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Immunology and Infection

बढ़ाता Vibrio हैजा औपनिवेशीकरण और दस्त वयस्क Zebrafish मॉडल में

Published: July 12, 2018 doi: 10.3791/57767
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology, Immunology, and Biochemistry, Wayne State University School of Medicine

Summary

Zebrafish एक प्राकृतिक Vibrio हैजा मेजबान है और दोहराऊंगा और औपनिवेशीकरण से संचरण के लिए पूरे संक्रामक चक्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यहां, हम प्रदर्शन कैसे V. हैजा औपनिवेशीकरण स्तर और zebrafish में दस्तों का आकलन करने के लिए ।

Abstract

Vibrio हैजा को संक्रामक एजेंट के रूप में जाना जाता है जो मानव रोग हैजा का कारण बनता है । मानव की मेजबानी के बाहर, V. हैजा मुख्य रूप से जलीय वातावरण में मौजूद है, जहां यह उच्च जलीय प्रजातियों की एक किस्म के साथ बातचीत । हड्डीवाला मछली एक पर्यावरणीय मेजबान होने के लिए जाना जाता है और प्रकृति में एक संभावित V. हैजा जलाशय हैं । दोनों V. हैजा और teleost मछली प्रजातियों ढाणियो rerio, सामांयतः zebrafish के रूप में जाना जाता है, भारतीय उपमहाद्वीप से उत्पंन, जलीय वातावरण में एक लंबे समय से बातचीत का सुझाव । Zebrafish जीव विज्ञान के कई पहलुओं, संक्रामक रोगों सहित अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल जीव हैं । Zebrafish आसानी से हो सकता है और तेजी से पानी में निवेश के बाद V. हैजा द्वारा बृहदांत्र । v. हैजा द्वारा आंत्र औपनिवेशीकरण दस्त के उत्पादन और दोहराया V. हैजाके उत्सर्जन की ओर जाता है । इन उत्सर्जित बैक्टीरिया तो नई मछली मेजबान उपनिवेश पर जा सकते हैं । यहां, हम प्रदर्शन कैसे v. हैजाका आकलन करने के लिए-zebrafish में आंत्र औपनिवेशीकरण और कैसे मात्रा v. हैजा-प्रेरित zebrafish दस्त । औपनिवेशीकरण मॉडल शोधकर्ताओं जो अध्ययन कर रहे है कि ब्याज की जीन मेजबान औपनिवेशीकरण के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है और के लिए उपयोगी होना चाहिए/ zebrafish दस्त के ठहराव किसी भी आंत्र रोगज़नक़ जो एक मॉडल प्रणाली के रूप में zebrafish की खोज में रुचि रखते है अध्ययन शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी होना चाहिए ।

Introduction

Vibrio हैजा एक जलीय, ग्राम-नकारात्मक जीवाणु है जो मानव रोग हैजा के साथ ही छिटपुट दस्त1,2का कारण बनता है । वि. हैजे के कारण प्रायः अन्य जलीय जीवों से सम्बद्ध विश्व के अनेक क्षेत्रों में वातावरण में पाया जाता है. इन जीवों को जोड़ प्लवक, कीट अंडा जनता, शंख, और हड्डीवाला मछली प्रजातियों3,4,5,6,7शामिल हैं । कई अध्ययनों से अलग भौगोलिक क्षेत्रों7,8,9,10में मछली के आंत्र पथ से V. हैजा अलग है । मछली में V. हैजे की उपस्थिति इंगित करता है कि मछली एक पर्यावरण जलाशय के रूप में कार्य कर सकते हैं । मछली भी मनुष्यों को रोग संचारित करने में और V. हैजा उपभेदों6के भौगोलिक प्रसार में फंसाया जा सकता है ।

बेहतर समझने के लिए कैसे v. हैजा मछली के साथ बातचीत, ढाणियो rerio, बेहतर zebrafish के रूप में जाना जाता है, v. हैजाई11की पढ़ाई के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में विकसित किया गया था । Zebrafish बंगाल क्षेत्र की खाड़ी सहित दक्षिणी एशिया के मूल निवासी हैं, जो वि. हैजाका शीघ्रातिशीघ्र जलाशय बनने लगा है. पहले हैजा महामारी १८१७ में शुरुआत करने से पहले, हैजा क्या अब भारत और बांग्लादेश है के बाहर नहीं बताया गया था । इसलिए, zebrafish और V. हैजा लगभग निश्चित रूप से विकासवादी समय तराजू पर एक दूसरे के साथ जुड़े, सुझाव है कि zebrafish प्राकृतिक वातावरण12में एक V. हैजे की मेजबानी कर रहे हैं ।

v. हैजे के लिए zebrafish मॉडल पर अमल सरल है और पूरे रोगजनक वि. हैजा जीवन चक्र का अध्ययन किया जा सकता है. मत्स्य वि. हैजे के संपर्क में आने से पानी में स्नान करके जो वि. हैजेकी ज्ञात संख्या के साथ inoculated गया है. कुछ ही घंटों के भीतर, आंत्र औपनिवेशीकरण जगह लेता है, दस्त के उत्पादन के बाद । दस्त mucin, प्रोटीन, उत्सर्जित बैक्टीरिया, और अन्य आंत्र सामग्री के होते हैं । दस्त की डिग्री कुछ सरल माप13का उपयोग कर quantified जा सकता है । V. हैजे कि संक्रमित मछलियों द्वारा उत्सर्जित किया गया है तो, के लिए पर जा सकते हैं भोली मछली संक्रमित, संक्रामक चक्र को पूरा करने. इसलिए zebrafish मॉडल recapitulates में वि. हैजे की मानव रोग प्रक्रिया१२,१४.

सबसे अक्सर इस्तेमाल किया V. हैजा पशु मॉडल ऐतिहासिक चूहों और खरगोश14,15,16,17,18है । इन मॉडलों में वि. हैजे रोगजनन के हमारे ज्ञान को जोड़ने में महत्वपूर्ण भूमिका रही है. तथापि, क्योंकि चूहों और खरगोशों के प्राकृतिक v. हैजे की मेजबानी नहीं कर रहे हैं, वहां v. हैजा जीवन चक्र के किन पहलुओं की सीमाओं का अध्ययन किया जा सकता है । V. चूहों और खरगोशों के हैजे औपनिवेशीकरण आमतौर पर आंत्र microbiota के अभाव या एंटीबायोटिक दवाओं के साथ एक उपचार आंत्र microbiota को नुकसान की आवश्यकता है । दोनों मॉडलों को या तो gavage पाचन तंत्र या शल्य हेरफेर करने के लिए बैक्टीरिया शुरू करने के लिए सीधे आंतों में बैक्टीरिया इंजेक्षन की आवश्यकता होती है । Zebrafish एक बरकरार आंत्र microbiota के साथ कि वयस्क मछली में एक फायदा है आसानी से और बृहदांत्र संक्रामक प्रक्रिया स्वाभाविक रूप से होता है, किसी भी हेरफेर के बिना आवश्यक है ।

वर्तमान काम V. हैजा संक्रमण में एक मॉडल के रूप में zebrafish के उपयोग को दर्शाता है । संक्रमण, विच्छेदन, बस्तियां v. हैजेकी गणना, तथा वि. हैजे की वजह से दस्त की ठहराव१२,१३बताई जाएगी. यह मॉडल दोनों v. हैजा रोग प्रक्रिया में और v. हैजा पर्यावरण जीवन शैली में रुचि वैज्ञानिकों के लिए उपयोगी होने की संभावना है ।

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Protocol

यहां बताए गए सभी तरीकों को वेन स्टेट यूनिवर्सिटी के इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड फीमेल कमेटी (IACUC) ने मंजूरी दे दी है । यह तरीका पहले Runft एट अल में बताया गया था । 12

1. आंत्र औपनिवेशीकरण के स्तर का निर्धारण

नोट: आंत्र औपनिवेशीकरण zebrafish मॉडल में सबसे उपयोगी मीट्रिक है क्योंकि यह विभिन्न वी. हैजा उपभेदों या उत्परिवर्तनों या जीन नॉकआउट के प्रभाव के सापेक्ष फिटनेस की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

  1. टीका ने किया zebrafish का विसर्जन
    नोट: जोखिम का यह मतलब संक्रमण के प्राकृतिक पाठ्यक्रम जैसा दिखता है ।
    1. V. हैजे की तैयारी
      1. Inoculate lysogeny शोरबा (पौंड) के एक पौंड प्लेट से एक अलग V. हैजा कॉलोनी के साथ 5 मिलीलीटर और ३७ डिग्री सेल्सियस पर मिलाते (१८० rpm) 6 के लिए-8 घंटे के साथ यह मशीन (रातोंरात संस्कृति) ।
      2. ऊपर रातोंरात संस्कृति के ५० µ एल के साथ एक २५० मिलीलीटर शंकु कुप्पी में ताजा autoclaved पौंड मध्यम के Inoculate 25 मिलीलीटर । यह 16 के लिए मशीन-३७ डिग्री सेल्सियस पर मिलाते (१५० rpm) के साथ 18 एच ।
      3. पर ऑप्टिकल घनत्व पढ़ें ६०० एनएम (आयुध डिपो६००) रातोंरात संस्कृति के एक 1/10 कमजोर पड़ने का अनुमान करने के लिए प्रति मिलीलीटर बैक्टीरिया की संख्या (आयुध डिपो६०० = 1 है ~ 109 CFU/एमएल)
      4. फसल के लिए ६,००० जी पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं 10 मिनट के लिए एक पिपेट के साथ मीडिया को दूर या यह एक संक्रामक समाधान में डाल दिया । विशेष रूप से 1 एक्स 107 से 1 x 10 10 के बीच पंजाब के प्रति मिलीलीटर, वांछित एकाग्रता के लिए बाँझ पंजाबियों में कोशिकाओं resuspend ।
        नोट: यहाँ, हम autoclaved रिवर्स करने के लिए देखें-असमस पानी युक्त ६० मिलीग्राम/L समुद्र लवण के रूप में बाँझ संक्रमण पानी.
    2. टीका और मशीन
      1. एक ४०० मिलीलीटर चोंच में चार या पांच zebrafish जगह बाँझ संक्रमण पानी की २०० मिलीलीटर युक्त ।
      2. V. हैजे की 1 मिलीलीटर जोड़ें (कदम से 1.1.1.4.) वांछित संक्रमण एकाग्रता पाने के लिए (आमतौर पर 5 x 104 से 5 x 107 CFU/एमएल) में २०० मिलीलीटर के संक्रमण पानी ।
      3. बाहर कूद से मछली को रोकने के लिए एक छिद्रित ढक्कन के साथ चोंच कवर; एक २०० µ एल टिप बॉक्स के शीर्ष इस के लिए अच्छी तरह से काम करता है ।
      4. लेबल प्रत्येक चोंच और उंहें एक गिलास सामने मशीन प्रयोग की अवधि के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर सेट में जगह है ।
    3. क्षणभंगुर जोखिम के लिए प्रक्रिया
      नोट: inoculating बैक्टीरिया को हटाने के द्वारा पीछा V. हैजा (आमतौर पर 6 एच) के लिए एक क्षणभंगुर प्रदर्शन संचरण का अध्ययन करने के लिए और उत्सर्जित बैक्टीरिया का अधिक सटीक ठहराव के लिए उपयोगी है ।
      1. एक्सपोजर के 6 ज के बाद, मछली इकट्ठा करने के लिए एक मछली जाल के माध्यम से चोंच पानी बाहर डालो । संक्रमित पानी को ब्लीच के एक कंटेनर में डालकर V. हैजेकी मार से त्यागें.
      2. निकाली गई मछली बाँझ संक्रमण पानी की २०० मिलीलीटर की एक चोंच में रखें । मछली से सतह बैक्टीरिया को दूर करने के लिए 5 मिनट के लिए इस साफ पानी में तैरने के लिए अनुमति दें ।
      3. नेट प्रक्रिया (step 1.2.2) को दोहराएँ और २०० मिलीलीटर बाँझ संक्रमण के पानी के एक नए चोंच में मछली रखें । प्रयोग की अवधि के लिए मछली को इस यूरिन में रखें ।
  2. इच्छामृत्यु
    1. जब प्रयोग अपने वांछित समापन बिंदु तक पहुंच गया है, संक्रमण के पानी का एक नमूना ले (15 मिलीलीटर आमतौर पर पर्याप्त है) उत्सर्जित बैक्टीरियल मायने रखता है और दस्त की माप के लिए अनुमति देने के लिए (जैसे mucin परख, प्रोटीन सामग्री, और/या आयुध डिपो), यदि वांछित (खंड 2) ।
    2. एक मछली जाल के माध्यम से पानी के शेष डालो (मछली इकट्ठा करने के लिए) ब्लीच में पानी में V. हैजा को मारने के लिए ।
    3. एक चोंच संक्रमण पानी से अधिक ३३६ µ g/एथिल 3 के एमएल-aminobenzoate methanesulfonate (tricaine) और आर टी में 20 मिनट के लिए इस tricaine समाधान में मछली मशीन युक्त में मछली प्लेस ।
      नोट: मछली जाल एक 10% ब्लीच समाधान के साथ निष्फल थे ।
  3. विच्छेदन
    1. मछली की तैयारी
      1. एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक चंमच के साथ tricaine समाधान के बाहर एक मछली स्कूप और यह विदारक सतह पर जगह है ।
      2. अपने ventral पक्ष के साथ मछली की स्थिति ऊपर की ओर का सामना करना पड़ और निचले जबड़े के माध्यम से पिन, पिन के कुंद अंत के साथ शरीर के केंद्र से दूर angled । एक और पिन सिर्फ गुदा के पीछे प्लेस, यह भी शरीर से दूर angled ।
    2. आंत्र पथ का एक्सपोजर
      1. झाड़ू एक एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त पोंछ के साथ मछली की ventral सतह ७०% इथेनॉल में डूबा ।
      2. उंहें ७०% इथेनॉल में सूई और उंहें ज्वलंत द्वारा एक स्केलपेल और Vannas कैंची निष्फल ।
      3. बस त्वचा के नीचे तराजू में घुसना और स्केलपेल का उपयोग करके एक छोटा सा चीरा पेट में लंबाई बनाओ । बहुत गहराई से कटौती नहीं सावधान रहना, के रूप में आंत्र पथ सिर्फ त्वचा के नीचे स्थित है ।
      4. कैंची का प्रयोग, ध्यान से शरीर की लंबाई के साथ चीरा का विस्तार, त्वचा के स्तर से कोई गहरा काटने और गुदा से परहेज ।
      5. मछली के सिर की ओर कैंची के साथ दो पार्श्व में कटौती करने के लिए चीरा के एक खोलने की अनुमति ।
      6. विच्छेदन सतह के लिए पार्श्व चीरा के प्रत्येक पक्ष पर त्वचा पिन, पिन बाहर angling, शरीर से दूर ।
        नोट: पिन के सुझावों को पहले उंहें शराब के साथ ज्वलंत द्वारा निष्फल थे ।
    3. आंत्र पथ को हटाने
      नोट: आंत्र पथ एक पीला, अंय अंगों के शीर्ष पर बहुत पतली ट्यूब के रूप में दिखाई जानी चाहिए ।
      1. लौ-संदंश निष्फल और फिर उंहें पूरे आंत्र पथ को दूर करने के लिए उपयोग (आमतौर पर 12-लंबाई में 15 मिमी) । एक homogenization ट्यूब ग्लास मोती युक्त में आंत प्लेस (कदम 1.4.1-1.4.2) और 1x पंजाब या पौंड के 1 मिलीलीटर, बर्फ पर देखें ।
  4. Homogenization
    1. पहले से homogenization ट्यूबों 1 मिमी ग्लास मोतियों की ~ १.५ जी में डाल द्वारा तैयार 2 मिलीलीटर पेंच कैप ट्यूब (उंहें भरने के लगभग आधे रास्ते) और फिर उंहें autoclaving द्वारा निष्फल ।
    2. बाँझ पौंड या 1x पंजाबियों की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. एक बार zebrafish आंतों जोड़ा गया है (कदम 1.3.3.1) ट्यूबों के लिए, बहुत कसकर पर टोपियां पेंच, और फिर भंवर homogenizer में ट्यूबों सुरक्षित ।
    4. अधिकतम सेटिंग पर 1 मिनट के लिए नमूने Homogenize, तो 1 के लिए बर्फ पर उन्हें शांत-2 min. this homogenization चक्र एक बार एक पूर्ण homogenization के लिए और अधिक दोहराएँ.
      नोट: homogenization के लिए कई वैकल्पिक तरीके भी काम करेगा ।
  5. आंतों औपनिवेशीकरण के स्तर को बढ़ाता है
    1. ट्यूबों तैयार (या तो छोटे गिलास परीक्षण ट्यूब या १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों) homogenate के सीरियल कमजोर पड़ने के लिए प्रत्येक ट्यूब के लिए पौंड या 1x पंजाबियों के ९०० µ एल जोड़ने के द्वारा । प्रत्येक मछली के लिए, 5-6 ट्यूबों तैयार करें और पहले ट्यूब के लिए homogenate के १०० µ l को जोड़कर आंतों homogenate के 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने, यह भंवर मिश्रण करने के लिए, और फिर दूसरी ट्यूब के लिए पहली ट्यूब से १०० µ एल जोड़ने.
    2. इस प्रक्रिया को दोहराएँ जब तक सभी कमजोर पड़ने तैयार किया गया है.
    3. 100 प्लेट-पौंड आगर पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के 200 µ l १०० µ जी/streptomycin की एमएल (यदि streptomycin प्रतिरोधी उपभेदों का उपयोग) और ४० µ g/एमएल एक्स-लड़की (5-ब्रोमो-4-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-3-indolyl-β-डी-galactopyranoside) से युक्त प्लेटें । 16 के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों की मशीन-18 एच ।
    4. रात भर की गर्मी के बाद, प्लेटों पर V. हैजा कालोनियों गिनती, या तो एक स्वचालित कॉलोनी काउंटर का उपयोग कर या स्वयं कालोनियों गिनती; यह एक मार्कर टिप के साथ गिना कालोनियों को चिह्नित करने के लिए उपयोगी है ।
    5. मछली आंत प्रति CFU निलंबन के कमजोर पड़ने कारक द्वारा प्लेट गिनती गुणा द्वारा निर्धारित करते हैं, खाते में मात्रा है कि चढ़ाया गया था ले रही है ।

2. मछली दस्त का मापन

नोट: चार विभिंन मैट्रिक्स मछली दस्त का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया: पानी में mucin का स्तर, पानी में समग्र उत्सर्जित प्रोटीन का स्तर, पानी की आयुध डिपो६०० , और V. हैजा पानी में CFU13। दस्त आम तौर पर नेत्रहीन स्पष्ट हो जाता है लगभग 6 zebrafish के जोखिम के बाद V. हैजे के रूप में ऊपर वर्णित के बाद एच ।

  1. mucin स्तरों का निर्धारण
    नोट: Mucin स्राव V. हैजा औपनिवेशीकरण के दौरान प्रेरित है और उत्सर्जन के स्तर का एक अच्छा उपाय है, विशेष रूप से13संक्रमण में जल्दी । mucin परख microtiter आवधिक एसिड Schiff परख19पर एक भिंनता है ।
    1. निंनलिखित सामग्री तैयार करें: ५०% (w/v) आवधिक एसिड स्टॉक समाधान और ०.१% आवधिक एसिड काम समाधान (10 µ एल के ५०% आवधिक एसिड स्टॉक 7% एसिटिक एसिड की 5 मिलीलीटर में जोड़ा-बनाने के बाद तुरंत उपयोग), mucin मानकों, ९६-अच्छी तरह से microtiter प्लेटें, Schiff के अभिकर्मक.
      1. एक सोडियम एसीटेट बफर में (एक सुअर का पेट प्रकार III से) mucin की निम्न मात्रा को निलंबित करके mucin मानकों को तैयार (१०० mM सोडियम एसीटेट, 5 मिमी EDTA, हिमनदों एसिटिक एसिड के साथ ५.५ के लिए पीएच): ४०० µ जी/एमएल, ३०० µ जी/एमएल, २०० µ जी/एमएल, १५० µ जी/ , १०० µ जी/एमएल, ७५ µ जी/एमएल, ५० µ जी/एमएल, 25 µ जी/एमएल, और 10 µ जी/
        एक अच्छी तरह से है कि परख में इस्तेमाल किया जाएगा के लिए संक्रमण के पानी की १०० µ एल जोड़कर प्लेट तैयार इस प्रकार है: रिक्त 1x पंजाबियों; mucin मानकों के रूप में ऊपर वर्णित है, या मछली संक्रमण से एक पानी के नमूने । प्रत्येक नमूने तपसिल में करें ।
    2. एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ एक अच्छी तरह से ताजा ०.१% आवधिक एसिड समाधान के ५० µ एल जोड़ें और इसे कई बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण ।
    3. लपेटें प्लेट प्लास्टिक लपेटो में कसकर और यह 1 के लिए ३७ ° c-1.5 एच में मशीन ।
    4. प्लेट ठंडा करने के लिए कमरे के तापमान के लिए नीचे 5 – 10 min. Add १०० µ l Fuchsin समाधान (Schiff के रिएजेंट) के लिए एक अच्छी तरह से, और प्लास्टिक ऊपर और नीचे मिश्रण करने के लिए.
    5. प्लास्टिक लपेटो में प्लेट लपेटें और रंग विकसित किया गया है जब तक एक कमाल मंच पर कमरे के तापमान पर यह गर्मी; रंग आम तौर पर 20 मिनट के भीतर विकसित की है. एक प्लेट रीडर का उपयोग कर ५६० एनएम पर अवशोषक पढ़ें ।
    6. प्लॉट एक mucin मानक वक्र (आयुध डिपो५६०बनाम µ g/एमएल mucin मानक) । पहचान जहां प्रत्येक अज्ञात के आयुध डिपो५६० मानक वक्र पर गिर जाता है और उस मूल्य के लिए इसी mucin एकाग्रता पढ़ने से unknown के स्तर का निर्धारण ।
  2. प्रोटीन के स्तर का निर्धारण
    नोट: mucin से अलग, पानी में समग्र प्रोटीन का स्तर दस्त के स्तर (बादल छाए रहेंगे, तरल स्टूल) मछली द्वारा उत्पादित के लिए एक और प्रॉक्सी हैं । यह प्रक्रिया प्रोटीन के स्तर का अनुमान लगाने के लिए एक मानक ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग करता है । प्रोटीन का स्तर एक गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) मानक वक्र पर आधारित अनुमानित हैं ।
    1. मिश्रण १०० BSA मानकों में से एक के µ एल (नीचे दिए गए नोट देखें) या १०० µ एल संक्रमण पानी की (संक्रमित मछली युक्त चोंच से पानी) ९०० µ एल के साथ ब्रैडफोर्ड परख रिएजेंट (पियर्स प्रोटीन परख एजेंट के लिए अच्छी तरह से काम करता है इस के लिए) एक डिस्पोजेबल cuvette में । 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सभी नमूनों की मशीन ।
      नोट: निम्नलिखित BSA मानकों का इस्तेमाल किया गया: १,८०० µ जी/एमएल, १,००० µ जी/एमएल, ७५० µ जी/एमएल, ५०० µ जी/एमएल, २५० µ जी/एमएल, १२५ µ जी/एमएल, ५० µ जी/एमएल, और 25 µ जी/ autoclaved आसुत जल में BSA मानकों को पतला किया गया ।
    2. प्रत्येक मानक के आयुध डिपो६६० पढ़ें या उंहें एक spectrophotometer का उपयोग कर नमूना ।
    3. भूखंड BSA मानक वक्र (आयुध डिपो६६०बनाम µ g/एमएल) । पहचान जहां प्रत्येक अज्ञात के आयुध डिपो६६० BSA मानक वक्र पर गिर जाता है और उस मूल्य के लिए इसी mucin एकाग्रता पढ़ें द्वारा अज्ञात के प्रोटीन के स्तर का निर्धारण ।
  3. माप आयुध डिपो६००
    नोट: दस्त की उपस्थिति (बादल, तरल मल) कई एच के बाद स्पष्ट रूप से दिख रहा है और एक सरल आयुध डिपो६०० निर्धारण करने के लिए इस मात्रा का इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    1. संक्रमण पानी कई बार समान रूप से सामग्री वितरित करने के लिए युक्त ट्यूब उलटा । एक डिस्पोजेबल cuvette के लिए पानी के नमूने के 1 मिलीलीटर जोड़ें । नकारात्मक नियंत्रण के रूप में बाँझ संक्रमण पानी की 1 मिलीलीटर का उपयोग करें ।
    2. नकारात्मक नियंत्रण नमूना का उपयोग कर ६०० एनएम पर spectrophotometer का उपयोग कर एक "रिक्त" माप निष्पादित करें । ६०० एनएम में प्रत्येक पानी के नमूने पढ़ें और परिणाम रिकॉर्ड ।
  4. संक्रमण के बाद उत्सर्जित वि. हैजा CFU/एमएल का निर्धारण
    नोट: zebrafish द्वारा उत्पादित दस्त का एक प्रमुख घटक V. हैजाउत्सर्जित होता है । CFU/एमएल का निर्धारण इस तरह के मछली आंत्र पथ में बैक्टीरियल प्रतिकृति का आकलन और संचरण प्रयोगों में एक संक्रामक खुराक का एक उपाय के रूप में प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह उपाय सबसे अच्छा किया जाता है जब एक क्षणभंगुर संक्रमण जगह ले ली है । एक 24 एच संक्रमण का उपयोग किया जाता है, तो इस परख संयुक्त इनोक्युलम से अधिक उत्सर्जित V. हैजाउपाय होगा ।
    1. वांछित समय बिंदु पर एक पानी का नमूना ले लो और प्रश्नपत्र इसे पतला पहले वर्णित के रूप में ।
    2. चयनित मीडिया पर धारावाहिक कमजोर पड़ने की थाली (पौंड streptomycin युक्त आगर या किसी अंय उपयुक्त एंटीबायोटिक या DCLS) और उंहें 30 डिग्री सेल्सियस में 24 घंटे के लिए मशीन ।
    3. कालोनियों की गिनती कराएं । १.५ चरण में वर्णित के रूप में पानी की CFU प्रति मिलीलीटर की गणना ।

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Representative Results

V. zebrafish आंत्र नलिका के हैजे की औपनिवेशीकरण

ठेठ औपनिवेशीकरण स्तर का हम निरीक्षण का एक उदाहरण प्रदान करने के लिए, हम inoculated 5 एक्स 106 CFU महामारी एल टो V. हैजा तनाव N16961 में २०० मिलीलीटर पानी की एक चोंच में कई zebrafish युक्त । संक्रमण के 6 ज के बाद, मछली ताजा पानी में धोया और प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में autoclaved संक्रमण पानी की २०० मिलीलीटर की एक चोंच में स्थानांतरित कर रहे थे । 18 एच स्थानांतरण के बाद (या प्राथमिक संक्रमण के बाद 24 ज), मछली euthanized थे, और उनकी आंतों औपनिवेशीकरण स्तर निर्धारित करने के लिए ले जाया गया । लगभग 105 से 106 वी. हैजा मछली आंत प्रति कोशिकाओं आम तौर पर आंत्र पथ 24 एच के बाद संक्रमण (hpi) (चित्रा 1) 5 x 106 इनोक्युलम आकार के साथ में मनाया गया ।

मछली दस्त का ठहराव

दस्त चार सरल ऊपर वर्णित परख का उपयोग कर quantified था । पहली परख, उत्सर्जित V. हैजेकी CFU, चित्रा 1में दिखाया गया है । पानी के धारावाहिक कमजोर पड़ने वाले २४ hpi को वि. हैजा CFU की गिनती के लिए चढ़ाया गया. उत्सर्जित V. हैजा के अपेक्षाकृत उच्च स्तर आमतौर पर मनाया जाता है; इस उदाहरण में, लगभग 105 V. हैजा पानी की प्रति मिलीलीटर का पता लगाया गया । संक्रमित मछली detectible V. हैजे का उत्पादन नहीं (डेटा नहीं दिखाया गया है) ।

दूसरी परख दस्तों के लिए इस्तेमाल किया mucin उत्सर्जित है । चित्रा 2 पानी 24 hpi में mucin के स्तर पर तीन अलग V. हैजा संक्रामक खुराक के प्रभाव से पता चलता है । एक उच्च संक्रामक खुराक पानी में mucin के एक उच्च उत्सर्जन के साथ संबद्ध है । नियंत्रण के तौर पर चार मछलियों को पानी के एक समरूप चोंच में रखा गया था, लेकिन पंजाबियों को वि. हैजा निलंबन के बजाए जोड़ दिया गया. नियंत्रण मछली बहुत कम mucin उत्सर्जित ।

तीसरे अतिसारीय ठहराव परख पानी 24 hpi के आयुध डिपो६०० है । के रूप में चित्रा 3में दिखाया गया है, इस पानी के आयुध डिपो६०० में काफी अधिक था V. हैजे से संक्रमित zebrafish युक्त चोंच में संक्रमित zebrafish से युक्त चोंच में ।

अंत में, कुल प्रोटीन का स्तर पानी में मापा गया । संक्रमित मछली युक्त पानी कुल प्रोटीन का स्तर लगभग दो बार है कि संक्रमित मछली युक्त पानी में मनाया (चित्रा 4) निहित । सामूहिक रूप से, इन चार परख प्रभाव V. हैजा संक्रमण zebrafish उत्सर्जन पर है वर्णन ।

Figure 1
चित्र 1: आंत्र औपनिवेशीकरण zebrafish के द्वारा V. हैजा। मछली 6 एच के लिए संक्रमित थे, तो धोया और 24 एच की कुल के लिए मशीन । आंकड़ा के बाईं ओर चार मछली (काले डॉट्स की आंत प्रति कुल CFU दिखाता है.) आंकड़ा के दाईं ओर V. हैजा CFU प्रति मिलीलीटर पानी में मापा 24 hpi (काला चौकों.) इंगित करता है दोनों डेटा सेट्स का अर्थ एक बड़ी क्षैतिज रेखा के साथ दिखाया जाता है और मानक विचलन त्रुटि पट्टियों द्वारा दर्शाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Mucin परख । तीन अलग V. हैजा संक्रामक खुराक इस्तेमाल किया गया, एक संक्रमित नियंत्रण के साथ, के रूप में एक्स-अक्ष के तहत संकेत दिया । संशोधित आवधिक एसिड Schiff (क़दम) परख द्वारा पानी में पाया mucin का मतलब मान प्रत्येक संक्रामक खुराक के ऊपर काले सलाखों के द्वारा संकेत कर रहे हैं । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का संकेत देती हैं । तारांकन चिह्न p < 0.05 इंगित करता है के रूप में विद्यार्थी के ख़राब t-परीक्षण द्वारा निर्धारित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: दस्त के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में आयुध डिपो६०० परख । आयुध डिपो से 1 मिलीलीटर की६०० या तो वी. हैजा संक्रमित या संक्रमित मछली से युक्त चोंच से मापा गया था । काली पट्टियों का अर्थ मान इंगित करता है और त्रुटि पट्टियां मानक विचलन इंगित करती हैं । तारांकन चिह्न p < 0.05 इंगित करता है के रूप में विद्यार्थी के ख़राब t-परीक्षण द्वारा निर्धारित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: पानी में कुल प्रोटीन का स्तर । कुल प्रोटीन एक ब्रैडफोर्ड परख द्वारा अनुमान के रूप में वर्णित किया गया था । काली पट्टियां माध्य मानों का संकेत देती है और त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का संकेत देती हैं । तारांकन चिह्न p < 0.05 इंगित करता है के रूप में विद्यार्थी के ख़राब t-परीक्षण द्वारा निर्धारित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

zebrafish v. हैजे की पढ़ाई के लिए एक अपेक्षाकृत नए मॉडल है, लेकिन v. हैजा जीव विज्ञान और रोगजनन11,12,13 के पहले से अज्ञात पहलुओं की भविष्य की खोज के लिए बहुत वादा रखती है . वयस्क zebrafish मॉडल दोनों एक प्राकृतिक V. हैजा मेजबान है कि बरकरार, परिपक्व आंत्र microbiota और एक पर्यावरण मॉडल शामिल होने के फायदे हैं । मॉडल के नुकसान है कि दो प्रमुख मानव डाह कारकों, हैजा विष और विष-coregulated pilus, zebrafish औपनिवेशीकरण या रोगजनन12के लिए आवश्यक नहीं हैं । हालांकि, यह वैकल्पिक रूप से एक और लाभ के रूप में देखा जा सकता है कि उपंयास v. हैजा औपनिवेशीकरण कारकों की पहचान को सक्षम करने और अंय v. हैजा विषाक्त पदार्थों के अध्ययन की सुविधा सकता है । यह विशेष रूप से गैर के विशाल बहुमत के लिए प्रासंगिक है O1/O139 "पर्यावरण" V. हैजा उपभेदों, जिनमें से अधिकांश हैजा विष या विष-coregulated pilus उत्पादन नहीं है और अभी भी रोग20,21का कारण बन सकता है ।

समस्याओं के सबसे इस मॉडल का उपयोग कर पैदा होने की संभावना प्रचुर मात्रा में आंत्र microbiota से संबंधित हैं । अचयनित मीडिया पर चढ़ाना इस मॉडल अनिवार्य रूप से अनुपयोगी के रूप में यह V. हैजा कालोनियों की पहचान असंभव हो जाएगा कर देगा । यहां तक कि इस तरह के पौंड से अधिक streptomycin या DCLS, आंतों microbiota से कालोनियों की पृष्ठभूमि के रूप में चयनात्मक या आंशिक रूप से चयनात्मक मीडिया का उपयोग कर उपस्थित रहेंगे । यह सत्यापित करने के लिए आवश्यक है कि कालोनियों है कि गिना जा रहा है बोना के रूप में एक बहुत ही चयनात्मक माध्यम पर कम चयनात्मक मीडिया पर चढ़ाना द्वारा उत्पादित कालोनियों पैच द्वारा TCBS. वैकल्पिक रूप से, ब्याज की एक तनाव के जीनोम में एक बेहतर चयनात्मक मार्कर के सम्मिलन काफी आंत्र homogenates से V. हैजा की पहचान को सरल होगा ।

परख zebrafish दस्त के लिए इस्तेमाल किया का लाभ यह है कि वे सरल और सस्ती करने के लिए13निष्पादित कर रहे हैं । नुकसान यह है कि इन परख काफी हद तक विशिष्ट हैं, एक तरफ की गिनती से उत्सर्जित v. हैजा CFU सीधे, और यह अगर दस्त सीधे v. हैजा रोगजनन, या कुछ अंय तनाव के कारण है निर्धारित करने के लिए मुश्किल हो सकता है . इन या अंय परख के रूपांतरों के विकास के लिए उनकी विशिष्टता की संभावना zebrafish में V. हैजा रोगजनन के भविष्य के माप में सहायता करेगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

मेलोडी Neely, जॉन एलन, बेसल Abuaita, और डोना Runft को zebrafish मॉडल विकसित करने में मदद करने में उनके प्रयासों के लिए धंयवाद । यहां बताया गया अनुसंधान पुरस्कार संख्या R21AI095520 और R01AI127390 (Jeffrey एच. Withey) के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोगों के संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instrument
Shaker incubator New Brunswick Scientific, Edison, NJ Excella E25
Incubator NUAIRE, Plymouth, MN Auto Flow
Spectrophotometer Thermo, Waltham, MA Geaesys 6
Vortex homogenizer Minibeadbeater24 112011
Weighing Machine Ohaus, Columbia, MD Adventurer Pro
Heat Stirer Corning, Corning, NY PC-420D
Burner
automated colony counter REVSCI 120417B
Materials
400 ml glass beakers Pyrex
perforated lids Microtip holder with holes from tip box
disposable plastic spoons Office Depot, Boca Raton, FL D15-25-7008
Fish Tank System Aquaneering, San Diego, CA
RO Water Purifier Aqua FX TK001
Fish net Marina
fish food Tetra fin
Brine Shrimp Red jungle brand O.S.I. pro 80
Styrofoam board
Pins
Scalpels Fine Scientific tools, Foster City, CA 10000-10
Forceps Fine Scientific tools, Foster City, CA 11223-20
Vannas scissors Fine Scientific tools, Foster City, CA 15000-11
2 ml screw cap tubes Fisher Scientific, Hampton, NH 02-681-375
1 mm glass beads Bio Spec 11079110
Glass beads for spreading Sigma, St. Louis, MO 18406-500G
Petri plate Fisher Brand, Hampton, NH FB0875713
1.5 ml centrifuge tube Midsci, Valley Park, MO AVSS1700
50 ml centrifuge tube Corning Falcon, Corning, NY 352098
Test tubes Pyrex 9820
Glass Pipette Fisher Brand, Hampton, NH 13675K
Micro pipettes Sartorius Biohit, Göttingen, Germany m1000/m200/m20
Tips Genesee Scientific, San Diego, CA 24-150RS/24-412
Chemicals
Instant Ocean salts
phosphate buffered saline VWR Life Science, Radnor, PA K813-500ml
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma, St. Louis, MO A5040
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside Sigma, St. Louis, MO 10651745001
Schiff’s reagent Sigma, St. Louis, MO 84655-250 mL
periodic acid Fisher Scientific, Hampton, NH 10450-60-9
Mucin from porcine stomach Sigma, St. Louis, MO M2378-100G
Bovine serum albumin Fisher Scientific, Hampton, NH 9046-46-8
Pierce 660nm Protein Assay Reagent Thermo, Waltham, MA 22660
LB medium
Trypton BD Biosciences, San Jose, CA 211705
Teast Extract BD Biosciences, San Jose, CA 212750
NACL Fisher Scientific, Hampton, NH BP358-212
Agar BD Biosciences, San Jose, CA 214010
TCBS Agar BD Biosciences, San Jose, CA 265020
DCLS Agar Sigma, St. Louis, MO 70135-500gm
Software
Microsoft office
Prism 5

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १३७ Zebrafish हैजा Vibrio हैजा मेजबान-रोगज़नक़ बातचीत औपनिवेशीकरण अतिसारीय रोगों आंत्र रोगजनकों
बढ़ाता <em>Vibrio हैजा</em> औपनिवेशीकरण और दस्त वयस्क Zebrafish मॉडल में
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Nag, D., Mitchell, K., Breen, P., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model. J. Vis. Exp. (137), e57767, doi:10.3791/57767 (2018).

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