreves.

Dette arbeidet demonstrerer bruken av sebrafisk som modell i V. cholerae infeksjon. Infeksjonen, disseksjon, opplisting av koloniserende V. choleraeog kvantifisering av diaré skyldes V. cholerae blir beskrevet^12,13. Denne modellen er trolig være nyttig for forskere interessert både sykdommen prosessen V. cholerae og V. cholerae miljømessige livsstil.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Wayne State University. Denne metoden ble først beskrevet i Runft et al. 12 1. fastsettelse av Intestinal kolonisering nivåer Merk: Intestinal colonization er nyttigst beregningen i sebrafisk modell som det kan brukes til å sammenligne den relative fitness av ulike V. cholerae stammer eller effekten av mutasjoner eller…

Representative Results

V. cholerae kolonisering av sebrafisk intestinal traktater For å gi et eksempel av typiske kolonisering vi observerer, inokulert vi 5 x 106 CFU for pandemisk EL Tor V. cholerae belastningen N16961 i 200 mL vann i et beaker med flere sebrafisk. Etter 6 h infeksjon, var fisken vasket i ferskvann og overført til en kanne av 200 mL autoklaveres infeksjon vann som beskrevet i protokollen. 18 h etter overf?…

Discussion

Sebrafisk er en relativt ny modell for å studere V. cholerae , men har mye løfte for fremtiden å tidligere ukjente aspekter av V. cholerae biologi og patogenesen^11,12,13 . Den voksne sebrafisk-modellen har fordelene av å være både en naturlig V. cholerae vert som inneholder intakt, modne tarmen bakterieflora og en miljømessig modell. Ulemper med modellen er at de to store menneskelige virulens f…

Materials

Instrument
Shaker incubator	New Brunswick Scientific, Edison, NJ	Excella E25
Incubator	NUAIRE, Plymouth, MN	Auto Flow
Spectrophotometer	Thermo, Waltham, MA	Geaesys 6
Vortex homogenizer	Minibeadbeater24	112011
Weighing Machine	Ohaus, Columbia, MD	Adventurer Pro
Heat Stirer	Corning, Corning, NY	PC-420D
Burner
automated colony counter	REVSCI	120417B
Materials
400 ml glass beakers	Pyrex
perforated lids	Microtip holder with holes from tip box
disposable plastic spoons	Office Depot, Boca Raton, FL	D15-25-7008
Fish Tank System	Aquaneering, San Diego, CA
RO Water Purifier	Aqua FX	TK001
Fish net	Marina
fish food	Tetra fin
Brine Shrimp	Red jungle brand	O.S.I. pro 80
Styrofoam board
Pins
Scalpels	Fine Scientific tools, Foster City, CA	10000-10
Forceps	Fine Scientific tools, Foster City, CA	11223-20
Vannas scissors	Fine Scientific tools, Foster City, CA	15000-11
2 ml screw cap tubes	Fisher Scientific, Hampton, NH	02-681-375
1 mm glass beads	Bio Spec	11079110
Glass beads for spreading	Sigma, St. Louis, MO	18406-500G
Petri plate	Fisher Brand, Hampton, NH	FB0875713
1.5 ml centrifuge tube	Midsci, Valley Park, MO	AVSS1700
50 ml centrifuge tube	Corning Falcon, Corning, NY	352098
Test tubes	Pyrex	9820
Glass Pipette	Fisher Brand, Hampton, NH	13675K
Micro pipettes	Sartorius Biohit, Göttingen, Germany	m1000/m200/m20
Tips	Genesee Scientific, San Diego, CA	24-150RS/24-412
Chemicals
Instant Ocean salts
phosphate buffered saline	VWR Life Science, Radnor, PA	K813-500ml
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma, St. Louis, MO	A5040
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside	Sigma, St. Louis, MO	10651745001
Schiff’s reagent	Sigma, St. Louis, MO	84655-250 mL
periodic acid	Fisher Scientific, Hampton, NH	10450-60-9
Mucin from porcine stomach	Sigma, St. Louis, MO	M2378-100G
Bovine serum albumin	Fisher Scientific, Hampton, NH	9046-46-8
Pierce 660nm Protein Assay Reagent	Thermo, Waltham, MA	22660
LB medium
Trypton	BD Biosciences, San Jose, CA	211705
Teast Extract	BD Biosciences, San Jose, CA	212750
NACL	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP358-212
Agar	BD Biosciences, San Jose, CA	214010
TCBS Agar	BD Biosciences, San Jose, CA	265020
DCLS Agar	Sigma, St. Louis, MO	70135-500gm
Software
Microsoft office
Prism 5