Summary
Здесь мы опишем стандартный протокол для выявления активности β-галактозидазы в начале всего мыши эмбрионов и метод для парафина секционирование и counterstaining. Это простая и быстрая процедура для мониторинга экспрессии генов в процессе разработки, которые могут также применяться для разделов ткани, органов или культивируемых клеток.
Abstract
Кишечная палочка LacZ гену, β-галактозидазы, в основном используется как репортер экспрессии генов и как трассировщик клеток линии исследований. Классическая гистохимические реакция основана на гидролиз субстрата X-гал в сочетании с ионами железа и черных, который производит нерастворимых синий осадок, который легко визуализировать. Таким образом активность β-галактозидазы выступает в качестве маркера для выражения гена интереса по мере развития. Здесь мы опишем стандартный протокол для выявления активности β-галактозидазы в начале всего мыши эмбрионов и последующий метод для парафина секционирование и counterstaining. Кроме того процедура для уточнения весь эмбрионов предоставляется лучше визуализировать X-Гал пятнать в более глубоких зонах эмбриона. Согласованные результаты получаются путем выполнения этой процедуры, хотя оптимизация условий реакции необходима для сведения к минимуму фоновой активности. Ограничения в assay должны рассматриваться также, особенно в отношении размера эмбриона окрашивания всю гору. Наш протокол обеспечивает чувствительной и надежный метод для обнаружения β-галактозидазы в процессе разработки мыши, который может применяться в криостата секций, а также целые органы. Таким образом динамический ген выражение шаблоны разработки может быть легко проанализирован с помощью этого протокола в целом эмбрионов, но также подробные выражение на клеточном уровне может оцениваться после разрезания парафин.
Introduction
Для того чтобы описать картин выражения определенного гена, использование репортер генов как маркеры был исключительно от дрозофилы до млекопитающих. В экспериментах с участием нокаут и трансгенных животных гена бактериальной β-галактозидазы (LacZ) Escherichia coli (E. coli) является одним из наиболее широко используемых в1,2,3, 4. β-галактозидазы (β-gal) катализирует гидролиз β-galactosides (например, лактоза) в моносахариды (глюкозы и галактозы)5. Его наиболее часто используемые субстрата является X-Гал (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), гликозид, гидролизуется по β-галактозидазы приведшего к 5-бромо-4-хлоро-3-гидроксииндол и галактозы. Первый окисляется в димер, когда используется в сочетании с Ферри калия- и Ферро цианид, производит характерный нерастворимые, синий цвет осадок (рис. 1)6.
Ген LacZ начал использоваться как репортер ген более тридцати лет назад7,8. Обычно, вставляется LacZ вниз по течению от эндогенных промоутер месте открытой чтении кадра, поэтому она может использоваться в культуре бактерий и клеток для визуализации ячеек, содержащих определенного Вставка, а также в трансгенных животных как трассировщик эндогенных картин выражения гена во время развития9. В этой связи визуализация активности β-галактозидазы широко применяется в дрозофилы для понимания развития и клеточных процессов от единичных клеток во всей ткани. Генетики дрозофилы пользу поколение стабильной линий, в которых изменение P-элемент конструкции, содержащие Репортер ген LacZ , вставляется наугад мест в геноме. Таким образом когда под влиянием усилитель элементы он может диск свое выражение определенным образом ткани, которая позволила систематический анализ структуры выражения многих генов в течение последних двух десятилетий10. Кроме того использование трансгенных мышей для мониторинга LacZ экспрессии генов также позволяет обнаружение событий рекомбинации генов, КРР loxP при посредничестве рекомбинации и локализации производных мутант эмбриональных стволовых клеток в химерных анализа 11, которая облегчает контроль LacZ выражения в определенных тканях также как височно. Кроме того в целом эмбрионов, обнаружение активности β-галактозидазы может производить дифференцированного окрашивания моделей на различной интенсивности, которые можно удобно наблюдать через различные этапы развития проанализировать временные изменения в экспрессии генов 8,12.
В этой статье мы представляем протокол для визуализации экспрессии генов через X-Гал пятнать в целом гора ткани на ранних этапах своего развития зародышей мыши. Мы представляем этот гистохимический метод как весьма деликатного и недорогой техники, которая выступает точное обнаружение помеченных клеток в целом гора образцов или на клеточном уровне, после того, как парафин-врезанных тканей или эмбрионов. Метод позволяет для прямого визуализации окрашивание ткани мыши с минимальное образование по сравнению с другими методами13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры были утверждены Комитетом по этике животных эксперименты CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) и Autónoma Comunidad де Мадрид для обеспечения минимальной животное страдает.
1. сбор эмбрионов от беременных мышей (от E8.5 до E12.5)
- Пожертвуйте беременных мышей шейки матки вывих или CO2 ингаляции. Первый день Вагинальные вилка считался эмбриональных день 0,5 (E0.5).
- Положите животное в лежачем положении на абсорбирующей прокладки и очистить брюшной кожу мыши с 70% этиловом спирте.
Примечание: Стерильность не требуется в следующих шагах. - Пинч и поднимите брюшной кожи с помощью мыши зуб щипцами.
- Сделайте надрез через кожу и брюшной стенки, 2-4 см вертикально по всей средней линии живота, используя Ножницы хирургические.
- Подвергать брюшной полости и удаление матки рога от матери с щипцами резки кровеносных сосудов вдоль внутренней кривизны матки с Ножницы хирургические.
- Удалите строку эмбрионов и перенести его на чашку Петри на льду, содержащие 10 мл ледяной 0,01 М фосфатного буфера физиологический рН 7,4 (PBS).
- Тщательно анализировать эмбрионов, из матки под стереомикроскопом в чашке Петри с 10 мл свежего ледяной PBS. Возьмите мышц стенки с щипцами расфиксировать подвергать Амниотический мешок и затем разрыв амниотической мембраны для удаления закрытых эмбриона и желточного мешка, используя советы щипцы.
- Собрать эмбрионов помёте от беременных мышей на ранних этапах (от E8.5 до E12.5) (рис. 2).
- Передать блюдо свежих эмбрионов с 10 мл холодной 1 x PBS с помощью Изогнутый пинцет или, для очень мелких эмбрионов (E8.5-E9.5), используйте пипетки пластиковые передачи для сбора образцов без повреждения эмбриона.
- Перед началом фиксации, принимать эмбриональных образцов в пробки microcentrifuge для генотипирования резки небольшой кусок эмбриона или принимая амниотической мембраны в маленьких эмбрионов (от E8.5 до E9.5) с расфиксировать щипцами.
Примечание: LacZ генотипирования определяется праймеров полимеразной цепной реакции (ПЦР): вперед, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´; обратный, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´.
2. Фиксация зародышей мыши
- Перевод каждого эмбриона в 2-мл пробирку microcentrifuge с закругленными база, содержащая 1 мл ПБС.
Примечание: Выполните все шаги в протоколе в эти трубы с перемешиванием с помощью подвижного шейкер. - Вымойте эмбрионы в однократном ПБС за 1 мин при комнатной температуре для ликвидации оставшихся крови. Использование пипетки пластиковые передачи изменить жидкости в трубах.
- Исправьте эмбриона в 1 мл глютаральдегид 0,125% на льду.
Примечание: Время фиксации зависит от размера эмбриона: 20 мин для E8.5-E9.5 эмбрионы, 30 мин E10.5 эмбрионов и 1 час для E12.5 эмбрионов. - Снимите фиксатор и мыть эмбрионы в однократном ПБС дважды за 10 мин при комнатной температуре перед обработкой образца для X-Гал пятнать.
3. Вся гора β-галактозидазы гистохимии зародышей мыши
- Подготовка X-Гал полоскания буфер и X-Гал окрашивание раствора до начала процедуры (см. таблицу 1 и Таблица материалов). Использование эмбрионов помёте (WT) одичал тип как негативный контроль для ферментативной реакции.
- Инкубируйте эмбрионов в X-Гал полоскания буфер 10 мин при комнатной температуре (рис. 2).
- Инкубируйте эмбрионов в X-Гал окрашивание раствора от 2 h для ночевки при 37 ° C, защищать от света. Монитор цветной реакции периодически через рассечения микроскопа до достаточной интенсивности синего окрашивания наблюдается без фона в эмбрион. Держите рН раствора между 8 и 9 для уменьшения фона в целом окрашивание. Если окрашивание раствора начинает свою очередь, свет, замените его свежий субстрат решение продлить ферментативной реакции.
- Остановите реакции, когда желаемый сигнал получается путем промывания эмбрионов в пробки microcentrifuge с PBS 1 x 1 мл два раза за 10 мин при комнатной температуре.
- Передавать параформальдегида 4% 1 мл (PFA) повторно исправить их, окрашенных эмбрионов за 1 ч до на ночь при 4 ° C.
Примечание: Эмбрионы могут храниться в 4% PFA/PBS для более длительное время при температуре 4 ° C или могут обрабатываться немедленно для разрезания. Этот шаг окончательной фиксации имеет решающее значение для долгосрочного сохранения окрашивание шаблон. - Вымойте эмбрионы в PBS 1 x 1 мл два раза за 10 мин при комнатной температуре.
- Вариант 1: Очистить эмбрионов, погружение в серии решений с увеличением концентрации глицерина (20%, 40%, 60% и 80% глицерина в однократном ПБС) за 1 ч при комнатной температуре в каждом решении.
Примечание: Мыть эмбрионов в 80% глицерина для больше времени, даже дней, до тех пор, пока они очищаются, а затем сохранить их в 80% глицерина на 4 ° C на этот шаг (рис. 2). Добавление эмбрионов, хранить при 4 ° C в глицерин или 1 x очень небольшое количество кристалл Ора азид натрия тимола PBS рекомендуется для предотвращения плесени. После очистки, вся гора эмбрионов может использоваться для фотографирования (шаг 4). - Вариант 2: Процесс эмбрионов для парафина встраивание и секционирование, используя микротом (рис. 2). Документ шаблона выражения в целом окрашенных эмбрионов перед секционирование (шаги 4 и 5).
4. фотография вся гора эмбрионов
- Фотографировать всю гору, окрашенных эмбрионов до секционирование, передавать их на Петри блюдо, приготовленное с базой затвердевших агарозы 1-2% в однократном ПБС.
- Обложка эмбриона полностью с 10 мл ПБС блюдах агарозы покрытием для предотвращения обезвоживания и отражение во время фотографирования через жидкость.
- Ориентировать зародыш погружен в 1 x PBS с помощью щипцов. Для старых эмбрионов (E10.5-E12.5) сделайте небольшое отверстие в агарозном пинцетом место и положение образца в пределах его под разными углами и избежать свободного плавания в течение фотографии.
- Поместите блюдо на сцене стереомикроскопом, используя переданные (заместитель) свет. Переключение между «темно поле» и «ярко поле» корректировок для установки желаемого освещения в фотографии и оптимизировать прозрачность образца.
Примечание: Использование волоконно оптические освещение для поздней стадии эмбриона избежать отражения на поверхности эмбриона. При фотографировании очищается эмбрионов, следовать той же процедуре, но передавать их на чашку Петри, содержащий 100% глицерина и полностью погрузить их.
5. Парафинотерапия встраивание и секционирование X-Гал окрашенных эмбрионов
- Встраивание парафина
- Удаление X-Гал, окрашенных эмбрионов от 4 ° C (шаг 3.5) и вымыть их с PBS 1 x 1 мл три раза, чтобы устранить избыток фиксатором.
- Перевод каждого эмбриона гистология кассету с помощью щипцов.
- Место кассеты, содержащие эмбрионов в стакан и затем обезвоживает, передавая их через серию градуированных этанола при комнатной температуре: 70% этанол, один раз в течение 30 мин; Этанол 96%, дважды за 30 минут каждый; 100% этанола, дважды за 30 мин.
Примечание: Эмбрионы могут храниться в 70% этанол на неопределенное время при температуре 4 ° C до начала процесса обезвоживания. - Инкубируйте всю кассету в изопропаноле на 30 минут при комнатной температуре.
- С помощью щипцов, передача кассеты на стакан, окрашивание корыта, содержащие подогретым изопропанол и оставить в духовке при температуре 60 ° C за 30 мин.
- Место кассеты в новое стекло, окрашивание корыта, содержащие смесь из 50% изопропиловый спирт / 50% расплавленный парафин и оставить на 4 ч в 60 ° C духовке.
- Инкубируйте кассеты с эмбрионов с двумя изменениями расплавленного парафина, 30 мин при 60 ° C.
- В конце заключительного парафин мыть откройте кассету и передавать отдельные ткани, встраивание формы для просмотра образца под стереомикроскопом каждого эмбриона.
- Заполнить колодец с расплавленный парафин при температуре 60 ° C. Используйте с подогревом щипцы для держать расплавленный воск и тщательно ориентироваться эмбриона в плесени.
Примечание: Правильную ориентацию образца является важным шагом для разрезания эмбриона в плоскости желаемого. - Прежде чем парафин застывает в форме, установите кассету без крышки на верхней части блока и заполнить его с расплавленного парафина. Пусть оставшиеся воска прохладно пока затвердевает на ночь при комнатной температуре.
- После того, как парафин полностью затвердевает, удалите твердого блока от плесени и хранить парафиновых блоков при комнатной температуре или при температуре 4 ° C до разрезания14.
- Парафин секционирование
- Ориент лезвие на микротома и настроить 5-7 мкм толщиной. 5.2.2. холодный парафин блок на льду и обрезать его производить куб или пирамиды.
- Прикрепите блок к держателю микротом, используя небольшое количество расплавленного воска.
- Восточный блок для оптимального раскроя. Раздел парафиновых блоков толщиной ломтиками 5-7 мкм при комнатной температуре с помощью стандартных микротома.
- С помощью тонкой кистью, поместите эти разделы в водяной бане при комнатной температуре для манипулирования и выбора фрагментов.
- Подобрать разделы из водяной бани с микроскопа и перенести их в водяной бане при 42 ° C для растяжения.
- Удалите разделы из водяной бани и осторожно поместите их на скольжениях микроскопа адгезии.
- Сухие слайды в духовке при 37 ° C на ночь, чтобы разрешить секций полностью придерживаться, в противном случае, они могут получить потеряли во время окрашивания.
Примечание: Храните слайды при температуре 4 ° C до начиная пятнать процедур.
- Депарафинизации и Counterstaining из X-Гал окрашенных парафиновых срезах
- Поместите слайды на подносе микроскопа в духовке при 60 ° C для по крайней мере 45 минут сделать парафина больше жидкости.
- Перенести слайды на решетку и использовать стекло, окрашивание блюда для выполнения следующих шагов: погружать стойки в окрашивание банки, содержащие спирты снижения концентрации для удаления полностью парафина и гидратации тканей: изопропиловый спирт для 5 минут 60 ° C; Изопропиловый спирт на 3 мин; 100% этанола на 2 мин; Этанол 96%, за 1 мин; 70% этанола за 1 мин при комнатной температуре.
- Полоскания разделы в дистиллированной воде дважды, чтобы убедиться, что есть нет остатков спирта.
- Изображение секции с пятно (например ядерное-Fast Красного раствора) за 5 мин (обычно между 3-8 мин) при комнатной температуре (рис. 2).
Примечание: Это окрашивание помогает выявить общую структуру ткани в разделах. - После окрашивания, мыть слайды в дистиллированной воде в течение 1 мин и проверьте раздел пятнать в микроскопе.
Примечание: Если желаемого окрашивания слишком слаб, изображение разделы снова на более длительное время. - Обезвоживает секций в следующих сериях с увеличением концентрации этанола: две автомойки в 95% этаноле за 2 мин, два моет в 100% этанола за 2 мин, и, чтобы избежать растворения синий цвет осаждает, только одна быстрая стирка в ксилоле.
- Удалите слайды из стойки один за другим и разместить их на листе бумаги. Горе и coverslip сдвиньте с использованием синтетических, постоянного монтажа средних.
Примечание: Ксилол является продуктом легковоспламеняющихся паров которого раздражающих и вредных для здоровья человека и водных организмов. Он должен управляться в рамках Худ и требует использования надлежащего защитного оборудования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы показываем результаты от применения стандартный протокол для β-галактозидазы гистохимические реакции с помощью X-Гал как субстрат в целом мыши эмбрионов (рис. 1 и рис. 2). Используя этот протокол, осматриваем мембраны типа 4-матрицы металлопротеиназы (Mt4-mmp) выражение на разных этапах эмбрионального развития (E9.5, E11.5 и E12.5) с помощью Mt4-ММЗ мутантных мышей, которые Экспресс LacZ репортер под контролем эндогенные MT4-ММЗ промоутер (рис. 3, рис. 4и рис. 5)9,15. MT4-СПП является эндопептидазы, привязанный к клеточной мембране через привязку glycophosphatidyl инозитол (GPI). Хотя Mt4-СПП была обнаружена в нескольких человеческих раков и была связана с прогрессирование опухолевого роста, информация о его протеолитической активности против компонентов внеклеточного матрикса является весьма ограниченной, на сегодняшний день. Кроме того почти ничего не сообщалось о роли и выражение Mt4-СПП во время эмбрионального развития9,16.
Дикого типа (WT), Mt4-ММЗLacZ / + гетерозиготной (ХТ) и помёте эмбрионов нокаутом (KO) обрабатываются параллельно для окрашивания протокола X-gal (Рисунок 2). Несколько элементов управления должны быть включены во время процесса окрашивания для проверки специфика процедуры. Таким образом, WT эмбрионов используются как негативный контроль для гистохимические реакции и служат для мониторинга неспецифической X-Гал маркировки (см. рис. 3а-D и Рисунок 4A-C). Кроме того чтобы избежать неспецифических фон, рН X-Гал окрашивание раствора должна поддерживаться между 8 и 9 в течение всего пятнать. В рисунке 3Eβ-Гал положительных клеток визуализируются в целом гора HT эмбрионов в сегменты и intersomitic сосудистую на стадии E9.5. Однако, чтобы сообщить точное местоположение окрашенных клеток, эмбриона секционирование требуется визуализировать под микроскопом сообщили экспрессии генов в разделах ткани на клеточном резолюции. В этом случае LacZ положительных клеток находятся в сегменты, спинной аорты, intersomitic сосудистую, а также рассасывании сосудистого сплетения в разделах ткани (стрелки в рисунке 3F-H). Эти результаты коррелируют с помощью шаблона выражения, сообщил для Mt4-ММЗ в эти мыши эмбриональных стадий9, указывающее, что этот метод легко воспроизводимые и надежной. Как и ожидалось, уровень активности β-Гал выше в KO эмбрионов по сравнению с HT благодаря наличию двух копий Репортер ген LacZ (Рисунок 3I-L). Однако только HT LacZ / + эмбрионы должны быть проанализированы в исследованиях картин выражения гена и KO ткани используется как доказательство концепции для демонстрации возможности метода с из-за отсутствия целевого гена интереса, β-Гал позитивные клетки могут быть аномально расположенные в последнем.
При выполнении настоящего Протокола, старые эмбрионов (от E10.5 до E12.5) не являются полупрозрачными, и, таким образом, наиболее видимым X-Гал, окрашенных областей являются те близко к поверхности. Таким образом альтернативный шаг к этому методу — очистить эмбрионов, моет в растворах с увеличением концентрации глицерина. На рисунке 4LacZ окрашенных эмбрионов E12.5 стало ясно, при сохранении X-Гал окрашивание, позволяя нам фотографировать глубже окрашенных областей эмбриона в стереомикроскопом. Как сообщалось ранее на этой начальной стадии маркировки локализована в отдельных регионах мозга, конечностей, фолликул пришла и кончик хвоста9. Однако если один хочет, чтобы получить сотовой резолюции, эмбрионов должны быть заливали в парафин, секционного и микроскопически изучены.
На рисунке 5иммуногистохимии с антител анти β-Гал был использован для подтверждения, что выражение Mt4-ММП наблюдается с помощью репортер LacZ пятная. Таким образом β-Гал положительных клеток были обнаружены в бассейне мотонейронов спинного мозга мыши на E11.5 с использованием обоих подходов, который подтверждает специфику протокола сообщили здесь (Рисунок 5A, B).
Рисунок 1 . Схематическая иллюстрация репортер кодирования ген LacZ E. coli для β-галактозидазы и гистохимических реакции, катализируемые этот фермент. В традиционной окрашивание, β-галактозидазы гидролизует 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside субстрата (X-gal) для 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole. Впоследствии это промежуточное окисляется, который вызывает димеризации и формирование конечного продукта синего цвета (5, 5'-дибром-4, 4'-дихлоро Индиго). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Диаграмма, показывающая основные шаги стандартного протокола для выявления активности β-галактозидазы. Эмбрионов мыши собираются и обрабатываются для окрашивания всю гору X-Гал. После гистохимические пятнать согласно протоколу, вся гора эмбрионов может быть (вариант 1) снят с моет в растворах с увеличением концентрации глицерина и впоследствии сфотографировали в стереомикроскопом, или (вариант 2) встроенный в парафин, секционного и counterstained. Сокращения: RT, комнатной температуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . X-Гал окрашивание E9.5 WT и Mt4-ММЗLacZ / + целом гора эмбрионов и разделах ткани. С помощью стандартного анализа гистохимические X-Гал, трансгенных эмбрионов, перевозящих ген LacZ под контролем промотора Mt4-ММЗ были проанализированы на активность β-Гал. WT (A), HT (E) и ко, (я) E9.5 вся гора эмбрионы были обработаны для обнаружения β-галактозидазы выражения. Парафиновых срезах, полученные из этих эмбрионов на уровне спинного мозга позволяют визуализации пятнать клеточных разрешением. Как и ожидалось, β-Гал позитивные клетки отсутствовали в разделах WT (B-D), в то время как интенсивность маркировки была выше в KO (J-L), по сравнению с HT разделов ткани (F-H). Поперечные сечения через нервной трубки показывают активность β-гал в развивающиеся сегменты, спинной аорты и рассасывании сосудистого сплетения. Сокращения: Да, спинной аорты; FLB, Бутон передних конечностей; h, сердце; м, среднего мозга; NT, Хорда; OTV, слуховой пузырек; ов, везикул оптика; PNVP, рассасывании сосудистого сплетения; s, Сомит; t, конечного мозга. Масштаб бары: 500 мкм (A, E, I); 100 мкм (B, F, J); 50 мкм (C, G, K); 20 мкм (D, H, L). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Микрофотографиями WT и HT X-Гал окрашенных эмбрионов мыши на E12.5 до (A, D) и после (B, C, E, F) очистка с моет в увеличение глицерола. Как и ожидалось, WT эмбрионов показать не репортер LacZ выражение (A-C) в то время как маркировка была обнаружена в конечностях (белые стрелки), Первобытная фолликула пришла (белая стрелка), кончик хвоста (черная стрелка) и мозг Mt4-ММЗLacZ / + Эмбрионы на этом этапе (D-F)9. (E, F) После очистки в глицерин, эмбрионы стал полупрозрачные и маркировки может быть более легко визуализировать в более глубоких зонах эмбриона, как показано в среднего мозга и конечного мозга (белые стрелки в F). Линейки: 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 . Гистохимические и Иммуногистохимическое определение β-галактозидазы. (A) X-Гал окрашивания (в синем) показывает выражение Mt4-ММЗ в бассейне мотонейронов в парафин, часть спинного мозга на эмбриональной стадии E11.5. (B) иммуногистохимии с антител анти β-Гал (в красном) подтвердил выражение Mt4-ММЗ в мотонейронов спинного мозга на той же стадии эмбриона в разделах криостата. Сокращения: ПС, напольной плиты; MN, мотонейронов; Линейки: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблицы 1. Рецепты и решения, необходимые для этого протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
E. coli ген LacZ широко используется как репортер в исследованиях картин выражения гена из-за его высокой чувствительностью и легкости обнаружения. Настоящий Протокол описывает классический метод для обнаружения β-Гал выражение на основе ферментативные реакции, которая легко и быстро выполнять а также недорогой. Этот метод может применяться без серьезных изменений в всю гору эмбрионов, нетронутыми органов, разделах ткани криостата или культивируемых клеток.
Точное применение этого метода приводит к надежной и разборчивой пятнать. Однако настоятельно рекомендуется одновременный контроль и последующих подтверждающих шаги. В этой связи настоящий протокол осуществляется параллельно в дикого типа помёте эмбрионов используются как негативный контроль, которые служат для мониторинга неспецифической X-Гал пятнать. Кроме того, выражение данные получены при помощью β-Гал пятнать подтверждается Западной блот и количественного PCR (Q-ПЦР) анализа или с помощью β-Гал иммуногистохимия (рис. 5), который в сочетании с другими антитела также позволяет выявить типы конкретных клеток, выражая LacZ9. Фиксация шаги должны приниматься во внимание с целью сохранения Ферментативная активность β-галактозидазы и свести к минимуму фон во время окрашивания. Таким образом эмбрионы должны быть исправлены в низкотемпературном растворе глютаральдегида, который дает наиболее последовательные и надежные результаты, по сравнению с параформальдегида фиксации17. Кроме того фиксации времени имеет решающее значение и должна определяться эмпирически для каждого эмбриональной стадии, поскольку чрезмерная фиксации может снизить активность β-галактозидазы. В этой связи вся гора эмбрионов может быть исправлено путем погружения или перфузии в зависимости от начальной стадии и размер. Таким образом transcardial перфузии рекомендуется для эмбрионов старше E14.5 и послеродовой образцов гарантировать, что фиксатор достигает все регионы образца. Меньшие эмбрионов (от E8.5 до E12.5) может быть исправлена путем погружения и обрабатываются непосредственно для отвергнуты X-Гал окрашивание (рис. 2). Следует отметить, что X-Гал пятнать зародышей мыши моложе E14.5 могут быть выполнены как всю гору. В этом случае окрашенные клетки близко к поверхности легко обнаруживаются путем пятнать β-Гал. Тем не менее это может произойти, что глубже маркировки выглядит размытым или даже краска не проникать в ткани, особенно в старых эмбрионов. В этом случае либо органы или ткани взрослых мышей может быть расчленены, X-Гал витражи и визуализированы под стереомикроскопом. Тем не менее резания и микроскопическое обследование окрашенные ткани интерес является более подходящим (рис. 2).
Несмотря на эффективность протокола окрашивание всей эмбрионов и обнаружения может быть хлопотно. Например, почек, яички, секреторные желез придатка и желудочно-кишечного тракта содержат большое количество эндогенного кислой β-галактозидазы18 , что может помешать с толкованием результатов благодаря фоновой активности. По этой причине гистохимические реакции должно выполняться в условиях слегка щелочной рН (рН 8-9) на протяжении окрашивания, так как E. coli β-галактозидазы имеет оптимальный рН 7.3. Это поможет значительно сократить фон и в пользу бактерий β-галактозидазы деятельности19,20,21,22. Следует также отметить, что долго пятнать раз может привести к подкислению X-Гал окрашивание раствора, в пользу увеличения фона. Кроме того активность β-галактозидазы теряется при инкубации температуре выше 50 ° C, но не ниже 42 ° C. В наших руках инкубация с X-Гал субстрата работает лучше, когда оставил на ночь при 37 ° C. После окрашивания и до этапа после фиксации важно смыть все X-Гал реакции материала как тщательно и так же быстро, как можно устранить преципитаты гистохимические реакции, которые могут быть зачислены в разделе ткани.
Как показано здесь, очистка эмбрионов в глицерин имеет важное значение для изготовления ткани полупрозрачные при сохранении X-Гал окрашивание и ткани гистологии. Таким образом эмбрионы стало ясно и маркировки могут быть визуализированы в более глубоких областях под стереомикроскопом. Однако анализировать точное расположение окрашенных клеток, секционирование образца не требуется, и, таким образом, очистка не важно. В данном случае на следующие рекомендации, указанные в методе, образцы могут быть тщательно парафин встраиваемых и секционного. В процессе внедрения этанола обезвоженной ткани должен быть погружен в смеси изопропиловый спирт парафин. Изопропиловый спирт используется в пользу замены этанола в образце и облегчить ткани, встраивание в парафина23. В некоторые протоколы ксилол используется вместо изопропиловый спирт для той же цели. Тем не менее использование ксилол представляет недостатки по сравнению с изопропиловый спирт, например, усадки и упрочнения образца за счет удаления ткани липиды24 и токсикологические профиль как легковоспламеняющиеся и раздражающий продукта25. Оранжевый на масляной основе очистки агенты являются одним из безопасных альтернатив ксилол, так как они позволяют быстро сняв без токсичность ксилола, а также отличные ткани структура сохранения26. Кроме того если использовать ксилол, этой частью протокола следует уменьшить на максимум, так как X-Гал окрашивания можно диффузного и быть потерял19. После разрезания, counterstaining красителями (например ядерная быстро красный) рекомендуется для облегчения гистологические идентификации выражения ячейки. Эта окрашивание процедура быстрого, требующих только один шаг, и его розовый внешний вид обеспечивает хороший контраст с X-Гал преципитат синего цвета. Однако этот counterstaining пригоден только для использования с безводным монтажа СМИ (т.е. DPX).
Этот классический метод подходит для выявления активности β-галактозидазы, начиная с X-гал в сочетании с калия Ферро - и Гексацианоферрат производит характерный синий осадок, что не исчезают или отбеливатель, легко и когда хорошо построен, может быть обнаружен даже под микроскопом рассечения. Имеются другие модификации исходного протокола. Использование доступных субстратов, например лосося Гал (6-Chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), пурпурный Гал (5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) или Bluo Гал (5-бромо-3-indolyl β-D-галактопиранозид)13,19 , или заменив классические X-Гал/FeCN для Tetrazolium соли могут значительно повысить чувствительность обнаружения13,19. Это особенно рекомендуется разрешить высокая чувствительность обнаружения низких выражение уровня белков и мРНК материала. Однако когда используется слишком долго, любой из этих процедур может привести к высокой фоновых уровней, и поэтому всегда рекомендуется тщательного управления условий, особенно если учесть, что длительный инкубационный периодов может облегчить неспецифических пятнать из-за 13,активность эндогенного β-галактозидазы27. Что касается последнего это всегда целесообразно использовать соли железа калия для оптимизации надежности техники и избежать ошибок.
Важное ограничение этого метода является классической процедуры окрашивания X-Гал производит нерастворимых синий осадок, который может быть легко обнаружен световой микроскопии, но не разрешает совместное локализации исследования по флуоресцентные или конфокальная микроскопия в ткани разделы. Один из возможных способов преодолеть это ограничение будет использовать антител против β-Гал (см. Рисунок 5) в сочетании с immunodetection для конкретной ячейки типа. Однако если выражение уровни являются низкими или высокий фон, immunolabeling может сделать его трудно обнаружить ли Репортер ген выражается в определенной ячейке. Примечательно сообщалось Новая техника для получения конфокальный изображения высокого качества на основе флуоресценции выбросов, производимых X-Гал осадок28. Кроме того этот метод совместим с иммунофлюоресценции и могут четко определить X-Гал позитивные клетки28. Ферментативный журналистам как ген LacZ предлагают преимущество более чувствительны, чем флуоресцентные, которая примечательна когда маркировки, если выражение уровни являются особенно низкими. В этой связи настоящий техника была доказана идеально подходит для обнаружения микроРНК29, таким образом позволяя как качественной оценки выражений шаблонов, так и количественной оценки уровня выражения. Двойной пятнать используется для выявления активности и мРНК присутствие β-Гал через в situ гибридизация методы, которые может предоставить весьма полезную информацию для изучения выражению эндогенного генов при мониторинге активности β-гал в том же образце 30. Тем не менее, оба β-Гал пятно в situ гибридизация обнаружения реакций и может отображать цвет несовместимость во время двойной пятнать. Выбор более подходящий субстрат, таких как S-Гал, рекомендуется в специально оптимизированные методы30.
Этот универсальный метод широко использовался для изучения функции гена в контексте биологии развития. Таким образом ген LacZ была принята для анализа картин выражения гена во время эмбрионального развития, сбивая его в целевых генов локуса. LacZ является общей Репортер ген для изучения СНГ действующих регуляторных элементов (усилители) участвует в регуляции экспрессии генов в ограниченных регионах зародыша, предоставляя информацию о деятельности транскрипции промоутер интерес31 ,32,33. Кроме того он часто используется для обнаружения событий генетическая рекомбинация Cre опосредованной рекомбинации loxP сайтов, который особенно полезен для обнаружения производных эмбриональных стволовых клеток в клетки судьба сопоставления экспериментов или клеток для трансплантации. Джин ловушка мутагенеза в эмбриональных стволовых клетках производит усеченного белки, сливается с β-Гал, который позволяет оценки деятельности промоутер в физиологических условиях34. Для всех этих подходов, трансгенных животных, перевозящих LacZ и выражая бактериальных β-галактозидазы породили в крыса35,36, курица37,38,39 Xenopusили Данио рерио40. До сих пор этот метод был использован в дрозофилы для улучшения визуализации экспрессии генов пространственном и временном отношении из-за наличия индуцибельной гена выражение систем, тканей и клеток конкретных p-LacZ маркера линии41 ,10. Стоит отметить, что наряду с этим многие приложения с участием нокаут и трансгенных животных, Репортер ген LacZ был использован в целом тканях, а также культивируемых клеток предсказать роль генов в болезни в биомедицинских исследований. Соответствующим примером последнего является изучение процесса старения в отношении реакции на стресс, подавления опухоли или развития. Стареющей клетки легко обнаружить, как на местах , так и в естественных условиях из-за их характерным гиперэкспрессия и накопление эндогенного лизосомальных бета галактозидазы42,43. Следовательно β-галактозидазы используется как стареющей биомаркера в количественных анализов в рак культивируемых клеток44.
В целом мы описываем осуществимым и оптимизированы процедуры для облегчения легко обнаруживать β-galactoside деятельности в мыши эмбриональные ткани. Настоящий метод позволяет в изменения, основанные на выбранные ткани и субстрат используется. Следовательно этот метод универсальным и экономичным, работающих с надлежащего контроля особенно хорошо подходит для использования с весь мыши эмбрионов, а также на тонких Гистологические срезы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они имеют не конкурирующие финансового интереса.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить службу гистопатологические их технической помощи в Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Мы также благодарим д-р Motoharu Seiki для любезно предоставление Mt4-ММЗLacZ мышей и д-р Алисия G. Арройо, для поддержки нашего проекта и для ее критического чтения рукописи. Мы хотим поблагодарить Питера Бонни для корректуры этой статьи. Эта работа была поддержана Europea Мадридский посредством гранта (# 2017UEM01) в ЦСК
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
| 99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
| 99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
| Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
| Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
| Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
| Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
| Microscope Cover Glasses 24x60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
| Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
| Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
| Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
| Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
| Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
| Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
| Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
| Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
| pHmeter | Crison | Basic 20 | |
| Optic fiber | Optech | PL2000 |
References
- Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
- Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182 (1994).
- Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
- Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
- Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
- Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
- Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
- Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767 (2017).
- Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux's Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
- Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
- Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
- Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
- Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797 (2011).
- Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
- Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
- Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
- Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
- Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
- Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
- Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937 (2013).
- Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
- Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
- Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
- Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
- Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
- Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
- Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
- Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
- Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
- Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
- Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
