Summary
Hier beschrijven we het standaardprotocol voor de detectie van β-galactosidase-activiteit in vroege hele muis embryo's en de methode voor paraffine segmenteren en counterstaining. Dit is een gemakkelijke en snelle procedure om te controleren van genexpressie tijdens de ontwikkeling die ook kan worden toegepast op weefselsecties, organen of gekweekte cellen.
Abstract
De Escherichia coli LacZ gen, codering van β-galactosidase, wordt grotendeels gebruikt als verslaggever voor de expressie van genen en als een tracer in cel lineage studies. De klassieke histochemische reactie is gebaseerd op de hydrolyse van het substraat X-gal in combinatie met ijzer(III) en ferro ionen, die een onoplosbare blauwe neerslag die gemakkelijk produceert te visualiseren. Daarom, β-galactosidase-activiteit dient als een marker voor het patroon van de uitdrukking van het gen van belang aangezien de ontwikkeling te werk gaat. Hier beschrijven we het standaardprotocol voor de detectie van β-galactosidase-activiteit in vroege hele muis embryo's en de latere methode voor paraffine segmenteren en counterstaining. Bovendien is voorzien in een procedure voor de verduidelijking van de hele embryo's aan X-gal kleuring dieper de regio, van de embryo beter te visualiseren. Consistente resultaten worden verkregen door het uitvoeren van deze procedure, hoewel optimalisatie van omstandigheden nodig is om te minimaliseren van achtergrond activiteit. Beperkingen in de bepaling moeten ook worden overwogen, met name met betrekking tot de grootte van het embryo in het hele mount kleuring. Onze protocol biedt een gevoelige en een betrouwbare methode voor de detectie van de β-galactosidase tijdens de ontwikkeling van de muis die verder kan worden toegepast op de cryostaat secties, evenals de hele organen. Dus de dynamische gen expressiepatronen in de gehele ontwikkeling kunnen gemakkelijk worden geanalyseerd met behulp van dit protocol in hele embryo's, maar ook gedetailleerde expressie op het cellulaire niveau kan worden beoordeeld na paraffine segmenteren.
Introduction
Om specifiek gen expressiepatronen beschrijven, is het gebruik van verslaggever genen als markeringen primordiaal van Drosophila tot zoogdieren geweest. In proeven met dieren van transgene en knockout, is het bacteriële β-galactosidase-gen (LacZ) van Escherichia coli (E. coli) één van de wijdst gebruikte1,,2,3, 4. β-galactosidase (β-gal) katalyseert de hydrolyse van β-galactosides (zoals lactose) in haar monosacchariden (glucose en galactose)5. Zijn meest gebruikte substraat is X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), een glycoside dat is gehydrolyseerd door β-galactosidase schadeveroorzakende in 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole en galactose. De eerste wordt geoxideerd tot een dimeer omgezet die, wanneer gebruikt in combinatie met kalium ferri- en ferro-cyanide, produceert een karakteristieke onoplosbare, blauwe kleur neerslag (Figuur 1)6.
Het LacZ -gen begon te worden gebruikt als een verslaggever gen meer dan dertig jaar geleden7,8. Meestal, LacZ is ingebracht stroomafwaarts van een endogene promotor in de plaats van de open leesraam, zodat het kan worden gebruikt in bacteriële en cel cultuur te visualiseren van cellen met een bepaalde invoegen, evenals in transgene dieren als een tracer van endogene Genetische expressiepatronen tijdens ontwikkeling9. In dit verband is de visualisatie van β-galactosidase-activiteit uitgebreid gebruikt in Drosophila te begrijpen van de ontwikkelings- en cellulaire processen van afzonderlijke cellen tot hele weefsels. Drosophila genetica gunst de generatie van stabiele lijnen waarin een gemodificeerde constructie van de P-element met het gen van de verslaggever dat lacz is ingevoegd op willekeurige locaties in het genoom. Dus, wanneer geplaatst onder invloed van enhancer elementen kan hij haar expressie rijden op een specifieke wijze van weefsel, waardoor een systematische analyse van de expressiepatronen van veel genen tijdens de afgelopen twee decennia10. Verder staat het gebruik van transgene muizen LacZ genuitdrukking controleren ook detectie van gene recombinatie gebeurtenissen door Cre-loxP gemedieerde recombinatie en lokalisatie van de mutant embryonale stamcellen derivaten in chimeer analyses 11, die de controle van LacZ expressie in specifieke weefsels zo goed als stoffelijk vergemakkelijkt. Ook in hele embryo's, kan detectie van de β-galactosidase-activiteit produceren differentiële kleuring patronen bij verschillende intensiteiten die gemakkelijk kunnen worden waargenomen in de verschillende ontwikkelingsstadia te analyseren van tijdelijke wijzigingen in genexpressie 8,12.
In dit artikel presenteren we een protocol om te visualiseren van genexpressie via X-gal vlekken in het weefsel van de hele berg op vroege ontwikkelingsstadia van muis embryo's. Wij presenteren deze histochemische methode als een zeer gevoelige en goedkope techniek die nauwkeurige detectie van de gelabelde cellen in de hele berg specimens of op cellulair niveau gunsten nadat paraffine-weefsels of embryo's ingebedde. De methode geschikt is voor de directe visualisatie van vlekken in het weefsel van de muis met de minimale achtergrond in vergelijking met andere methoden13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de Commissie op de ethiek van dier experimenten van de CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) en de Comunidad Autónoma de Madrid om minimale dierenleed.
1. verzamelen van embryo's van zwangere muizen (van E8.5 naar E12.5)
- Offeren zwangere muizen door cervicale dislocatie of CO2 inademing. De dag van de eerste waargenomen vaginale plug werd beschouwd als embryonale dag 0,5 (E0.5).
- Leg het dier in de liggende positie op het absorberend stootkussen en reinigen van de buikhuid van de muis met 70% ethanol.
Opmerking: Steriliteit is niet vereist in de volgende stappen. - Knijpen en til de buikhuid met behulp van de muis-tooth pincet.
- Maak een incisie door de huid en de buikwand, 2 tot 4 cm verticaal over de middellijn van de buik met behulp van chirurgische scharen.
- De buik bloot en verwijderen van de baarmoeder horens van de moeder met pincet snijden bloedvaten langs de innerlijke kromming van de baarmoeder met een chirurgische schaar.
- Verwijder de tekenreeks van embryo's en het overbrengen in een petrischaal op ijs met 10 mL ijskoud 0,01 M fosfaatbuffer zoutoplossing pH 7.4 (PBS).
- Zorgvuldig ontleden de embryo's uit van de baarmoeder onder een stereomicroscoop in een petrischaal met 10 mL verse ijskoude PBS. Pak de spier muur met horlogemakers pincet om het vruchtwater sac bloot te stellen, en vervolgens het scheuren van het vruchtwater membraan om de bijgevoegde embryo en de dooierzak met behulp van de tips van de verlostang te verwijderen.
- Verzamelen van de embryo's van littermate van zwangere muizen in vroege stadia (van E8.5 naar E12.5) (Figuur 2).
- De embryo's overbrengen in een verse schotel met 10 mL koude 1 x PBS met gebogen pincet of voor zeer kleine embryo's (E8.5-E9.5), kunststof overdracht pipetten te gebruiken voor het verzamelen van de monsters zonder embryo schade.
- Voordat u begint de fixatie, neemt een embryonale monster in de buis van een microcentrifuge voor genotypering door snijden van een klein stukje van het embryo of het nemen van het vruchtwater membraan in de kleinste embryo's (van E8.5 naar E9.5) met horlogemakers pincet.
Opmerking: LacZ genotypering wordt bepaald door de polymerase-kettingreactie (PCR) inleidingen: forward, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´; omkeren, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´.
2. fixatie van muis embryo 's
- Pipetteer elk embryo in een tube van 2 mL microcentrifuge met een afgeronde basis met 1 mL 1 x PBS.
Opmerking: Voer alle stappen in het protocol in deze buizen met agitatie met behulp van een rollende shaker. - De embryo's in 1 x PBS voor 1 minuut bij kamertemperatuur te elimineren van het resterende bloed wassen. Gebruik plastic overdracht pipetten te veranderen van vloeistoffen in de buizen.
- Corrigeer het embryo in 1 mL van 0,125% Glutaaraldehyde op ijs.
Opmerking: De tijd van fixatie hangt af van de grootte van het embryo: 20 min voor E8.5-E9.5 embryo's, 30 min voor E10.5 embryo's en 1 h voor E12.5 embryo's. - Verwijder de fixeer en wassen van de embryo's in 1 x PBS tweemaal gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur alvorens het monster te verwerken voor X-gal kleuring.
3. hele Mount β-galactosidase histochemie van muis embryo 's
- Voorbereiden X-Gal Rinse buffer en X-Gal kleuring van de oplossing vóór het begin van de procedure (Zie tabel 1 en Tabel van materialen). Gebruik een wild-type (WT) littermate embryo's als negatieve controles voor de enzymatische reactie.
- Incubeer de embryo's X-Gal Rinse buffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (Figuur 2).
- Incubeer de embryo's X-Gal kleuring oplossing van 2 h tot overnachting bij 37 ° C beschermd tegen licht. Monitor de kleur reactie periodiek via een ontleden Microscoop totdat voldoende intensiteit van de blauwe vlekken zonder de achtergrond in het embryo wordt waargenomen. Houden van de pH van de oplossing tussen 8 en 9 te verminderen achtergrond tijdens de hele kleuring. Als de kleurstofoplossing begint te licht, vervangen door verse substraat oplossing uit te breiden van de enzymatische reactie.
- Zet de reactie stop wanneer het gewenste signaal wordt verkregen door wassen van embryo's in een microcentrifuge buis met 1 mL 1 x PBS tweemaal voor elke 10 min bij kamertemperatuur.
- 1 mL 4% paraformaldehyde (PFA) opnieuw corrigeren, gebeitst embryo's overbrengen voor 1 h naar girale bij 4 ° C.
Opmerking: Embryo's kunnen worden opgeslagen in 4% PFA/PBS voor langere tijd bij 4 ° C of onmiddellijk kan worden verwerkt voor het segmenteren. Deze laatste fixatie stap is cruciaal voor de instandhouding op lange termijn van de kleuring patroon. - Het wassen van de embryo's in 1 mL 1 x PBS tweemaal gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Optie 1: Schakel embryo's door onderdompeling in een reeks van oplossingen met toenemende concentraties van glycerol (20%, 40%, 60% en 80% glycerol in 1 x PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in elke oplossing.
Opmerking: Wassen van embryo's in 80% glycerol voor langere tijden, zelfs dagen, totdat ze worden gewist, en vervolgens in 80% glycerol bij 4 ° C bij deze stap (Figuur 2 opgeslagen). Een zeer kleine hoeveelheid natrium azide ora kristal van thymol toe te voegen aan de embryo's opgeslagen bij 4 ° C in glycerol of 1 x wordt PBS aanbevolen om te voorkomen dat schimmel groei. Na verrekening, kunnen hele mount embryo's worden gebruikt voor het fotograferen (stap 4). - Optie 2: Verwerken van embryo's voor paraffine insluiten en segmenteren gebruikend microtome (Figuur 2). Document het expressiepatroon in geheel gebeitst embryo's vóór het segmenteren (stappen 4 en 5).
4. fotografie van de embryo's hele Mount
- Verhard om te fotograferen hele mount gekleurd embryo's voorafgaand aan afdelen, hen overbrengen in een petrischaal bereid met een basis van 1-2% agarose in 1 x PBS.
- Betrekking hebben op het embryo volledig met 10 mL 1 x PBS in de agarose beklede gerechten om uitdroging en reflectie tijdens het fotograferen door de vloeistof te voorkomen.
- Het embryo ondergedompeld in 1 x PBS met pincet oriënteren. Voor oudere embryo's (E10.5-E12.5), maak een klein gaatje in de agarose met een tang te plaatsen en plaats het model binnen het onder verschillende hoeken en om te voorkomen dat de vrij zwevende tijdens fotografie.
- Plaats de schotel in het werkgebied van de stereomicroscoop, met behulp van het licht uitgezonden (onder fase). Wisselen tussen de 'dark-veld' en 'helder-veld' aanpassingen om de gewenste verlichting tijdens fotografie en voor het optimaliseren van de doorschijnendheid van het monster.
Opmerking: Gebruik fiber optic verlichting voor later-stadium embryo's te voorkomen van reflectie op het oppervlak van het embryo. Bij het fotograferen van gewiste embryo's, volgt u dezelfde procedure maar hen overbrengen in een petrischaal met 100% glycerol en hen volledig te onderdompelen.
5. de paraffine insluiten en segmenteren van X-gal gekleurd embryo 's
- Paraffine insluiten
- Verwijderen van de X-gal gekleurd embryo's bij 4 ° C (stap 3.5) en spoel ze met 1 mL 1 x PBS driemaal te elimineren van de overdaad aan fixeerspray.
- Elk embryo overbrengen in een histologie cassette met pincet.
- Plaats de cassettes die met de embryo's in een bekerglas en vervolgens uitdrogen door hen door een gesorteerde ethanol reeks bij kamertemperatuur: 70% ethanol, eenmaal voor 30 min; 96% ethanol, twee keer voor 30 min elke; 100% ethanol, tweemaal voor elke 30 min.
Opmerking: Embryo's kunnen worden opgeslagen in 70% ethanol voor een onbepaalde tijd bij 4 ° C tot aanvang van het proces van uitdroging. - Laat de hele cassette in isopropanol en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
- Met behulp van Tang, de cassettes overbrengen in een glas kleuring trog met voorverwarmde isopropanol en laat in een oven bij 60 ° C gedurende 30 minuten.
- Plaats de cassettes in een nieuwe glas kleuring trog met een mengsel van isopropanol en de 50% / 50% gesmolten paraffine en laat gedurende 4 uur in een oven van 60 ° C.
- Incubeer de cassettes met de embryo's met twee wijzigingen voor gesmolten paraffine, 30 minuten bij 60 ° C elke.
- Aan het einde van de laatste paraffine wassen, opent u de cassette en elk embryo overbrengen in een aparte weefsel schimmel om het monster onder een stereomicroscoop weer te embedding.
- Vul de put met gesmolten paraffine bij 60 ° C. Gebruik verwarmd pincet voorzichtig oriënteren het embryo in de mal te houden de was gesmolten.
Opmerking: De juiste stand van het monster is een cruciale stap voor afdelen van het embryo in het gewenste vlak. - Voordat paraffine in de mal stolt, plaats een cassette zonder het deksel op de bovenkant van het blok en vul deze met gesmolten paraffine. Laat de resterende wax afkoelen totdat gestold overnachting bij kamertemperatuur.
- Zodra de paraffine is volledig verhard, de massief blok uit de mal te verwijderen en bewaren van de paraffineblokken bij kamertemperatuur of bij 4 ° C tot14segmenteren.
- Paraffine segmenteren
- Het mes op de microtoom oriënteren en het opzetten van 5-7 µm van dikte. 5.2.2. cool de paraffine-blok op het ijs en snijd het voor de productie van een kubus of een piramide.
- Koppelt het blok aan de microtoom houder met behulp van een kleine hoeveelheid gesmolten wax.
- Het blok voor optimale scherpe oriënteren. Sectie de paraffineblokken in 5-7 µm dikke sneden bij kamertemperatuur met behulp van standaard microtoom.
- Plaats een fijn penseel met de secties in een waterbad bij kamertemperatuur voor manipuleren en segmenten te selecteren.
- Secties uit het waterbad met een microscoopglaasje halen en ze vervolgens overbrengen naar een waterbad bij 42 ° C voor het uitrekken.
- Verwijderen van secties van het waterbad en plaats ze voorzichtig in hechting Microscoop dia's.
- De dia's in een oven bij 37 ° C's nachts om de secties zich volledig houden goed drogen, anders, ze kunnen krijgen verloren tijdens de kleuring.
Opmerking: Bewaren de dia's bij 4 ° C tot starten van kleuring van procedures.
- Deparaffinization en Counterstaining van X-Gal-gekleurd paraffine secties
- Zet de dia's op een microscoopglaasje lade in een oven bij 60 ° C gedurende ten minste 45 min om de paraffine meer vloeistof.
- Overdracht van de dia's op een rek en glas kleuring gerechten gebruikt u de volgende stappen uitvoeren: dompelen de rek in de kleuring potten met alcoholen van PM10 voor volledige paraffine verwijdering en hydratatie van de weefsels: isopropanol voor 5 min op 60 ° C; isopropanol gedurende 3 minuten; 100% ethanol voor 2 min; 96% ethanol voor 1 min; 70% ethanol voor 1 minuut bij kamertemperatuur.
- Spoel secties in gedistilleerd water tweemaal om ervoor te zorgen dat er geen resten van alcohol zijn.
- Counterstain delen met een vlek (bijvoorbeeld nucleaire-Fast Red oplossing) voor 5 min (meestal tussen 3-8 min) bij kamertemperatuur (Figuur 2).
Opmerking: Deze kleuring helpt te onthullen van de algehele structuur van het weefsel in de secties. - Na kleuring, wassen van de dia's in gedestilleerd water gedurende 1 minuut en controleer sectie vlekken in de Microscoop.
Opmerking: Als de gewenste kleuring te zwak is, counterstain afdelingen opnieuw voor een langere tijd. - Uitdrogen van de secties in de volgende serie met toenemende concentraties van ethanol: twee wasbeurten in ethanol van 95% voor elke 2 min, twee wast in 100% ethanol voor 2 minuten elk, en, om te voorkomen dat ontbinding van de blauwe kleur precipitaten, slechts één snelle wassen in xyleen.
- De dia's uit het rek één voor één verwijderen en leg ze op een stuk papier. Mount en dekglaasje aan elke Schuif met behulp van een synthetische, permanente montage medium.
Opmerking: Xyleen is een ontvlambaar product waarvan dampen irriterend zijn en schadelijk voor de menselijke gezondheid en voor waterorganismen zijn. Het moet binnen een kap worden gemanipuleerd en vereist het gebruik van de juiste beschermende uitrusting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier tonen we de resultaten van de toepassing van het standaardprotocol voor de β-galactosidase histochemische reactie met behulp van X-gal als het substraat in hele muis embryo's (Figuur 1 en Figuur 2). Met behulp van dit protocol, onderzoeken we membraan type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp) expressie op verschillende embryonale ontwikkelingsstadia (E9.5, E11.5 en E12.5) met behulp van Mt4-mmp mutant muizen die uitdrukking geven aan de verslaggever van de LacZ onder de controle van de endogene Mt4-mmp promotor (Figuur 3, Figuur 4en Figuur 5)9,15. Mt4-mmp is een endopeptidase die is vastgebonden aan de celmembraan door middel van een anker inositol glycophosphatidyl (GPI). Hoewel Mt4-mmp in verschillende menselijke kanker is geconstateerd en is geweest in verband met de progressie van de tumorgroei, is informatie over haar proteolytic activiteit tegen componenten van de extracellulaire matrix zeer beperkt is tot nu toe. Bovendien heeft bijna niets gemeld over de rol en de uitdrukking van Mt4-mmp tijdens de embryonale ontwikkeling9,16.
Wild type (WT), Mt4-mmpLacZ / + heterozygoot (HT) en knock-out (KO) littermate embryo's worden verwerkt in parallel laten werken voor het X-gal kleuring protocol (Figuur 2). Meerdere besturingselementen moeten worden opgenomen tijdens de kleuring proces voor het valideren van het specifieke karakter van de procedure. Dus, WT embryo's worden gebruikt als negatieve controles voor de histochemische reactie en dienen te controleren van niet-specifieke X-gal labeling (Zie figuur 3A-D en figuur 4A-C). Ook, om te voorkomen van aspecifieke achtergrond, de pH van de X-Gal kleurstofoplossing moet worden gehandhaafd tussen de 8 en 9 gedurende de hele kleuring. In figuur 3E, worden β-gal-positieve cellen gevisualiseerd in hele mount HT embryo's in de somieten en de intersomitic therapieën in de E9.5 stadium. Om te melden de precieze locatie van de gekleurde cellen, embryo segmenteren is echter vereist om te visualiseren onder de Microscoop gemeld genexpressie in weefselsecties bij cellulaire resolutie. In dit geval worden LacZ-positieve cellen gevonden in de somieten, de dorsale aorta, de intersomitic therapieën, evenals de perineural vasculaire plexus in weefselsecties (pijlen in figuur 3F-H). Deze resultaten correleren met het expressiepatroon gemeld voor de Mt4-mmp in deze muis embryonale stadia9, waarmee wordt aangegeven dat deze techniek gemakkelijk reproduceerbaar zijn en betrouwbare. Zoals verwacht, zijn β-gal activiteitsniveaus hoger in de KO-embryo's ten opzichte van de HT als gevolg van de aanwezigheid van twee kopieën van het gen verslaggever LacZ (figuur 3I-L). Echter alleen HT LacZ / + embryo's moeten worden geanalyseerd in studies van gen-expressiepatronen en KO weefsel wordt gebruikt als een proof of concept om de haalbaarheid van de methode sinds vanwege het ontbreken van de gerichte gen van belang aantonen, β-gal positieve cellen kunnen abnormaal gelegen in de laatste.
Bij het uitvoeren van dit protocol, oudere embryo's (van E10.5 naar E12.5) zijn niet doorschijnend en daarom zijn de meest zichtbare X-gal gekleurd van regio's die dicht bij het oppervlak. Dus, een alternatieve stap naar deze methode is het wissen van embryo's door wast in oplossingen met toenemende concentraties van glycerol. In Figuur 4, de E12.5 LacZ gebeitste embryo's werd duidelijk met behoud van de X-gal kleuring, waardoor ons te fotograferen dieper gekleurd regio's van het embryo in de stereomicroscoop. Zoals eerder gemeld deze embryonale stadium, werd labeling gelokaliseerd in verschillende gebieden van de hersenen, de ledematen, de follikel van vibrissa en het puntje van de staart9. Echter, als men wil verkrijgen van een cellulaire resolutie, embryo's moeten worden ingesloten in paraffine, gesegmenteerd en microscopisch onderzocht.
In Figuur 5, werd immunohistochemistry met anti-β-gal antilichamen gebruikt om te bevestigen dat de expressie van Mt4-mmp waargenomen door middel van verslaggever LacZ kleuring. Dus, β-gal-positieve cellen werden ontdekt in het zwembad van motoneurons van het ruggenmerg muis op E11.5 met behulp van beide benaderingen, die de specificiteit van het protocol hier gemeld (figuur 5A, B bevestigt).
Figuur 1 . Schematische illustratie van de E. coli LacZ reporter gene codering voor de β-galactosidase en de histochemische reactie gekatalyseerd door dit enzym. In de traditionele kleuring ontstabiel β-galactosidase het substraat 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) op 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole. Vervolgens wordt deze intermediair geoxideerd, waardoor dimerisatie en vorming van het eindproduct blauw gekleurde (5, 5'-dibroom-4, 4'-dichloorethaan indigo). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Diagram waarin de belangrijkste stappen van het standaardprotocol voor de detectie van β-galactosidase-activiteit worden weergegeven. Muis embryo's zijn verzameld en verwerkt voor de hele berg X-gal kleuring. Nadat de histochemische kleuring uitgevoerd volgens het protocol, kunnen hele mount embryo's (optie 1) gewist met wast in oplossingen met toenemende concentraties van glycerol en vervolgens gefotografeerd in een stereomicroscoop, of in ingesloten (optie 2) paraffine, gesegmenteerd en counterstained. Afkortingen: RT, kamertemperatuur. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . X-gal kleuring van E9.5 WT en Mt4-mmpLacZ / + geheel-mount embryo's en weefselsecties. Met behulp van de standaard X-gal histochemische assay, werden transgene embryo's met de LacZ gen onder de controle van Mt4-mmp promotor geanalyseerd voor β-gal activiteit. WT (A), HT (E) en KO (ik) E9.5 hele mount embryo's werden verwerkt voor de opsporing van de β-galactosidase-expressie. Paraffine secties verkregen deze embryo's op het niveau van het ruggenmerg toestaan visualisatie van de kleuring met cellulaire resolutie. Zoals verwacht, β-gal positieve cellen afwezig waren in WT secties (B-D), terwijl de intensiteit van labeling hoger in de KO (J-L) ten opzichte van de HT weefselsecties (F-H was). Doorsneden door de neurale buis onthullen β-gal activiteit in de ontwikkelingslanden somieten, dorsal aorta en de perineural vasculaire plexus. Afkortingen: da, dorsal aorta; FLB, voorpoot bud; h, hart; m, mesencephalon; NT, chorda; OTV, otic vesikel; OV, optic vesikel; PNVP, perineural vasculaire plexus; s, Somiet; t, telencephalon. Schaal bars: 500 μm (A, E, ik); 100 μm (B, F, J); 50 μm (C, G, K); 20 μm (D, H, L). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Photomicrographs van WT en HT X-gal gekleurd muis embryo's op E12.5 vóór (A, D) en na (B, C, E, F) clearing met wast in verhoogde glycerol. Zoals verwacht, WT embryo's tonen geen verslaggever LacZ expressie (A-C) terwijl labeling werd ontdekt in de ledematen (witte pijlpunten), de primordium van de follikel van vibrissa (witte pijl), het puntje van de staart (zwarte pijl) en hersenen van Mt4-mmpLacZ / + embryo's in dit stadium (D-F)9. (E, F) Na verrekening in glycerol, embryo's werd doorschijnend en labelen kunnen gemakkelijker gevisualiseerde in diepere delen van het embryo, zoals wordt weergegeven in het mesencephalon en de telencephalon (witte pijlen in F). Schaal bar: 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Histochemische en immunohistochemische detectie van de β-galactosidase. (A) X-gal kleuring (in blauw) onthult de uitdrukking van Mt4-mmp in het zwembad van motoneurons in een paraffine-sectie van het ruggenmerg in de embryonale fase van E11.5. (B) Immunohistochemistry met anti-β-gal antilichamen (in rood) bevestigd de expressie van Mt4-mmp in het ruggenmerg-motoneurons in de dezelfde embryonale stadium in cryostaat secties. Afkortingen: fp, vloerplaat; MN, motoneurons; Schaal bar: 100 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Tabel 1. Recepten en oplossingen voor dit protocol vereiste. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het LacZ-gen van E. coli is wijd verbeid gebruikt als verslaggever in studies van gen-expressiepatronen vanwege de hoge gevoeligheid en gebruiksgemak detectie. Dit protocol beschrijft een klassieke methode voor het opsporen van β-gal expressie gebaseerd op een enzymatische reactie die is eenvoudig en snel uit te voeren en goedkoop. Deze methode kan ook worden toegepast zonder belangrijke wijzigingen in de hele berg embryo's, intact organen, cryostaat weefselsecties of gekweekte cellen.
Nauwkeurige toepassing van deze methode resulteert in een robuuste en interpreteerbaar kleuring. Gelijktijdige controles en latere confirmatieve stappen zijn echter sterk aanbevolen. In dit verband is het huidige protocol parallel uitgevoerd in wild type littermate embryo's gebruikt als negatieve controles die dienen om te controleren van niet-specifieke X-gal kleuring. Bovendien, expressie gegevens verkregen wanneer met behulp van β-gal kleuring wordt bevestigd door de western-blot en kwantitatieve-PCR (Q-PCR) analyse of door middel van β-gal immunohistochemistry (Figuur 5), die in combinatie met andere antistoffen maakt het ook mogelijk de identificatie van specifieke celtypes uiting van LacZ9. Fixatie moet rekening worden gehouden, om te bewaren de enzymatische activiteit van de β-galactosidase en om te minimaliseren van achtergrond tijdens de kleuring. Embryo's moeten dus worden vastgesteld in Glutaaraldehyde, waardoor de resultaten van het meest consistente en betrouwbare in vergelijking met paraformaldehyde fixatie17. Bovendien, fixatie tijd is van cruciaal belang en moet worden bepaald empirisch voor iedere embryonale fase, aangezien de overmatige fixatie kan verminderen β-galactosidase-activiteit. In dit opzicht kunnen hele mount embryo's worden opgelost door onderdompeling of perfusie afhankelijk van het stadium van de embryonale en grootte. Transcardial perfusie is dus aangeraden voor embryo's ouder dan E14.5 en postnatale exemplaren om ervoor te zorgen dat de fixeerspray alle regio's van het monster bereikt. Kleinere embryo's (van E8.5 tot E12.5) kunnen worden vastgesteld door onderdompeling en verwerkt rechtstreeks voor in toto X-gal kleuring (Figuur 2). Dient te worden vermeld dat X-gal kleuring van muis embryo's jonger dan E14.5 kan worden uitgevoerd als de hele mount. In dit geval worden gebeitst cellen dicht bij het oppervlak gemakkelijk gedetecteerd door middel van β-gal kleuring. Het kan zelfs zo, dat dieper labeling wazig verschijnt of zelfs kleurstof niet in het weefsel, vooral in oudere embryo's doordringen doet voorkomen. In dit geval, of organen of volwassen muizen weefsel kan worden ontleed, X-gal gekleurd, en gevisualiseerd onder een stereomicroscoop. Vectorafbeeldingsbestanden en microscopisch onderzoek van het gekleurd weefsel van belang is echter meer geschikt (Figuur 2).
Ondanks het protocol van de efficiëntie, kan kleuring hele embryo's en detectie worden lastig. Bijvoorbeeld, de nieren, de testis, de secretoire klieren bevatten bijbal en gastro-intestinale tractus hoge hoeveelheden van endogene zure β-galactosidase18 die met de interpretatie van de resultaten als gevolg van achtergrond activiteit interfereren kunnen. Om die reden moet de histochemische reactie worden uitgevoerd onder alkalisch pH voorwaarden (pH 8-9) gedurende de kleuring, aangezien E. coli β-galactosidase een optimale pH van 7.3 heeft. Dit zal helpen om beduidend te verminderen achtergrond en om de gunst van bacteriële β-galactosidase activiteit19,20,21,22. Ook opgemerkt moet worden dat het lang kleuring tijden leiden verzuring van de X-gal kleurstofoplossing tot kan, ten gunste van een grotere achtergrond. Bovendien, de β-galactosidase-activiteit gaat verloren bij zware incubatie temperaturen boven 50 ° C, maar niet minder dan 42 ° C. In onze handen, incubatie met X-gal substraat werkt beter wanneer verlaten 's nachts bij 37 ° C. Na kleuring en vóór de stap na fixatie is het belangrijk voor alle X-gal reactie materiaal zo zorgvuldig en zo snel mogelijk om te elimineren precipitaten uit de histochemische reactie die kan worden gedeponeerd in de weefselsectie afwassen.
Zoals hier wordt weergegeven, is schakelen van embryo's in glycerol belangrijk voor het maken van het weefsel doorschijnend met behoud van de X-gal kleuring en weefsel histologie. Dus, de embryo's duidelijk geworden en labelen kan worden gevisualiseerd in diepere regio's die onder de stereomicroscoop. Echter voor het analyseren van de exacte locatie van de gekleurde cellen, afdelen van het monster is vereist, en daarom, clearing is niet essentieel. In dit geval, kan door de volgende aanbevelingen vermeld bij de specifieke methoden, monsters worden zorgvuldig paraffine ingesloten en verdeelde. Tijdens het insluiten gedehydreerd ethanol weefsel moet worden ondergedompeld in een mengsel van isopropanol-paraffine. Isopropanol en wordt gebruikt om de gunst van de vervanging van ethanol in de steekproef en ter vergemakkelijking van het weefsel inbedden in paraffine23. In sommige protocollen, wordt xyleen gebruikt in plaats van isopropanol voor hetzelfde doel. Het gebruik van xyleen presenteert echter nadelen ten opzichte van isopropanol, zoals de krimp en verharding van het monster als gevolg van het wegnemen van weefsel lipiden24 en het toxicologische profiel als een ontvlambare en irriterend product25. Oranje olie gebaseerde clearing agenten zijn een van de veiligste alternatieven voor xyleen omdat zij toestaan dat snelle wissen zonder de toxiciteit van xyleen evenals uitstekende weefsel structuur behoud26. Ook, als met behulp van xyleen, dit deel van het protocol moet worden verminderd bij maximum, aangezien X-gal kleuring kan diffuus en19worden verloren. Na afdelen, counterstaining met kleurstoffen (bijvoorbeeld nucleaire snel rood) wordt aanbevolen om histologische identificatie uiting te geven aan de cellen te vergemakkelijken. Deze kleuring procedure is snel, waarvoor slechts één stap, en het roze uiterlijk biedt goed contrast met het blauw gekleurde X-gal neerslag. Deze counterstaining is echter alleen geschikt voor de montage van de niet-waterige media (d.w.z. DPX).
Deze klassieke methode is geschikt voor het opsporen van β-galactosidase-activiteit, sinds X-gal in combinatie met kalium ferro - en Hexacyanoferraat produceert een karakteristieke blauwe neerslag die doet niet vervagen of bleekmiddel gemakkelijk en, als goedgebouwde, kan gedetecteerd zelfs onder de ontleden Microscoop. Er zijn andere wijzigingen van het oorspronkelijke protocol. Met behulp van beschikbare substraten zoals zalm-gal (6-Chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), Magenta-gal (5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) of Bluo-gal (β-D-galactopyranoside van de 5-Bromo-3-=(indool-3-yl)-azijnzuur))13,19 , of vervanging van de klassieke X-gal/FeCN voor Tetrazolium zouten sterk gevoeligheid van detectie13,19 verbeteren kunnen. Dit wordt met name aanbevolen om hoge gevoeligheid detectie van lage expressie niveaus van proteïne en mRNA materiaal. Echter, wanneer gebruikt voor te lang, om het even welk van deze procedures kan leiden tot hoge achtergrondniveaus en dus zorgvuldig beheer van de voorwaarden altijd aan te raden is, vooral gezien dat langdurige incubatie perioden kunnen vergemakkelijken aspecifieke kleuring wijten aan endogene β-galactosidase activiteit13,27. Wat dit laatste betreft is het altijd raadzaam om gebruik van ijzer(III) kalizouten om te optimaliseren van de betrouwbaarheid van de techniek en valkuilen te vermijden.
Een belangrijke beperking van deze methode is dat de klassieke X-gal kleuring procedure produceert een onoplosbare blauwe neerslag die gemakkelijk kan worden gedetecteerd door de lichte microscopie, maar kan geen co lokalisatie studies door TL of confocal microscopie in weefsel secties. Een mogelijke manier om te overwinnen deze beperking zou moeten gebruiken van antilichamen tegen β-gal (Zie Figuur 5) gecombineerd met immunodetection voor een specifieke celtype. Echter, als de expressie laag zijn of als de hoge achtergrond, immunolabeling het moeilijk maken kan om te detecteren of de verslaggever-gen uitgedrukt in een bepaalde cel. Met name is een nieuwe techniek gemeld te verkrijgen van de confocal afbeeldingen van hoge kwaliteit op basis van de uitstoot van de fluorescentie geproduceerd door de X-gal overhaaste28. Bovendien, deze methode is compatibel met immunofluorescentie en X-gal positieve cellen28duidelijk kan identificeren. Enzymatische verslaggevers zoals het LacZ-gen bieden het voordeel dat ze gevoeliger dan tl, die opmerkelijk wanneer etikettering, als expressie vooral laag zijn. In dit opzicht is de huidige techniek ideaal voor de detectie van microRNA29, daarom toelaat zowel kwalitatieve evaluatie van de expressiepatronen en kwantificering van expressie niveaus bewezen. Dubbele kleuring wordt gebruikt voor het detecteren van β-gal activiteit en mRNA aanwezigheid via in situ hybridisatie technieken, die zeer nuttige informatie om te onderzoeken het expressiepatroon van endogene genen bieden kunnen terwijl β-gal bewakingsactiviteit in hetzelfde monster 30. echter beide β-gal vlek en in situ hybridisatie detectie reacties kleur incompatibiliteit kunnen weergeven tijdens het dubbele kleuring. Het kiezen van een meer geschikt substraat, zoals S-gal, wordt aanbevolen in de specifiek geoptimaliseerde methoden30.
Deze veelzijdige methode heeft uitgebreid te bestuderen van de genfunctie in het kader van de ontwikkelingsbiologie is gebruikt. Dus, het LacZ gen heeft aangenomen voor de analyse van genetische expressiepatronen tijdens de embryonale ontwikkeling kloppen in een gerichte gene locus. LacZ is een gemeenschappelijk verslaggever-gen voor de studie van cis-acteren regelgevende elementen (versterkers) die betrokken zijn bij het regisseren van genexpressie in beperkte regio's van het embryo, het verstrekken van informatie over de activiteiten van de transcriptie van de promotor van belang31 ,32,33. Ook, het is vaak gebruikt in de opsporing van genetische recombinatie gebeurtenissen door Cre-gemedieerde recombinatie van loxP sites, die is met name handig voor het opsporen van embryonale stamcellen derivaten in cel lot toewijzing experimenten of in cel transplantaties. Gen-trap mutagenese in embryonale stamcellen produceert afgeknotte eiwitten gesmolten aan β-gal dat evaluatie van promotor activiteit onder fysiologische omstandigheden34toelaat. Voor al deze benaderingen, transgene dieren uitvoering van LacZ en het uiten van bacteriële β-galactosidase zijn gegenereerd in rat35,36,37,38, Xenopus39 kip of zebravis40. Tot nu toe, deze techniek is gebruikt in Drosophila ter verbetering van de visualisatie van de genexpressie ruimtelijk en stoffelijk als gevolg van de beschikbaarheid van afleidbare gene expressiesystemen, en weefsel en cel-specifieke p-LacZ markering lijnen41 ,10. Het is vermeldenswaard dat afgezien van deze vele toepassingen waarbij transgene en knockoutstadia dieren, LacZ verslaggever gen is gebruikt in de hele weefsels evenals gekweekte cellen te voorspellen van de rol van genen in ziekte in biomedisch onderzoek. Een relevant voorbeeld hiervan is de studie van het verouderingsproces met betrekking tot de reacties op stress, de onderdrukking van de tumor, of de ontwikkeling. Verouderend cellen zijn gemakkelijk te ontdekken in situ zowel in vivo als gevolg van hun karakteristieke overexpressie en accumulatie van endogene lysosomale beta-galactosidase42,43. Vandaar, β-galactosidase wordt gebruikt als een verouderend biomarker in kwantitatieve tests in kanker gekweekte44 cellen.
In samenvatting beschrijven we een haalbaar en geoptimaliseerde procedure ter vergemakkelijking gemakkelijk detectie van β-galactoside activiteiten in muis embryonale weefsel. De huidige methode kunt wijzigingen op basis van het weefsel geselecteerd en het substraat gebruikt. Vandaar, is deze methode van het veelzijdige en rendabele werkzaam met de juiste besturingselementen is speciaal geschikt voor het gebruik met hele muis embryo's alsook op dunne histologische secties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële interesse hebben.
Acknowledgments
We bedank de histopathologische Service voor hun technische bijstand bij het Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Wij danken ook Dr. Motoharu Seiki voor vriendelijk bieden Mt4-mmpLacZ muizen, en Dr. Alicia G. Arroyo om ons project te steunen en voor haar kritische lezing van het manuscript. Wij wensen Peter Bonney dank voor dit artikel proeflezen. Dit werk werd gesteund door Universidad Europea de Madrid door middel van een subsidie uit (# 2017UEM01) aan CSC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
| 99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
| 99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
| Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
| Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
| Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
| Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
| Microscope Cover Glasses 24x60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
| Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
| Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
| Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
| Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
| Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
| Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
| Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
| Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
| pHmeter | Crison | Basic 20 | |
| Optic fiber | Optech | PL2000 |
References
- Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
- Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182 (1994).
- Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
- Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
- Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
- Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
- Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
- Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767 (2017).
- Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux's Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
- Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
- Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
- Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
- Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797 (2011).
- Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
- Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
- Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
- Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
- Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
- Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
- Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937 (2013).
- Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
- Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
- Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
- Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
- Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
- Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
- Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
- Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
- Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
- Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
- Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
