Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

עקיבה ביטוי גנים דרך זיהוי של β-galactosidase פעילות ב עכבר כל העוברים

Published: June 26, 2018 doi: 10.3791/57785
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 2,3
1Faculty of Biomedical and Health Sciences, Universidad Europea de Madrid, 2Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), 3School of Doctoral Studies and Research, Universidad Europea de Madrid
* These authors contributed equally

Summary

כאן נתאר הפרוטוקול הסטנדרטי איתור פעילות β-galactosidase מוקדם העכבר כל העוברים ואת שיטת העבודה פרפין חלוקתה ולא counterstaining. . זה הליך קלה ומהירה כדי לפקח על ביטוי גנים במהלך פיתוח שניתן להחילם גם על מקטעים של רקמות, איברים או תאים בתרבית.

Abstract

הגן Escherichia coli LacZ , קידוד β-galactosidase, משמש בעיקר כתב של ביטוי גנים וכן מכשיר מעקב במחקרים שושלת היוחסין התא. התגובה פתולוגיה הקלאסית מבוססת על הידרוליזה של המצע X-גל בשילוב עם יונים ferrous ו ferric, המייצרת לא מסיסים התמיסה כחול קל לדמיין. לכן, β-galactosidase פעילות משמשת כסמן את דפוס ביטוי של הגן עניין בפיתוח מתקדם. כאן נתאר הפרוטוקול הסטנדרטי איתור פעילות β-galactosidase מוקדם העכבר כל העוברים ואת שיטת עוקבות עבור פרפין חלוקתה ולא counterstaining. בנוסף, הליך שהבהרת כל העוברים מסופק משופרת של X-גל צביעת אזורים עמוקים יותר של העובר. תוצאות עקביות מתקבלים על ידי ביצוע הליך זה, למרות אופטימיזציה של תנאי ריאקציה יש צורך למזער את פעילות ברקע. מגבלות וזמינותו גם להתייחס, במיוחד לגבי הגודל של העובר מכתים כל הר. פרוטוקול שלנו מספק רגיש, שיטה אמינה לגילוי β-galactosidase במהלך פיתוח העכבר שניתן להחיל עוד סעיפים cryostat, כמו גם כל האיברים. לפיכך, דפוסי ביטוי גנים דינמי במהלך הפיתוח ניתן לנתח בקלות על-ידי שימוש בפרוטוקול זה כל העוברים, אך גם ביטוי מפורט ברמה התאית יכול להידרש לאחר חלוקתה פרפין.

Introduction

כדי לתאר דפוסי ביטוי גנים ספציפיים, השימוש של הכתב גנים כסמני כבר ביותר מדרוזופילה . יונקים. בניסויים המערבים הטרנסגניים ובעלי נוקאאוט, הגן β-galactosidase חיידקי (LacZ) של Escherichia coli (e. coli) הוא אחד בשימוש נרחב ביותר1,2,3, 4. β-galactosidase (β-גל) ה מזרז הידרוליזה של β-galactosides (כגון לקטוז) לתוך שלו monosaccharides (גלוקוז, גלקטוז)5. המצע הנפוץ ביותר שלה הוא X-גל (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), גליקוזיד זה hydrolyzed מאת β-galactosidase והוליד 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole וגלקטוז. הראשון הוא מחומצן לתוך דיימר, בעת שימוש בשילוב עם אשלגן פרי-פרו-ציאניד, מייצרת של מאפיין לא מסיס, צבע כחול לזרז (איור 1)6.

הגן LacZ התחיל לשמש גן כתב לפני למעלה משלושים שנה7,8. בדרך כלל, מוכנס LacZ במורד הזרם של יזם אנדוגני במקום מסגרת קריאה פתוחה, אז זה יכול לשמש בתרבות בקטריאלי ותא להמחיש תאים המכילים של הוספה מסוים, כמו גם בבעלי חיים הטרנסגניים מכשיר מעקב של אנדוגני ג'ין תבניות ביטוי במהלך פיתוח9. בהקשר זה, החזיית β-galactosidase פעילות יש נעשה שימוש נרחב דרוזופילה להבין את התהליכים התפתחותית וסלולריות של תאים בודדים כל רקמות. דרוזופילה גנטיקה טובה הדור של קווים יציב שבו בונה P-אלמנט שונה המכיל את גן מדווח ש-lacz הוא מוכנס באופן אקראי מיקומים הגנום. לכן, כאשר מניחים תחת השפעת משפר אלמנטים זה ייתכן להסיע הביטוי שלה בצורה רקמות ספציפיות, אשר איפשר ניתוח שיטתי של דפוסי ביטוי של גנים רבים במהלך שני העשורים האחרונים10. בנוסף, השימוש של העכברים הטרנסגניים כדי לפקח על ביטוי גנים LacZ גם מאפשר זיהוי של גן אירועים רקומבינציה לפי Cre-loxP מתווכת רקומבינציה, לוקליזציה של נגזרות מוטציה בתאי גזע עובריים בניתוח chimeric 11, אשר מקלה על השליטה של LacZ ביטוי ברקמות ספציפיות כמו גם חנותם. כמו כן, בתוך כל העוברים, זיהוי של הפעילות β-galactosidase עשויה לייצר דיפרנציאלית מוכתמים דפוסי בעוצמות שונות, זה יכול להיות שנצפו בנוחות על פני שלבים התפתחותיים שונים כדי לנתח טמפורלית שינויים בביטוי הגנים 8,12.

במאמר זה, נציג פרוטוקול להמחיש ביטוי גנים דרך X-גל מכתים ברקמה הר שלם בשלבים התפתחותיים מוקדם של העכבר עוברי. אנו מציגים בשיטה זו פתולוגיה כמו טכניקה מאוד רגיש וזולה טובות איתור מדויק של התאים עם תוויות דגימות הר שלם או ברמה התאית לאחר פרפין מוטבע רקמות או עוברי. השיטה מאפשרת פריט חזותי ישיר מכתים ברקמה עכבר עם הרקע המינימלי כאשר לעומת שיטות אחרות13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים ניסיוני אושרו על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares), את Autónoma קומונידד דה מדריד כדי להבטיח סבלם מינימלי של בעלי החיים.

1. אוסף של העוברים מן העכברים בהריון (מ E8.5 ל E12.5)

  1. להקריב עכברים בהריון מאת נקע בצוואר הרחם או שאיפת2 CO. ביום הראשון שנצפה הכנס הנרתיק נחשב מתחלקים היום 0.5 (E0.5).
  2. להניח את החיה במצב פרקדן על משטח סופג, לנקות את העור בבטן של העכבר עם 70% אתנול.
    הערה: עקרות לא נדרש בשלבים הבאים.
  3. לצבוט והרם בעור בטן בעזרת העכבר-שן מלקחיים.
  4. לעשות חתך דרך העור לבין קיר הבטן, 2-4 ס מ אנכית לאורך הקו האמצעי של הבטן בעזרת מספריים כירורגיים.
  5. לחשוף את הבטן ולהסיר את הקרניים הרחם מהצד של האמא עם מלקחיים חיתוך כלי הדם לאורך העקמומיות הפנימית של הרחם עם מספריים כירורגיים.
  6. הסר את המחרוזת של העוברים, להעביר אותו צלחת פטרי על קרח המכילה 10 מ"ל כקרח 0.01 M פוספט מאגר מלוחים pH 7.4 (PBS).
  7. בזהירות לנתח את העוברים החוצה מן הרחם תחת stereomicroscope בצלחת פטרי עם PBS קר כקרח טריים 10 מ"ל. לתפוס את הקיר שריר עם מלקחיים השענים לחשוף השפרה ולאחר מכן לקרוע את קרום מי השפיר כדי להסיר את העובר סגורים ולא שק החלמון באמצעות קצות המלקחיים.
  8. לאסוף את העוברים littermate עכברים בהריון בשלבים המוקדמים (מ E8.5 ל E12.5) (איור 2).
  9. להעביר את העוברים מאכל טריים עם PBS קר 1 x 10 מ"ל באמצעות מלקחיים מעוקל או, העוברים קטן מאוד (E8.5-E9.5), להשתמש פיפטות פלסטיק העברה כדי לאסוף דגימות ללא נזק העובר.
  10. לפני שמתחילים את הקיבעון, לקחת דוגמה עובריים צינור microcentrifuge עבור genotyping על ידי חיתוך חתיכה קטנה של העובר או לקיחת קרום מי השפיר העוברים הקטן ביותר (מ E8.5 ל E9.5) עם מלקחיים השענים.
    הערה: LacZ genotyping נקבעת על-ידי תחל (PCR) תגובת שרשרת של פולימראז: קדימה, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´; הפוך, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´.

2. קיבוע של העכבר עוברי

  1. העברת כל העובר לתוך צינור microcentrifuge 2 מ עם בסיס עגול המכיל PBS 1 x 1 מ"ל.
    הערה: בצע את כל השלבים בפרוטוקול תוך הצינורות האלה עם עצבנות בעזרת מטרף מתגלגל.
  2. לשטוף את העוברים ב- PBS 1 x על 1 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחסל את הדם הנותרים. שימוש פיפטות פלסטיק העברה להחליף נוזלים בתוך הצינורות.
  3. לתקן את העובר 1 מ"ל של 0.125% גלוטראלדהיד על קרח.
    הערה: הזמן של קיבעון תלוי בגודל של העובר: 20 דקות עבור E8.5-E9.5 עוברי, 30 דקות עבור עוברי E10.5 ו- h 1 עבור עוברי E12.5.
  4. הסרת מקבע את ולשטוף את העוברים ב- PBS 1 x פעמיים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני עיבוד הדגימה עבור X-גל מכתים.

3. כל הר β-galactosidase להסטולוגיה של העוברים העכבר

  1. הכן X-גל שטיפה מאגר והפתרון X-גל מכתים לפני תחילת ההליך (ראה טבלה 1 ו לטבלה של חומרים). השתמש עוברי littermate (WT) פראי-סוג כפקדי שלילי עבור התגובה אנזימטיות.
  2. דגירה העוברים במאגר שטיפה X-גל במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (איור 2).
  3. דגירה העוברים בפתרון מכתים X-גל מ- 2 h ללון ב 37 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור. לנטר את תגובת צבע מעת לעת באמצעות מיקרוסקופ ויבתר עד בעוצמה מספקת של צביעת התכלת נצפית ללא הרקע של העובר. שמור את ה-pH של התמיסה בין 8 ל- 9 כדי להפחית את הרקע במהלך כל מוכתמים. אם הפתרון מכתימים מתחילה לכבות אור, להחליף אותו מצע טרי פתרון כדי להרחיב את התגובה אנזימטיות.
  4. לעצור את התגובה כאשר האות הרצויה מושגת על ידי שטיפת העוברים בצינור microcentrifuge תסיים 1 x 1 מ"ל פעמיים במשך 10 דקות כל בטמפרטורת החדר.
  5. להעביר עוברי מוכתמים paraformaldehyde 4% 1 מ"ל (PFA) לתקן אותם, מחדש עבור h 1 ללון ב 4 º C.
    הערה: עוברי שניתן לאחסן ב 4% מחברים/PBS לזמנים ארוכים ב 4 ° C או יכול להיות מעובד באופן מיידי על חלוקתה. שלב קיבוע סופי זה מכריע של שימור לטווח ארוך של התבנית מוכתמים.
  6. לשטוף את העוברים ב- PBS 1 x 1 מ"ל פעמיים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. אפשרות 1: ברור העוברים על ידי טבילה בסדרה של פתרונות עם הגדלת ריכוזים של גליצרול (גליצרול 20%, 40%, 60% ו- 80% ב- 1 x PBS) לשעה בטמפרטורת החדר כל פתרון.
    הערה: לשטוף את העוברים גליצרול 80% משכי זמן ארוכים יותר, אפילו ימים, עד הם נמחקים ולאחר מכן לאחסן אותם גליצרול 80% ב 4 ° C בשלב זה (איור 2). הוספת כמות קטנה מאוד של קריסטל אורה אזיד הנתרן של תימול העוברים המאוחסנים ב 4 ° C גליצרול או 1 x PBS מומלץ כדי למנוע צמיחה של עובש. לאחר ניקוי, הר שלמה עוברי יכול לשמש עבור צילום (שלב 4).
  8. אפשרות 2: העוברים תהליך של פרפין הטבעה ואת חלוקתה באמצעות של מיקרוטום (איור 2). במסמך התבנית הביטוי בתוך מוכתם כל העוברים לפני חלוקתה (שלבים 4 ו- 5).

4. צילום של כל העוברים הר

  1. כדי לצלם כל הר צבעונית העוברים לפני חלוקתה, להעביר אותם ל צלחת פטרי מוכן עם בסיס של פני השטח למוצק agarose 1-2% ב- PBS 1 x
  2. מכסים את העובר לחלוטין עם PBS 1 x 10 מ"ל בכלים מצופים agarose כדי למנוע התייבשות השתקפות במהלך הצילום דרך הנוזל.
  3. להתמצא העובר שקוע PBS x 1 באמצעות מלקחיים. עבור מבוגרים העוברים (E10.5-E12.5), לעשות בו חור קטן agarose עם מלקחיים כדי למקם ומקם את הדגימה בתוכו בזוויות שונות וכדי למנוע את לתרשים במשך הצילום.
  4. מקם את המנה על הבמה stereomicroscope, באמצעות האור המשודר (תת שלב). שינוי בין 'כהה-שדה' התאמות 'בהיר-שדה' כדי להגדיר את התאורה הרצויה במשך הצילום וכדי לייעל את המוגבהת המדגם.
    הערה: השתמש סיבים אופטיים תאורה עבור עוברי בשלב מאוחר יותר כדי למנוע השתקפות על פני השטח של העובר. כאשר מצלמים עוברי שנוקה, בצע את ההליך אבל להעביר אותם ל צלחת פטרי המכילות 100% גליצרול, מלא לטבול אותם.

5. פרפין הטבעה ואת חלוקתה של X-גל צבעונית עוברי

  1. פרפין הטבעה
    1. להסיר את X-גל צבעונית העוברים מ 4 ° C (שלב 3.5) ולשטוף אותם עם PBS 1 x 1 מ ל שלוש פעמים כדי למנוע עודף של מקבע.
    2. להעביר את העובר כל קלטת היסטולוגיה באמצעות מלקחיים.
    3. למקם את הקלטות המכיל את העוברים בתוך, ואז מייבשים על ידי הכנסתם סדרה מדורגת אתנול בטמפרטורת החדר: 70% אתנול, פעם אחת במשך 30 דקות; 96% אתנול, פעמיים במשך 30 דקות כל; 100% אתנול, פעמיים במשך 30 דקות כל אחד.
      הערה: עוברי יכול להיות מאוחסן אתנול 70% למשך זמן בלתי ידוע ב 4 ° C עד התחלת תהליך התייבשות.
    4. דגירה בקלטת כל ב אלכוהול איזופרופיל למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. באמצעות מלקחיים, העברת הקלטות לכוס מכתים שוקת המכיל אלכוהול איזופרופיל ומחוממת מראש ולהשאיר בתנור ב 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    6. למקם את הקלטות כוס חדשה מכתים שוקת המכיל תערובת של 50% אלכוהול איזופרופיל / 50% נמס פרפין ולהשאיר במשך 4 שעות בתנור 60 ° C.
    7. דגירה הקלטות עם העוברים עם שני שינויים של פרפין מותכת, 30 דקות ב 60 ° C לכל.
    8. בסוף לשטוף את הפרפין הסופי, פתח את הקלטת, להעביר את העובר בכל רקמה נפרדת הטבעה עובש כדי להציג את הדגימה תחת stereomicroscope.
    9. למלא את הבאר פרפין שעווה מותכת ב 60 מעלות צלזיוס. להשתמש מלקחיים מחומם כדי לשמור את השעווה מותכת בקפידה להתמצא העובר העובש.
      הערה: הכיוון הנכון של המדגם הוא שלב קריטי עבור חלוקתה העובר במישור הרצוי.
    10. לפני פרפין בגרגירים כייר, מקום קלטת ללא המכסה על גג הבניין, למלא אותו פרפין שעווה מותכת. ומצננים את הנותרים שעווה עד פני השטח למוצק ללילה בטמפרטורת החדר.
    11. ברגע הפרפין הוא לחלוטין פני השטח למוצק, להסיר את גוש מוצק כייר ו לאחסן בלוקים פרפין או בטמפרטורת החדר או ב 4 ° C עד חלוקתה14.
  2. פרפין חלוקתה
    1. אוריינט הלהב על האזמל הקטן ולהגדיר 5-7 מיקרומטר של עובי. 5.2.2. מגניב לבלוק פראפין על הקרח, לקצץ אותו לייצר קובייה או פירמידה.
    2. לצרף את הבלוק בעל מיקרוטום באמצעות כמות קטנה של שעווה מותכת.
    3. אוריינט הרחוב לחיתוך אופטימלית. בסעיף הבלוקים פרפין 5-7 מיקרומטר פרוסות עבות בטמפרטורת החדר באמצעות מיקרוטום סטנדרטי.
    4. שימוש במכחול בסדר, הניחו הסעיפים באמבט מים בטמפרטורת החדר במשך מניפולציה ובחירה פרוסות.
    5. לאסוף את המקטעים מהאמבטיה מים עם מגלשת מיקרוסקופ, להעביר אותם לתוך אמבט מים ב 42 ° C עבור מתיחה.
    6. להסיר מקטעים תנורים ומניחים בעדינות על גבי שקופיות מיקרוסקופ אדהזיה.
    7. יבש את השקופיות היטב בתנור ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאפשר הסעיפים לדבוק לחלוטין, אחרת, הם עשויים להגיע לאיבוד במהלך צביעה.
      הערה: לאחסן את השקופיות ב 4 ° C עד לתחילת מכתים הליכים.
  3. Deparaffinization, Counterstaining סעיפים פרפין X-גל-צבעונית
    1. לשים את השקופיות על מגש שקופיות מיקרוסקופ בתנור ב 60 מעלות צלזיוס למשך לפחות 45 דקות להפוך פרפין יותר נוזלים.
    2. להעביר את השקופיות על מתלה ולהשתמש זכוכית מכתים מנות כדי לבצע את השלבים הבאים: להטביע את המדף בצנצנות מכתימים המכיל כהלים של הפחתת ריכוזים הסרה מלאה פרפין, הידרציה של הרקמות: אלכוהול איזופרופיל למשך 5 דקות- 60 ° C; אלכוהול איזופרופיל למשך 3 דקות; 100% אתנול למשך 2 דקות; אתנול 96% עבור 1 דקות; אתנול 70% עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. לשטוף ובסעיף מים מזוקקים פעמיים כדי לוודא כי קיימים ללא שאריות אלכוהול.
    4. Counterstain מקטעים עם כתם (למשל פתרון גרעיני-Fast אדום) במשך 5 דקות (בדרך כלל בין 3-8 דקות) בטמפרטורת החדר (איור 2).
      הערה: זה מכתים מסייע לחשוף את המבנה הכללי של רקמות בסעיפים.
    5. לאחר צביעת, לשטוף את השקופיות במים מזוקקים למשך 1 דקות, עיין בסעיף מכתים במיקרוסקופ.
      הערה: אם ההכתמה הרצוי הוא חלש מדי, counterstain סעיפים שוב למשך זמן ארוך יותר.
    6. מייבשים מקטעים בסדרות הבאות עם הגדלת ריכוזי אתנול: מנקי שני אתנול 95% למשך 2 דקות כל אחד, שניים שוטף אתנול 100% למשך 2 דקות, ו, כדי להימנע המסת הכחול צבע ארגונייט שוקע, אחת מהירה לרחוץ קסילן.
    7. הסר את השקופיות מהמדף אחד ומניחים אותם על נייר. אז הר, coverslip להחליק בעזרת אמצעי הרכבה סינתטי, קבע.
      הערה: קסילן הוא מוצר דליק האדים של מי אתה מעצבן ואינם מזיקים לבריאות האדם, לאורגניזמים מימיים. הוא צריך להשפיע בתוך ברדס, מחייב שימוש ציוד מגן מתאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הנה אנחנו מראים תוצאות החלת הפרוטוקול הסטנדרטי עבור התגובה פתולוגיה β-galactosidase באמצעות X-גל כמו המצע ב עכבר כל העוברים (איור 1 ואיור 2). באמצעות פרוטוקול זה, נבחן ממברנה סוג 4-מטריקס מטאלו-פרוטאינאז (Mt4-mmp) ביטוי שלבים התפתחותיים עובריים שונים (E9.5, E11.5 ו E12.5) שימוש בעכברים המוטנטים Mt4-mmp המבטאים הכתב LacZ תחת השליטה של אנדוגני Mt4-mmp יזם (איור 3 איור 4, איור 5)9,15. Mt4-mmp הוא endopeptidase כי הוא קשור קרום התא באמצעות עוגן אינוזיטול glycophosphatidyl (GPI). למרות Mt4-mmp זוהה סרטן אנושי מספר קשורה את ההתקדמות של הגידול, מידע אודות פעילותה הפרוטאוליטי נגד מטריצה חוץ-תאית רכיבים מצומצמת מאוד לתאריך. בנוסף, כמעט ולא דווח על התפקיד ועל ביטוי של Mt4-mmp במהלך התפתחות9,16.

פראי סוג (WT), Mt4-mmpLacZ / + משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים (HT), הסתרה (KO) littermate עוברי מעובדים במקביל עבור פרוטוקול מכתימים X-גל (איור 2). מספר פקדים חייב להיות כלול בתהליך צביעת כדי לאמת את ייחודה של ההליך. לפיכך, WT עוברי משמשים כפקדי שלילי עבור התגובה פתולוגיה ומגישים לפקח X שאינם ספציפיים-תיוג גל (ראה איור 4Aו- 3A איור-D -C). כמו כן, כדי למנוע את הרקע לא ספציפי, רמת ה-pH של התמיסה מכתימים X-גל חייב להישמר בין 8 ל 9 לאורך מכתים כל ב- איור 3E, תאי β-גל-חיוביים הם דמיינו ב- HT הר כל העוברים את somites, את intersomitic להערכת בשלב E9.5. עם זאת, לדווח את המיקום המדויק של תאי מוכתם, העובר חלוקתה נדרש לדמיין תחת המיקרוסקופ דיווחו על ביטוי גנים בסעיפים רקמות ברזולוציה הסלולר. במקרה זה, LacZ-חיוביות נמצאו תאים את somites, העורקים הגבי, את להערכת intersomitic, כמו גם מקלעת כלי הדם של perineural בסעיפים רקמות (חיצים, איור 3F-H). תוצאות אלו לתאם עם התבנית ביטוי שדווחו עבור Mt4-mmp אלה העכבר העובריים9, המציינת כי טכניקה זו אמינה הדירים בקלות. כצפוי, רמות של פעילות β-גל הם גבוה יותר העוברים KO לעומת לחוטף בשל נוכחותם של שני עותקים של הגן כתב LacZ (איור 3עכשיו-L). עם זאת, רק HT LacZ / + עוברי צריך להיות מנותח במחקרים דפוסי ביטוי גנים ו KO רקמה משמש הוכחה של המושג כדי להדגים את הכדאיות של השיטה מאז בשל היעדר הגן יישוב של עניין, תאי β-גל חיובי יכול להיות ממוקם באופן חריג בחודש האחרון.

בעת ביצוע פרוטוקול זה, העוברים בוגרים (מ E10.5 ל E12.5) אינם שקופים, לכן, X-גל הכי גלויה צבעונית אזורים אלה קרוב לפני השטח. לפיכך, צעד חלופית לשיטה זו היא ברורה העוברים על ידי שוטף בתחום פתרונות עם הגדלת ריכוז גליצרול. איור 4, העוברים שהוכתמו LacZ E12.5 התברר תוך שמירה על X-gal מכתים, ומאפשר לנו לצלם עמוק יותר צבעונית אזורים של העובר stereomicroscope. כפי שדווח בעבר בשלב העוברי, תיוג היה מקומי באזורים שונים של המוח, הגפיים, הזקיק של vibrissa, קצה הזנב9. עם זאת, אם אנחנו רוצים להשיג רזולוציה הסלולר, העוברים צריך להיות מוטבע פרפין, למחלקה ובחן ברמה המיקרוסקופית.

איור 5, אימונוהיסטוכימיה עם נוגדנים anti-β-גל נעשה שימוש כדי לאשר שהביטוי של Mt4-mmp שנמדדו באמצעות כתב LacZ מכתים. לפיכך, תאי β-גל-חיוביות אותרו בבריכה של motoneurons של חוט השדרה העכבר על E11.5 באמצעות שתי הגישות, שמאשרת יחודיות של פרוטוקול דיווח כאן (איור 5 א, ב').

Figure 1
איור 1 . איור סכמטי של e. coli LacZ כתב קידוד גנטי עבור β-galactosidase ועל תגובת פתולוגיה מזורז על ידי אנזים זה. ב ההכתמה מסורתיים, β-galactosidase הידרוליזה המצע 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-גל) כדי 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole. לאחר מכן, ביניים זו הוא מחומצן, הגורמת dimerization היווצרות של המוצר הסופי בצבע כחול (5'-dibromo-4, 5, 4'-dichloro אינדיגו). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . דיאגרמה המציגה את השלבים העיקריים של הפרוטוקול הסטנדרטי איתור פעילות β-galactosidase. העכבר עוברי שנאסף, מעובד עבור כל X הר-גל מכתים. לאחר ההכתמה פתולוגיה מבוצעת לפי הפרוטוקול, העוברים הר שלם יכול להיות (אפשרות 1) מסומנת עם שוטף בתחום פתרונות עם הגדלת ריכוז גליצרול, לאחר מכן צולם ב stereomicroscope, או מוטבע (אפשרות 2) פרפין, למחלקה ו counterstained. קיצורים: RT, בטמפרטורת החדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 . X-גל כתמים E9.5 WT ו- Mt4-mmpLacZ / + כולה-הר עוברי ומקטעים רקמות. באמצעות תקן X-גל פתולוגיה וזמינותו, העוברים הטרנסגניים נושאת את הגן LacZ תחת השליטה של Mt4-mmp יזם נותחו לפעילות β-גל. איתור של הביטוי β-galactosidase עובדו WT (A), HT (E), העוברים כל הר E9.5 KO (אני). סעיפים פרפין המתקבל אלה העוברים ברמה של חוט השדרה לאפשר ויזואליזציה של ההכתמה ברזולוציה הסלולר. כצפוי, תאי β-גל חיובי נעדרו בסעיפים WT (B-D), בעוד האינטנסיביות של תיוג היה גבוה יותר KO (J-L) לעומת הסעיפים רקמות HT (F-H). חתכי רוחב דרך הצינור העצבי לחשוף פעילות β-גל את somites המתפתח, אבי העורקים הגבי ו מקלעת כלי הדם של perineural. קיצורים: דא, העורקים הגבי; flb, forelimb ניצן; h, לב; m, mesencephalon; nt, מיתר הגב; otv, שלפוחית otic; ov, שלפוחית אופטיים; PNVP, perineural פלקסוס כלי דם; s, somite; t, telencephalon. גודל ברים: 500 μm (A, E, אני); 100 μm (B, F, J); 50 μm (C, G, K); Μm 20 (ד', ה', יב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 . Photomicrographs של WT ו- HT X-גל צבעונית העכבר עוברי-E12.5 לפני (A, D) ואחרי (B, C, E, F) ניקוי עם שוטף גליצרול מוגבר. כצפוי, WT עוברי מציגים לא כתב LacZ ביטוי (A-C) בעוד תיוג זוהה בגפיים (חץ לבן), ראשית של הזקיק של vibrissa (חץ לבן), קצה הזנב (חץ שחור) והמוח של Mt4-mmpLacZ / + העוברים את זה שלב (D-F)9. (E, F) לאחר ניקוי גליצרול, העוברים הפך שקוף וניתן תיוג מטמיעים בקלות רבה יותר באזורים עמוקים יותר של העובר, כפי שניתן לראות את mesencephalon, את telencephalon (החצים הלבנים בפה). סרגל קנה מידה: 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 . זיהוי פתולוגיה, immunohistochemical של β-galactosidase. X (A)-צביעת (בכחול) גל חושף את הביטוי של Mt4-mmp בבריכה של motoneurons במקטע פרפין של חוט השדרה בשלב העוברי E11.5. אימונוהיסטוכימיה (B) עם נוגדנים anti-β-גל (באדום) אישר הביטוי של Mt4-mmp ב motoneurons חוט השדרה בשלב העוברי זהה בסעיפים cryostat. קיצורים: fp, צלחת קומה; MN, motoneurons; סרגל קנה מידה: 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

טבלה 1. מתכונים ואת הפתרונות הנדרשים עבור פרוטוקול זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הגן LacZ e. coli כבר בשימוש נרחב בשל רגישות גבוהה קלות לזיהוי ככתב במחקרים דפוסי ביטוי גנים. בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה קלאסית לגילוי β-גל ביטוי בהתאם לתגובה אנזימטי זה קל ומהיר לביצוע כמו גם זול. בשיטה זו ניתן ליישם גם בלי שינויים הר כל העוברים, איברים שלמים, מקטעי רקמת cryostat או תאים בתרבית.

יישום מדויק של שיטה זו גורמת interpretable ועמיד מכתים. עם זאת, פקדים בו זמנית, והשלבים מאשרות מומלץ מאוד. בהקשר זה, בפרוטוקול הנוכחי מתבצע במקביל עוברי littermate פראי סוג להשתמש כפקדים שלילי לשרת כדי לפקח X שאינם ספציפיים-צביעת גל. יתר על כן, ביטוי נתונים המתקבל כאשר באמצעות צביעת β-גל אושר על ידי המערב-כתם ו- PCR כמותי (Q-PCR) ניתוח או באמצעות β-גל אימונוהיסטוכימיה (איור 5), אשר בשילוב עם נוגדנים אחרים גם מאפשר זיהוי של סוגי תאים מסוים מביע LacZ9. קיבוע צעדים שצריך לקחת בחשבון על מנת לשמר את הפעילות אנזימטי של β-galactosidase וכדי לצמצם את הרקע במהלך צביעה. לפיכך, יש לתקן עוברי ב גלוטראלדהיד, אשר נותן את התוצאות הכי עקבית ומהימנה לעומת הקיבעון paraformaldehyde17. . חוץ מזה, קיבוע זמן חיוני, צריך להיות נחוש מדעית לכל שלב עובריים, מאז קיבוע יתר. המצמצמים β-galactosidase פעילות. בהקשר זה, העוברים הר שלם יכול להיות קבוע על ידי טבילה או זלוף בהתאם בשלב העוברי ולגודל. לפיכך, transcardial זלוף מומלץ עבור עוברי מבוגר יותר E14.5, דגימות כמחנכת לוודא מקבע יגיע בכל האזורים של המדגם. העוברים קטן יותר (מ- E8.5 עד E12.5) ניתן לתקן על ידי טבילה ולעבד ישירות עבור בוססו X-גל מכתים (איור 2). יצוין כי X-גל מכתים של העכבר העוברים יותר E14.5 יכול להתבצע ההר כל צעיר. במקרה זה, תאים מוכתם קרוב לפני השטח מאותרים בקלות באמצעות צביעת β-גל. למרות זאת, זה עלולה להתרחש תיוג עמוק מופיעה מטושטשת או לצבוע אפילו אינו לחדור את הרקמה, במיוחד אצל מבוגרים העוברים. במקרה זה, או יכול להיות גזור איברים או רקמות עכברים בוגרים, X-גל צבעונית, דמיינו תחת stereomicroscope. עם זאת, בחינה אופטים ובניה של מיקרוסקופית של הרקמה מוכתם עניין הוא מתאים יותר (איור 2).

למרות היעילות של הפרוטוקול, מכתים כל העוברים וזיהוי יכול להיות בעייתי. עבור מופע הכליה, testis, בלוטות הפרשה, יותרת האשך, מערכת העיכול מכילים כמויות גבוהות של β חומצי אנדוגני-galactosidase18 יכולים להפריע הפרשנות של התוצאות בשל פעילות ברקע. מסיבה זו, התגובה פתולוגיה צריכה להתבצע בתנאים pH מעט אלקליין (pH 8-9) לאורך מכתים, מאז e. coli β-galactosidase על ה-pH האופטימלי של 7.3. זה יעזור כדי להפחית באופן משמעותי את הרקע וכדי טובה חיידקי β-galactosidase פעילות19,20,21,22. יש גם לציין כי זמן מכתים פעמים עלול לגרום לחומצי X-gal מכתים פתרון, העדפה של רקע מוגבר. יתר על כן, הפעילות β-galactosidase הוא איבד תחת הדגירה טמפרטורות מעל 50 º C, אך לא מתחת 42 מעלות צלזיוס. בידיים שלנו, דגירה עם סובסטרט X-גל עובד טוב יותר כאשר נשאר ללון ב 37 º C. לאחר צביעת ולפני השלב קיבוע שאחרי, חשוב לשטוף את כל החומר התגובה X-גל בקפידה, מהר ככל האפשר למנוע פוחת משקעים מן התגובה פתולוגיה כי ניתן להפקיד במדור רקמות.

כפי שמוצג להלן, ניקוי עוברי גליצרול חשוב בהכנת הרקמה שקוף תוך שמירה על X-gal היסטולוגיה מכתים ורקמות. לפיכך, העוברים הפך ברור, תיוג ניתן לאבחן באזורים עמוק תחת stereomicroscope. עם זאת, כדי לנתח את המיקום המדויק של תאי מוכתם, חלוקתה של המדגם נדרש, לכן, סליקה אינה חיונית. במקרה זה, לפי ההמלצות הבאות המצוין השיטה, דגימות יכול להיות בקפידה שעוות פרפין מוטבע, המחולקת למקטעים. במהלך תהליך ההטבעה, אתנול מיובש רקמות צריך להיות שקוע בתוך תערובת של אלכוהול איזופרופיל-פרפין. אלכוהול איזופרופיל משמש לטובה ההחלפה של אתנול במדגם וכדי להקל על הרקמה הטבעה פרפין23. ב פרוטוקולים מסוימים, קסילן משמש במקום אלכוהול איזופרופיל לאותה מטרה. עם זאת, השימוש של קסילן מציג חסרונות נגד אלכוהול איזופרופיל, כגון הצטמקות התקשות של המדגם בשל הסרת רקמה שומנים24 ו פרופיל שלה רעילות כמו המוצר דליק מגרה25. ניקוי על בסיס שמן תפוז סוכנים הם אחת החלופות הבטוחה ל קסילן מכיוון שהם מאפשרים מהירה ניקוי ללא הרעילות של קסילן, כמו גם רקמות מצוינת מבנה לשימור26. גם, אם משתמש קסילן, חלק זה של הפרוטוקול צריך להיות מופחת לעוצמה מלאה, כיוון X-גל מכתים יכול לפזר לאיבוד19. לאחר חלוקתה, counterstaining עם צבעי (למשל הגרעין האדום מהר) מומלץ כדי להקל על זיהוי היסטולוגית להביע את התאים. הליך ההגדלה היא מהירה, הדורשים צעד אחד בלבד, ומספק את מראהו ורוד קונטרסט טוב עם התמיסה X-גל בצבע כחול. עם זאת, counterstaining הזה מתאים רק לשימוש עם הרכבה מימית מדיה (קרי DPX).

שיטה קלאסית זו מתאימה הגילוי של β-galactosidase פעילות, מאז X-גל בשילוב עם אשלגן פרו - ו ferricyanide מייצרת של התמיסה הכחול מאפיין זה אינו דוהה או מלבין בקלות, כאשר בנוי היטב, יכול להיות זוהה גם תחת המיקרוסקופ ויבתר. ישנם שינויים אחרים של הפרוטוקול המקורי. באמצעות מצעים זמינים כגון סלמון-גל (6-Chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), מגנטה-גל (5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) או Bluo-גל (5-ברומו-3-indolyl β-D-galactopyranoside)13,19 , או החלפת X-גל/FeCN קלאסי עבור Tetrazolium מלחי שמשביחים מאוד רגישות של זיהוי13,19. זה מומלץ במיוחד כדי לאפשר גילוי רגישות גבוהה של רמות הביטוי נמוכה של חלבון וחומר mRNA. עם זאת, כאשר נעשה שימוש במשך זמן רב מדי, הליכים אלה עלולה להוביל לרמות רקע, אז תמיד מומלץ ניהול זהיר של התנאים, במיוחד בהתחשב כי דגירה ממושך תקופות עשויה להקל מכתים לא ספציפי בשל β אנדוגני-galactosidase פעילות13,27. לגבי האחרון, זה תמיד רצוי להשתמש מלחי אשלגן ferric כדי למטב את המהימנות של הטכניקה ולהימנע ממלכודות.

מגבלה חשוב של שיטה זו הוא כי ההליך מכתימים קלאסית X-גל מייצרת לא מסיסים התמיסה כחול ניתן להבחין בקלות באמצעות מיקרוסקופ אור, אך אינו מאפשר שיתוף לוקליזציה מחקרים על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי או פלורסנט ברקמת סעיפים. דרך אפשרית. אחת כדי להתגבר על מגבלה זו יהיה להשתמש נוגדנים נגד β-גל (ראה איור 5) בשילוב עם immunodetection עבור סוג תא מסוים. עם זאת, אם רמות ביטוי נמוכה או גבוהה, על הרקע immunolabeling יכול לעשות את זה קשה לזהות אם הגן כתב מתבטאת בתא מסוים. ראוי לציין, טכניקה חדשה דווח כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה קונאפוקלית בהתבסס על הפליטה פלורסצנטיות המיוצר על ידי X-גל precipitate28. יתר על כן, שיטה זו תואמת ל- immunofluorescence, ניתן לזהות בבירור X-גל תאים חיוביים28. כתבים אנזימטי כגון הגן LacZ מציעים את היתרון של להיות רגיש יותר אלה פלורסנט, וזה ראוי לציון כאשר תיוג, אם רמות ביטוי נמוך במיוחד. בהקשר זה, הטכניקה נוכח הוכח אידיאלי עבור הגילוי של microRNA29, ולכן מאפשר גם הערכה איכותית של הדפוסים ביטוי וגם כימות של רמות הביטוי. צביעת כפול משמש כדי לזהות נוכחות ופעילות mRNA β-גל דרך בחיי עיר הכלאה טכניקות, אשר יכול לספק מידע שימושי מאוד לבחון את דפוס ביטוי של גנים אנדוגני תוך מעקב אחר פעילות β-גל באותה דגימת זרע 30. בכל זאת, שניהם β-גל הכתם בחיי עיר הכלאה זיהוי תגובות עשוי להציג צבע התאמה במהלך צביעת כפול. בחירת מצע מתאים יותר, כגון S-גל, מומלץ במיוחד בשיטות אופטימיזציה30.

בשיטה זו תכליתי כבר בשימוש נרחב ללמוד ג'ין פונקציה בהקשר של ביולוגיה התפתחותית. לפיכך, הגן LacZ אומץ לניתוח דפוסי ביטוי גנים במהלך התפתחות עובריים מאת מפיל אותו לוקוס ג'ין יישוב. LacZ הוא מדווח נפוצות ללמוד cis אקטינג רגולטוריות אלמנטים (משפרי) מעורב בבימוי ביטוי גנים לאזורים מוגבלים של העובר, מתן מידע על הפעילות שעתוק של האמרגן של עניין31 ,32,33. בנוסף, הוא משמש לעתים קרובות זיהוי אירועים שחלוף מאת בתיווך Cre רקומבינציה מאתרי loxP, אשר הוא שימושי במיוחד עבור הגילוי של תאי גזע עובריים נגזרים בניסויים מיפוי תא הגורל או השתלת תאים. מוטגנזה מכוונת ג'ין-מלכודת בתאי גזע עובריים מייצר חלבונים קטום דבוקה β-גל המאפשר הערכה של יזם פעילות תחת התנאים הפיזיולוגיים34. עבור כל הגישות הללו עוף הטרנסגניים חיות הנושאות LacZ ולבטא חיידקי β-galactosidase נוצרו עכברוש35,36,37,38, צפרדע רפואית39 או דג זברה40. עד כה, טכניקה זו כבר בשימוש דרוזופילה לשפר את הפריט החזותי של ביטוי גנים במרחב חנותם בשל הזמינות של מערכות ביטוי גנים inducible, ואת רקמת תאים ספציפיים p-LacZ סמן קווים41 ,10. זה ראוי לציין כי מלבד אלה יישומים רבים מעורבים בעלי חיים מהונדס, הסתרה, LacZ מדווח שימש ברקמות כולו, כמו גם תרבותי תאים כדי לחזות את התפקיד של גנים המחלה במחקר ביו-רפואי. אחד לא יכול להכחיש של האחרונים היא המחקר של תהליך ההזדקנות לגבי תגובות הלחץ, דיכוי הגידול או פיתוח. תאים senescent הם קל לזהות הן מקומיים והן ויוו בשל ביטוי אופייני שלהם ואת הצטברות בטא lysosomal אנדוגני-galactosidase42,43. לפיכך, β-galactosidase משמש במבחני כמותית ב סרטן ותרבותית סמן senescent תאים44.

לסיכום, אנו מתארים הליך ריאלי וממוטב כדי להקל על זיהוי קל של β-galactoside פעילות ברקמה עוברית העכבר. השיטה הנוכחית מאפשרת שינויים מבוסס על הרקמה נבחר את המצע בשימוש. לפיכך, שיטה זו רב-תכליתי וחסכוני מועסק עם הפקדים המתאימים מתאימה במיוחד לשימוש עם העכבר כל העוברים, כמו גם על חלקים היסטולוגית דק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם שום עניין פיננסי מתחרות.

Acknowledgments

ברצוננו להודות השירות Histopathological לסיוע טכני שלהם ב- Cardiovasculares סנטרו נאסיונאל דה Investigaciones (CNIC). אנו מודים גם ד ר Seiki מוטוהארא עבור עכברים Mt4-mmpLacZ מתן בחביבות, ד ר אליסיה ג'י ארויו עבור תמיכה הפרויקט שלנו ועבור שלה קריאה ביקורתית של כתב היד. אנחנו רוצים להודות פיטר בוני להגהת מאמר זה. עבודה זו נתמך על ידי אוניברסיטת Europea דה מדריד באמצעות מענק (# 2017UEM01) הוענק C.S.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
2-Propanol SIGMA-ALDRICH 24137-1L-R
Agarose SCHARLAU 50004/ LE3Q2014
Aqueous mounting medium VECTOR LABS H-5501
Synthetic mounting media MERCK 100579
96% Ethanol PROLABO 20824365
99.9% Ethanol absolute SCHARLAU ET00021000
50% Glutaraldehyde solution SIGMA-ALDRICH G6403-100ml
85% Glycerol MERCK 104094
99.9% Glycerol SIGMA-ALDRICH G5516
Magnesium chloride hexahydrate SIGMA-ALDRICH 63064
Nonionic surfactant (Nonidet P-40) SIGMA-ALDRICH 542334
Nuclear Fast Red counterstain SIGMA-ALDRICH N3020
Paraffin pastilles MERCK 111609
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH 158127-500g
Phosphate buffered saline (tablets) SIGMA-ALDRICH P4417-50TAB
Potassium ferrocyanate MERCK 1049840500
Potassium ferrocyanide MERCK 1049731000
Sodium azide SIGMA-ALDRICH S8032
Sodium deoxycholate SIGMA-ALDRICH 30970
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate SIGMA-ALDRICH 106346
Sodium phosphate dibasic dihydrate SIGMA-ALDRICH 71638
Thymol SIGMA-ALDRICH T0501
Tris hydrochloride (Tris HCl) SIGMA-ALDRICH 10812846001 (Roche)
X-GAL VENN NOVA R-0004-1000
Xylene VWR CHEMICALS VWRC28973.363
EQUIPMENT
Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm SAKURA 4566
Rotatory Microtome Leica RM2235
Cassettes Oxford Trade OT-10-9046
Microscope Cover Glasses 24x60 mm VWR ECN631-1575
Microscope slides Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER AGAA000001#12E
Adhesion microscope slides Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER J1820AMNZ
Flotation Water bath Leica HI1210
Disposable Low Profile Microtome Blades Feather UDM-R35
Paraffin oven J.R. SELECTA 2000205
Wax Paraffin dispenser J.R. SELECTA 4000490
Stereomicroscope Leica DM500
Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL SIGMA-ALDRICH T2795
Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL SIGMA-ALDRICH T9661
Orbital shaker IKA Labortechnik HS250 BASIC
Stirring Hot Plate Bibby HB502
Vortex Shaker IKA Labortechnik MS1
Laboratory scale GRAM FH-2000
Precision scale Sartorius ISO9001
pHmeter Crison Basic 20
Optic fiber Optech PL2000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
  2. Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182 (1994).
  3. Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
  4. Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
  5. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
  6. Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
  7. Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
  8. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  9. Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767 (2017).
  10. Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux's Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
  11. Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
  12. Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
  13. Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
  14. Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797 (2011).
  15. Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
  16. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  17. Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
  18. Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
  19. Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
  20. Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
  21. Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
  22. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
  23. Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
  24. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  25. Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
  26. Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
  27. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
  28. Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937 (2013).
  29. Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
  30. Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
  31. Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
  32. Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
  33. Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
  34. Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
  35. Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
  36. Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
  37. Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
  38. Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
  39. Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
  40. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
  41. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  42. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  43. Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
  44. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 136 LacZ β-galactosidase פרפין חלוקתה פיתוח העכבר הבהרה עובריים ביטוי גנים
עקיבה ביטוי גנים דרך זיהוי של β-galactosidase פעילות ב עכבר כל העוברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blanco, M. J., Learte, A. I. R.,… More

Blanco, M. J., Learte, A. I. R., Marchena, M. A., Muñoz-Sáez, E., Cid, M. A., Rodríguez-Martín, I., Sánchez-Camacho, C. Tracing Gene Expression Through Detection of β-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (136), e57785, doi:10.3791/57785 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter