Summary
هنا يمكننا وصف بروتوكول قياسي للكشف عن النشاط β-جالاكتوسيداسي في الأجنة الماوس كله في وقت مبكر وأسلوب البارافين تمزيقها وكونتيرستينينج. هذا هو إجراء سهل وسريع لرصد الجينات أثناء التطوير التي يمكن أن تطبق أيضا على أقسام الأنسجة، الأجهزة أو الخلايا المستزرعة.
Abstract
ويستخدم الجين الإشريكيّة القولونية لاكز ، ترميز β-جالاكتوسيداسي، إلى حد كبير كمراسل للتعبير الجيني وتتبع في الخلية النسب الدراسات. رد فعل histochemical الكلاسيكي يرتكز على التحلل المائي للركيزة X-غال في تركيبة مع أيونات الحديديك والحديدية، التي تنتج ترسبات زرقاء غير قابلة للذوبان من السهل تصور. ولذلك، β-جالاكتوسيداسي النشاط بمثابة كعلامة لنمط التعبير للجينات لمصلحة التنمية العائدات. هنا يصف لنا بروتوكول قياسي للكشف عن النشاط β-جالاكتوسيداسي في الأجنة الماوس كله في وقت مبكر وأسلوب البارافين تمزيقها وكونتيرستينينج لاحقاً. بالإضافة إلى ذلك، يتم توفيرها من إجراء لتوضيح الأجنة كله تصور أفضل X-غال تلطيخ في مناطق أكثر عمقاً للجنين. يتم الحصول على نتائج متسقة قبل تنفيذ هذا الإجراء، رغم الحاجة إلى تحسين ظروف رد فعل لتقليل النشاط الخلفية. ينبغي أيضا النظر قصور التحليل، لا سيما فيما يتعلق بحجم الجنين في جبل كله تلطيخ. وينص البروتوكول لدينا حساسة وطريقة موثوقة لكشف β-جالاكتوسيداسي أثناء وضع الماوس التي يمكن تطبيقها كذلك على أبواب كريوستات، فضلا عن أجهزة كاملة. وهكذا، يمكن تحليل أنماط تعبير الجينات الحيوية في جميع أنحاء التنمية بسهولة باستخدام هذا البروتوكول في الأجنة كلها، ولكن كما يمكن تقييم التعبير مفصلة على المستوى الخلوي بعد تقطيع البارافين.
Introduction
من أجل وصف أنماط التعبير الجيني محددة، تم استخدام الجينات مراسل كعلامات قصوى من المورفولوجية للثدييات. في التجارب التي تنطوي على الحيوانات المحورة وراثيا والضربة القاضية، الجين البكتيري β-جالاكتوسيداسي (لاكز) من الإشريكيّة القولونية (كولاي) واحدة من الأكثر استخداماً1،2،3، 4-β-جالاكتوسيداسي (β-غال) يحفز على أن التحلل من β-جالاكتوسيديس (مثل اللاكتوز) إلى السكريات الأحادية (الجلوكوز واللبن)5. الركيزة الأكثر استخداماً هو العاشر-غال (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)، غليكوزيد الذي هو تحلل من β-جالاكتوسيداسي نشأ عنه 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole واللبن. الأول هو تتأكسد في ديمر، عندما تستخدم جنبا إلى جنب مع البوتاسيوم فيري-وتنتج فيرو-السيانيد، مميزة غير قابلة للذوبان، ويعجل باللون الأزرق (الشكل 1)6.
بدأت الجينات لاكز لاستخدامها كأحد جينات مراسل منذ أكثر من ثلاثين عاماً7،8. عادة، يتم إدراج لاكز المتلقين للمعلومات من المروجين الذاتية مكان الإطار القراءة المفتوحة، حيث يمكن استخدامه في الثقافة البكتيريا والخلية لتصور الخلايا التي تحتوي على إدراج خاصة، وكذلك في الحيوانات المحورة وراثيا كتتبع من الذاتية أنماط التعبير الجيني أثناء التنمية9. وفي هذا الصدد، التصور من β-جالاكتوسيداسي النشاط على نطاق واسع استخدمت في المورفولوجية لفهم العمليات الإنمائية والخلوية من خلايا مفردة لكل الأنسجة. الوراثة المورفولوجية لصالح توليد خطوط مستقرة فيه بناء عنصر ف معدلة تحتوي على الجينات مراسل لاكز إدراج المواقع في الجينوم عشوائياً. وهكذا، عندما وضعت تحت تأثير عناصر محسن قد محرك التعبير عن بطريقة محددة أنسجة، مما سمح إجراء تحليل منهجي لأنماط التعبير العديد من الجينات خلال العقدين الماضيين الماضية10. وبالإضافة إلى ذلك، يتيح استخدام الفئران المعدلة وراثيا لرصد التعبير الجيني لاكز أيضا الكشف عن المورثات جزئ الأحداث حسب لوكسب لجنة المساواة العرقية بوساطة جزئ، والترجمة من المشتقات متحولة الخلايا الجذعية الجنينية في تحليلات تشيميريك 11، مما يسهل التحكم في التعبير لاكز في أنسجة محددة، وكذلك وقتيا. أيضا، في الأجنة كله، الكشف عن نشاط β-جالاكتوسيداسي قد تنتج أنماط المصبوغة التفاضلية في كثافات مختلفة التي يمكن ملاحظتها مريح عبر مراحل تنموية مختلفة لتحليل التغيرات الزمنية في التعبير الجيني 8،12.
في هذه المقالة، نقدم بروتوكولا لتصور التعبير الجيني عن طريق X-غال تلطيخ في الأنسجة جبل كله في مراحل النمو المبكر للأجنة الماوس. أننا نقدم هذا الأسلوب histochemical كتقنية حساسة للغاية وغير مكلفة التي تفضل كشف دقيق للخلايا المسماة في العينات جبل كله أو على المستوى الخلوي بعد البارافين مضمن الأنسجة أو الأجنة. الأسلوب يسمح للتصور مباشرة من تلطيخ في الأنسجة الماوس مع خلفية الحد الأدنى عند مقارنتها مع أساليب أخرى13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافق جميع الإجراءات التجريبية اللجنة المعنية "أخلاقيات التجارب الحيوانية" المحوسبة بطاقة الهوية الوطني (المركز الوطني للبحوث كارديوفاسكولاريس) وفي مدريد الدولية المستقلة لضمان الحد الأدنى الحيوان المعاناة.
1-جمع الأجنة من الفئران الحوامل (من E8.5 إلى E12.5)
- التضحية الفئران الحوامل بخلع عنق الرحم أو استنشاق أول أكسيد الكربون2 . الاحتفال باليوم الأول التوصيل المهبلية اعتبرت الجنينية يوم 0.5 (E0.5).
- وضع الحيوان في موقف ضعيف على لوحة ماصة وتنظيف البشرة البطن للماوس مع الإيثانول 70%.
ملاحظة: ليس مطلوب من العقم في الخطوات التالية. - قرصه ورفع الجلد البطن باستخدام الملقط الماوس-الأسنان.
- جعل شق من خلال الجلد وجدار البطن، 2 إلى 4 سم عمودياً عبر خط الوسط للبطن باستخدام مقص جراحي.
- كشف البطن وإزالة قرون الرحم من الأم مع ملقط قطع الأوعية الدموية على طول انحناء الرحم الداخلي مع المقص الجراحي.
- إزالة سلسلة الأجنة ونقلها إلى طبق بتري على الجليد التي تحتوي على 10 مل المثلج 0.01 متر الفوسفات المخزن المؤقت المالحة درجة الحموضة 7.4 (PBS).
- تشريح الأجنة خارجاً من الرحم تحت ستيريوميكروسكوبي في طبق بتري مع 10 مل برنامج تلفزيوني المثلج الطازجة بعناية. فهم الجدار العضلات بالملقط الساعات لفضح الكيس الذي يحيط بالجنين، وثم تمزق الغشاء السلوى لإزالة الجنين المغلقة وكيس ألمح باستخدام النصائح من الملقط.
- جمع الأجنة ليتيرماتي من الفئران الحوامل في مراحل مبكرة (من E8.5 إلى E12.5) (الشكل 2).
- نقل الأجنة إلى طبق جديد مع برنامج تلفزيوني الباردة 1 x 10 مل باستخدام الملقط منحنى، أو لاجنة صغيرة جداً (E8.5-E9.5)، استخدام الماصات البلاستيكية نقل لجمع العينات دون ضرر الجنين.
- قبل البدء في التثبيت، أن نموذج جنينية في أنبوب ميكروسينتريفوجي للتنميط بقطع قطعة صغيرة من الجنين أو أخذ الغشاء السلوى في الأجنة أصغر (من E8.5 إلى E9.5) مع الملقط الساعات.
ملاحظة: التنميط لاكز يتحدد بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد) كبسولة تفجير: إلى الأمام، 5´-أتكجتجكجتجتجاكتج-3´؛ عكس، 5´-كجاجكجتاككجتكاجكا-3´.
2. تثبيت الأجنة الماوس
- نقل كل الأجنة في أنبوب ميكروسينتريفوجي 2 مل مع قاعدة مدورة تحتوي على برنامج تلفزيوني 1 x 1 مل.
ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات في البروتوكول في هذه الأنابيب مع الانفعالات استخدام شاكر متداول. - تغسل الأجنة في 1 x برنامج تلفزيوني لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإزالة الدم المتبقي. استخدام الماصات البلاستيكية نقل لتغيير السوائل في الأنابيب.
- إصلاح الجنين في 1 مل من 0.125 ٪ glutaraldehyde على الجليد.
ملاحظة: وقت التثبيت يعتمد على حجم الجنين: 20 دقيقة للأجنة E8.5-E9.5، 30 دقيقة للأجنة E10.5 وح 1 للأجنة E12.5. - إزالة مثبت وتغسل الأجنة في برنامج تلفزيوني 1 x مرتين لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل تجهيز العينة لتلطيخ غال X.
3-كله جبل β-جالاكتوسيداسي هيستوتشيميستري الأجنة الماوس
- العاشر-غال "تلطيخ حل" قبل البدء في هذا الإجراء و "شطف" غال X إعداد المخزن المؤقت (انظر الجدول 1 و الجدول للمواد). استخدام أجنة ليتيرماتي (WT) البرية من نوع كعناصر سلبية لرد الفعل الأنزيمي.
- تبني الأجنة في شطف X-غال المخزن المؤقت لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2).
- تبني الأجنة في "حل تلطيخ" غال س من ح 2 المبيت في 37 درجة مئوية محمية من الضوء. مراقبة رد فعل اللون بشكل دوري عبر مجهر تشريح حتى لوحظ كثافة كافية لتلطيخ الأزرق دون الخلفية في الجنين. الحفاظ على درجة الحموضة للحل بين 8 و 9 لتقليل الخلفية أثناء المصبوغة كلياً. إذا كان الحل المصبوغة يبدأ تشغيل الضوء، استبدلها بحل الركازة جديدة لتوسيع التفاعل الأنزيمي.
- وقف رد الفعل عندما يتم الحصول على إشارة المطلوب قبل الغسيل الأجنة في أنبوب ميكروسينتريفوجي مع برنامج تلفزيوني 1 x 1 مل مرتين عن 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- نقل الأجنة الملون إلى 1 مل 4% بارافورمالدهيد (PFA) لإعادة إصلاحها، ح 1 المبيت في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يمكن تخزين الأجنة في 4% PFA/برنامج تلفزيوني لأوقات أطول في 4 درجات مئوية أو يمكن معالجته فورا لتمزيقها. تعد هذه الخطوة التثبيت النهائي الحاسم للحفظ الطويل الأجل لنمط المصبوغة. - تغسل الأجنة في برنامج تلفزيوني 1 x 1 مل مرتين لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- الخيار 1: مسح الأجنة قبل الانغماس في مجموعة من الحلول مع التركيزات المتزايدة الجلسرين (والغليسيرول 20%، 40%، 60% و 80% في برنامج تلفزيوني 1 x) عن ح 1 في درجة حرارة الغرفة في كل حل.
ملاحظة: تغسل الأجنة في والغليسيرول 80% لأوقات أطول، وحتى أيام، حتى أنها يتم مسح ومن ثم تخزينها في والغليسيرول 80% في 4 درجات مئوية في هذه الخطوة (الشكل 2). إضافة كمية صغيرة جداً من الصوديوم كريستال أورا أزيد من ثيمول إلى الأجنة المخزنة في 4 درجات مئوية أما في الجلسرين أو 1 x يوصي ببرنامج تلفزيوني لمنع نمو العفن. بعد تطهير، يمكن استخدام الأجنة جبل كله لتصوير (الخطوة 4). - الخيار 2: عملية الأجنة البارافين التضمين وتمزيقها باستخدام مبضع (الشكل 2). الوثيقة نمط التعبير في أجنة ملطخة كلياً قبل تمزيقها (الخطوات 4 و 5).
4-التصوير كله جبل الأجنة
- تصوير جبل كله الملون الأجنة قبل تمزيقها، ونقلها إلى طبق بتري أعد مع قاعدة من وطدت [اغروس] 1-2% في برنامج تلفزيوني 1 x.
- تغطية الجنين تماما مع PBS 1 x 10 مل في الأطباق [اغروس] المغلفة لمنع التجفاف والتأمل حين تصوير عن طريق السائل.
- توجيه الجنين منغمسين في 1 x PBS باستخدام الملقط. لكبار السن من الأجنة (E10.5-E12.5)، جعل ثقب صغير في [اغروس] مع الملقط للمكان ووضع العينة داخله في زوايا مختلفة وتجنب التعويم الحر أثناء التصوير.
- ضع الطبق على المسرح ستيريوميكروسكوبي، واستخدام الضوء المنقولة (وكيل المرحلة). تغيير بين 'الظلام-الحقل' والتسويات 'مشرق الحقل' لتعيين الإضاءة المطلوبة أثناء التصوير الفوتوغرافي وتحسين الشفافية العينة.
ملاحظة: استخدام الإضاءة الألياف البصرية للأجنة لاحقاً لتجنب التفكير في السطح للجنين. عند تصوير الأجنة المطهرة، اتبع نفس الإجراء ولكن نقلها إلى طبق بتري يحتوي على الجلسرين 100% وتزج الكامل لهم.
5-البارافين التضمين وتمزيقها من X-غال الملون الأجنة
- شمع البارافين التضمين
- إزالة X-غال الملون الأجنة من 4 درجة مئوية (الخطوة 3، 5) وغسلها ببرنامج تلفزيوني 1 x 1 مل ثلاث مرات للقضاء على الفائض في مثبت.
- نقل كل الأجنة إلى كاسيت الأنسجة باستخدام الملقط.
- وضع أشرطة الكاسيت التي تحتوي على الأجنة في كوب ويذوي ثم بتمريرها من خلال سلسلة متدرجة من إيثانول في درجة حرارة الغرفة: 70% إيثانول، مرة واحدة لمدة 30 دقيقة؛ إيثانول 96%، مرتين لمدة 30 دقيقة في كل؛ 100 ٪ الإيثانول، مرتين لكل 30 دقيقة.
ملاحظة: يمكن تخزين الأجنة في الإيثانول 70% بالنسبة لوقت غير محدد عند 4 درجة مئوية حتى تبدأ عملية الجفاف. - احتضان كاسيت كله في الكحول لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- باستخدام الملقط، نقل الأشرطة لزجاج تلطيخ الحوض يحتوي على الايزوبروبانول المعالجون مسبقاً وتترك في فرن عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- ضع أشرطة الكاسيت في زجاج جديد تلطيخ الحوض الصغير الذي يحتوي على خليط الكحول 50%/50% ذاب شمع البارافين وإجازة ح 4 في فرن 60 درجة مئوية.
- احتضان الأشرطة مع الأجنة مع اثنين من التغييرات من شمع البارافين المنصهر، 30 دقيقة عند 60 درجة مئوية كل.
- في نهاية الغسيل البارافين النهائي، فتح الكاسيت ونقل كل الأجنة إلى أنسجة منفصلة تضمين القالب لعرض العينة تحت ستيريوميكروسكوبي.
- سد البئر شمع البارافين المنصهر في 60 درجة مئوية. استخدام الملقط ساخنة للاحتفاظ الشمع المنصهر وتوجيه عناية الجنين في القالب.
ملاحظة: التوجه السليم للعينة خطوة حاسمة لتقطيع الجنين في الطائرة المطلوب. - قبل أن يتصلب البرافين في القالب، ضع كاسيت دون غطاء على رأس الكتلة وملئه شمع البارافين المنصهر. السماح لتبرد الشمع المتبقي حتى توطد بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
- بمجرد البارافين هو توطد تماما، إزالة كتلة صلبة من العفن وتخزين كتل البارافين في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجات مئوية حتى تمزيقها14.
- البارافين تمزيقها
- توجيه النصل على مبضع وإعداد 5-7 ميكرون سمك. 5.2.2-كول في كتلة البارافين على الجليد وتقليم لإنتاج مكعب أو هرم.
- إرفاق الكتلة حامل مبضع باستخدام كمية صغيرة من الشمع المصهور.
- توجيه كتلة قطع الأمثل. قسم كتل البارافين إلى 5-7 ميكرون شرائح سميكة في درجة حرارة الغرفة باستخدام مبضع القياسية.
- استخدام الرسام ما يرام، وضع المقاطع في حمام مائي في درجة حرارة الغرفة للتلاعب وتحديد الشرائح.
- التقاط أجزاء من حمام الماء مع شريحة مجهر وتحويلها إلى حمام مائي في 42 درجة مئوية للتمدد.
- إزالة أقسام من حمام المياه ووضعها بلطف على شرائح المجهر الالتصاق.
- الجاف للشرائح جيدا في فرن عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها للسماح للفروع التقيد تماما، وإلا فإنها قد تضيع خلال تلطيخ.
ملاحظة: تخزين الشرائح عند 4 درجة مئوية حتى تبدأ تلطيخ الإجراءات.
- ديبارافينيزيشن وكونتيرستاينينج من مقاطع البارافين غال الملطخة X
- وضع الشرائح على شريحة مجهر صينية في فرن عند 60 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة على الأقل جعل شمع البارافين أكثر مرونة.
- نقل الشرائح إلى رف واستخدام الزجاج تلطيخ الأطباق إلى الخطوات التالية: تغرق الحامل في الجرار المصبوغة التي تحتوي على الكحول لتقليل تركيزات لإزالة كاملة من البارافين وترطيب الأنسجة: الايزوبروبانول لمدة 5 دقائق في 60 درجة مئوية؛ الايزوبروبانول لمدة 3 دقائق؛ الإيثانول 100% لمدة 2 دقيقة؛ إيثانول 96% لمدة 1 دقيقة؛ إيثانول 70% لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- شطف المقاطع في الماء المقطر مرتين للتأكد من أن هناك لا بقايا الكحول.
- كونتيرستين الأقسام مع وصمة عار (مثلاً حل "الأحمر" النووي-سريع) لمدة 5 دقائق (عادة ما بين 3-8 دقيقة) في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2).
ملاحظة: تلطيخ هذا يساعد على الكشف عن هيكل الأنسجة عموما في الفروع. - بعد تلطيخ، يغسل الشرائح في الماء المقطر لمدة 1 دقيقة ومراجعة قسم تلطيخ في المجهر.
ملاحظة: إذا كان المطلوب تلطيخ ضعيفة جداً، كونتيرستين الأبواب مرة أخرى لفترة أطول. - يذوي المقاطع في السلسلة التالية مع زيادة تركيزات إيثانول: يغسل اثنين في الإيثانول 95% لمدة 2 دقيقة، يغسل اثنين في الإيثانول 100% لكل 2 دقيقة، وتفادي تذويب الزرقاء اللون رواسب، الغسيل السريع واحد فقط في زيلين نفط.
- إزالة الشرائح من الرف واحداً تلو الآخر، ووضعها على قطعة من الورق. ثم جبل وساترة كل شريحة باستخدام وسيلة تصاعد الاصطناعية، الدائمة.
ملاحظة: زيلين نفط هو منتج قابل للاشتعال الأبخرة التي مزعجة وضارة بصحة الإنسان والكائنات الحية المائية. أنه يحتاج إلى معالجته داخل غطاء محرك السيارة، ويتطلب استخدام المعدات الواقية المناسبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا نعرض النتائج من تطبيق البروتوكول القياسي لرد فعل histochemical β-جالاكتوسيداسي باستخدام X-غال كالركيزة في الأجنة كله الماوس (الشكل 1 و الشكل 2). باستخدام هذا البروتوكول، علينا أن ندرس نوع الغشاء أية 4-مصفوفة (Mt4-mmp) التعبير في مختلف مراحل النمو الجنيني (E9.5 و E11.5 و E12.5) استخدام Mt4-mmp متحولة الفئران التي تعبر عن مراسل لاكز الخاضعة لسيطرة الذاتية Mt4-mmp المروج (الشكل 3، الرقم 4، و الرقم 5)9،15. Mt4-نظام التمثيل التناسبي المختلط هو endopeptidase مرتبط بغشاء الخلية من خلال رابط اينوزيتول جليكوفوسفاتيديل (GPI). على الرغم من Mt4-نظام التمثيل التناسبي المختلط قد اكتشفت في العديد من السرطانات البشرية وقد كانت تتصل بتطور نمو الورم، معلومات حول نشاطه proteolytic ضد عناصر المصفوفة خارج الخلية محدود جداً حتى الآن. بالإضافة إلى ذلك، لا شيء تقريبا أبلغ عن دور والتعبير Mt4-نظام التمثيل التناسبي المختلط أثناء التطور الجنيني9،16.
نوع البرية (WT)، Mt4-mmpلاكز/+ تجهز متخالف (HT) وخروج المغلوب (كو) ليتيرماتي الأجنة بالتوازي للبروتوكول العاشر-غال المصبوغة (الشكل 2). يجب تضمين عدة عناصر تحكم أثناء عملية المصبوغة للتحقق من الطابع الخاص لهذا الإجراء. وهكذا، تستخدم كعناصر سلبية لرد فعل histochemical وتقوم برصد غير محددة X غال وسم الأجنة WT (انظر الشكل 3 ألف-دال و الشكل 4A-ج). أيضا، لتجنب الخلفية غير محدد، يجب الاحتفاظ الرقم الهيدروجيني للحل المصبوغة X-غال بين 8 و 9 في جميع أنحاء تلطيخ كله. في الشكل 3 أي، هي تصور الخلايا β-غال-الإيجابية في الأجنة كله جبل HT سميتس والمفرج إينتيرسوميتيك في المرحلة E9.5. بيد تقرير الموقع الدقيق للخلايا الملون، تقطيع الجنين مطلوب تصور تحت المجهر أبلغ تعبير الجينات في أقسام الأنسجة في القرار الخلوية. في هذه الحالة، يتم العثور على خلايا لاكز-الإيجابية في سميتس والشريان الاورطي الظهرية، والمفرج إينتيرسوميتيك، فضلا عن الضفيرة الوعائية perineural في أقسام الأنسجة (الأسهم في الشكل 3F-H). ربط هذه النتائج مع نمط التعبير أبلغ عن Mt4-نظام التمثيل التناسبي المختلط في هذه الماوس المراحل الجنينية9، مشيراً إلى أن هذا الأسلوب استنساخه بسهولة ويمكن الاعتماد عليها. كما هو متوقع، مستويات النشاط غال β أعلى في الأجنة كو بالمقارنة مع HT نظراً لوجود نسختين من الجينات مراسل لاكز (الرقم 3I-L). ومع ذلك، فقط HT لاكز/+ يجب أن يتم تحليل الأجنة في الدراسات المتعلقة بأنماط التعبير الجيني والأنسجة كو يستخدم كدليل على مفهوم لإثبات جدوى الأسلوب منذ نظراً لعدم وجود الجين المستهدف للفائدة، يمكن أن تكون الخلايا β-غال الإيجابية عادي يقع في هذه الأخيرة.
عند تنفيذ هذا البروتوكول، الأجنة الأكبر سنا (من E10.5 إلى E12.5) ليست شفافة، وذلك، أبرز X-غال الملون المناطق تلك القريبة من السطح. وهكذا، خطوة بديلة لهذا الأسلوب لمسح الأجنة التي يغسل في الحلول مع زيادة تركيزات والغليسيرول. في الشكل 4، الأجنة الملون لاكز E12.5 أصبح واضحا مع الحفاظ على س-غال تلطيخ، مما يسمح لنا بصورة أعمق الملون مناطق الجنين في ستيريوميكروسكوبي. وكما ذكر سابقا في هذه المرحلة الجنينية، مترجمة العلامات في مناطق متميزة من الدماغ وأطرافه والمسام من فيبريسا وطرف الذيل9. ومع ذلك، إذا كان أحد يرغب في الحصول على قرار خلوية، أجنة ينبغي جزءا لا يتجزأ من البارافين، مقطوع وفحصت مجهريا.
في الشكل 5، استخدمت إيمونوهيستوتشيميستري مع الأجسام المضادة-β-غال لتأكيد التعبير عن Mt4-mmp ولاحظ عن طريق تلطيخ لاكز المراسل. وهكذا، تم الكشف عن الخلايا β-غال-الإيجابية في مجمع موتونيورونس الحبل الشوكي الماوس في E11.5 باستخدام كلا النهجين، مما يؤكد خصوصية البروتوكول ذكرت هنا (الشكل 5 أ، ب).
الشكل 1 . الرسم التوضيحي التخطيطي لترميز الجينات مراسل لاكز كولاي β-جالاكتوسيداسي ورد فعل histochemical تحفزها هذا الإنزيم. في تلطيخ التقليدية، هيدروليزيس β-جالاكتوسيداسي 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside الركيزة (X-غال) إلى 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole. وفي وقت لاحق، هذا المتوسط هو المؤكسدة، الذي يسبب ثنائي وتشكيل للمنتج النهائي باللون الأزرق (5، 5 '-ديبرومو-4, 4'-ثنائي نيلي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . رسم تخطيطي يوضح الخطوات الرئيسية لبروتوكول قياسي للكشف عن النشاط β-جالاكتوسيداسي- أجنة الفأر وتم جمعها وتجهيزها لتلطيخ جبل X غال كله. بعد تلطيخ histochemical أداء وفقا للبروتوكول، الأجنة جبل كله يمكن أن يكون (الخيار 1) مسح مع يغسل في الحلول مع زيادة تركيزات والغليسيرول وصورت في وقت لاحق في ستيريوميكروسكوبي، أو (الخيار 2) جزءا لا يتجزأ من البارافين، مقطوع وكونتيرستينيد. المختصرات: RT، درجة حرارة الغرفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . العاشر-غال تلطيخ E9.5 WT ونظام التمثيل التناسبي المختلط-Mt4لاكز/+ جبل كل أقسام الأنسجة والأجنة- باستخدام مقايسة histochemical القياسية في العاشر--غال، حللت الأجنة المعدلة وراثيا تحمل الجينات لاكز تحت سيطرة المروج Mt4 mmp لنشاط β-غال. تم تجهيز WT (A) وتقنية HT (ﻫ) والأجنة كله جبل E9.5 كو (أنا) للكشف عن التعبير β-جالاكتوسيداسي. البارافين المقاطع التي تم الحصول عليها من هذه الأجنة في مستوى النخاع الشوكي يسمح التصور لتلطيخ في القرار الخلوية. كما هو متوقع، الخلايا β-غال الإيجابية كانت غائبة في أقسام WT (ب-د)، بينما في كو (J-L) بالمقارنة مع أقسام الأنسجة HT (وح) أعلى الكثافة من العلامات. المقاطع العرضية من خلال الأنبوب العصبي تكشف عن نشاط β-غال في سميتس النامي والشريان الاورطي الظهرية والضفيرة الوعائية perineural. المختصرات: دا، الشريان الاورطي الظهرية؛ فلب، فوريليمب برعم؛ قلب ح،؛ م، ميسينسيفالون؛ الإقليم الشمالي، نوتوتشورد؛ أو تي في، حويصلة عتيق؛ ov، حويصلة البصرية؛ PNVP، perineural ضفيرة الأوعية الدموية؛ s، سميط؛ تي، تيلينسيفالون. تغيير حجم أشرطة: 500 ميكرومتر (أ، ه، أنا)؛ 100 ميكرومتر (ب، و، ي)؛ 50 ميكرومتر (ج، ز، ك)؛ 20 ميكرومتر (د، ح، ل). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . Photomicrographs WT وغال X HT ملطخة الماوس الأجنة في E12.5 قبل (أ، د) وبعد (ب، ج، ه، و) تطهير مع يغسل في زيادة والغليسيرول. كما هو متوقع، الأجنة WT إظهار لا مراسل لاكز التعبير (أ-ج) في حين تم اكتشاف العلامات في أطرافه (رؤوس الأسهم البيضاء)، بريمورديوم المسام فيبريسا (السهم الأبيض)، وطرف الذيل (السهم الأسود) والدماغ Mt4-نظام التمثيل التناسبي المختلطلاكز/+ الأجنة في هذه المرحلة (د-و)9. (ه، و) بعد المقاصة في الجلسرين، الأجنة أصبحت شفافة ووضع العلامات يمكن أن تصور بسهولة أكبر في مناطق أكثر عمقاً للجنين، كما هو مبين في ميسينسيفالون وتيلينسيفالون (الأسهم البيضاء في واو). شريط مقياس: 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 . الكشف عن Histochemical والمناعي من β-جالاكتوسيداسي. (أ) X غال تلطيخ (باللون الأزرق) يكشف عن التعبير عن Mt4-mmp في مجمع موتونيورونس في قسم بارافين من الحبل الشوكي في المرحلة الجنينية E11.5. (ب) إيمونوهيستوتشيميستري مع الأجسام المضادة-β-غال (باللون الأحمر) أكد التعبير Mt4-نظام التمثيل التناسبي المختلط في موتونيورونس الحبل الشوكي في نفس المرحلة الجنينية في أقسام كريوستات. المختصرات: fp، لوحة الكلمة؛ مينيسوتا، موتونيورونس؛ شريط الحجم: 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الجدول 1. الوصفات والحلول المطلوبة لهذا البروتوكول- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الجين لاكز كولاي قد استخدمت على نطاق واسع من كمراسل في الدراسات المتعلقة بأنماط التعبير الجيني بسبب حساسية عالية وسهولة الاكتشاف. هذا البروتوكول وصف أسلوب كلاسيكي للكشف عن التعبير β-غال استناداً إلى فعل الانزيمية التي من السهل والسريع لأداء وغير مكلفة. يمكن تطبيق هذا الأسلوب أيضا دون تعديلات رئيسية في الأجنة جبل كله أو أجهزة سليمة، كريوستات أقسام الأنسجة أو الخلايا المستزرعة.
التطبيق الدقيق لهذا الأسلوب يؤدي تلطيخ قوية والتفسير. ومع ذلك، عناصر التحكم المتزامن والخطوات اللاحقة توكيدي يوصي بشدة. وفي هذا الصدد، تجري جنبا إلى جنب في نوع البرية ليتيرماتي الأجنة المستخدمة كعناصر تحكم السلبية التي تقوم برصد غير محددة X غال تلطيخ هذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك، الحصول على بيانات التعبير عند استخدام التلوين β-غال ويتأكد من وصمة عار الغربية والكمي PCR (س-PCR) التحليل أو عن طريق β-غال إيمونوهيستوتشيميستري (الشكل 5)، الذي جنبا إلى جنب مع غيرها من الأجسام المضادة كما يتيح تحديد الإعراب عن لاكز9أنواع الخلايا المحددة. خطوات التثبيت بحاجة إلى أن تؤخذ في الاعتبار للحفاظ على النشاط الأنزيمي من β-جالاكتوسيداسي وتقليل الخلفية أثناء تلطيخ. وهكذا، يجب أن يحدد الأجنة في جلوتارالديهيدي، مما يعطي نتائج أكثر اتساقا وموثوق بها بالمقارنة مع التثبيت بارافورمالدهيد17. إلى جانب ذلك، وقت التثبيت أمر بالغ الأهمية، وينبغي أن تحدد تجريبيا لكل المرحلة الجنينية، منذ التثبيت المفرط يمكن أن تقلل من نشاط β-جالاكتوسيداسي. وفي هذا الصدد، يمكن أن تكون ثابتة الأجنة كله جبل الغمر أو التروية اعتماداً على المرحلة الجنينية وحجم. ومن ثم، ينصح نضح ترانسكارديال للأجنة أقدم من E14.5 والعينات بعد الولادة لضمان أن مثبت تصل إلى جميع المناطق في العينة. يمكن إصلاحها بواسطة الغمر أجنة أصغر (من E8.5 إلى E12.5) ومعالجة مباشرة بكاملها X-غال تلطيخ (الشكل 2). تجدر الإشارة إلى أن إكس-غال تلطيخ أجنة الفأر أصغر من E14.5 يمكن أن يؤديها كجبل كله. في هذه الحالة، يتم بسهولة الكشف عن الملون من الخلايا القريبة من السطح عن طريق تلطيخ β-غال. ومع ذلك فإنه قد يحدث أن وسم أعمق يظهر غير واضحة أو صبغ حتى لا تخترق الأنسجة، خاصة في الأجنة الأكبر سنا. وفي هذه الحالة، أما يمكن تشريح أو أنسجة الفئران الكبار، X-غال الملون، وتصور تحت ستيريوميكروسكوبي. ومع ذلك، الفحص المجهري وتقطيع النسيج الملون للفائدة هو أنسب (الشكل 2).
وبالرغم من الكفاءة البروتوكول، يمكن تلطيخ الأجنة كلها وكشف مزعجا. على سبيل المثال، الكلي، الخصية، الغدد الافرازية، البربخ والقناة الهضمية تحتوي على كميات عالية من الذاتية حمضية β-جالاكتوسيداسي18 التي يمكن أن تتداخل مع تفسير النتائج بسبب نشاط الخلفية. ولهذا السبب، ينبغي القيام برد فعل histochemical تحت ظروف درجة الحموضة القلوية قليلاً (pH 8-9) في جميع أنحاء تلطيخ، منذ كولاي β-جالاكتوسيداسي على درجة حموضة مثلى من 7.3. هذا سيساعد على التقليل من خلفية لصالح البكتيريا β-جالاكتوسيداسي النشاط19،20،،من2122. كما تجدر الإشارة إلى أن تلطيخ أوقات طويلة قد يؤدي تحمض X-غال إلى تلطيخ الحل، وتفضل خلفية زيادة. وعلاوة على ذلك، يتم فقدان النشاط β-جالاكتوسيداسي تحت حضانة درجات الحرارة فوق 50 درجة مئوية، ولكن لا تقل 42 درجة مئوية. في أيدينا، حضانة مع الركازة غال X يعمل بشكل أفضل عندما تترك بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. بعد تلطيخ، وقبل هذه الخطوة بعد انتهاء التثبيت، من المهم أن يغسل كل غال س رد فعل المواد بعناية وبأسرع وقت ممكن للقضاء على رواسب من رد فعل histochemical التي يمكن أن تودع في قسم الأنسجة.
كما هو موضح هنا، مسح الأجنة في والغليسيرول مهم لصنع الأنسجة شفافة مع الحفاظ على س-غال الأنسجة تلطيخ والأنسجة. وبالتالي الأجنة أصبح واضحا ويمكن تصور وضع العلامات في مناطق أكثر عمقاً تحت ستيريوميكروسكوبي. ومع ذلك، لتحليل الموقع الدقيق للخلايا الملون، تقطيع العينة مطلوب، ولذلك المقاصة ليست ضرورية. في هذه الحالة، بالتوصيات التالية التي ذكرت في الأسلوب، عينات يمكن أن يكون بعناية البارافين المضمنة ومقطعة. أثناء عملية التضمين، نزعت الإيثانول احتياجات الأنسجة تكون مغمورة في خليط من الايزوبروبانول-البارافين. يتم استخدام الايزوبروبانول لصالح إحلال الإيثانول في العينة، وتيسيرا للنسيج في التضمين في البارافين23. في بعض البروتوكولات، يستخدم زيلين نفط بدلاً من الايزوبروبانول لنفس الغرض. ومع ذلك، يعرض استخدام زيلين نفط عيوب مقابل الايزوبروبانول، مثل الانكماش والتشدد عينة بسبب إزالة أنسجة الدهون24 وصورتها السمية كمنتجات القابلة للاشتعال ومهيجة25. وكلاء التخليص أورانج القائم على النفط أحد البدائل الأكثر أماناً زيلين نفط أنها تتيح سرعة مسح دون سمية زيلين نفط، فضلا عن الحفاظ على بنية الأنسجة ممتازة26. أيضا، إذا كان استخدام زيلين نفط، ينبغي تخفيض هذا الجزء من البروتوكول كحد أقصى، حيث X-غال تلطيخ يمكن منتشر وفقدان19. بعد تمزيقها، كونتيرستاينينج مع الأصباغ (مثل الأحمر سريع النووية) ينصح لتسهيل تحديد النسيجي للتعبير عن الخلايا. هذا الإجراء المصبوغة السريع، التي تحتاج إلى خطوة واحدة فقط، ومظهره الوردي يوفر التباين جيدة مع ترسبات غال X زرقاء اللون. ومع ذلك، كونتيرستينينج هذا فقط مناسبة للاستخدام مع وسائل الإعلام المتزايدة غير المائية (أي DPX).
هذا الأسلوب الكلاسيكي مناسبة للكشف عن النشاط β-جالاكتوسيداسي، ومنذ العاشر-غال في تركيبة مع البوتاسيوم فيرو--وفروسيانيد ينتج عنه ترسبات الأزرق المميزة التي لا تتلاشى أو التبييض بسهولة، ويمكن أن يكون عند حسن البناء، كشف حتى تحت مجهر تشريح. وهناك تعديلات أخرى من البروتوكول الأصلي. استخدام ركائز المتاحة مثل سمك السلمون-غال (6-Chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) أو أرجواني-غال (5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) أو بلو-غال (5-برومو-3-إيندوليل β-د-جالاكتوبيرانوسيدي)13،19 ، أو استبدال X-غال/فيكن الكلاسيكية لأملاح تيترازوليوم يمكن أن يعزز بحساسية للكشف عن13،19. وهذا يوصي بصفة خاصة للسماح للكشف عن حساسية عالية من مستويات التعبير منخفضة من مادة البروتين ومرناً. ومع ذلك، عند استخدامها لفترة طويلة جداً، أي من هذه الإجراءات قد يؤدي إلى مستويات عالية من خلفية وذلك دائماً ينصح بإدارة حذرة من الشروط، فترات قد تيسير خاصة بالنظر إلى أن حضانة طويلة تلطيخ غير محدد نظراً β-جالاكتوسيداسي الذاتية نشاط13،27. فيما يتعلق بالنقطة الأخيرة، فمن المستحسن استخدام أملاح البوتاسيوم الحديديك من أجل تحسين موثوقية التقنية وتجنب المزالق دائماً.
قيداً هاما لهذا الأسلوب هو أن الإجراء المصبوغة الكلاسيكية غال X تنتج ترسبات زرقاء تستعصي على الحل التي يمكن كشفها بسهولة بالفحص المجهري الخفيفة ولكن لا يسمح بدراسات الترجمة المشارك مجهر فلوري أو [كنفوكل] في الأنسجة الأقسام. وسيكون أحد السبل الممكنة للتغلب على هذا القيد استخدام الأجسام المضادة ضد β-غال (انظر الشكل 5) جنبا إلى جنب مع إيمونوديتيكشن لنوع خلية محددة. ومع ذلك، إذا كانت مستويات التعبير منخفضة أو خلفية عالية، إيمونولابيلينج يمكن أن تجعل من الصعب الكشف عن ما إذا كان هو أعرب الجينات مراسل في خلية معينة. جدير بالذكر أن أبلغ تقنية جديدة للحصول على صور ذات جودة عالية [كنفوكل] استناداً إلى انبعاث الأسفار التي تنتجها المتعجل غال X28. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب متوافق مع الفلورة ويمكن أن تحدد بوضوح الخلايا إيجابية غال X28. الصحافيين الانزيمية مثل الجين لاكز توفر ميزة كونها أكثر حساسية من تلك الفلورية، وجديرة بالذكر عند وضع العلامات، إذا كان التعبير مستويات منخفضة بشكل خاص. في هذا الصدد، وقد ثبت هذا الأسلوب المثالي للكشف عن ميكرورنا29، وبالتالي السماح لكل من التقييم النوعي لأنماط التعبير والتحديد الكمي لمستويات التعبير. تلوين مزدوج يستخدم للكشف عن وجود نشاط ومرناً غال β عبر في الموقع تقنيات التهجين، والتي يمكن أن توفر معلومات مفيدة للغاية لدراسة نمط التعبير للجينات الذاتية حين رصد نشاط غال بيتا في نفس العينة 30-على الرغم من ذلك، قد عرض كلا β-غال وصمة عار و في الموقع التهجين الكشف عن ردود فعل التعارض اللون أثناء تلطيخ مزدوجة. اختيار الركازة أكثر ملاءمة، مثل S-غال، ينصح بالتحديد أساليب محسنة30.
هذا الأسلوب تنوعاً قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة وظيفة الجينات في سياق علم الأحياء التنموي. وهكذا، الجين لاكز اعتمدتها لتحليل أنماط التعبير الجيني أثناء التطور الجنيني يطرق فيه إلى موضع جينات مستهدفة. لاكز جين مراسل مشتركة لدراسة رابطة الدول المستقلة-النيابة العناصر التنظيمية (محسنات) تشارك في توجيه التعبير الجيني في المناطق المقيدة للجنين، تقديم معلومات عن نشاط النسخ المروج لمصلحة31 ،،من3233. أيضا، فإنه يستخدم غالباً في الكشف عن الأحداث جزئ الوراثية باقترانها بوساطة لجنة المساواة العرقية من مواقع لوكسب، ومفيدة بشكل خاص للكشف عن المشتقات الخلايا الجذعية الجنينية في التجارب تعيين مصير الخلية أو في عمليات زرع الخلايا. الطفرات فخ الجينات في الخلايا الجذعية الجنينية تنتج بروتينات مبتوراً تنصهر فيها غال β التي تسمح بتقييم نشاط المروج تحت الظروف الفسيولوجية34. لجميع هذه النهج، الدجاج الحيوانات المحورة وراثيا تحمل لاكز والإعراب عن البكتيريا β-جالاكتوسيداسي تم إنشاؤها في الفئران35،36،37،38،39 من النموأو 40من الزرد. حتى الآن، استخدمت هذا الأسلوب في المورفولوجية لتحسين تصور التعبير الجيني مكانياً وزمنياً نظراً لتوافر نظم التعبير الجيني إيندوسيبلي، والأنسجة وخطوط العلامة الخاصة بخلية فلاكز41 ،10. فإنه تجدر الإشارة إلى أنه وبصرف النظر عن هذه العديد من التطبيقات التي تشمل الحيوانات المحورة وراثيا والضربة القاضية، لاكز مراسل الجينات قد استخدمت في الأنسجة كاملة، فضلا عن استزراع الخلايا للتنبؤ بدور الجينات في الأمراض في البحوث الطبية الحيوية. مثال ذات الصلة من هذا الأخير هو دراسة عملية الشيخوخة فيما يتعلق بالردود على الإجهاد، وقمع الورم، أو التنمية. خلايا مسن سهلة الكشف سواء في الموقع أو في فيفو سبب overexpression المميزة وتراكم بيتا الليزوزومية الذاتية-جالاكتوسيداسي42،43. ومن ثم، يستخدم β-جالاكتوسيداسي كالعلامات البيولوجية مسن في الكمية فحوصات السرطان المزروع في الخلايا44.
وباختصار، نحن تصف إجراء عمليا والأمثل لتيسير الكشف عن نشاط β-جالاكتوسيدي في الأنسجة الجنينية الماوس سهلة. هذا الأسلوب يسمح تعديلات على أساس النسيج المحدد والركازه المستخدمة. ومن ثم فهذا الأسلوب فعالة من حيث التكلفة وتنوعاً يعملون مع عناصر التحكم المناسبة مناسبة خاصة للاستخدام مع الأجنة الماوس كله فضلا عن أقسام نسيجية رقيقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم أي مصلحة مالية المتنافسة.
Acknowledgments
نود أن نشكر "خدمة نسيجية" لمساعدتها التقنية في كارديوفاسكولاريس المركز الوطني للبحوث (المحوسبة بطاقة الهوية الوطني). كما نشكر الدكتور Motoharu سيكي للفئران Mt4-mmpلاكز توفير يرجى، والدكتورة أليسيا زاي أرويو لدعم مشروعنا ولها قراءة نقدية من المخطوطة. ونود أن نشكر بيتر بوني لتصحيح هذه المقالة. وأيده هذا العمل الأوروبي جامعة مدريد عن طريق منحة (# 2017UEM01) منحت إلى C.S.C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
| 99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
| 99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
| Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
| Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
| Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
| Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
| Microscope Cover Glasses 24x60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
| Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
| Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
| Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
| Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
| Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
| Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
| Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
| Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
| pHmeter | Crison | Basic 20 | |
| Optic fiber | Optech | PL2000 |
References
- Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
- Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182 (1994).
- Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
- Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
- Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
- Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
- Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
- Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767 (2017).
- Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux's Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
- Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
- Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
- Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
- Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797 (2011).
- Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
- Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
- Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
- Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
- Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
- Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
- Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937 (2013).
- Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
- Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
- Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
- Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
- Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
- Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
- Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
- Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
- Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
- Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
- Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
