Summary
Zebrafisk er en naturlig Vibrio cholerae vært og kan bruges til at sammenfatte og studere den hele smitsomme cyklus fra kolonisering til transmission. Vi viser her, hvordan man vurdere V. cholerae kolonisering niveauer og kvantificere diarré i zebrafisk.
Abstract
Vibrio cholerae er bedst kendt som det infektiøse agens, der forårsager sygdom hos mennesker kolera. Uden for menneskelig vært findes V. cholerae primært i vandmiljøet, hvor det interagerer med en bred vifte af højere akvatiske arter. Hvirveldyr fisk er kendt for at være en miljømæssig vært og er en potentiel V. cholerae reservoir i naturen. Både V. cholerae og den teleost fiskearter Danio rerio, almindeligvis kendt som zebrafisk, stammer fra det indiske subkontinent, tyder på en mangeårig interaktion i akvatiske miljøer. Zebrafisk er en ideel model organisme til at studere mange aspekter af biologi, herunder infektionssygdomme. Zebrafisk kan være hurtigt og nemt koloniseret af V. cholerae efter eksponering i vand. Tarm kolonisering af V. cholerae fører til produktion af diarré og udskillelsen af replikerede V. cholerae. Disse udskilles bakterier kan derefter gå at kolonisere nye fisk værter. Her, vi viser, hvordan man skal vurdere V. cholerae-tarm kolonisering i zebrafisk og hvordan man kan kvantificere V. cholerae-induceret zebrafisk diarré. Kolonisering model bør være nyttig for forskere, der studerer om gener af interesse kan være vigtigt for værten kolonisering og/eller miljømæssige overlevelse. Kvantificering af zebrafisk diarré bør være nyttigt at forskere studerer enhver intestinal patogen, der er interesseret i at udforske zebrafisk model system.
Introduction
Vibrio cholerae er en akvatisk, Gram-negative bakterie, der forårsager sygdom hos mennesker kolera samt sporadiske diarré1,2. V. cholerae findes i miljøet i mange områder af kloden, ofte forbundet med andre akvatiske organismer. Disse sætter organismer omfatter plankton, insekt æg masserne, skaldyr og hvirveldyr fisk arter3,4,5,6,7. Flere undersøgelser har isoleret V. cholerae fra de tarm skrifter af fisk i forskellige geografiske områder7,8,9,10. Tilstedeværelsen af V. cholerae i fisk angiver, at fisk kan fungere som en miljømæssig reservoir. Fisk kan også være impliceret i overførsel af sygdomme til mennesker og den geografiske spredning af V. cholerae stammer6.
For bedre at forstå hvordan V. cholerae interagerer med fisk, blev Danio rerio, bedre kendt som zebrafisk, udviklet som et modelsystem til at studere V. kolerae11. Zebrafisk er hjemmehørende i det sydlige Asien, herunder regionen bengalske, som menes at være den tidligste reservoir af V. cholerae. Før den første kolera pandemisk begyndelsen i 1817, havde kolera ikke været rapporteret uden for hvad der nu er Indien og Bangladesh. Derfor zebrafisk og V. cholerae næsten helt sikkert forbundet med hinanden over evolutionære tidsskalaer, tyder på at zebrafisk er en V. cholerae vært i det naturlige miljø,12.
Zebrafisk model til V. cholerae er enkel at udføre og kan bruges til at studere hele patogene V. cholerae livscyklus. Fisk udsættes for V. cholerae ved badning i vand, der har været podet med en kendt antallet af V. cholerae. Inden for et par timer finder intestinal kolonisering sted, efterfulgt af produktionen af diarré. Diarré består af mucin, proteiner, udskilte bakterier og andre tarmindhold. Graden af diarré kan kvantificeres ved hjælp af et par enkle målinger13. V. cholerae der har været udskilles af inficerede fisk kan derefter gå at inficere naive fisk, fuldfører den smitsomme cyklus. Derfor sammenfatter zebrafisk model V. cholerae human sygdom proces12,14.
De hyppigst anvendte V. cholerae dyremodeller har historisk set været mus og kaniner14,15,16,17,18. Disse modeller har været medvirkende til at føje til vores viden om V. cholerae patogenese. Men fordi mus og kaniner ikke er naturlige V. cholerae værter, der er begrænsninger for hvilke aspekter af livscyklus V. cholerae kan studeres. V. cholerae kolonisering af mus og kaniner kræver typisk mangel af tarmens mikrobiota eller en forbehandling med antibiotika for at skade den tarmens mikrobiota. Begge modeller kræver enten sonde til at introducere bakterier til mave-tarmkanalen eller kirurgisk manipulation til direkte injicere bakterier i tarmene. Zebrafisk har en fordel i, at voksne fisk med en intakt tarmens mikrobiota er let koloniseret og infektiøs proces sker naturligt, uden manipulation kræves.
Den nuværende arbejde viser udnyttelsen af zebrafisk som model i V. cholerae infektion. Infektionen, dissektion, optælling af koloniserer V. choleraeog kvantificering af diarré forårsaget af V. cholerae bliver beskrevet12,13. Denne model er tilbøjelige til at være nyttig for forskere interesseret både i sygdomsprocessen V. cholerae og i V. cholerae miljømæssige livsstil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) fra Wayne State University. Denne metode blev første gang beskrevet i Runft et al. 12
1. bestemmelse af Intestinal kolonisering niveauer
Bemærk: Tarm colonization er den mest nyttige metriske i zebrafisk model som det kan bruges til at sammenligne de relative fitness af forskellige V. cholerae stammer eller virkningerne af mutationer eller gen knockouts.
- Podning af zebrafisk ved nedsænkning
Bemærk: Denne form for eksponering ligner den naturlige løbet af infektion.- Fremstilling af V. cholerae
- Podes 5 mL af lysogeny bouillon (LB) med en isoleret V. cholerae koloni fra en LB plade og inkuberes ved 37 ° C under omrystning (180 rpm) i 6-8 timer (natten kultur).
- Podes 25 mL frisk autoklaveres LB medium i en 250 mL konisk kolbe med 50 µL af de ovenstående overnight kultur. Inkuber det i 16-18 timer ved 37 ° C under omrystning (150 rpm).
- Læs den optisk tæthed på 600 nm (OD600) i en 1/10 fortynding af overnight kultur til at estimere antallet af bakterier pr. mL (OD600 = 1 er ~ 109 CFU/mL.)
- Høste cellerne ved centrifugering ved 6.000 g i 10 min. Fjern medier med en pipette eller hæld det ud i en desinficerende løsning. Resuspend celler i steril PBS til den ønskede koncentration, typisk mellem 1 x 107 til 1 x 1010 pr. ml PBS.
Bemærk: Her, henviser vi til autoklaveres omvendt-osmose vand indeholdende 60 mg/L sea salte som steril infektion vand.
-
Podning og inkubation
- Anbring fire eller fem zebrafisk i et 400 mL bægerglas indeholdende 200 mL sterilt infektion vand.
- Der tilsættes 1 mL af V. cholerae (fra skridt 1.1.1.4.) for at få den ønskede infektion koncentration (typisk 5 x 104 til 5 x 107 CFU/mL) i 200 mL infektion vand.
- Bægerglasset dækkes med et perforeret låg til at forhindre, at fiskene springer ud; toppen af en 200 µL tip box fungerer godt for dette.
- Label hver bægerglas og placere dem i et glas-front inkubator, indstillet på 28 ° C for varigheden af forsøget.
-
Procedure for kortvarig eksponering
Bemærk: En kortvarig udsættelse for V. cholerae (typisk 6 h) efterfulgt af fjernelse af inoculating bakterier er nyttigt for at studere transmission og en mere nøjagtig kvantificering af udskilte bakterier.- Efter 6 h af eksponering, udøse bægerglas vandet gennem et fiskenet til at indsamle fisk. Kassér den inficeret vand ind i en beholder med blegemiddel til at dræbe V. cholerae.
- Placer den fjernede fisk i et bæger 200 ml sterilt infektion vand. Tillade fisk svømme i denne rent vand i 5 min. til at fjerne overflade bakterier fra fisken.
- Gentag den netto procedure (trin 1.2.2) og læg fisken i en ny bæger 200 mL sterilt infektion vand. Holde fiskene i dette bæger for varigheden af forsøget.
- Fremstilling af V. cholerae
- Aktiv dødshjælp
- Når eksperimentet har nået det ønskede slutpunkt, tage en prøve af infektionen vand (15 mL er normalt tilstrækkelig) til at tillade udskilte bakteriel tæller og måling af diarré (såsom mucin assay, proteinindhold og OD) hvis ønsket (afsnit 2).
- Hæld resten af vandet gennem et fiskenet (til at indsamle fisk) i blegemiddel til at dræbe V. cholerae i vandet.
- Læg fisken i et bægerglas, der indeholder infektion vand plus 336 µg/mL ethanol 3-aminobenzoat methanesulfonate (tricaine), og der inkuberes fisk i denne tricaine løsning for 20 min på RT.
Bemærk: Fiskenet blev steriliseret med en 10% blegemiddelopløsning.
- Dissektion
- Forberedelse af fisk
- Øse en fisk ud af tricaine løsningen med en engangs plastikske og placere den på dissekere overfladen.
- Position fisk med sin ventrale side opad og pin det gennem den nederste kæbe med den stumpe ende af pin vinklet fra midten af kroppen. Placer en anden pin lige posteriort for anus, også vinklet væk fra kroppen.
- Eksponering af og tarmkanal
- Vatpind den ventrale overflade af fisk med en fnugfri serviet dyppet i 70% ethanol.
- Sterilisere en skalpel og markriyor saks ved at dyppe dem i 70% ethanol og flammende dem.
- Gør et lille snit på langs i maven lige under huden af gennemtrængende skalaer og ved hjælp af en skalpel. Pas på ikke at skære for dybt, da tarmkanalen er placeret lige under huden.
- Ved hjælp af saks, udvide indsnittet forsigtigt langs længden af kroppen, skære ikke dybere end huden niveau og undgå anus.
- To laterale skære med saks mod lederen af fisk til at tillade en åbning af snittet.
- PIN huden på hver side af de laterale indsnit at dissekere overfladen, Lystfiskeri benene ud, væk fra kroppen.
Bemærk: Tips af benene var tidligere steriliseret ved flambering dem med alkohol.
-
Fjernelse af og tarmkanal
Bemærk: Tarmkanalen bør være synlig som en bleg, meget tynde rør på toppen af andre organer.- Flamme-sterilisere pincet og derefter bruge dem til at fjerne hele tarmkanalen (typisk 12-15 mm i længden). Placer tarmen ind i en homogenisering rør indeholdende glasperler (Se trin 1.4.1–1.4.2) og 1 mL af 1 x PBS eller LB, på is.
- Forberedelse af fisk
- Homogenisering
- Forbered homogenisering rør på forhånd ved at hælde ~1.5 g af 1 mm glasperler til 2 mL skruelåg rør (fylde dem ca halvvejs) og derefter sterilisere dem ved autoklavering.
- Der tilsættes 1 mL sterilt LB eller 1 x PBS.
- Når zebrafisk tarme er blevet tilføjet (trin 1.3.3.1) til rør, skrue lågene på meget stramt, og derefter sikre rør i vortex homogeniseringsapparat.
- Homogeniseres prøver for 1 min på den maksimale indstilling, så cool dem på køl i 1-2 min. Gentag denne homogenisering cyklus én gang mere for en fuldstændig homogenisering.
Bemærk: Flere alternative metoder til homogenisering virker også.
- Kvantificere intestinal kolonisering niveauer
- Forberede rør (lille glas reagensglas eller 1,5 mL microcentrifuge rør) til seriel fortynding af homogenatet ved at tilføje 900 µL af LB eller 1 x PBS hver tube. For hver fisk, forberede 5 – 6 rør og gøre 10-fold serielle fortyndinger af den intestinale homogenatet ved at tilføje 100 µL af homogenatet til det første rør, vortexing det til mix, og derefter tilføje 100 µL fra den første rør til det andet rør.
- Gentag denne fremgangsmåde, indtil alle fortyndinger har udarbejdet.
- Plade 100 – 200 µL af hver fortynding på LB agar plader der indeholder 100 µg/mL af streptomycin (hvis du bruger Streptomycin resistente stammer) og 40 µg/mL X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). Inkuber plader ved 30 ° C i 16-18 h.
- Efter natten inkubation, tælle V. cholerae kolonier på pladerne, enten ved hjælp af en automatiseret koloni counter eller manuelt optælling af kolonierne; Det er nyttigt at markere de optalte kolonier med en markør spids.
- Bestemme CFU pr. fisk tarmen ved at multiplicere kimtal med fortyndingsfaktoren af suspensionen, under hensyntagen til den diskenhed, der blev forgyldt.
2. måling af fisk diarré
Bemærk: Fire forskellige målinger blev brugt til at vurdere fisk diarré: mucin niveauer i vandet, de samlede udskilte protein niveauer i vandet, OD600 af vandet, og V. cholerae CFU i vand13. Diarré bliver normalt visuelt tydeligt ca 6 h efter zebrafisk eksponering for V. cholerae som beskrevet ovenfor.
-
Bestemme mucin niveauer
Bemærk: Mucin sekretion er induceret under V. cholerae kolonisering og er en god målestok for udskillelse niveauer, især tidligt i infektionen13. Mucin assay er en variation på mikrotiter periodiske syre Schiff assay19.- Forberede følgende materialer: 50% (w/v) periodiske syre stamopløsning og 0,1% periodiske syre brugsopløsning (10 µL af 50% periodiske syre bestanden tilsættes 5 mL af 7% eddikesyre — brug umiddelbart efter at gøre), mucin standarder, 96-brønd mikrotiter plader, Schiff reagens.
- Forberede mucin standarder ved at suspendere de følgende mængder af mucin (fra et svin mave type III) i en natrium acetat buffer (100 mM natrium acetat, 5mM EDTA, pH til 5,5 med iseddike): 400 µg/mL, 300 µg/mL, 200 µg/mL, 150 µg/mL , 100 µg/mL, 75 µg/mL, 50 µg/mL, 25 µg/mL og 10 µg/mL.
Forbered pladen ved at tilføje 100 µL af infektion vand i hver brønd, der skal bruges i analysen som følger: blank 1 x PBS; mucin standarder som beskrevet ovenfor, eller en vandprøve fra fisk infektion. Gøre hver prøve i tre eksemplarer.
- Forberede mucin standarder ved at suspendere de følgende mængder af mucin (fra et svin mave type III) i en natrium acetat buffer (100 mM natrium acetat, 5mM EDTA, pH til 5,5 med iseddike): 400 µg/mL, 300 µg/mL, 200 µg/mL, 150 µg/mL , 100 µg/mL, 75 µg/mL, 50 µg/mL, 25 µg/mL og 10 µg/mL.
- Tilsæt 50 µL af frisk 0,1% periodiske syre løsning til hver godt med en multikanalpipette og bland det af pipettering op og ned flere gange.
- Pak pladen stramt ind i plastikfolie og der inkuberes ved 37 ° C i 1-1,5 timer.
- Cool plade ned til stuetemperatur for 5-10 min. tilsættes 100 µL af Fuchsin løsning (Schiff's reagens) til hver brønd, og med pipette overfoeres op og ned at blande det.
- Wrap pladen i plast wrap og der inkuberes ved stuetemperatur på en vuggende platform, indtil farve har udviklet; farven er generelt udviklet indenfor 20 min. læse absorbans på 560 nm med en pladelæseren.
- Afbilde en mucin standardkurve (OD560vs µg/mL mucin standard). Bestemme mucin niveauer af ubekendte ved at identificere hvor OD560 for hver ukendte falder på standardkurven og læse den tilsvarende mucin koncentration for den pågældende værdi.
- Forberede følgende materialer: 50% (w/v) periodiske syre stamopløsning og 0,1% periodiske syre brugsopløsning (10 µL af 50% periodiske syre bestanden tilsættes 5 mL af 7% eddikesyre — brug umiddelbart efter at gøre), mucin standarder, 96-brønd mikrotiter plader, Schiff reagens.
-
Bestemme protein niveauer
NOTE: Bortset fra mucin, samlede protein niveauer i vandet er en anden proxy for niveauer af diarré (overskyet, flydende afføring) produceret af fisken. Denne procedure bruger en standard Bradford analyse til at anslå protein niveauer. Protein niveauer er skønnet baseret på en bovint serumalbumin (BSA) standardkurven.- Blandes 100 µL af en af BSA standarder (se note nedenfor) eller 100 µL af infektion vand (vand fra bægerglasset indeholdende de inficerede fisk) med 900 µL af Bradford assay reagens (Pierce protein assay reagens fungerer godt for dette) i en engangs kuvette. Inkuber alle prøverne ved stuetemperatur i 2 min.
Bemærk: Følgende BSA standarder blev brugt: 1.800 µg/mL, 1000 µg/mL, 750 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL, 50 µg/mL, og 25 µg/mL. BSA standarder blev fortyndet i autoklaveres destilleret vand. - Læs OD660 af hver standard eller prøve dem ved hjælp af et spektrofotometer.
- Plot BSA standardkurven (OD660vs µg/mL). Bestemme protein niveauer af ubekendte ved at identificere hvor OD660 for hver ukendte falder på BSA standardkurven og læse den tilsvarende mucin koncentration for den pågældende værdi.
- Blandes 100 µL af en af BSA standarder (se note nedenfor) eller 100 µL af infektion vand (vand fra bægerglasset indeholdende de inficerede fisk) med 900 µL af Bradford assay reagens (Pierce protein assay reagens fungerer godt for dette) i en engangs kuvette. Inkuber alle prøverne ved stuetemperatur i 2 min.
-
Foranstaltning OD600
Bemærk: Forekomsten af diarré (overskyet, flydende afføring) er synligt tydeligt efter flere h og en simpel OD600 bestemmelse kan bruges til at kvantificere dette.- Vend røret indeholdende infektion vand flere gange at jævnt distribuere indholdet. Der tilsættes 1 mL af vandprøven til et engangs kuvette. Brug 1 mL sterilt infektion vand som den negative kontrol.
- Udføre en "blank" måling ved hjælp af spektrofotometret på 600 nm ved hjælp af en negativ kontrolprøve. Læse hver vandprøve på 600 nm, og Optag resultaterne.
-
Bestemmelse af udskilles V. cholerae CFU/mL efter infektion
Bemærk: En større komponent af diarré produceret af zebrafisk udskilles V. cholerae. Bestemmelse af CFU/mL kan anvendes til formål såsom estimering bakteriel replikering i fisk og tarmkanal og som en foranstaltning af en smitsom dosis i transmission eksperimenter. Denne foranstaltning gøres bedst, når en forbigående infektion har fundet sted. Hvis en 24 h infektion er anvendt, vil dette assay måle den kombinerede inokulum plus den udskilte V. cholerae.- Tag en vandprøve på det ønskede tidspunkt og seriefremstillede fortynd det som tidligere beskrevet.
- Plade de serielle fortyndinger på selektiv medier (LB-agar indeholdende streptomycin eller en anden passende antibiotika eller Dataforbindelser) og dem der inkuberes ved 30 ° C i 24 timer.
- Kolonierne. Beregne CFU pr. mL vand, som beskrevet i trin 1,5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
V. cholerae kolonisering af zebrafisk tarm skrifter
For at give et eksempel på de typiske kolonisering niveauer vi observere, podes vi 5 x 106 CFU af den EL Tor V. cholerae pandemistamme N16961 i 200 mL vand i et bægerglas, der indeholder flere zebrafisk. Efter 6 h af infektion, fisken skylles i ferskvand og overført til et bægerglas på 200 mL autoklaveres infektion vand som beskrevet i protokollen. 18 h efter overførsel (eller 24 timer efter den primære infektion), fisken var aflivet, og deres tarme er taget til at bestemme kolonisering niveauer. Ca. 105 til 106 V. cholerae celler pr. fisk tarmen blev normalt observeret i tarmkanalen 24 h efter infektionen (hpi) (figur 1) med 5 x 106 inokulum størrelse.
Kvantificering af fisk diarré
Diarré blev kvantificeres ved hjælp af de fire enkle assays beskrevet ovenfor. Den første analyse, CFU af udskilte V. cholerae, er vist i figur 1. Serielle fortyndinger af vand 24 hpi var belagt for at tælle V. cholerae CFU. Relativt høje niveauer af udskilte V. cholerae er normalt observeret; i dette eksempel, ca. 105 V. cholerae pr. mL vand blev opdaget. Ikke-inficerede fisk producerer ikke detectible V. cholerae (data ikke vist).
Andet analysen bruges til at kvantificere diarré er udskilte mucin. Figur 2 viser effekten af tre forskellige V. cholerae smitsomme doser på mucin niveauer i vand 24 hpi. En højere infektiøse dosis er korreleret med en højere udskillelse af mucin i vandet. Som kontrol, fire fisk blev placeret i en identisk bægerglas med vand, men PBS blev tilføjet i stedet for V. cholerae suspension. Kontrol fisk udskilles meget lidt mucin.
Den tredje diarré kvantificering assay er OD600 af vand 24 hpi. Som vist i figur 3, var OD600 af dette vand betydeligt højere i bægerglasset indeholdende zebrafisk inficeret med V. cholerae end i bægerglasset der indeholder ikke-inficerede zebrafisk.
Endelig, total protein niveauer blev målt i vandet. Vand indeholdende de inficerede fisk indeholdt total protein niveauer næsten dobbelt så stor som observeret i det vand, der indeholder den ikke-inficerede fisk (figur 4). Kollektivt, illustrere disse fire assays virkningerne V. cholerae infektion har på zebrafisk udskillelse.
Figur 1: Tarm kolonisering af zebrafisk af V. cholerae. Fisken var inficeret til 6 h, derefter vaskes og inkuberes i 24 timer i alt. I venstre side af figuren illustrerer den samlede CFU pr. tarmen af fire fisk (sorte prikker.) I højre side af figuren angiver V. cholerae CFU pr. mL målt i vand 24 hpi (sorte firkanter.) Middel til begge datasæt er vist med en stor horisontal linje og standardafvigelsen er angivet af fejllinjer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Mucin assay. Tre forskellige V. cholerae smitsomme doser blev anvendt, sammen med en ikke-inficerede kontrol, som angivet under x-aksen. Middelværdier af mucin opdaget i vandet af den modificerede periodiske syre Schiff (PAS) assay er angivet med de sorte bjælker over hver infektiøse dosis. Fejllinjer angiver standardafvigelsen. Stjernerne tyder p < 0,05 som fastsat af studerende er parrede t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: OD600 assay som en proxy for diarré. OD600 af 1 mL af vand fra bægre indeholdende enten V. cholerae inficeret eller ikke-inficerede fisk blev målt. De sorte bjælker angiver gennemsnitsværdien og fejllinjer angiver standardafvigelsen. Stjernerne tyder p < 0,05 som fastsat af studerende er parrede t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Total protein niveauer i vand. Den samlede protein blev anslået af en Bradford assay som beskrevet. De sorte bjælker angiver de gennemsnitlige værdier og fejllinjer angiver standardafvigelsen. Stjernerne tyder p < 0,05 som fastsat af studerende er parrede t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For zebrafisk er en forholdsvis ny model til at studere V. cholerae men holder meget lovende for fremtidige opdagelsen af hidtil ukendte aspekter af V. cholerae biologi og patogenese11,12,13 . Voksen zebrafisk model har fordelene ved at være både en naturlig V. cholerae host, der indeholder intakt, modne tarmens mikrobiota og en miljømæssig model. Ulemperne ved modellen er, at to store menneskelige virulens faktorer, kolera toksin og toksin-coregulated pilus, ikke er påkrævet for zebrafisk kolonisering eller patogenesen12. Men dette kunne alternativt ses som en anden fordel, der kan muliggøre identifikation af roman V. cholerae kolonisering faktorer og lette undersøgelsen af andre V. cholerae toksiner. Dette er især relevant for langt størstedelen af ikke-O1/O139 "miljø" V. cholerae stammer, hvoraf de fleste kan ikke producere kolera toxin eller giftstof-coregulated pilus og endnu kan stadig forårsage sygdom20,21.
De problemer, der er mest sandsynligt vil opstå ved hjælp af denne model er relateret til den rigelige tarmens mikrobiota. Plating på nonselective medier vil gøre denne model væsentlige ubrugelig som det vil være umuligt at identificere V. cholerae kolonier. Selv benytter selektiv eller delvis selektivt medie såsom LB plus streptomycin eller Dataforbindelser, vil en baggrund af kolonier fra tarmens mikrobiota være til stede. Det er vigtigt at kontrollere, at de kolonier, der er regnes er bona fide V. cholerae af lappe kolonierne produceret af klædningen på mindre selektive medier på et meget selektivt medie såsom TCBS. Alternativt, indsættelse af en bedre selektiv markør i genomet af en stamme af interesse ville i høj grad forenkle identifikation af V. cholerae fra tarm homogeniseret.
Fordelen ved assays bruges til at kvantificere zebrafisk diarré er, at de er enkel og billig at udføre13. Ulempen er, at disse assays er i vid udstrækning uspecifik, bortset fra tælle udskilte V. cholerae CFU direkte, og det kan blive vanskeligt at afgøre, om diarré er direkte på grund af V. cholerae patogenese, eller nogle andre stressor . Udviklingen af variationer af disse eller andre assays til at forbedre deres specificitet vil sandsynligvis støtte fremover målinger af V. cholerae patogenese i zebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Takket være melodi Neely, Jon Allen, Basel Abuaita og Donna Runft for deres bestræbelser på at udvikle zebrafisk model. Forskningen rapporteret her blev støttet af det nationale Institut for allergi og smitsomme sygdomme af National Institutes of Health under award numre R21AI095520 og R01AI127390 (til Jeffrey H. Withey). Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Shaker incubator | New Brunswick Scientific, Edison, NJ | Excella E25 | |
| Incubator | NUAIRE, Plymouth, MN | Auto Flow | |
| Spectrophotometer | Thermo, Waltham, MA | Geaesys 6 | |
| Vortex homogenizer | Minibeadbeater24 | 112011 | |
| Weighing Machine | Ohaus, Columbia, MD | Adventurer Pro | |
| Heat Stirer | Corning, Corning, NY | PC-420D | |
| Burner | |||
| automated colony counter | REVSCI | 120417B | |
| Materials | |||
| 400 ml glass beakers | Pyrex | ||
| perforated lids | Microtip holder with holes from tip box | ||
| disposable plastic spoons | Office Depot, Boca Raton, FL | D15-25-7008 | |
| Fish Tank System | Aquaneering, San Diego, CA | ||
| RO Water Purifier | Aqua FX | TK001 | |
| Fish net | Marina | ||
| fish food | Tetra fin | ||
| Brine Shrimp | Red jungle brand | O.S.I. pro 80 | |
| Styrofoam board | |||
| Pins | |||
| Scalpels | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 10000-10 | |
| Forceps | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 11223-20 | |
| Vannas scissors | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 15000-11 | |
| 2 ml screw cap tubes | Fisher Scientific, Hampton, NH | 02-681-375 | |
| 1 mm glass beads | Bio Spec | 11079110 | |
| Glass beads for spreading | Sigma, St. Louis, MO | 18406-500G | |
| Petri plate | Fisher Brand, Hampton, NH | FB0875713 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Midsci, Valley Park, MO | AVSS1700 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning Falcon, Corning, NY | 352098 | |
| Test tubes | Pyrex | 9820 | |
| Glass Pipette | Fisher Brand, Hampton, NH | 13675K | |
| Micro pipettes | Sartorius Biohit, Göttingen, Germany | m1000/m200/m20 | |
| Tips | Genesee Scientific, San Diego, CA | 24-150RS/24-412 | |
| Chemicals | |||
| Instant Ocean salts | |||
| phosphate buffered saline | VWR Life Science, Radnor, PA | K813-500ml | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma, St. Louis, MO | A5040 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | Sigma, St. Louis, MO | 10651745001 | |
| Schiff’s reagent | Sigma, St. Louis, MO | 84655-250 mL | |
| periodic acid | Fisher Scientific, Hampton, NH | 10450-60-9 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma, St. Louis, MO | M2378-100G | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific, Hampton, NH | 9046-46-8 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Reagent | Thermo, Waltham, MA | 22660 | |
| LB medium | |||
| Trypton | BD Biosciences, San Jose, CA | 211705 | |
| Teast Extract | BD Biosciences, San Jose, CA | 212750 | |
| NACL | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP358-212 | |
| Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 214010 | |
| TCBS Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 265020 | |
| DCLS Agar | Sigma, St. Louis, MO | 70135-500gm | |
| Software | |||
| Microsoft office | |||
| Prism 5 |
References
- Harris, J. B., LaRocque, R. C., Qadri, F., Ryan, E. T., Calderwood, S. B. Cholera. The Lancet. 379 (9835), 2466-2476 (2012).
- Dutta, D., et al. Vibrio cholerae non-O1, non-O139 serogroups and cholera-like diarrhea, Kolkata, India. Emerging Infectious Diseases. 19 (3), 464-467 (2013).
- Huq, A., et al. Ecological relationships between Vibrio cholerae and planktonic crustacean copepods. Applied and Environmental Microbiology. 45 (1), 275-283 (1983).
- Halpern, M., Landsberg, O., Raats, D., Rosenberg, E. Culturable and VBNC Vibrio cholerae: interactions with chironomid egg masses and their bacterial population. Microbial Ecology. 53 (2), 285-293 (2007).
- Broza, M., Halpern, M. Pathogen reservoirs. Chironomid egg masses and Vibrio cholerae. Nature. 412 (6842), 40 (2001).
- Halpern, M., Izhaki, I. Fish as hosts of Vibrio cholerae. Frontiers in Microbiology. 8 (282), (2017).
- Senderovich, Y., Izhaki, I., Halpern, M. Fish as reservoirs and vectors of Vibrio cholerae. PLoS ONE. 5 (1), e8607 (2010).
- Traore, O., et al. Occurrence of Vibrio cholerae in fish and water from a reservoir and a neighboring channel in Ouagadougou, Burkina Faso. The Journal of Infection in Developing Countries. 8 (10), 1334-1338 (2014).
- Booth, L. V., Lang, D. A., Athersuch, R. Isolation of Vibrio cholerae non-01 from a Somerset farmworker and his tropical fish tank. Journal of Infection. 20 (1), 55-57 (1990).
- Torres-Vitela, M. A., et al. Incidence of Vibrio cholerae in fresh fish and ceviche in Guadalajara, Mexico. Journal of Food Protection. 60 (3), 237-241 (1997).
- Rowe, H. M., Withey, J. H., Neely, M. N. Zebrafish as a model for zoonotic aquatic pathogens. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 96-107 (2014).
- Runft, D. L., et al. Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).
- Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model. Applied and Environmental Microbiology. , (2017).
- Klose, K. E. The suckling mouse model of cholera. Trends in Microbiology. 8 (4), 189-191 (2000).
- Formal, S. B., Kundel, D., Schneider, H., Kunevn,, Sprinz, H. Studies with Vibrio cholerae in the ligated loop of the rabbit intestine. British Journal of Experimental Pathology. 42, 504-510 (1961).
- Williams, E. M., Dohadwalla, A. N., Dutta, N. K. Diarrhea and accumulation of intestinal fluid in infant rabbits infected with Vibrio cholerae in an isolated jejunal segment. The Journal of Infectious Diseases. 120 (6), 645-651 (1969).
- Spira, W. M., Sack, R. B., Froehlich, J. L. Simple adult rabbit model for Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea. Infection and Immunity. 32 (2), 739-747 (1981).
- Ritchie, J. M., Rui, H., Bronson, R. T., Waldor, M. K. Back to the future: studying cholera pathogenesis using infant rabbits. mBio. 1 (1), (2010).
- Kilcoyne, M., Gerlach, J. Q., Farrell, M. P., Bhavanandan, V. P., Joshi, L. Periodic acid-Schiff's reagent assay for carbohydrates in a microtiter plate format. Analytical Biochemistry. 416 (1), 18-26 (2011).
- Balaji, V., Sridharan, G., Jesudason, M. V. Cytotoxicity of non O1, non O139 Vibrios isolated from fresh water bodies in Vellore, south India. Indian Journal of Medical Research. 110, 155-159 (1999).
- Hasan, N. A., et al. Nontoxigenic Vibrio cholerae non-O1/O139 isolate from a case of human gastroenteritis in the U.S. Gulf Coast. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 9-14 (2015).
