Summary
Nous décrivons ici le protocole standard pour la détection de l’activité β-galactosidase dans des embryons de souris tout au début et à la méthode paraffine sectionnement et contre-coloration. Il s’agit d’une procédure simple et rapide pour contrôler l’expression des gènes au cours du développement qui peut également être appliquée à des coupes de tissus, organes ou cellules en culture.
Abstract
Le gène de l’Escherichia coli LacZ , codant la β-galactosidase, est largement utilisé comme reporter pour l’expression des gènes et comme traceur dans les études de lignée de cellules. La réaction classique histochimique est issue de l’hydrolyse du substrat X-gal en combinaison avec les ions ferreux et ferreux, qui produit un précipité insoluble bleu qui est facile à visualiser. Par conséquent, activité β-galactosidase sert de marqueur pour le modèle d’expression du gène d’intérêt à mesure que le développement progresse. Nous décrivons ici le protocole standard pour la détection de l’activité β-galactosidase dans des embryons de souris tout début et la méthode suivante paraffine sectionnement et contre-coloration. En outre, une procédure pour clarifier les embryons entiers est fournie pour mieux visualiser le X-gal de coloration dans les régions plus profondes de l’embryon. Résultats cohérents obtenus à la suite de cette procédure, bien que l’optimisation des conditions de réaction est nécessaire pour réduire l’activité de fond. Limitations lors de l’essai devraient être considérées, notamment quant à la taille de l’embryon dans la coloration entière de support. Notre protocole prévoit un sensible et une méthode fiable pour la détection de la β-galactosidase lors du développement de souris qui peut s’appliquer davantage à la sections cryostat, mais aussi les organes entiers. Ainsi, les patrons d’expression de gène dynamique tout au long du développement peuvent être analysés facilement à l’aide de ce protocole dans les embryons entiers, mais aussi expression détaillée au niveau cellulaire peut être évaluée après le sectionnement de la paraffine.
Introduction
Afin de décrire des profils d’expression génique spécifique, l’utilisation de gènes marqueurs a été primordiale de drosophile aux mammifères. Dans les expériences impliquant des animaux transgéniques et knock-out, le gène de la β-galactosidase bactérienne (LacZ) d' Escherichia coli (e. coli) est l’un des plus largement utilisé1,2,3, 4. β-galactosidase (β-gal) catalyse l’hydrolyse des β-galactosides (tels que le lactose) dans son monosaccharides (glucose et galactose)5. Son substrat plus couramment utilisé est le X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), un glucoside qui est hydrolysé par une β-galactosidase donnant lieu à 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole et le galactose. Le premier est oxydé en un dimère qui, lorsqu’il est utilisé combiné avec potassium ferri- et ferro-cyanure, produit une caractéristique insoluble, couleur bleue précipiter (Figure 1)6.
Le gène LacZ ont commencé à être utilisé comme un gène rapporteur il y a plus de trente ans7,8. Habituellement, les LacZ est inséré en aval d’un promoteur endogène à la place de la trame de lecture ouverte, donc il peut être utilisé dans la culture bactérienne et cellule de visualiser les cellules contenant un insert en particulier, ainsi que chez les animaux transgéniques comme traceur d’endogène profils d’expression génique au cours du développement9. À cet égard, la visualisation de l’activité β-galactosidase a été largement utilisée chez la drosophile pour comprendre les processus cellulaires et du développement de cellules individuelles à tissus entiers. Drosophila génétique favorise la génération de lignes stables dans laquelle une construction élément P modifiée contenant le gène rapporteur que lacZ est inséré au hasard des endroits dans le génome. Ainsi, lorsqu’il est placé sous l’influence d’éléments activateurs il peut conduire son expression d’une manière spécifique de tissu, qui a permis l’analyse systématique des modèles expression de nombreux gènes pendant les dernières deux décennies10. En outre, l’utilisation de souris transgéniques pour surveiller l’expression du gène LacZ permet aussi détection des événements de recombinaison du gène par Cre-loxP médiée par recombinaison et localisation des dérivés mutant les cellules souches embryonnaires dans les analyses chimériques 11, qui facilite le contrôle de l’expression de LacZ dans des tissus spécifiques ainsi que dans le temps. En outre, dans les embryons entiers, détection de l’activité β-galactosidase peut-être produire des colorations différentielles à des intensités différentes que l'on peut observer commodément à travers des stades différents de développement pour analyser les changements temporels dans l’expression des gènes 8,,12.
Dans cet article, nous présentons un protocole afin de visualiser l’expression des gènes par le biais de X-gal coloration dans les tissus de support entier aux premiers stades du développement des embryons de souris. Nous présentons cette méthode histochimique comme une technique très sensible et peu coûteuse qui favorise la détection précise des cellules marquées au niveau cellulaire ou dans des échantillons de toute monture après que paraffine encastré de tissus ou embryons. La méthode permet la visualisation directe de la coloration dans les tissus de souris avec le fond minimal par rapport aux autres méthodes de13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité sur l’éthique de l’expérimentation animale du CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) et de la Comunidad Autónoma de Madrid pour assurer minimal animal souffrant.
1. la collecte d’embryons de souris enceintes (à partir de E8.5 à E12.5)
- Sacrifier des souris enceintes par dislocation cervicale ou inhalation de CO2 . Le jour de la première observée plug vaginal était considéré comme embryonnaire jour 0.5 (E0.5).
- Posez l’animal en position couchée sur le tampon absorbant et nettoyer la peau abdominale de la souris avec l’éthanol à 70 %.
Remarque : La stérilité n’est pas nécessaire dans les étapes suivantes. - Pincez et soulever la peau abdominale à l’aide de pinces à souris à dents.
- Faites une incision à travers la peau et la paroi abdominale, 2 à 4 cm verticalement dans l’ensemble de la ligne médiane de l’abdomen à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
- Exposer l’abdomen et retirer les cornes utérines de la mère avec pince coupe vaisseaux le long de la courbure intérieure de l’utérus avec des ciseaux chirurgicaux.
- Retirez la corde d’embryons et la transférer sur un plat de Pétri sur glace contenant 10 mL glacee 0,01 M tampon phosphate salin pH 7,4 (PBS).
- Soigneusement disséquer les embryons en dehors de l’utérus sous un stéréomicroscope dans une boîte de Pétri avec 10 mL de PBS glacée fraîche. Saisir la paroi musculaire avec une pince de grands noms pour exposer la cavité amniotique et puis déchirer la membrane amniotique pour enlever l’embryon clos et le sac vitellin à l’aide de la pointe de la pince.
- Rassembler les embryons de la même portée de souris enceintes des stades précoces (à partir de E8.5 à E12.5) (Figure 2).
- Transférer les embryons dans un plat frais avec du PBS de froid 1 x 10 mL avec une pincette courbée ou, pour les très petits embryons (E8.5-E9.5), utiliser des pipettes de transfert en plastique pour recueillir les échantillons sans dommage de l’embryon.
- Avant de commencer la fixation, prendre un échantillon embryonnaire dans un tube de microcentrifuge de génotypage en coupe un petit morceau de l’embryon ou en prenant la membrane amniotique chez les embryons plus petits (à partir de E8.5 à E9.5) avec une pince des horlogers.
NOTE : LacZ génotypage est déterminée par des amorces polymerase chain reaction (PCR) : avant, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´ ; Reverse, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´.
2. fixation des embryons de souris
- Transférer chaque embryon dans un tube de microcentrifuge de 2 mL avec une base arrondie contenant du PBS 1 x 1 mL.
Remarque : Exécutez toutes les étapes du protocole dans ces tubes en agitant le mélange à l’aide d’un agitateur de roulement. - Lavez les embryons dans du PBS 1 x pendant 1 min à température ambiante pour éliminer le sang restant. Utiliser les pipettes de transfert en plastique pour changer des liquides dans les tubes.
- Fixer l’embryon dans 1 mL de 0,125 % glutaraldéhyde sur la glace.
NOTE : Le temps de fixation dépend de la taille de l’embryon : 20 mn pour les embryons de E8.5-E9.5, 30 min pour les embryons E10.5 et 1 h pour les embryons E12.5. - Retirez le fixateur et lavez les embryons dans du PBS 1 x deux fois pendant 10 min à température ambiante avant de traiter l’échantillon pour la coloration de X-gal.
3. toute monture β-galactosidase histochimie d’embryons de souris
- Tampon de rinçage X-Gal prepare et Solution de X-Gal coloration avant de commencer la procédure (voir tableau 1 et Table des matières). Utiliser un embryons de même portée sauvage (WT) comme témoins négatifs pour la réaction enzymatique.
- Incuber les embryons dans un tampon de X-Gal rincer pendant 10 min à température ambiante (Figure 2).
- Incuber les embryons dans la Solution de coloration de X-Gal de 2 h à une nuit à 37 ° C, abri de la lumière. Surveiller la réaction de couleur périodiquement par un microscope à dissection jusqu'à ce qu’on observe une intensité suffisante de coloration bleu sans le fond dans l’embryon. Garder le pH de la solution entre 8 et 9 pour réduire le fond durant la toute coloration. Si la solution colorante commence à allumer la lumière, remplacez-la par la solution de substrat frais d’étendre la réaction enzymatique.
- Arrêter la réaction lorsque le signal désiré est obtenu en lavant les embryons dans un tube de microcentrifuge avec du PBS 1 x 1 mL deux fois plus de 10 min chacun, à température ambiante.
- Transfert des embryons colorés à 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pour les re-fixer, pendant 1 h à une nuit à 4 ° C.
Remarque : Les embryons peuvent être stockés dans 4 % PFA/PBS pour les plus longs à 4 ° C ou peut être traité immédiatement pour le sectionnement. Cette étape de fixation définitive est fondamentale pour la conservation à long terme du modèle coloration. - Lavez les embryons dans du PBS 1 x 1 mL deux fois pendant 10 min à température ambiante.
- Option 1 : Désactivez les embryons par immersion dans une série de solutions avec des concentrations croissantes de glycérol (20 %, 40 %, 60 % et 80 % de glycérol dans du PBS 1 x) pendant 1 h à température ambiante dans chaque solution.
Remarque : Lavez les embryons dans 80 % de glycérol pour les plus longs, voire des jours, jusqu'à ce qu’ils sont effacés et puis les stocker dans 80 % de glycérol à 4 ° C à cette étape (Figure 2). Ajout d’une très petite quantité de sodium azide ora cristaux de thymol pour les embryons stockés à 4 ° C en glycérol ou 1 x PBS est recommandée pour prévenir la croissance de moisissures. Après compensation, embryons de support entier peuvent être utilisés pour photographier (étape 4). - Option 2 : Traiter les embryons paraffine incorporation et la découpe à l’aide d’un microtome (Figure 2). Le document le modèle d’expression chez les embryons tout tachés avant sectionnement (étapes 4 et 5).
4. photographie d’embryons entiers de Mont
- Pour photographier toute monture coloré des embryons avant incision, transférez-les sur un plat de Pétri préparé à base de solidifié 1-2 % d’agarose dans du PBS 1 x.
- Couvrir l’embryon complètement avec 10 mL 1 x PBS dans les plats revêtus d’agarose pour prévenir la déshydratation et la réflexion alors qu’elle photographiait à travers le liquide.
- Orientez l’embryon plongé dans 1 x PBS avec une pincette. Pour les plus vieux embryons (E10.5-E12.5), faire un petit trou dans l’agarose avec une pince pour placer et positionner l’échantillon qu’il contient à des angles différents et éviter le flottant au cours de la photographie.
- Placez le plat sur la scène du stéréomicroscope, à l’aide de la lumière transmise (stade sous). La variation entre le « champ sombre » et ajustements « lumineux-zone » pour régler l’éclairage désiré au cours de photographie et d’optimiser la translucidité de l’échantillon.
Remarque : Utilisez l’illumination optique de fibre pour les embryons de stade avancé pour éviter la réflexion à la surface de l’embryon. Lorsque vous photographiez des embryons défrichées, suivez la même procédure mais les transférer sur un plat de Pétri contenant 100 % de glycérol et les plonger pleinement.
5. paraffine incorporation et sectionnement du X-gal teinté d’embryons
- Enrobage de paraffine
- Enlever le X-gal coloré des embryons de 4 ° C (étape 3.5) et les laver avec du PBS 1 x 1 mL trois fois pour éliminer l’excès de fixatif.
- Chaque embryon transférer une cassette d’histologie avec une pincette.
- Placez les cassettes contenant les embryons dans un bécher et déshydrater puis en les passant à travers une série graduée de l’éthanol à température ambiante : éthanol à 70 %, une fois pour 30 min ; éthanol à 96 %, deux fois pour 30 min chacun ; éthanol à 100 %, deux fois pour chaque 30 min.
Remarque : Les embryons peuvent être stockés dans l’éthanol à 70 % pour un temps indéterminé à 4 ° C jusqu’au début du processus de déshydratation. - Incuber la cassette entière dans l’isopropanol pendant 30 min à température ambiante.
- À l’aide de pinces, transférer les cassettes sur un verre creux contenant préchauffé isopropanol de coloration et de laisser dans une étuve à 60 ° C pendant 30 min.
- Placer les cassettes dans un verre nouvel coloration creux contenant un mélange d’alcool isopropylique 50 % / 50 % fondu de cire de paraffine et laisser pendant 4 h dans un four à 60 ° C.
- Incuber les cassettes avec les embryons avec deux changements de paraffine fondue, 30 min à 60 ° C.
- À la fin du cycle de lavage final de paraffine, ouvrir la cassette et transférer chaque embryon dans un tissu séparé enrobage moule pour afficher l’exemple sous un stéréomicroscope.
- Remplir le puits de cire de paraffine fondue à 60 ° C. Utilisez des pinces chauffées pour garder la cire fondue et orienter avec soin l’embryon dans le moule.
Remarque : L’orientation correcte de l’échantillon est une étape cruciale pour le sectionnement de l’embryon dans le plan désiré. - Avant la paraffine se solidifie dans le moule, placez une cassette sans le couvercle sur le dessus du bloc et remplissez-le avec la cire de paraffine fondue. Laissez refroidir le cire restante jusqu'à ce que solidifié du jour au lendemain à la température ambiante.
- Une fois la paraffine est complètement solidifiée, retirer le bloc du moule et stocker les blocs de paraffine à 4 ° C ou à température ambiante jusqu'à ce que la section14.
- Sectionnement de paraffine
- Orienter la lame sur le microtome et mis en place 5-7 µm d’épaisseur. 5.2.2. refroidir le bloc de paraffine sur la glace et la garniture pour produire un cube ou une pyramide.
- Et placez le bloc le microtome à l’aide d’une petite quantité de cire fondue.
- Orienter le bloc pour une coupe optimale. Section des blocs de paraffine en tranches épaisses de 5 à 7 µm à température ambiante à l’aide de microtome standard.
- À l’aide d’un pinceau fin, placer les sections dans un bain d’eau à température ambiante pour manipuler et sélectionnant les tranches.
- Ramasser des sections du bain-marie avec une lame de microscope et de les transférer dans un bain d’eau à 42 ° C pour les étirements.
- Retirer les sections du bain-marie et placez-les délicatement sur lames de microscope d’adhérence.
- Les lames bien dans une étuve à 37 ° C pendant la nuit pour permettre les sections d’adhérer complètement à sec, dans le cas contraire, ils peuvent se perdre pendant la coloration.
NOTE : Conserver les lames à 4 ° C jusqu’au démarrage des procédures de coloration.
- Déparaffinage et contre-coloration de Sections de paraffine X-Gal-teinté
- Mettre les diapositives sur un plateau lame de microscope dans une étuve à 60 ° C pendant au moins 45 min faire la cire de paraffine plus fluide.
- Transférer les lames dans un rack et utiliser le verre plats de coloration pour effectuer les étapes suivantes : plonger le panier dans les cuves de coloration contenant alcools de la baisse des concentrations pour enlèvement complet paraffine et l’hydratation des tissus : isopropanol pendant 5 min à 60 ° C ; isopropanol pendant 3 min ; éthanol à 100 % pendant 2 min ; éthanol à 96 % pendant 1 min ; éthanol à 70 % pendant 1 min à température ambiante.
- Rincer les sections dans l’eau distillée deux fois pour s’assurer qu’il n’y a aucun résidu d’alcool.
- Contre-coloration sections avec une tache (p. ex. solution nucléaire-Fast Red) pendant 5 min (généralement entre 3-8 min) à température ambiante (Figure 2).
Remarque : Cette coloration permet de révéler la structure globale du tissu dans les sections. - Après coloration, laver les lames dans l’eau distillée pendant 1 min et vérifier la section coloration sous le microscope.
Remarque : Si la coloration désirée est trop faible, contre-colorant Articles encore plus longtemps. - Déshydrater des sections dans les séries suivantes avec les concentrations d’éthanol : deux lavages dans l’éthanol à 95 % de 2 min chacun, deux lave dans l’éthanol à 100 % pendant 2 min de chaque, et, pour éviter la dissolution du bleu couleur précipite, juste un lavage rapide dans le xylène.
- Supprimer les diapositives de la grille un par un et placez-les sur une feuille de papier. Montage et lamelle chaque glissent ensuite à l’aide d’un milieu de montage permanent synthétique.
Remarque : Le xylène est un produit inflammable dont les vapeurs sont irritantes et nocives pour la santé humaine et pour les organismes aquatiques. Il doit être manipulé dans une hotte et nécessite l’utilisation d’équipement de protection adéquat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ici, nous montrons les résultats de l’application du protocole standard pour la réaction histochimique de β-galactosidase en utilisant X-gal comme substrat dans des embryons de souris entière (Figure 1 et Figure 2). En utilisant ce protocole, nous examinons la Membrane type 4-matrice métalloprotéinases (mmp-Mt4) expression à différents stades de développement embryonnaires (E9.5, E11.5 et E12.5) en utilisant des souris mutantes Mt4-mmp qui expriment le journaliste LacZ sous le contrôle de l’endogène MT4-mmp promoteur (Figure 3, Figure 4et Figure 5)9,15. MT4-mmp est une endopeptidase qui est attaché à la membrane de la cellule par une ancre en glycophosphatidyl inositol (GPI). Bien que Mt4-mmp a été détectée dans plusieurs types de cancers humains et a été associée à la progression de la croissance tumorale, informations sur son activité protéolytique contre les constituants de la matrice extracellulaire sont très limitées à ce jour. En outre, presque rien n’a été signalé sur le rôle et l’expression de Mt4-mmp durant le développement embryonnaire9,16.
Type sauvage (WT), Mt4-mmpLacZ / + hétérozygote (HT) et les embryons de même portée knockout (KO) sont traitées en parallèle pour le protocole de coloration de X-gal (Figure 2). Plusieurs contrôles doivent être inclus au cours du processus de coloration pour valider la spécificité de la procédure. Ainsi, les embryons WT sont utilisés comme témoins négatifs pour les réactions histochimiques et servent à surveiller non-spécifiques X-gal étiquetage (voir Figure 3 a-D et la Figure 4 a-C). Aussi, pour éviter le fond non spécifique, le pH de la solution colorante du X-Gal doit être maintenu entre 8 et 9 tout au long de la coloration à l’ensemble. Dans Figure 3E, cellules β-gal-positives sont visualisées dans des embryons de toute monture HT dans les somites et le système vasculaire intersomitic au stade de la E9.5. Toutefois, pour signaler l’emplacement précis des cellules colorées, embryon de sectionnement est requis pour visualiser au microscope a signalé l’expression des gènes dans des sections de tissu à résolution cellulaire. Dans ce cas, les cellules positives LacZ sont trouvent dans les somites, l’aorte dorsale, la vascularisation intersomitic ainsi que le plexus vasculaire péri-radiculaire dans des sections de tissu (flèches dans la Figure 3F-h). Ces résultats sont corrélés avec le modèle d’expression rapporté pour Mt4-mmp dans ces souris stades embryonnaires9, indiquant que cette technique est facilement reproductible et fiable. Comme prévu, les niveaux d’activité β-gal sont plus élevés chez les embryons de KO par rapport à la HT en raison de la présence de deux copies du gène LacZ journaliste (Figure 3I-L). Toutefois, seuls les LacZ HT / + embryons devraient être analysés dans l’étude de modèles d’expression de gène et tissu KO est utilisé comme une preuve de concept pour démontrer la faisabilité de la méthode depuis en raison de l’absence du gène ciblé d’intérêt, les cellules positives de β-gal peuvent être anormalement situé dans ce dernier.
Lors de l’exécution de ce protocole, les embryons âgés (à partir de E10.5 à E12.5) ne sont pas translucides, et, par conséquent, le X-gal plus visible coloré des régions sont les proches de la surface. Ainsi, une autre étape de cette méthode est d’effacer les embryons par lavages dans des solutions avec l’augmentation des concentrations de glycérol. Dans la Figure 4, les embryons de LacZ teinté E12.5 sont apparus tout en conservant le X-gal coloration, ce qui nous permet de photographier plus profond teinté des régions de l’embryon dans le stéréomicroscope. Comme indiqué précédemment à ce stade embryonnaire, l’étiquetage a été localisée dans des régions distinctes du cerveau, les branches, le follicule de vibrissa et l’extrémité de la queue9. Cependant, si l'on veut obtenir une résolution cellulaire, embryons doivent être incorporés à la paraffine, sectionnés et examinés au microscope.
Dans la Figure 5, immunohistochimie avec des anticorps anti-β-gal a été utilisée pour confirmer que l’expression de la Mt4-mmp observé au moyen de la journaliste LacZ coloration. Ainsi, les cellules β-gal-positives ont été détectés dans le pool des motoneurones de la moelle épinière de souris à E11.5 en utilisant les deux méthodes, qui confirme la spécificité du protocole rapporté ici (Figure 5 a, B).
Figure 1 . Illustration schématique de l’e. coli LacZ journaliste gène codant la β-galactosidase et la histochimique réaction catalysée par l’enzyme. La coloration traditionnelle, β-galactosidase hydrolyse du substrat 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) à 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole. Par la suite, cet intermédiaire est oxydé, qui provoque la dimérisation et la formation du produit final couleur bleue (5, 5'-dibromo-4, 4'-dichloro indigo). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Schéma montrant les principales étapes du protocole standard pour la détection de l’activité β-galactosidase. Des embryons de souris sont collectées et traitées pour la coloration de toute monture X-gal. Après que la coloration histochimique effectuée conformément au protocole, embryons de support entier peuvent être (Option 1) effacé avec lavages dans des solutions avec l’augmentation des concentrations de glycérol et photographié par la suite dans un stéréomicroscope ou (Option 2) incorporé dans paraffine, sectionnées et Eosine. Abréviations : RT, température ambiante. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . X-gal coloration de E9.5 WT et Mt4-mmpLacZ / + entier-montent des embryons et des coupes de tissus. En utilisant le standard test histochimique de X-gal, embryons transgéniques porteuses du gène LacZ sous le contrôle du promoteur de la Mt4-mmp ont été analysés pour l’activité β-gal. WT (A), HT (E) et KO (j’ai) E9.5 support entier embryons ont été traités pour la détection de l’expression de la β-galactosidase. Sections de paraffine obtenues à partir de ces embryons au niveau de la moelle épinière permettent la visualisation de la coloration à résolution cellulaire. Comme prévu, les cellules β-gal étaient absents dans les sections WT (B-D), tandis que l’intensité du marquage était plus élevée dans le KO (J-L) contre les coupes de tissus HT (F-H). Coupes à travers le tube neural révèlent l’activité dans les pays en développement somites, aorte dorsale et le plexus vasculaire péri-radiculaire β-gal. Abréviations : da, aorte dorsale ; FLB, bourgeon de membre antérieur ; h, cœur ; m, mésencéphale ; NT, la notochorde ; OTV, vésicule otique ; OV, vésicule optique ; PNVP, péri-radiculaire plexus vasculaire ; s, somite ; t, télencéphale. Barreaux de l’échelle : 500 μm (A, E, I) ; 100 μm (B, F, J) ; 50 μm (C, G, K) ; 20 μm (D, H, L). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Microphotographies de WT et HT X-gal colorées des embryons de souris à E12.5 avant (A, D) et après (B, C, E, F) clearing avec lavages en glycérol accrue. Comme prévu, les embryons WT ne montrent aucun journaliste LacZ expression (A-C) étiquetage est détectée dans les membres (flèches blanches), le primordium de la follicule de vibrissa (flèche blanche), l’extrémité de la queue (flèche noire) et le cerveau de Mt4-mmpLacZ / + embryons à ce stade (DF)9. (E, F) Après la clairière au glycérol, embryons devient translucides et étiquetage peut être plus facilement visualisables dans les régions plus profondes de l’embryon, comme illustré dans le mésencéphale et le télencéphale (flèches blanches en fa). Echelle : 1 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . Histochimique et immunohistochemical detection de la β-galactosidase. (A) X-gal, coloration (en bleu) révèle l’expression de Mt4-mmp dans la piscine des motoneurones dans une section de paraffine de la moelle épinière au stade embryonnaire E11.5. (B) l’immunohistochimie avec des anticorps anti-β-gal (en rouge) a confirmé l’expression de Mt4-mmp dans les motoneurones de la moelle épinière au même stade embryonnaire dans les sections du cryostat. Abréviations : fp, plaque de sol ; MN, motoneurones ; Echelle : 100 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Tableau 1. Recettes et les Solutions requises pour le présent protocole. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le gène LacZ d’e. coli a été employé couramment comme reporter dans les études des profils d’expression génique en raison de sa grande sensibilité et de la facilité de détection. Le présent protocole décrit une méthode classique pour la détection des β-gal expression basée sur une réaction enzymatique qui est facile et rapide à jouer aussi bien que bon marché. Cette méthode peut être également appliquée sans modifications majeures dans des embryons de support entier, organes intacts, des sections de tissu cryostat ou cellules cultivées.
Une application exacte de cette méthode entraîne une coloration robuste et interprétable. Toutefois, les contrôles simultanés et les étapes de confirmation suivantes sont fortement recommandés. À cet égard, le présent protocole est effectué en parallèle dans des embryons de même portée de type sauvage utilisés comme témoins négatifs qui servent à surveiller non-spécifiques X-gal de coloration. En outre, les données d’expression obtient lorsqu’à l’aide de coloration de la β-gal est confirmé par western blot et -PCR quantitative (Q-PCR) analyse ou au moyen de la β-gal immunohistochimie (Figure 5), qui combine avec d’autres anticorps permet également d’identifier types spécifiques de cellules exprimant le gène LacZ9. Étapes de fixation doivent être pris en considération afin de préserver l’activité enzymatique de la β-galactosidase et minimiser l’arrière-plan pendant la coloration. Ainsi, les embryons doivent être fixées au glutaraldéhyde, qui donne des résultats plus cohérents et fiables par rapport à la paraformaldéhyde fixation17. En outre, les temps de fixation est cruciale et devraient être déterminées empiriquement pour chaque stade embryonnaire, puisque la fixation excessive peut réduire l’activité β-galactosidase. À cet égard, les embryons de support entier peuvent être fixés par immersion ou par perfusion selon le stade embryonnaire et de la taille. Ainsi, transcardial perfusion est recommandée pour plus de E14.5 des embryons et postnatals spécimens afin d’assurer que le fixateur atteint toutes les régions de l’échantillon. Des embryons plus petits (à partir de E8.5 jusqu'à E12.5) peuvent être fixés par immersion et traitées directement pour dans sa totalité X-gal coloration (Figure 2). Il convient de mentionner que X-gal coloration des embryons de souris âgés de moins de E14.5 peut être exécuté dans le support entier. Dans ce cas, les cellules colorées près de la surface sont facilement détectés au moyen de la coloration de la β-gal. Malgré cela, il se peut qu’un étiquetage plus profonde apparaît floue ou même colorant ne pénètre pas dans les tissus, en particulier chez les embryons âgés. Dans ce cas, soit organes ou tissus de souris adultes peuvent être disséqués, X-gal colorées et visualisés sous un stéréomicroscope. Néanmoins, examen de sectionnement et microscopique du tissu taché d’intérêt est plus adapté (Figure 2).
Malgré l’efficacité du protocole, la coloration des embryons entiers et détection peut être gênante. Par exemple, le rein, testicules, glandes sécrétrices, épididyme et tractus gastro-intestinal contiennent des quantités élevées d’endogène acides β-galactosidase18 qui peuvent interférer avec l’interprétation des résultats en raison de l’activité de fond. Pour cette raison, la réaction histochimique doit être effectuée dans des conditions de pH légèrement alcalin (pH 8-9) tout au long de la souillure, comme e. coli β-galactosidase a un pH optimum de 7,3. Cela aidera à réduire significativement le fond et à favoriser les bactéries β-galactosidase activité19,20,21,22. Il est à noter également que depuis longtemps la coloration fois peut entraîner l’acidification de le X-gal, solution de coloration, favorisant une expérience accrue. En outre, l’activité β-galactosidase est perdue sous une température d’incubation supérieure à 50 ° C, mais pas en dessous de 42 ° C. Dans nos mains, d’incubation avec le substrat X-gal fonctionne mieux lorsque laissé toute la nuit à 37 ° C. Après coloration et avant l’étape d’après fixation, il est important de laver tous les matériaux de réaction de X-gal soigneusement et aussi rapidement que possible afin d’éliminer les précipités de la réaction histochimique qui peuvent être déposés dans la section de tissu.
Comme indiqué ici, compensation des embryons en glycérol est important pour faire le tissu translucide tout en préservant le X-gal histologie de coloration et de tissus. Ainsi, les embryons deviennent claires et étiquetage peut être visualisée dans les régions plus profondes sous le stéréomicroscope. Toutefois, pour analyser l’emplacement exact des cellules colorées, il est nécessaire de sectionnement de l’échantillon et, donc, la compensation n’est pas essentielle. Dans ce cas, par les recommandations suivantes aux méthodes, échantillons peut être avec soin paraffine embarqués et sectionnés. Au cours du processus d’incorporation, éthanol déshydraté tissu doit être immergé dans un mélange d’alcool isopropylique-paraffine. Isopropanol sert à favoriser le remplacement de l’éthanol dans l’échantillon et pour faciliter le tissu à l’incorporation dans la paraffine,23. Dans certains protocoles, xylène est utilisé au lieu de l’alcool isopropylique dans le même but. Néanmoins, l’utilisation du xylène présente des inconvénients par rapport à l’isopropanol, tels que le rétrécissement et le durcissement de l’échantillon en raison de l’élimination des tissus lipides24 et son profil toxicologique comme un produit inflammable et irritant25. Agents de compensation de base d’huile orange sont une des alternatives plus sûres au xylène, car ils permettent à effacer sans la toxicité du xylène ainsi que de préservation tissulaire excellente structure26rapides. En outre, si vous utilisez xylène, cette partie du protocole devrait être réduite au maximum, puisque X-gal coloration peut se diffuser et être perdu19. Après sectionnement, contre-coloration avec des colorants (p. ex. nucléaire Fast Red) est recommandé pour faciliter l’identification histologique d’exprimer des cellules. Cette procédure est rapide, ne nécessitant qu’une seule étape, et son aspect rose fournit bon contraste avec le précipité de X-gal de couleur bleue. Toutefois, cette contre-coloration convient uniquement pour une utilisation avec les supports de montage non aqueux (c.-à-d. DPX).
Cette méthode classique est adaptée pour la détection de l’activité de la β-galactosidase, depuis le X-gal en combinaison avec potassium ferro - et ferricyanure produit une caractéristique précipité bleue qui ne se fane pas ou eau de Javel facilement et, quand il est bien construit, peut être détectés même sous le microscope à dissection. Il existe d’autres modifications du protocole original. En utilisant des substrats disponibles tels que le saumon-gal (6-Chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), Magenta-gal (5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) ou Bluo-gal (5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside)13,19 , ou son remplacement par le X-gal/FeCN classique pour les sels de tétrazolium peuvent grandement améliorer la sensibilité de détection13,19. Ceci est particulièrement recommandé de faire une détection ultrasensible faible des niveaux d’expression des ARNm et protéines matériel. Toutefois, lorsqu’il est utilisé trop longtemps, une de ces procédures peut conduire à un niveau élevé et une gestion prudente des conditions est donc toujours recommandée, surtout si l'on considère que l’incubation prolongée périodes peuvent faciliter une coloration non spécifique dû à β-galactosidase endogène activité13,27. Quant à ce dernier, il est toujours conseillé d’utiliser des sels de potassium ferrique afin d’optimiser la fiabilité de la technique et éviter les pièges.
Une limitation importante de cette méthode, c’est que la procédure de marquage X-gal classique produit un précipité insoluble bleu qui peut être facilement détecté par microscopie optique, mais ne permet pas d’études de co-localisation par microscopie fluorescente ou confocale en tissu sections. Une façon possible de contourner cette limitation serait d’utiliser des anticorps dirigés contre la β-gal (voir Figure 5) combiné avec l’immunodétection pour un type spécifique de cellules. Toutefois, si les niveaux d’expression sont faibles ou le fond haut, immunomarquage peut rendre difficile à détecter si le gène rapporteur est exprimé dans une cellule particulière. Notamment, une nouvelle technique a été signalée pour obtenir des images confocales de haute qualité basées sur l’émission de fluorescence produite par le précipité de X-gal28. En outre, cette méthode est compatible avec l’immunofluorescence et peut identifier clairement les cellules positives de X-gal28. Enzymatiques reporters tel que le gène LacZ offrent l’avantage d’être plus sensible que fluorescentes, qui se distingue lors de l’étiquetage, si les niveaux d’expression sont particulièrement faibles. À cet égard, la technique actuelle s’est avérée idéale pour la détection de micro-ARN29, ce qui permettra le fois evaluation qualitative des modèles d’expression et la quantification des niveaux d’expression. Double coloration sert à détecter la présence d’ARNm et activité β-gal via in situ hybridation techniques qui peuvent fournir des informations très utiles pour examiner le modèle d’expression des gènes endogènes tout en surveillant l’activité β-gal dans le même échantillon 30. Néanmoins, les deux réactions de détection de l’hybridation à tache et in situ β-gal peuvent afficher incompatibilité de couleur pendant la double coloration. Choisir un substrat plus adapté, comme S-gal, est recommandé spécifiquement des méthodes optimisées30.
Cette méthode polyvalente a été largement utilisée pour étudier la fonction des gènes dans le contexte de la biologie du développement. Ainsi, le gène LacZ a été adopté pour l’analyse des profils d’expression génique au cours du développement embryonnaire par il frappe dans un locus du gène ciblé. LacZ est un gène rapporteur commune pour l’étude des éléments régulateurs intramoléculaires (exhausteurs) impliqués dans la direction de l’expression des gènes dans des régions restreintes de l’embryon, fournissant des informations sur l’activité de transcription du promoteur d’intérêt31 ,32,33. Aussi, il est fréquemment utilisé dans la détection des événements de recombinaison génétique par recombinaison Cre-mediated des sites loxP, qui est particulièrement utile pour la détection des dérivés de cellules souches embryonnaires dans les expériences de cartographie destin cellulaire ou dans les greffes de cellules. Mutagenèse siphon-gène dans les cellules souches embryonnaires produit des protéines tronquées fusionnés au β-gal qui permet d’évaluer l’activité promoteur sous des conditions physiologiques,34. Pour toutes ces approches, les animaux transgéniques porteurs LacZ et exprimant la β-galactosidase bactérienne ont été générés dans le rat35,36, poulet37,38, Xenopus39 ou poisson-zèbre,40. Jusqu'à présent, cette technique a été utilisée chez la drosophile pour améliorer la visualisation de l’expression génique dans le temps et l’espace en raison de la disponibilité des systèmes d’expression de gène inductible et les tissus et les traits de repère spécifique des cellules p-LacZ41 ,,10. Il est intéressant de noter qu’en dehors de ces nombreuses applications impliquant des animaux transgéniques et knock-out, gène rapporteur LacZ a servi à tissus entiers ainsi que les cellules pour prévoir le rôle des gènes dans la maladie dans la recherche biomédicale cultivées. Un exemple pertinent de ce dernier est l’étude du vieillissement sur les réponses au stress, suppression tumorale ou développement. Les cellules sénescentes sont faciles à déceler tant in situ et in vivo en raison de leurs caractéristique surexpression et l’accumulation de bêta-galactosidase endogène lysosomale42,43. Par conséquent, β-galactosidase est utilisé comme un biomarqueur sénescent en dosages quantitatifs dans le cancer mis en culture des cellules44.
En résumé, nous décrivons une procédure réalisable et optimisée afin de faciliter la détection facile d’activité β-galactoside dans les tissus embryonnaires de souris. La présente méthode permet des modifications basées sur le tissu choisi et le substrat utilisé. Par conséquent, cette méthode souple et rentable au service des contrôles appropriés est particulièrement adaptée pour l’utilisation avec des embryons de souris entière ainsi que sur les coupes histologiques minces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrente.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le Service histopathologique pour leur assistance technique à le Cardiovasculares de Centro Nacional de Investigaciones (CNIC). Nous remercions également m. Motoharu Seiki pour bien vouloir fournir Mt4-mmpLacZ souris et Dr Alicia G. Arroyo pour soutenir notre projet et pour sa lecture critique du manuscrit. Nous tenons à remercier Peter Bonney pour la relecture de cet article. Ce travail a été soutenu par l’Universidad Europea de Madrid au moyen d’une subvention (# 2017UEM01) L.C.C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
| 99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
| 99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
| Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
| Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
| Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
| Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
| Microscope Cover Glasses 24x60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
| Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
| Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
| Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
| Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
| Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
| Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
| Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
| Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
| pHmeter | Crison | Basic 20 | |
| Optic fiber | Optech | PL2000 |
References
- Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
- Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182 (1994).
- Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
- Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
- Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
- Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
- Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
- Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767 (2017).
- Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux's Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
- Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
- Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
- Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
- Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797 (2011).
- Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
- Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
- Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
- Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
- Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
- Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
- Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937 (2013).
- Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
- Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
- Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
- Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
- Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
- Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
- Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
- Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
- Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
- Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
- Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
