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Developmental Biology

Seguimiento de la expresión génica mediante la detección de actividad de β-galactosidasa en embriones de ratón todo

Published: June 26, 2018 doi: 10.3791/57785
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 2,3
1Faculty of Biomedical and Health Sciences, Universidad Europea de Madrid, 2Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), 3School of Doctoral Studies and Research, Universidad Europea de Madrid
* These authors contributed equally

Summary

Aquí describimos el protocolo estándar para la detección de actividad de β-galactosidasa en embriones de ratón todo principios y el método de parafina de seccionamiento y contratinción. Este es un procedimiento fácil y rápido para controlar la expresión génica durante el desarrollo que puede aplicarse también a las secciones de tejido, órganos o células cultivadas.

Abstract

La Escherichia coli LacZ codificación del gene, β-galactosidasa, se utiliza en gran parte como reportera de expresión génica y como trazador en estudios de linaje celular. La reacción histoquímica clásica se basa en la hidrólisis del sustrato X-gal en combinación con los iones férricos y ferrosos, que produce un precipitado insoluble de azul que es fácil de visualizar. Por lo tanto, actividad β-galactosidasa sirve como marcador para el patrón de expresión del gen de interés, medida que avanza el desarrollo. Aquí describimos el protocolo estándar para la detección de actividad de β-galactosidasa en embriones de ratón todo temprano y el posterior método de parafina de seccionamiento y contratinción. Además, se proporciona un procedimiento para clarificar todo embriones para visualizar mejor coloración en regiones más profundas del embrión de X-gal. Resultados se obtienen mediante la realización de este procedimiento, aunque optimización de condiciones de la reacción es necesaria para minimizar la actividad de fondo. Limitaciones en el análisis se deben también considerar, particularmente con respecto al tamaño del embrión en el Monte toda la coloración. Nuestro protocolo proporciona un sensible y un método confiable para la detección de β-galactosidasa durante el desarrollo del ratón que puede ser aún más aplicado a las secciones de criostato como órganos enteros. Así, los patrones de expresión dinámica gene a lo largo del desarrollo se pueden analizar fácilmente mediante el uso de este protocolo en embriones de todo, pero también expresión detallada a nivel celular puede ser evaluada después de parafina secciones.

Introduction

Para describir los patrones de expresión del gen específico, el uso de genes como marcadores del reportero ha sido primordial de Drosophila a mamíferos. En experimentos con animales transgénicos y knockout, el gen bacteriano de la β-galactosidasa (LacZ) de Escherichia coli (e. coli) es uno de los más utilizados1,2,3, 4. β-galactosidasa (β-gal) cataliza la hidrólisis de β-galactósidos (como la lactosa) en sus monosacáridos (glucosa y galactosa)5. Su sustrato más utilizado es X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), un glucósido que se hidroliza por que dé lugar a 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole y galactosa β-galactosidasa. La primera es oxidada en un dimer que, cuando se utiliza combinado con potasio ferri- y ferro-cianuro, produce un característico insoluble, precipitado de color azul (figura 1)6.

El gene del LacZ comenzó a usarse como un gen reportero hace más de treinta años de7,8. Por lo general, se inserta el LacZ aguas abajo de un promotor endógeno en el lugar del marco de lectura abierto, por lo que puede ser utilizado en la cultura bacteriana y celular para visualizar las células que contienen un relleno especial, así como en animales transgénicos como un trazador de endógeno patrones de expresión génica durante el desarrollo9. En este sentido, la visualización de actividad β-galactosidasa se ha ampliamente utilizada en Drosophila para entender los procesos del desarrollo y celulares de las células a los tejidos todos. Genética de la Drosophila a favor de la generación de líneas estables en los que una construcción de elemento P modificada que contiene el gen reportero que lacZ es insertada al azar localizaciones en el genoma. Así, cuando se coloca bajo la influencia de elementos de reforzador puede conducir su expresión en una forma específica de tejido, que ha permitido el análisis sistemático de los patrones de expresión de muchos genes durante los últimos dos décadas10. Además, el uso de ratones transgénicos para controlar la expresión del gen LacZ también permite la detección de eventos de recombinación génica en Cre-loxP mediada por recombinación y la localización de los derivados de células madre embrionarias mutantes quiméricos análisis 11, que facilita el control de la expresión de LacZ en tejidos específicos, así como temporal. También, en embriones de todo, la detección de la actividad β-galactosidasa puede producir patrones de tinción diferencial en diferentes intensidades que se pueden observar convenientemente a través de diferentes etapas de desarrollo para analizar cambios temporales en la expresión del gen 8,12.

En este artículo, presentamos un protocolo para visualizar la expresión génica a través de X-gal la coloración en el tejido de montar todo en las primeras etapas del desarrollo de embriones de ratón. Presentamos este método histoquímico como una técnica altamente sensible y económica que favorece la detección precisa de las células etiquetadas en especímenes de todo Monte o a nivel celular después de embebido de parafina tejidos o embriones. El método permite la visualización directa de la coloración en el tejido de ratón con el Fondo mínimo en comparación con otros métodos13.

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Protocol

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité sobre el ética de los experimentos animales el CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) y la Comunidad Autónoma de Madrid para garantizar el mínimo sufrimiento de los animales.

1. recolección de embriones de ratones embarazadas (desde E8.5 para E12.5)

  1. Sacrificio de ratones embarazadas por dislocación cervical o por inhalación de CO2 . El día de la primera observa tapón vaginal era considerado embrionario día 0.5 (E0.5).
  2. Coloque el animal en la posición supina en el cojín absorbente y limpiar la piel abdominal de ratón con etanol al 70%.
    Nota: No es necesaria la esterilidad en los siguientes pasos.
  3. Pellizcar y levantar la piel abdominal con unas pinzas diente de ratón.
  4. Hacer una incisión a través de la piel y la pared abdominal, 2 a 4 cm verticalmente a través de la línea media del abdomen con tijeras quirúrgicas.
  5. Exponer el abdomen y quitar los cuernos uterinos de la madre con pinzas corte vasos a lo largo de la curvatura interna del útero con tijeras quirúrgicas.
  6. Eliminar la cadena de los embriones y transferir a un plato de Petri en el hielo que contiene 10 mL helado 0.01 M tampón fosfato salino pH 7.4 (PBS).
  7. Disecar cuidadosamente los embriones fuera del útero bajo un estereomicroscopio en una placa de Petri con PBS helado fresco 10 mL. Sujete la pared muscular con fórceps de relojeros para exponer el saco amniótico y luego rasgar la membrana amniótica para eliminar el embrión cerrado y el saco vitelino con las puntas de las pinzas.
  8. Recoger los embriones littermate de ratones embarazadas en las primeras etapas (desde E8.5 para E12.5) (figura 2).
  9. Transfiera los embriones a un plato fresco con 10 mL x 1 frío PBS utilizando fórceps curvado o embriones muy pequeños (E8.5 E9.5), utilizar pipetas de transferencia de plástico para recoger las muestras sin daño del embrión.
  10. Antes de comenzar la fijación, tome una embrionaria muestra en un tubo de microcentrífuga para genotipificación por corte un pequeño trozo del embrión o la membrana amniótica en los embriones más pequeños (de E8.5 a E9.5) con pinzas de relojeros.
    Nota: Genotipado de LacZ es determinada por cartillas de la reacción en cadena (PCR) polimerasa: avance, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´; inversa, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´.

2. fijación de embriones de ratón

  1. Transferir cada embrión en un tubo de microcentrífuga de 2 mL con una base redondeada que contiene 1 mL 1 x PBS.
    Nota: Realice todos los pasos en el protocolo en estos tubos con agitación utilizando un agitador de balanceo.
  2. Lave los embriones en PBS 1 x durante 1 min a temperatura ambiente para eliminar la sangre restante. Pipetas de transferencia plástica de uso cambiar líquidos en los tubos.
  3. Fijar el embrión en 1 mL de glutaraldehído 0.125% sobre hielo.
    Nota: El tiempo de fijación depende del tamaño del embrión: 20 min E8.5 E9.5 embriones, 30 min para embriones E10.5 y 1 h para E12.5 embriones.
  4. Retirar el fijador y lave los embriones en PBS 1 x dos veces por 10 min a temperatura ambiente antes de procesar la muestra para tinción de X-gal.

3. todo montaje de β-galactosidasa histoquímica de embriones de ratón

  1. Prepare X-Gal enjuague tampón y la solución de tinción de X-Gal antes de iniciar el procedimiento (ver tabla 1 y Tabla de materiales). Utilizar un embriones de tipo salvaje (WT) littermate como controles negativos para la reacción enzimática.
  2. Incubar los embriones en buffer de X-Gal enjuague durante 10 minutos a temperatura ambiente (figura 2).
  3. Incubar los embriones en la solución de tinción de X-Gal desde 2 h hasta toda la noche a 37 ° C, protegido de la luz. Vigilar la reacción de color periódicamente a través de un microscopio de disección hasta suficiente intensidad de la coloración azul se observa sin el fondo en el embrión. Mantener el pH de la solución entre el 8 y 9 para reducir el fondo durante la toda coloración. Si la solución de tinción se empieza a apagar luz, reemplazarlo con solución de sustrato fresco para ampliar la reacción enzimática.
  4. Detener la reacción cuando la señal deseada se obtiene por lavado de embriones en un tubo de microcentrífuga con 1 mL 1 x PBS dos veces por 10 min a temperatura ambiente.
  5. Transferir embriones teñidos a paraformaldehído al de 4% 1 mL (PFA) para volver a fijar, durante 1 hora hasta toda la noche a 4 ° C.
    Nota: Los embriones se pueden almacenar en el 4% PFA/PBS por más tiempo a 4 º C o puede ser procesado inmediatamente para seccionamiento. Este paso de fijación final es crucial para la conservación a largo plazo del patrón de coloración.
  6. Lave los embriones en PBS de 1 x 1 mL dos veces por 10 min a temperatura ambiente.
  7. Opción 1: Clara embriones por inmersión en una serie de soluciones con el aumento de las concentraciones de glicerol (glicerina 20%, 40%, 60% y 80% en PBS 1 x) por 1 h a temperatura ambiente en cada solución.
    Nota: Lave los embriones en 80% de glicerol por más tiempo, incluso días, hasta que se borran y luego almacenan en glicerol al 80% a 4 ° C en este paso (figura 2). Añadiendo una pequeña cantidad de cristal de ora de azida de sodio de timol a los embriones almacenados a 4 ° C en glicerol o 1 x PBS se recomienda para prevenir el crecimiento de moho. Después de la tala, todo Monte embriones pueden utilizarse para fotografiar (paso 4).
  8. Opción 2: Proceso de embriones para parafina inclusión y corte usando un micrótomo (figura 2). Documentar el patrón de expresión en toda manchados embriones antes de seccionamiento (pasos 4 y 5).

4. fotografía de toda montura embriones

  1. Para fotografiar todo Monte manchado embriones antes de seccionar, transferirlas a una placa de Petri preparadas con una base de solidificado agarosa 1-2% en PBS 1 x.
  2. Cubrir el embrión completamente con 10 mL 1 x PBS en los platos de agarosa recubiertas para evitar la deshidratación y la reflexión mientras fotografiaba a través del líquido.
  3. Orientar el embrión inmerso en PBS de x 1 con unas pinzas. Para embriones mayores (E10.5-E12.5), hacer un pequeño agujero en la agarosa con pinzas y coloque a la muestra dentro de la misma en diferentes ángulos y para evitar la flotación libre en fotografía.
  4. Coloque el plato en el escenario de Estereomicroscopio, usando la luz transmitida (etapa de menores). Cambiar entre el 'campo oscuro' y 'campo brillante' ajustes para configurar la iluminación deseada en fotografía y para optimizar la transparencia de la muestra.
    Nota: Use iluminación óptica de fibra para la etapa posterior de embriones para evitar la reflexión en la superficie del embrión. Al fotografiar embriones hayan borrado, siga el mismo procedimiento pero transferirlas a una placa Petri conteniendo glicerol al 100% y sumergirlos completamente.

5. parafina inclusión y seccionamiento de X-gal manchado embriones

  1. Inclusión de parafina
    1. Retire el gal X manchada embriones de 4 ° C (paso 3.5) y lavarlas con 1 mL 1 x PBS tres veces para eliminar el exceso de fijador.
    2. Transferir cada embrión en una casete de histología con unas pinzas.
    3. Colocar las cintas que contienen los embriones en un vaso de precipitados y luego deshidratar pasando a través de una serie gradual de etanol a temperatura ambiente: etanol al 70%, una vez durante 30 minutos; etanol al 96%, dos veces por 30 min cada uno; etanol 100%, dos veces por 30 minutos cada uno.
      Nota: Los embriones se pueden almacenar en etanol al 70% durante un tiempo indeterminado a 4 º C hasta comenzar el proceso de deshidratación.
    4. Incubar el casete todo en isopropanol durante 30 min a temperatura ambiente.
    5. Mediante el uso de fórceps, transferir las cintas a un vaso que contiene isopropanol precalentado a través de la coloración y dejar en el horno a 60 ° C durante 30 minutos.
    6. Los cassettes en un nuevo vidrio que contiene una mezcla de isopropanol al 50% a través de tinción / 50% derritió la cera de parafina y dejar durante 4 horas en un horno de 60 ° C.
    7. Incubar los casetes con los embriones con dos cambios de fundido de cera de parafina, 30 min a 60 C °.
    8. Al final de la colada final parafina, abrir el cassette y transferir cada embrión a un tejido separado incrustar molde para ver la muestra bajo un estereomicroscopio.
    9. Llenar el pozo con cera de parafina fundida a 60 ° C. Uso de pinzas calientes para mantener la cera fundida y orientar cuidadosamente los embriones en el molde.
      Nota: La orientación correcta de la muestra es un paso crítico para seccionar el embrión en el plano deseado.
    10. Antes de parafina se solidifica en el molde, coloque un cassette sin tapa en la parte superior del bloque y llenarlo con cera de parafina fundida. Deje enfriar el resto cera hasta que se solidificó durante la noche a temperatura ambiente.
    11. Una vez que la parafina está completamente solidificada, desmoldar el bloque sólido y almacenar los bloques de parafina a temperatura ambiente o a 4 ° C hasta14de seccionamiento.
  2. Secciones de parafina
    1. Oriente la hoja en el microtomo y configurar 5-7 μm de espesor. 5.2.2. enfriar el bloque de parafina en el hielo y cortar para producir un cubo o una pirámide.
    2. Fijar el bloque al titular del micrótomo utilizando una pequeña cantidad de cera fundida.
    3. Oriente el bloque para el corte óptimo. Sección de los bloques de parafina en rodajas de 5-7 μm a temperatura ambiente mediante micrótomo estándar.
    4. Con un pincel fino, colocar los elementos en un baño de agua a temperatura ambiente durante la manipulación y selección de rebanadas.
    5. Recoge secciones del baño de agua con un portaobjetos de microscopio y transferirlos a un baño de agua a 42 ° C para estirar.
    6. Quitar las secciones del baño de agua y colocarlos suavemente en portaobjetos de adhesión.
    7. Las diapositivas en una estufa a 37 ° C durante la noche para permitir que las secciones se adhieran completamente en seco, de lo contrario, pueden perderse durante la tinción.
      Nota: Almacene las diapositivas a 4 ° C hasta a partir de procedimientos de tinción.
  3. Parafina y contratinción de secciones de la parafina teñida de Gal X
    1. Poner los portaobjetos en una bandeja portaobjetos en horno a 60 ° C durante al menos 45 minutos hacer más fluida la cera de parafina.
    2. Transfiera los portaobjetos en un rack y usar tinción platos de vidrio para realizar los siguientes pasos: sumerja la rejilla en los recipientes de tinción que contienen alcoholes de disminuir las concentraciones de retiro completo parafina e hidratación de los tejidos: isopropanol durante 5 min a 60 ° C; isopropanol durante 3 min; etanol al 100% por 2 min; etanol al 96% por 1 min; etanol al 70% durante 1 min a temperatura ambiente.
    3. Enjuague las secciones en agua destilada dos veces para asegurarse de que no hay ningunos residuos de alcohol.
    4. Contratinción secciones con una mancha (e.g. solución Nuclear Fast Red) durante 5 minutos (generalmente entre 3-8 minutos) a temperatura ambiente (figura 2).
      Nota: Esta tinción permite para revelar la estructura general del tejido en las secciones.
    5. Después de la tinción, lave los portaobjetos en agua destilada por 1 min y verifique la sección de tinción al microscopio.
      Nota: Si la coloración deseada es muy débil, contraste las secciones otra vez por más tiempo.
    6. Deshidratar las secciones en las siguientes series con el aumento de las concentraciones de etanol: dos lavados en etanol al 95% por 2 min, dos lava en etanol al 100% por 2 min, y para evitar la disolución azul precipitados de color, un lavado rápido en xileno.
    7. Quite las diapositivas de la parrilla uno por uno y colocarlos en un pedazo de papel. Entonces Monte y cubreobjetos cada diapositiva utilizando un medio de montaje sintético, permanente.
      Nota: Xileno es un producto inflamable, cuyos vapores son irritantes y nocivos para la salud humana y para los organismos acuáticos. Debe ser manipulada dentro de una campana y requiere el uso de equipo de protección adecuado.

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Representative Results

A continuación os mostramos los resultados de la aplicación del protocolo estándar para la reacción histoquímica de β-galactosidasa utilizando a X-gal como el sustrato en embriones de ratón entero (figura 1 y figura 2). Mediante este protocolo, se examina la membrana tipo 4-matriz metaloproteinasa (Mt4-mmp) la expresión en las diferentes etapas del desarrollo embrionarias (E9.5 E11.5 y E12.5) con Mt4-mmp ratones mutantes que expresan el reportero LacZ bajo el control de la endógena MT4-mmp promotor (figura 3, figura 4y figura 5)9,15. MT4-mmp es una endopeptidasa que está anclado a la membrana de la célula a través de un ancla glycophosphatidyl de inositol (GPI). Aunque Mt4-mmp ha sido detectado en varios cánceres humanos y se ha relacionado con la progresión del crecimiento del tumor, información sobre su actividad proteolítica contra componentes de la matriz extracelular es muy limitada hasta la fecha. Además, casi nada se ha divulgado sobre la función y expresión de la Mt4-mmp durante el desarrollo embrionario9,16.

Tipo salvaje (WT), Mt4-mmpLacZ / + heterozigótico (HT) y embriones de littermate nocaut (KO) se procesan en paralelo para el protocolo de tinción de X-gal (figura 2). Varios controles deben incluirse durante el proceso de tinción para validar la especificidad del procedimiento. Así, embriones WT se utilizan como controles negativos para la reacción histoquímica y sirven para monitorear no específico X-gal etiquetado (ver Figura 4Ay Figura 3A-D -C). También, para evitar el fondo inespecífica, el pH de la solución de tinción de X-Gal debe mantenerse entre 8 y 9 en toda la mancha entera. En la figura 3E, las células β-gal-positivas se visualizan en embriones de todo Monte HT en los somitas y la vasculatura intersomitic en la etapa E9.5. Sin embargo, para informar de la ubicación precisa de las células, embrión seccionado es necesario visualizar al microscopio informó de expresión génica en las secciones de tejido celular resolución. En este caso, las células LacZ positivas se encuentran en los somitas, la aorta dorsal, la vasculatura intersomitic así como el plexo vascular perineural en secciones del tejido (flechas en figura 3F-H). Estos resultados se correlacionan con el patrón de expresión registrado para Mt4-mmp en estos mouse etapas embrionarias9, indicando que esta técnica es fácilmente reproducible y fiable. Como era de esperar, los niveles de actividad β-gal son mayores en los embriones de KO en comparación con la HT debido a la presencia de dos copias del gen reportero LacZ (figura 3I-L). Sin embargo, sólo HT LacZ / + embriones deben ser analizados en estudios de patrones de expresión génica y KO tejido se utiliza como una prueba de concepto para demostrar la viabilidad del método puesto que debido a la falta del gen específica de interés, pueden ser células positivas β-gal encuentra anormalmente en el último.

Cuando se realiza este protocolo, más embriones (de E10.5 para E12.5) no son translúcidos, y, por lo tanto, la más visible X-gal manchada las regiones son los cerca de la superficie. Así, un paso alternativo para este método es eliminar embriones lavados en soluciones con el aumento de las concentraciones de glicerol. En la figura 4, los embriones teñidos de LacZ E12.5 quedó claros manteniendo la X-gal la coloración, lo que nos permite fotografiar más teñidos de regiones del embrión en el estereomicroscopio. Como se informó anteriormente en esta fase embrionaria, etiquetado fue localizado en regiones distintas del cerebro, las extremidades, el folículo de vibrisas y de la punta de la cola9. Sin embargo, si se quiere obtener una resolución celular, embriones deben ser incrustados en parafina, seccionados y examinados microscópicamente.

En la figura 5, inmunohistoquímica con anticuerpos anti-β-gal fue utilizado para confirmar que la expresión de la Mt4-mmp observada mediante tinción de reportero LacZ. Así, las células β-gal-positivas fueron detectadas en el grupo de motoneuronas de la médula espinal de ratón en E11.5 mediante el uso de ambos enfoques, que confirma la especificidad del protocolo aquí (figura 5A, B).

Figure 1
Figura 1 . Ilustración esquemática de la reportero LacZ de e. coli gene codificación para la β-galactosidasa y la reacción histoquímica catalizada por esta enzima. En la tradicional tinción, β-galactosidasa hidroliza el sustrato 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) a 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole. Posteriormente, este intermedio es oxidado, que causa la dimerización y la formación del producto final de color azul (5, 5'-dibromo-4, 4'-dicloro indigo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 . Diagrama que muestra los pasos principales del protocolo estándar para la detección de actividad β-galactosidasa. Embriones de ratón son recogidos y procesados para la tinción de montaje X-gal todo. Después de la coloración histoquímica realizada según el protocolo, todo Monte embriones pueden ser (opción 1) con lavados de soluciones con el aumento de las concentraciones de glicerol y posteriormente fotografiado en un estereomicroscopio, o (opción 2) incorporados en parafina, seccionadas y contratinción. Abreviaturas: RT, temperatura ambiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 . X-gal de E9.5 WT y Mt4-mmpLacZ / + conjunto montaje en embriones y tejido. Usando el estándar ensayo histoquímico de X-gal, embriones transgénicos portadores del gen LacZ bajo el control del promotor de la Mt4-mmp se analizaron para la actividad β-gal. WT (A), HT (E) y KO () E9.5 todo Monte embriones fueron procesados para la detección de la expresión de β-galactosidasa. Secciones de la parafina obtenidas de estos embriones a nivel de la médula espinal permiten la visualización de la coloración en celulares de resolución. Como era de esperarse, las células positivas β-gal estuvieron ausentes en las secciones de la WT (B-D), mientras que la intensidad de etiquetado fue mayor en el KO (J-L) en comparación con las secciones de tejido de HT (F-H). Secciones transversales a través del tubo neural revelan actividad β-gal en somitas en desarrollo, la aorta dorsal y el plexo vascular perineural. Abreviaturas: da, aorta dorsal; FLB, brote del miembro anterior; h, corazón; m, mesencéfalo; NT, notocordio; OTV, vesícula ótica; OV, vesícula óptica; PNVP, plexo vascular perineural; s, somite; t, telencéfalo. Barras de escala: 500 μm (A, E, I); 100 μm (B, F, J); 50 μm (C, G, K); 20 μm (D, H, L). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 . Microfotografías de WT y HT X-gal mancharon embriones de ratón en E12.5 antes (A, D) y después (B, C, E, F) claro con lavados en glicerol aumento. Como era de esperar, embriones WT no mostrar ningún reportero LacZ expresión (A-C) mientras que etiquetado fue detectado en las extremidades (puntas de flecha blancas), el primordio del folículo de vibrisas (flecha blanca), la punta de la cola (flecha negra) y el cerebro de la Mt4-mmpLacZ / + embriones en esta etapa (D-F)9. (E, F) Después de la tala en glicerol, embriones se convirtieron translúcidos y etiquetado puede ser más fácilmente visualizado en regiones más profundas del embrión, como se muestra en el mesencéfalo y telencéfalo (flechas blancas en F). Barra de escala: mm 1. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 . Histoquímicas e immunohistochemical detección de la β-galactosidasa. (A) X-gal (en azul) la coloración revela la expresión de la Mt4-mmp en la piscina de motoneurons en una sección de la parafina de la médula espinal en la fase embrionaria de E11.5. (B) de inmunohistoquímica con anticuerpos anti-β-gal (en rojo) confirmó la expresión de la Mt4-mmp en las motoneuronas de la médula espinal en la misma fase embrionaria en secciones de criostato. Abreviaturas: fp, placa de piso; MN, motoneuronas; Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. Recetas y soluciones necesarias para este protocolo de. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

El gen LacZ de e. coli ha sido ampliamente utilizado como reportero en los estudios de patrones de expresión génica debido a su alta sensibilidad y facilidad de detección. El presente Protocolo describe un método clásico para detectar la expresión de β-gal basada en una reacción enzimática que es fácil y rápido de realizar y barato. Este método también puede aplicarse sin modificaciones importantes en todo montaje embriones, órganos intactos, secciones de criostato del tejido o células cultivadas.

Precisa aplicación de este método resulta en una coloración sólida e interpretable. Sin embargo, controles simultáneos y posteriores pasos de confirmación son muy recomendables. En este sentido, el presente Protocolo se lleva a cabo en paralelo en embriones de littermate de tipo salvaje utilizado como controles negativos que sirven para monitorear a no específico X-gal la coloración. Por otra parte, datos de expresión obtienen utilizando tinción de β-gal es confirmado por western-blot y PCR cuantitativa (Q-PCR) análisis o mediante β-gal inmunohistoquímica (figura 5), que combinado con otros anticuerpos también permite la identificación de tipos de células específicos expresan LacZ9. Medidas de fijación deben tenerse en cuenta para preservar la actividad enzimática de la β-galactosidasa y a minimizar el fondo durante la tinción. Así, los embriones deben ser fijados en glutaraldehído, que da los resultados más consistentes y fiables en comparación con paraformaldehido fijación17. Además, el tiempo de fijación es crucial y debe determinarse empíricamente para cada fase embrionaria, ya que la fijación excesiva puede reducir la actividad β-galactosidasa. En este sentido, todo Monte embriones pueden fijarse por inmersión o perfusión dependiendo de la etapa embrionaria y tamaño. Así, transcardial perfusión se recomienda para embriones mayores de E14.5 y postnatal muestras para que el fijador llegue a todas las regiones de la muestra. Embriones más pequeños (de E8.5 hasta E12.5) pueden ser fijados por inmersión y procesados directamente para en toto X-gal tinción (figura 2). Cabe mencionar que gal X coloración de embriones de ratón menores E14.5 se puede realizar como el Monte entero. En este caso, células cerca de la superficie se detectan fácilmente mediante tinción de β-gal. Aún así, puede ocurrir que más etiquetado aparece borroso o incluso tinte no penetra en el tejido, especialmente en más viejos embriones. En este caso, ya sea órganos o tejidos de ratones adultos pueden ser disecado, X-gal y visualiza bajo un estereomicroscopio. Sin embargo, seccionamiento y microscópica examinación del tejido teñido de interés es más conveniente (figura 2).

A pesar de la eficacia del Protocolo, coloración embriones enteros y detección puede ser problemática. Por ejemplo, el riñón, testículos, glándulas secretoras, epidídimo y vías gastrointestinales contienen altas cantidades de β-galactosidasa ácida endógena18 que pueden interferir con la interpretación de los resultados debido a la actividad de fondo. Por esa razón, la reacción histoquímica debe realizarse bajo condiciones de pH ligeramente alcalino (pH 8-9) a través de la tinción, ya que β-galactosidasa de e. coli tiene un pH óptimo de 7.3. Esto ayudará a reducir significativamente el fondo y a favor de β-galactosidasa bacteriana actividad19,20,21,22. Cabe señalar que durante mucho tiempo la coloración veces puede resultar en la acidificación de la gal X solución de tinción, favoreciendo una mayor formación. Por otra parte, la actividad de β-galactosidasa se pierde bajo temperaturas de incubación superiores a 50 ° C, pero no por debajo de 42 ° C. En nuestras manos, incubación con el sustrato X-gal funciona mejor si se deja durante la noche a 37 ° C. Después de la tinción y antes el paso de posteriores a la fijación, es importante lavar todo el material de reacción X-gal como con cuidado y lo más rápidamente posible eliminar los precipitados de la reacción histoquímica que puede ser depositado en la sección de tejido.

Como se muestra aquí, claro embriones en glicerol es importante para hacer el tejido translúcido conservando el gal X histología del tejido y coloración. Así, los embriones llegan a estar claros y etiquetado puede ser visualizado en regiones más profundas bajo el estereomicroscopio. Sin embargo, para analizar la ubicación exacta de las células, seccionamiento de la muestra es necesaria y, por lo tanto, claro no es esencial. En este caso, por recomendaciones indicadas en los métodos, muestras puede ser cuidadosamente parafina incrustado y seccionado. Durante el proceso de inclusión, etanol deshidratado tejido deben ser sumergidas en una mezcla de isopropanol-parafina. Isopropanol se usa para favorecer la sustitución del etanol en la muestra y para facilitar la inclusión en parafina23tisular. En algunos protocolos, xileno se utiliza en lugar de isopropanol para el mismo propósito. Sin embargo, el uso del xileno presenta desventajas frente a isopropanol, tales como la contracción y el endurecimiento de la muestra debido a la eliminación de tejidos lípidos24 y su perfil toxicológico como producto inflamable e irritante25. Agentes de naranja claro a base de aceite son una de las alternativas más seguras a xileno ya que permiten rápidos claro sin la toxicidad de xileno como tejido excelente estructura conservación26. También, si se usa xileno, esta parte del protocolo debe reducirse al máximo, ya que X-gal la coloración puede difundir y perdido19. Después de seccionar, contratinción con colorantes (e.g. Nuclear Fast Red) se recomienda para facilitar la identificación histológica de las células de expresar. Este procedimiento de tinción es rápida, que requiere sólo un paso, y su aspecto rosado ofrece buen contraste con el precipitado de color azul X-gal. Sin embargo, este contratinción es solamente conveniente para el uso con medio de montaje no acuoso (es decir, DPX).

Este método clásico es adecuado para la detección de actividad de β-galactosidasa, desde X-gal en combinación con potasio ferro - y ferricianuro produce un precipitado azul característico que no se desvanezca o blanqueador fácilmente y, cuando están bien construidos, pueden detecta incluso con el microscopio de disección. Hay otras modificaciones del protocolo original. Utilizando sustratos disponibles tales como Salmon-gal (6-Chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), Magenta-gal (5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) o Bluo-gal (5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopiranosida)13,19 , o sustituir el clásico X-gal/FeCN para sales de tetrazolio pueden realzar grandemente la sensibilidad de detección13,19. Esto es especialmente recomendado para permitir la detección de alta sensibilidad de los niveles de baja expresión de material de proteína y de mRNA. Sin embargo, cuando se utiliza durante demasiado tiempo, cualquiera de estos procedimientos puede conducir a niveles altos y por lo que siempre se recomienda el manejo cuidadoso de las condiciones, especialmente teniendo en cuenta incubación prolongado períodos pueden facilitar la coloración inespecífica debido a endógena de β-galactosidasa actividad13,27. Con respecto a este último, siempre es recomendable utilizar sales de potasio férrico para optimizar la fiabilidad de la técnica y evitar errores.

Una importante limitación de este método es que el procedimiento de tinción clásico X-gal produce un precipitado azul insoluble que puede ser fácilmente detectado por microscopía de luz pero no permite estudios de co-localización por microscopía confocal o fluorescente en el tejido secciones. Una posible forma de superar esta limitación sería utilizar anticuerpos contra β-gal (ver figura 5) combinada con inmunodetección para un tipo de célula específica. Sin embargo, si los niveles de expresión son bajos o el fondo alta, inmunomarcación puede hacer difícil detectar si el gen reportero se expresa en una célula particular. En particular, se ha divulgado una nueva técnica para obtener imágenes confocal de alta calidad basados en la emisión de fluorescencia producida por el precipitado de X-gal28. Además, este método es compatible con inmunofluorescencia y puede identificar claramente las células positivas de X-gal28. Enzimáticas reporteros como el gene del LacZ ofrecen la ventaja de ser más sensibles que las fluorescentes, que destaca al etiquetado, si son especialmente bajos niveles de expresión. En este sentido, se ha demostrado la presente técnica ideal para la detección de microARN29, permitiendo por lo tanto ambos evaluación cualitativa de los patrones de la expresión y cuantificación de niveles de expresión. Coloración doble se utiliza para detectar la presencia de actividad y ARNm de β-gal vía en situ hibridación técnicas que puede proporcionar información muy útil para examinar el patrón de expresión de genes endógenos manteniéndose en actividad β-gal en la misma muestra 30. sin embargo, ambos β-gal mancha en situ hibridación detección reacciones pueden mostrar la incompatibilidad de color durante la tinción doble. Elegir un sustrato más adecuado, como S-gal, se recomienda específicamente optimizado métodos30.

Este versátil método se ha utilizado ampliamente para estudiar la función génica en el contexto de la biología del desarrollo. Así, el gene del LacZ se ha adoptado para el análisis de patrones de expresión génica durante el desarrollo embrionario golpeando en un locus de genes específicos. LacZ es un gen reportero común para el estudio de elementos reguladores de acción cis (potenciadores) involucrados en la dirección de expresión génica en regiones restringidas del embrión, proporcionando información sobre la actividad de transcripción del promotor de interés31 ,32,33. También, se usa frecuentemente en la detección de eventos de recombinación genética por recombinación mediada por Cre loxP sitios web, que es especialmente útil para la detección de derivados de células madre embrionarias en experimentos de asignación de destino celular o en trasplantes de la célula. Mutagénesis gene-trampa en las células madre embrionarias produce proteínas truncadas sobre β-gal que permite la evaluación de la actividad de promotor bajo condiciones fisiológicas34. Para todos estos enfoques, animales transgénicos que LacZ y la expresión de β-galactosidasa bacteriana se han generado en rata35,36, pollo37,38, Xenopus39 o pez cebra40. Hasta ahora, esta técnica se ha utilizado en Drosophila para mejorar la visualización de la expresión génica espacial y temporalmente debido a la disponibilidad de sistemas de expresión de genes inducible y tejido y las líneas específicas de células p-LacZ marcador41 ,10. Cabe destacar que aparte de estos muchas aplicaciones en animales transgénicos y knockout, gene del reportero LacZ se ha utilizado en tejidos todo así como cultivados en células para predecir la función de genes en la enfermedad en la investigación biomédica. Un ejemplo relevante de este último es el estudio del proceso de envejecimiento con respecto a las respuestas al estrés, supresión tumoral o desarrollo. Las células senescentes son fáciles de detectar en situ y en vivo debido a su característico énfasis excesivo y acumulación de beta-galactosidasa lysosomal endógeno42,43. Por lo tanto, β-galactosidasa se utiliza como un biomarcador senescente en ensayos cuantitativos en cáncer cultivadas células44.

En Resumen, describimos un procedimiento factible y optimizado para facilitar la fácil detección de actividad de β-galactósido en tejido embrionario de ratón. El presente método permite modificaciones basadas en el tejido seleccionado y del sustrato utilizado. Por lo tanto, este método versátil y rentable con los controles adecuados es especialmente conveniente para el uso con embriones de ratón entero así como en secciones histológicas finas.

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Disclosures

Los autores declaran que ellos no tienen ningún interés financiero competencia.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer el servicio histopatológicos para su asistencia técnica en el Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). También agradecemos a Dr. Motoharu Seiki para ratones de Mt4-mmpLacZ que amablemente y el Dr. Alicia G. Arroyo para apoyar nuestro proyecto y para su lectura crítica del manuscrito. Queremos agradecer a Peter Bonney para corregir este artículo. Este trabajo fue financiado por la Universidad Europea de Madrid por medio de una beca (# 2017UEM01) concedida a C.S.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
2-Propanol SIGMA-ALDRICH 24137-1L-R
Agarose SCHARLAU 50004/ LE3Q2014
Aqueous mounting medium VECTOR LABS H-5501
Synthetic mounting media MERCK 100579
96% Ethanol PROLABO 20824365
99.9% Ethanol absolute SCHARLAU ET00021000
50% Glutaraldehyde solution SIGMA-ALDRICH G6403-100ml
85% Glycerol MERCK 104094
99.9% Glycerol SIGMA-ALDRICH G5516
Magnesium chloride hexahydrate SIGMA-ALDRICH 63064
Nonionic surfactant (Nonidet P-40) SIGMA-ALDRICH 542334
Nuclear Fast Red counterstain SIGMA-ALDRICH N3020
Paraffin pastilles MERCK 111609
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH 158127-500g
Phosphate buffered saline (tablets) SIGMA-ALDRICH P4417-50TAB
Potassium ferrocyanate MERCK 1049840500
Potassium ferrocyanide MERCK 1049731000
Sodium azide SIGMA-ALDRICH S8032
Sodium deoxycholate SIGMA-ALDRICH 30970
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate SIGMA-ALDRICH 106346
Sodium phosphate dibasic dihydrate SIGMA-ALDRICH 71638
Thymol SIGMA-ALDRICH T0501
Tris hydrochloride (Tris HCl) SIGMA-ALDRICH 10812846001 (Roche)
X-GAL VENN NOVA R-0004-1000
Xylene VWR CHEMICALS VWRC28973.363
EQUIPMENT
Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm SAKURA 4566
Rotatory Microtome Leica RM2235
Cassettes Oxford Trade OT-10-9046
Microscope Cover Glasses 24x60 mm VWR ECN631-1575
Microscope slides Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER AGAA000001#12E
Adhesion microscope slides Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER J1820AMNZ
Flotation Water bath Leica HI1210
Disposable Low Profile Microtome Blades Feather UDM-R35
Paraffin oven J.R. SELECTA 2000205
Wax Paraffin dispenser J.R. SELECTA 4000490
Stereomicroscope Leica DM500
Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL SIGMA-ALDRICH T2795
Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL SIGMA-ALDRICH T9661
Orbital shaker IKA Labortechnik HS250 BASIC
Stirring Hot Plate Bibby HB502
Vortex Shaker IKA Labortechnik MS1
Laboratory scale GRAM FH-2000
Precision scale Sartorius ISO9001
pHmeter Crison Basic 20
Optic fiber Optech PL2000

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Seguimiento de la expresión génica mediante la detección de actividad de β-galactosidasa en embriones de ratón todo
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Blanco, M. J., Learte, A. I. R.,… More

Blanco, M. J., Learte, A. I. R., Marchena, M. A., Muñoz-Sáez, E., Cid, M. A., Rodríguez-Martín, I., Sánchez-Camacho, C. Tracing Gene Expression Through Detection of β-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (136), e57785, doi:10.3791/57785 (2018).

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