Summary
Sebrafisk er en naturlig Vibrio cholerae vert og kan brukes å recapitulate og studere hele smittsomme syklusen fra kolonisering overføring. Her viser vi hvordan du vurdere V. cholerae kolonisering nivåer og kvantifisere diaré i sebrafisk.
Abstract
Vibrio cholerae er best kjent som den smittsomme agenten som forårsaker menneskelig sykdom kolera. Utenfor menneskelig verten finnes V. cholerae hovedsakelig i vannmiljøet, hvor den kommuniserer med en rekke høyere dyrearter. Virveldyr fisken er kjent for å være en miljømessig vert og er en potensiell V. cholerae reservoaret i naturen. Både V. cholerae og de teleost Fiskene Danio rerio, kjent som sebrafisk, kommer fra det indiske subkontinentet, antyder en langvarig interaksjon i akvatiske miljøer. Sebrafisk er en ideell modell organisme for å studere mange aspekter av biologi, inkludert infeksjonssykdommer. Sebrafisk kan være enkelt og raskt kolonisert av V. cholerae etter eksponering i vann. Intestinal kolonisering av V. cholerae fører til produksjon av diaré og utskillelse av replikerte V. cholerae. Disse utskilles bakterier kan deretter gå på å kolonisere nye fisk verter. Her viser vi hvordan du vurdere V. cholerae-intestinal kolonisering i sebrafisk og hvordan kvantifisere V. cholerae-indusert sebrafisk diaré. Kolonisering modellen bør være nyttig for forskere som studerer om gener av interesse kan være viktig for verten kolonisering og/eller for miljømessige overlevelse. Kvantifisering av sebrafisk diaré bør være nyttig for forskere studere enhver intestinal patogen som er interessert i å utforske sebrafisk som modellsystem.
Introduction
Vibrio cholerae er en aquatic, Gram-negative bakterien som forårsaker menneskelig sykdom kolera samt sporadisk diaré1,2. V. cholerae finnes i miljøet i mange områder av verden, ofte assosiert med andre vannlevende organismer. Organismene associating inkluderer plankton, insekt egg massene, skalldyr og virveldyr fisk arter3,4,5,6,7. Flere studier har isolert V. cholerae fra de tarmen traktater fisk i ulike geografiske områder7,8,9,10. Tilstedeværelsen av V. cholerae i fisk angir at fisk kan fungere som en miljømessig reservoaret. Fisken kunne også innblandet i overføring sykdom til mennesker og geografisk spredning av V. cholerae stammer6.
For bedre å forstå hvordan V. cholerae kommuniserer med fisk, ble Danio rerio, bedre kjent som sebrafisk, utviklet som et modellsystem for å studere V. kolerae11. Sebrafisk som er innfødt til Sør-Asia, inkludert regionen Bengalbukta, som antas å være det tidligste reservoaret av V. cholerae. Før den første kolera pandemi begynnelsen i 1817, blitt kolera ikke rapportert utenfor det som nå India og Bangladesh. Derfor sebrafisk og V. cholerae nesten helt sikkert forbundet med hverandre over evolusjonær tidsskalaer, antyder at sebrafisk er en V. cholerae vert i naturen12.
Sebrafisk modell for V. cholerae er enkel å kjøre og kan brukes til å studere hele patogene V. cholerae livssyklus. Fisk er utsatt for V. cholerae med bading i vann som har blitt inokulert med et kjent antall V. cholerae. Innen et par timer finner intestinal kolonisering sted, etterfulgt av produksjonen av diaré. Diaré består av mucin, proteiner, utskilles bakterier og andre intestinal innholdet. Graden av diaré kan kvantifiseres ved hjelp av noen enkle mål13. V. cholerae som har vært utskilles av infiserte fisk kan deretter gå på å infisere naive fisken, fullfører smittsomme syklusen. Derfor viser sebrafisk-modellen V. cholerae menneskelig sykdom prosess12,14.
De mest brukte V. cholerae dyremodeller har historisk sett vært mus og kaniner14,15,16,17,18. Disse modellene har vært medvirkende i å legge til vår kunnskap om V. cholerae patogenesen. Men fordi mus og kaniner ikke er naturlig V. cholerae verter, finnes begrensinger for hvilke aspekter av livssyklusen V. cholerae kan studeres. V. cholerae koloniseringen av mus og kaniner krever vanligvis fravær av tarmen bakterieflora eller en forbehandling med antibiotika for å skade på tarmen bakterieflora. Begge modeller krever enten gavage å innføre bakterier til fordyelseskanal eller kirurgisk manipulasjon å injisere direkte bakterier i tarmen. Sebrafisk ha en fordel i at voksne fisk med en intakt tarmen bakterieflora er lett kolonisert og smittsomme prosessen skjer naturlig, uten manipulasjon kreves.
Dette arbeidet demonstrerer bruken av sebrafisk som modell i V. cholerae infeksjon. Infeksjonen, disseksjon, opplisting av koloniserende V. choleraeog kvantifisering av diaré skyldes V. cholerae blir beskrevet12,13. Denne modellen er trolig være nyttig for forskere interessert både sykdommen prosessen V. cholerae og V. cholerae miljømessige livsstil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Wayne State University. Denne metoden ble først beskrevet i Runft et al. 12
1. fastsettelse av Intestinal kolonisering nivåer
Merk: Intestinal colonization er nyttigst beregningen i sebrafisk modell som det kan brukes til å sammenligne den relative fitness av ulike V. cholerae stammer eller effekten av mutasjoner eller genet fortrenging.
- Vaksinasjon av sebrafisk ved nedsenkning
Merk: Dette betyr eksponering ligner den naturlige løpet av infeksjon.- Utarbeidelse av V. cholerae
- Vaksinere 5 mL av lysogeny kjøttkraft (LB) med en isolert V. cholerae colony fra en LB plate og Inkuber det på 37 ° C med skjelvende (180 rpm) for 6-8 h (overnatting kultur).
- Vaksinere 25 mL av fersk autoklaveres LB medium i en 250 mL konisk kolbe med 50 µL av over natten kultur. Inkuber det 16 til 18 h på 37 ° C med skjelvende (150 rpm).
- Avles optisk densitet på 600 nm (OD600) av en 1/10 fortynning av natten kultur å anslå hvor mange bakterier per mL (OD600 = 1 er ~ 109 CFU/mL.)
- Høste celler med sentrifugering 6000 g for 10 min. Fjern media med en pipette eller hell den av i et desinfeksjonsmiddel. Resuspend cellene i sterilt PBS til ønsket konsentrasjonen, vanligvis mellom 1 x 107 til 1 x 1010 per ml PBS.
Merk: Her, vi referere til autoklaveres omvendt osmose vann som inneholder 60 mg/L sjøsalt som sterilt infeksjon vann.
-
Inokulasjonen
- Plasser fire eller fem sebrafisk i en 400 mL kanne inneholder 200 mL steril infeksjon vann.
- Legge til 1 mL av V. cholerae (fra trinn 1.1.1.4.) for å få ønsket infeksjon konsentrasjon (vanligvis 5 x 104 til 5 x 107 CFU/mL) i 200 mL infeksjon vann.
- Dekke begeret med perforert lokk for å forhindre at fisken hopper ut; toppen av en 200 µL tips for fungerer godt for dette.
- Merk hver kanne og plassere dem i en glass-foran inkubator satt på 28 ° C for varigheten av eksperimentet.
-
Prosedyren for forbigående eksponering
Merk: En forbigående eksponering for V. cholerae (vanligvis 6 h) etterfulgt av fjerning av inoculating bakterier er nyttig for studerer overføring og mer nøyaktig kvantifiseringen utskilles bakterier.- Etter 6 h eksponering, helle ut kanne vannet gjennom en fishnet samle fisken. Kast infiserte vannet i en beholder med blekemiddel å drepe den V. cholerae.
- Legg fjernet fisken i et beaker med 200 mL steril infeksjon vann. Tillat fisken å svømme i dette rent vann på 5 min å fjerne overflaten bakterier fra fisken.
- Gjenta netto (trinn 1.2.2) og legg fisken i et nytt beaker 200 mL steril infeksjon vann. Holde fisken i denne kanne for varigheten av eksperimentet.
- Utarbeidelse av V. cholerae
- Eutanasi
- Når eksperimentet har nådd endepunktet ønsket, ta en prøve av infeksjon vann (15 mL er vanligvis tilstrekkelig) å tillate utskilles bakteriell teller og måling av diaré (for eksempel mucin analysen, proteininnhold eller OD), hvis ønsket (inndeling 2).
- Hell av resten av vannet gjennom en fishnet (å samle fisken) i blekemiddel å drepe den V. cholerae i vannet.
- Legg fisken i et beaker med infeksjon vann pluss 336 µg/mL Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaine) og Inkuber fisken i denne tricaine løsningen for 20 min på RT.
Merk: Fishnets ble sterilisert med en 10% blekemidler løsning.
- Disseksjon
- Tilberedning av fisk
- Øse en fisk ut av tricaine løsningen med en engangs plast skje og plasser den på dissecting overflaten.
- Plasser fisken ventral side vender oppover og pin gjennom underkjeven, med den butte enden av pinnen vinklet fra midten av kroppen. Plass en pin bare bakenfor anus, også vinklet fra kroppen.
- Eksponering av tarmkanalen
- Vattpinne ventrale overflaten av fisken med en lofri tørke dyppet i 70% etanol.
- Sterilisere en skalpell og Vannas saks dyppe dem i 70% etanol og flammende dem.
- Lag et lite innsnitt på langs i magen rett under huden trenge skalerer og bruker skalpell. Pass på at du ikke kutte for dypt som tarmkanalen ligger rett under huden.
- Ved hjelp av saks, utvide innsnitt nøye langs kroppen, kutte ikke er dypere enn huden og unngå anus.
- Gjøre to laterale kutt med saksen mot hodet av fisken å tillate en åpning av innsnitt.
- Feste huden på hver side av de laterale snittene til dissecting overflaten, sportsfiske pinnene ut fra kroppen.
Merk: Tips av pinnene ble tidligere sterilisert av flammende dem med alkohol.
-
Fjerning av tarmkanalen
Merk: Tarmkanalen skal vises som en blek, svært tynne rør over til andre organer.- Flamme-sterilisere tang og deretter bruke dem til å fjerne hele tarmkanalen (vanligvis 12-15 mm i lengde). Plass tarmen i en homogenisering rør som inneholder glassperler (se trinn 1.4.1–1.4.2) og 1 mL 1 x PBS eller LB, på is.
- Tilberedning av fisk
- Homogenisering
- Klargjør homogenisering rørene på forhånd ved å helle ~1.5 g 1 mm glassperler i 2 mL skrukork rør (Fyll dem omtrent halvveis) og deretter sperre av autoklavering.
- Legg 1 mL steril LB eller 1 x PBS.
- Når sebrafisk tarmen har vært lagt (trinn 1.3.3.1) til rør, skruen caps på svært tett, og sikre rør i vortex homogenizer.
- Homogenize prøvene for 1 min på den høyeste innstillingen, og kjølig dem på is 1 – 2 min. Gjenta denne homogenisering cycle igjen for en komplett homogenisering.
Merk: Flere alternative metoder for homogenisering fungerer også.
- Kvantifisere intestinal kolonisering nivåer
- Klargjør rør (liten reagensglass eller 1,5 mL microcentrifuge rør) for den serielle fortynning av homogenate ved å legge til 900 µL av LB eller 1 x PBS hver rør. For hver fisk, forberede 5 – 6 rør og gjøre 10 ganger føljetong fortynninger av intestinal homogenate ved å legge til 100 µL av homogenate første røret, vortexing den til mix, og deretter legge til 100 µL fra første tuben til andre røret.
- Gjenta dette til alle fortynninger er utarbeidet.
- Plate 100-200 µL av hver fortynning på LB agar plater som inneholder 100 µg/mL streptomycin (hvis Streptomycin resistente stammer) og 40 µg/mL X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). Inkuber platene på 30 ° C i 16 til 18 h.
- Etter den natten inkubering, telle V. cholerae kolonier på plater, bruke en automatisert kolonien teller eller manuelt teller koloniene; Det er nyttig å merke telt koloniene med markør tips.
- Bestemme CFU per fisk tarmen ved å multiplisere plate greven av fortynningsfaktoren av suspensjon, tar hensyn til volumet som var belagt.
2. måling av fisk diaré
Merk: Fire ulike beregninger ble brukt til å vurdere fisk diaré: mucin nivåene i vannet, generelle utskilles protein nivå i vannet, OD600 vannet og den V. cholerae CFU i vann13. Diaré normalt blir visuelt tydelig ca 6 h etter eksponering for sebrafisk V. cholerae som beskrevet ovenfor.
-
Bestemme mucin nivåer
Merk: Mucin sekresjon er indusert under V. cholerae kolonisering og er et godt mål på utskillelse nivåer, spesielt tidlig i infeksjon13. Mucin analysen er en variant av være ferdig innen periodiske syre Schiff analysen19.- Klargjør følgende materialer: 50% (w/v) periodiske acid lager løsning og 0,1% periodiske acid fungerende løsning (10 µL av 50% periodiske acid aksjen lagt til 5 mL av 7% eddiksyre, bruke umiddelbart etter at), mucin standarder, 96-brønnen microtiter plater, Schiff reagens.
- Forberede mucin standarder ved å stenge den følgende mengden mucin (fra en svin magen type III) i en natrium acetate buffer (100 mM natrium acetate, 5mM EDTA, pH til 5,5 med iseddik): 400 µg/mL, 300 µg/mL, 200 µg/mL, 150 µg/mL , 100 µg/mL, 75 µg/mL, 50 µg/mL, 25 µg/mL og 10 µg/mL.
Forbereder platen ved å legge til 100 µL av vann hver brønn som skal brukes i analysen som følger: Tom 1 x PBS; mucin standarder som beskrevet ovenfor, eller en vann utvalget av fisk infeksjon. Gjøre hvert utvalg i tre eksemplarer.
- Forberede mucin standarder ved å stenge den følgende mengden mucin (fra en svin magen type III) i en natrium acetate buffer (100 mM natrium acetate, 5mM EDTA, pH til 5,5 med iseddik): 400 µg/mL, 300 µg/mL, 200 µg/mL, 150 µg/mL , 100 µg/mL, 75 µg/mL, 50 µg/mL, 25 µg/mL og 10 µg/mL.
- Legge til 50 µL frisk 0,1% periodiske acid løsningen å hver godt med en flerkanals pipette og bland det av pipettering opp og ned flere ganger.
- Pakk platen tett i plastfolie og ruge det ved 37 ° C i 1-1,5 h.
- Cool platen til romtemperatur for 5 – 10 min. Tilsett 100 µL Fuchsin løsning (Schiff's reagens) hver brønn og Pipetter opp og ned for å blande den.
- Plastfolie platen i og Inkuber det ved romtemperatur på en rocking plattform til fargen har utviklet; fargen er vanligvis utviklet i 20 min. lese absorbansen på 560 nm likner en plate.
- Tegn en mucin standard kurve (OD560vs µg/mL mucin standard). Bestemme mucin nivåer av ukjente ved å identifisere hvor OD560 hver ukjent faller på standardkurven og lese tilsvarende mucin konsentrasjonen verdien.
- Klargjør følgende materialer: 50% (w/v) periodiske acid lager løsning og 0,1% periodiske acid fungerende løsning (10 µL av 50% periodiske acid aksjen lagt til 5 mL av 7% eddiksyre, bruke umiddelbart etter at), mucin standarder, 96-brønnen microtiter plater, Schiff reagens.
-
Bestemme protein nivå
Merk: Bortsett fra mucin, generell protein nivå i vannet er en annen proxy for nivåer av diaré (skyet, flytende avføring) produsert av fisken. Denne fremgangsmåten bruker en standard Bradford analysen for å anslå protein nivå. Protein nivå er beregnet basert på et storfe serum albumin (BSA) standardkurve.- Bland 100 µL av en av BSA (se merknaden nedenfor) eller 100 µL infeksjon vann (vann fra begeret inneholder infiserte fisken) med 900 µL Bradford analysen reagens (Pierce protein analysen reagensen fungerer bra for dette) i disponibel søppel. Inkuber alle prøvene i romtemperatur i 2 minutter.
Merk: Følgende BSA standarder ble brukt: 1800 µg/mL, 1000 µg/mL, 750 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL, 50 µg/mL og 25 µg/mL. BSA standardene ble utvannet i autoklaveres destillert vann. - Les OD660 hver standard eller prøve dem med et spektrofotometer.
- Tegne BSA standardkurven (OD660vs µg/mL). Bestemme protein nivåer av ukjente ved å identifisere hvor OD660 hver ukjent faller på BSA standardkurven og lese tilsvarende mucin konsentrasjonen verdien.
- Bland 100 µL av en av BSA (se merknaden nedenfor) eller 100 µL infeksjon vann (vann fra begeret inneholder infiserte fisken) med 900 µL Bradford analysen reagens (Pierce protein analysen reagensen fungerer bra for dette) i disponibel søppel. Inkuber alle prøvene i romtemperatur i 2 minutter.
-
Mål OD600
Merk: Tilstedeværelsen av diaré (skyet, flytende avføring) er tydelig tydelig etter flere h og en enkel OD600 vilje kan brukes å kvantifisere dette.- Invertere tuben inneholder infeksjon vann flere ganger å jevnt distribuere innholdet. Legge til 1 mL av den disponible søppel. Bruk 1 mL steril infeksjon vann som kontrollen negative.
- Utføre en "blank" måling ved hjelp av spektrofotometeret på 600 nm bruker negativ kontroll prøven. Lese hver vann utvalget på 600 nm og registrere resultatene.
-
Fastsettelse av utskilles V. cholerae CFU/mL etter smitte
Merk: En viktig komponent i diaré produsert av sebrafisk skilles ut V. cholerae. Fastsettelse av CFU/mL kan brukes for eksempel beregne bakteriell replikering i tarmkanalen fisk og som et mål på en smittsomme dose overføring eksperimenter. Dette tiltaket gjøres best når en forbigående infeksjon har funnet sted. Hvis en 24 h infeksjon, vil så denne analysen måle den kombinerte inoculum pluss den utskilles V. cholerae.- Ta en vannprøve på ønsket tidspunktet og serielt fortynne den som beskrevet tidligere.
- Tallerkenen de føljetong fortynninger på selektiv media (LB agar inneholder streptomycin eller et annet passende antibiotikumet eller DCLER) og ruge dem ved 30 ° C i 24 timer.
- Telle koloniene. Beregne CFU per mL vann som beskrevet i trinn 1.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
V. cholerae kolonisering av sebrafisk intestinal traktater
For å gi et eksempel av typiske kolonisering vi observerer, inokulert vi 5 x 106 CFU for pandemisk EL Tor V. cholerae belastningen N16961 i 200 mL vann i et beaker med flere sebrafisk. Etter 6 h infeksjon, var fisken vasket i ferskvann og overført til en kanne av 200 mL autoklaveres infeksjon vann som beskrevet i protokollen. 18 h etter overføring (eller 24 timer etter primær infeksjon), fisken var euthanized, og deres tarmen ble tatt å bestemme kolonisering nivåene. Ca. 105 til 106 V. cholerae celler per fisk tarmen ble vanligvis observert i tarmkanalen 24 timer etter infeksjon (hpi) (figur 1) med 5 x 106 inoculum størrelse.
Kvantifisering av fisk diaré
Diaré ble kvantifisert ved hjelp av fire enkle analyser beskrevet ovenfor. Første analysen, CFU av utskilles V. cholerae, er vist i figur 1. Seriell fortynninger av vann 24 hpi var belagt vil telle den V. cholerae CFU. Relativt høye nivåer av utskilles V. cholerae er vanligvis observert; i dette eksemplet, ca. 105 V. cholerae per mL vann ble oppdaget. Infisert fisk produserer ikke detectible V. cholerae (data ikke vist).
Andre analysen brukt om å kvantifisere diaré er utskilles mucin. Figur 2 viser effekten av tre forskjellige V. cholerae smittsomme doser på mucin nivåene i vann 24 hpi. En høyere smittsomme dose er korrelert med en høyere utskillelse av mucin i vannet. Som en kontroll, fire fisk ble plassert i en identisk beger vann, men PBS ble lagt i stedet for V. cholerae suspensjon. Kontroll fisken utskilles lite mucin.
Tredje diaré kvantifisering analysen er OD600 av vann 24 hpi. Som vist i Figur 3, var OD600 i dette vannet betydelig høyere i begeret inneholder sebrafisk infisert med V. cholerae enn i begeret inneholder infisert sebrafisk.
Til slutt, de totale protein nivåene ble målt i vannet. Vann som inneholder infiserte fisken inneholdt totale protein nivå nesten dobbelt som observert i vannet inneholder infisert fisken (Figur 4). Samlet illustrere disse fire analyser effekten V. cholerae infeksjon har på sebrafisk utskillelse.
Figur 1: Intestinal kolonisering av sebrafisk av V. cholerae. Fisken ble smittet 6 h og deretter vasket og ruges totalt 24 timer. Venstre side av figuren illustrerer den totale CFU per tarmen av fire fisk (svart prikker.) Høyre side av figuren viser den V. cholerae CFU per mL målt i vann 24 hpi (svarte firkanter.) Gjennomsnittet i begge datasettene er vist med en stor horisontal linje og standardavviket angis av feilfelt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Mucin analysen. Tre forskjellige V. cholerae smittsomme doser ble brukt, sammen med en infisert kontroll, som angitt under x-aksen. Mener verdiene i mucin funnet i vannet av endrede periodiske syre Schiff (PAS) analysen angis av svarte striper over hver smittsomme dose. Feilfeltene viser standardavviket. Stjernene angir p < 0,05 som Student er unpaired t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: OD600 analysen som en proxy for diaré. OD600 1 ml vann fra kanner som inneholder enten V. cholerae smittet eller infisert fisk ble målt. Svarte striper angir middelverdien og feilfeltene angir standardavviket. Stjernene angir p < 0,05 som Student er unpaired t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Total protein nivå i vann. Totalt protein ble anslått av en Bradford analysen som beskrevet. Svarte striper angir mener verdiene og feilfeltene angir standardavviket. Stjernene angir p < 0,05 som Student er unpaired t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sebrafisk er en relativt ny modell for å studere V. cholerae , men har mye løfte for fremtiden å tidligere ukjente aspekter av V. cholerae biologi og patogenesen11,12,13 . Den voksne sebrafisk-modellen har fordelene av å være både en naturlig V. cholerae vert som inneholder intakt, modne tarmen bakterieflora og en miljømessig modell. Ulemper med modellen er at de to store menneskelige virulens faktorer og kolera gift gift-coregulated pilus, ikke er nødvendig for sebrafisk kolonisering eller patogenesen12. Imidlertid kan dette også sees som en annen fordel som kan føre til identifikasjon av romanen V. cholerae kolonisering faktorer og tilrettelegge studiet av andre V. cholerae giftstoffer. Dette er spesielt relevant for det store flertallet av ikke-O1/O139 "miljø" V. cholerae stammer, de fleste som ikke produserer kolera gift eller gift-coregulated pilus og ennå kan likevel forårsake sykdom20,21.
Problemer sannsynligvis å oppstå med denne modellen er knyttet til den rike tarmen bakterieflora. Plating på ikke-selektivt media vil gjøre denne modellen essensielt ubrukelig som det vil være umulig å identifisere V. cholerae koloniene. Selv bruker selektiv eller delvis selektiv medier som LB pluss streptomycin eller DCLER, vil en bakgrunn av koloniene fra tarmen bakterieflora være tilstede. Det er viktig å kontrollere at koloniene som blir regnet er bona fide V. cholerae ved patching koloniene produsert av plating på mindre selektiv medier på en veldig selektiv medium som TCBS. Alternativt, innsetting av en bedre selektiv markør i genomet av en stamme av interesse vil forenkle identifikasjon av V. cholerae fra intestinal homogenates.
Fordelen med analyser brukt om å kvantifisere sebrafisk diaré er at de er enkelt og billig å kjøre13. Ulempen er at disse analyser er hovedsakelig uspesifikke, bortsett fra teller utskilles V. cholerae CFU direkte, og det kan bli vanskelig å avgjøre om diaré er direkte skyldes V. cholerae patogenesen, eller noen andre stressor . Utviklingen av variasjoner av disse eller andre analyser å forbedre deres spesifisitet vil sannsynligvis hjelp i fremtiden målinger av V. cholerae patogenesen sebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Takket være Melodi Neely, Jon Allen, Basel Abuaita og Donna Runft for deres innsats i å utvikle sebrafisk modell. Forskning rapporterte her ble støttet av National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer i National Institutes of Health under prisen tall R21AI095520 og R01AI127390 (å Jeffrey H. Withey). Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Shaker incubator | New Brunswick Scientific, Edison, NJ | Excella E25 | |
| Incubator | NUAIRE, Plymouth, MN | Auto Flow | |
| Spectrophotometer | Thermo, Waltham, MA | Geaesys 6 | |
| Vortex homogenizer | Minibeadbeater24 | 112011 | |
| Weighing Machine | Ohaus, Columbia, MD | Adventurer Pro | |
| Heat Stirer | Corning, Corning, NY | PC-420D | |
| Burner | |||
| automated colony counter | REVSCI | 120417B | |
| Materials | |||
| 400 ml glass beakers | Pyrex | ||
| perforated lids | Microtip holder with holes from tip box | ||
| disposable plastic spoons | Office Depot, Boca Raton, FL | D15-25-7008 | |
| Fish Tank System | Aquaneering, San Diego, CA | ||
| RO Water Purifier | Aqua FX | TK001 | |
| Fish net | Marina | ||
| fish food | Tetra fin | ||
| Brine Shrimp | Red jungle brand | O.S.I. pro 80 | |
| Styrofoam board | |||
| Pins | |||
| Scalpels | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 10000-10 | |
| Forceps | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 11223-20 | |
| Vannas scissors | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 15000-11 | |
| 2 ml screw cap tubes | Fisher Scientific, Hampton, NH | 02-681-375 | |
| 1 mm glass beads | Bio Spec | 11079110 | |
| Glass beads for spreading | Sigma, St. Louis, MO | 18406-500G | |
| Petri plate | Fisher Brand, Hampton, NH | FB0875713 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Midsci, Valley Park, MO | AVSS1700 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning Falcon, Corning, NY | 352098 | |
| Test tubes | Pyrex | 9820 | |
| Glass Pipette | Fisher Brand, Hampton, NH | 13675K | |
| Micro pipettes | Sartorius Biohit, Göttingen, Germany | m1000/m200/m20 | |
| Tips | Genesee Scientific, San Diego, CA | 24-150RS/24-412 | |
| Chemicals | |||
| Instant Ocean salts | |||
| phosphate buffered saline | VWR Life Science, Radnor, PA | K813-500ml | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma, St. Louis, MO | A5040 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | Sigma, St. Louis, MO | 10651745001 | |
| Schiff’s reagent | Sigma, St. Louis, MO | 84655-250 mL | |
| periodic acid | Fisher Scientific, Hampton, NH | 10450-60-9 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma, St. Louis, MO | M2378-100G | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific, Hampton, NH | 9046-46-8 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Reagent | Thermo, Waltham, MA | 22660 | |
| LB medium | |||
| Trypton | BD Biosciences, San Jose, CA | 211705 | |
| Teast Extract | BD Biosciences, San Jose, CA | 212750 | |
| NACL | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP358-212 | |
| Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 214010 | |
| TCBS Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 265020 | |
| DCLS Agar | Sigma, St. Louis, MO | 70135-500gm | |
| Software | |||
| Microsoft office | |||
| Prism 5 |
References
- Harris, J. B., LaRocque, R. C., Qadri, F., Ryan, E. T., Calderwood, S. B. Cholera. The Lancet. 379 (9835), 2466-2476 (2012).
- Dutta, D., et al. Vibrio cholerae non-O1, non-O139 serogroups and cholera-like diarrhea, Kolkata, India. Emerging Infectious Diseases. 19 (3), 464-467 (2013).
- Huq, A., et al. Ecological relationships between Vibrio cholerae and planktonic crustacean copepods. Applied and Environmental Microbiology. 45 (1), 275-283 (1983).
- Halpern, M., Landsberg, O., Raats, D., Rosenberg, E. Culturable and VBNC Vibrio cholerae: interactions with chironomid egg masses and their bacterial population. Microbial Ecology. 53 (2), 285-293 (2007).
- Broza, M., Halpern, M. Pathogen reservoirs. Chironomid egg masses and Vibrio cholerae. Nature. 412 (6842), 40 (2001).
- Halpern, M., Izhaki, I. Fish as hosts of Vibrio cholerae. Frontiers in Microbiology. 8 (282), (2017).
- Senderovich, Y., Izhaki, I., Halpern, M. Fish as reservoirs and vectors of Vibrio cholerae. PLoS ONE. 5 (1), e8607 (2010).
- Traore, O., et al. Occurrence of Vibrio cholerae in fish and water from a reservoir and a neighboring channel in Ouagadougou, Burkina Faso. The Journal of Infection in Developing Countries. 8 (10), 1334-1338 (2014).
- Booth, L. V., Lang, D. A., Athersuch, R. Isolation of Vibrio cholerae non-01 from a Somerset farmworker and his tropical fish tank. Journal of Infection. 20 (1), 55-57 (1990).
- Torres-Vitela, M. A., et al. Incidence of Vibrio cholerae in fresh fish and ceviche in Guadalajara, Mexico. Journal of Food Protection. 60 (3), 237-241 (1997).
- Rowe, H. M., Withey, J. H., Neely, M. N. Zebrafish as a model for zoonotic aquatic pathogens. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 96-107 (2014).
- Runft, D. L., et al. Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).
- Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model. Applied and Environmental Microbiology. , (2017).
- Klose, K. E. The suckling mouse model of cholera. Trends in Microbiology. 8 (4), 189-191 (2000).
- Formal, S. B., Kundel, D., Schneider, H., Kunevn,, Sprinz, H. Studies with Vibrio cholerae in the ligated loop of the rabbit intestine. British Journal of Experimental Pathology. 42, 504-510 (1961).
- Williams, E. M., Dohadwalla, A. N., Dutta, N. K. Diarrhea and accumulation of intestinal fluid in infant rabbits infected with Vibrio cholerae in an isolated jejunal segment. The Journal of Infectious Diseases. 120 (6), 645-651 (1969).
- Spira, W. M., Sack, R. B., Froehlich, J. L. Simple adult rabbit model for Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea. Infection and Immunity. 32 (2), 739-747 (1981).
- Ritchie, J. M., Rui, H., Bronson, R. T., Waldor, M. K. Back to the future: studying cholera pathogenesis using infant rabbits. mBio. 1 (1), (2010).
- Kilcoyne, M., Gerlach, J. Q., Farrell, M. P., Bhavanandan, V. P., Joshi, L. Periodic acid-Schiff's reagent assay for carbohydrates in a microtiter plate format. Analytical Biochemistry. 416 (1), 18-26 (2011).
- Balaji, V., Sridharan, G., Jesudason, M. V. Cytotoxicity of non O1, non O139 Vibrios isolated from fresh water bodies in Vellore, south India. Indian Journal of Medical Research. 110, 155-159 (1999).
- Hasan, N. A., et al. Nontoxigenic Vibrio cholerae non-O1/O139 isolate from a case of human gastroenteritis in the U.S. Gulf Coast. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 9-14 (2015).
