Summary
Aqui descrevemos o protocolo padrão para a detecção de atividade de β-galactosidase em embriões adiantados do rato inteiro e o método de parafina seccionamento e counterstaining. Este é um procedimento fácil e rápido para monitorar a expressão gênica durante o desenvolvimento, o que também pode ser aplicado às secções de tecidos, órgãos ou células cultivadas.
Abstract
O gene de Escherichia coli LacZ , codifica a β-galactosidase, é largamente utilizado como um repórter para a expressão de gene e como um tracer em estudos de linhagem celular. A clássica reação histochemical baseia-se a hidrólise do substrato X-gal em combinação com íons férricos e ferrosos, que produz um precipitado azul insolúvel que é fácil de Visualizar. Portanto, atividade de β-galactosidase serve como um marcador para o padrão de expressão do gene de interesse como o desenvolvimento prossegue. Aqui descrevemos o protocolo padrão para a detecção de atividade de β-galactosidase em embriões adiantados do rato inteiro e o método subsequente para parafina de seccionamento e counterstaining. Além disso, está previsto um procedimento para clarificar todo embriões para visualizar melhor o X-gal em regiões mais profundas do embrião. Resultados consistentes são obtidos por meio deste procedimento, apesar de otimização das condições de reação é necessária para minimizar as atividades do fundo. Limitações no ensaio devem ser também consideradas, particularmente sobre o tamanho do embrião no monte de toda mancha. Nosso protocolo fornece um sensível e um método confiável para detecção de β-galactosidase durante o desenvolvimento do mouse que pode ser mais aplicado para as seções do criostato, bem como os órgãos inteiros. Assim, os padrões de expressão de gene dinâmico durante todo o desenvolvimento podem ser facilmente analisados usando este protocolo em embriões de todo, mas também detalhada expressão a nível celular pode ser avaliada após corte de parafina.
Introduction
A fim de descrever os padrões de expressão de genes específicos, o uso de genes repórter como marcadores tem sido fundamental da drosófila para mamíferos. Em experimentos envolvendo animais transgénicos e nocaute, o gene bacteriano β-galactosidase (LacZ) de Escherichia coli (e. coli) é um dos mais amplamente utilizado1,2,3, 4. β-galactosidase (β-gal) catalisa a hidrólise da β-galactosidioss (por exemplo, lactose) em seus monossacarídeos (glicose e galactose)5. Seu substrato mais comumente usado é o X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), um glucosídeo que é hidrolisado por β-galactosidase fundadas 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole e galactose. O primeiro é oxidado em um dímero que, quando usados combinados com potássio ferri- e ferro-cianeto, produz uma característica insolúvel, o precipitado de cor azul (Figura 1)6.
O gene LacZ começou a ser usado como um gene repórter, há mais de trinta anos de7,8. Geralmente, LacZ é inserida a jusante de um promotor endógeno no lugar do frame de leitura aberto, então ele pode ser usado na cultura bacteriana e célula para visualizar células contendo um encarte especial, bem como em animais transgénicos como um traçador de endógena padrões de expressão de genes durante o desenvolvimento,9. A este respeito, a visualização da atividade de β-galactosidase tem sido usada extensivamente em Drosophila para compreender os processos de desenvolvimento e celulares de células únicas para tecidos. Genética da Drosophila favorece a geração de linhas estáveis em que uma construção P-elemento modificada, contendo o gene repórter que lacZ é inserido aleatoriamente posições no genoma. Assim, quando colocado sob a influência de elementos potenciador pode dirigir sua expressão de maneira específica de tecido, que permitiu a análise sistemática dos padrões de expressão de diversos genes durante as duas décadas passadas10. Além disso, o uso de ratos transgênicos para monitorar a expressão do gene LacZ também permite a detecção de eventos de recombinação genética por Cre-loxP mediada por recombinação e localização dos derivados de células-tronco embrionárias mutante em análises quiméricoes 11, que facilita o controle da expressão de LacZ em tecidos específicos, bem como temporalmente. Além disso, em todo embriões, deteção da atividade β-galactosidase pode produzir padrões de coloração diferenciais em intensidades diferentes que podem ser convenientemente observados em diferentes estádios de desenvolvimento para analisar mudanças temporais na expressão do gene 8,12.
Neste artigo, apresentamos um protocolo para visualizar a expressão do gene através do X-gal mancha no tecido toda montagem em estágios iniciais de desenvolvimento de embriões do rato. Apresentamos este método histoquímico como uma técnica altamente sensível e de baixo custo que favorece a detecção precisa das pilhas etiquetadas em espécimes de montagem inteira ou a nível celular, depois incorporado de parafina tecidos ou embriões. O método permite a visualização directa da mancha no tecido do mouse com o plano de fundo mínimo quando comparado com outros métodos de13.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comité sobre a ética de experimentos Animal o CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) e da Comunidad Autónoma de Madrid, para garantir o mínimo sofrimento dos animais.
1. coleta de embriões de ratos grávidas (de 8.5 para E12.5)
- Sacrificar os ratos grávidas por deslocamento cervical ou inalação de CO2 . O dia do primeiro observado plug vaginal foi considerada embrionária dia 0,5 (E0.5).
- Colocar o animal em posição supina na almofada absorvente e limpar a pele abdominal do mouse com etanol a 70%.
Nota: A esterilidade não é necessário nas etapas a seguir. - Beliscar e levantar a pele abdominal usando pinça dente de rato.
- Fazer uma incisão através da pele e da parede abdominal, 2 a 4 cm, verticalmente, do outro lado da linha mediana do abdômen com uma tesoura cirúrgica.
- Expor o abdome e remover os cornos uterinos da mãe com fórceps vasos sanguíneos de corte ao longo da curvatura interna do útero com uma tesoura cirúrgica.
- Remover a sequência de caracteres de embriões e transferi-lo para um prato de Petri no gelo contendo 10 mL gelada 0,01 M tampão fosfato salina pH 7,4 (PBS).
- Disse cuidadosamente os embriões para fora do útero sob um estereomicroscópio em uma placa de Petri com 10 mL de PBS gelado fresco. Segure a parede muscular com fórceps dos relojoeiros para expor o saco amniótico e então rasgar a membrana amniótica para remover o embrião fechado e o saco vitelino, usando as pontas da pinça.
- Coletar os embriões littermate de ratos grávidos em estágios iniciais (a partir de 8.5 para E12.5) (Figura 2).
- Transferir os embriões para um prato fresco com 10ml frio 1X PBS usando fórceps curvo ou, muito pequenos embriões (8.5-E9.5), usar pipetas de transferência plástico para coletar as amostras sem danos de embrião.
- Antes de iniciar a fixação, tirar uma amostra embrionária em um tubo de microcentrifugadora para a genotipagem cortando um pequeno pedaço do embrião ou levando a membrana amniótica nos menor dos seus embriões (8.5 para E9.5) com fórceps dos relojoeiros.
Nota: Genotipagem LacZ é determinada pelos iniciadores de reação em cadeia (PCR) polimerase: avanço, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´; reversa, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´.
2. fixação dos embriões do rato
- Transferi cada embrião para um tubo de microcentrifugadora de 2 mL com uma base arredondada contendo 1 mL 1X PBS.
Nota: Execute todas as etapas do protocolo nesses tubos com agitação, utilizando um agitador de rolamento. - Lave os embriões em PBS 1x por 1 min à temperatura ambiente para eliminar o sangue restante. Uso de pipetas de transferência plástica para alterar líquidos nos tubos.
- Corrigi o embrião em 1 mL de 0,125% de glutaraldeído no gelo.
Nota: O tempo de fixação depende do tamanho do embrião: 20 min para 8.5-E9.5 embriões, 30 min para embriões E10.5 e 1h para E12.5 embriões. - Retire o fixador e lave os embriões em 1X PBS duas vezes durante 10 minutos à temperatura ambiente antes de processar a amostra para coloração X-gal.
3. toda montagem β-galactosidase histoquímica de embriões do rato
- Buffer de preparar X-galão enxaguar e solução de coloração X-Gal antes de iniciar o procedimento (ver tabela 1 e Tabela de materiais). Use um embriões de littermate do selvagem-tipo (WT) como controles negativos para a reação enzimática.
- Incube os embriões no buffer X-galão enxaguar por 10 minutos em temperatura ambiente (Figura 2).
- Incube os embriões na solução de coloração X-Gal de 2h durante a noite a 37 ° C, protegido da luz. Monitore a reação de cor periodicamente através de um microscópio de dissecação até intensidade suficiente de coloração azul é observada sem o fundo no embrião. Manter o pH da solução entre 8 e 9 para reduzir a fundo durante toda a mancha. Se a solução de coloração começa a virar luz, substituí-lo com solução de substrato fresco para ampliar a reação enzimática.
- Pare a reação quando o sinal desejado é obtido por lavagem embriões em um tubo de microcentrifugadora com 1 mL 1X PBS duas vezes por 10 min à temperatura ambiente.
- Transferir os embriões manchados de paraformaldeído 4% de 1 mL (PFA) re-corrigi-los, durante 1 h durante a noite a 4 ° C.
Nota: Os embriões podem ser armazenados em 4% PFA/PBS para tempos mais longos, a 4 ° C ou pode ser processada imediatamente para a corte. Essa etapa final da fixação é crucial para a conservação a longo prazo do padrão de coloração. - Lave os embriões em 1 mL 1X PBS duas vezes durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Opção 1: Limpar os embriões por imersão em uma série de soluções com concentrações crescentes de glicerol (20%, 40%, 60% e 80% de glicerol em 1X PBS) por 1h à temperatura ambiente em cada solução.
Nota: Lave os embriões em 80% de glicerol para tempos mais longos, até mesmo dias, até que eles são limpas e em seguida, armazene-os em 80% de glicerol a 4 ° C, a esta etapa (Figura 2). Adicionando uma quantidade muito pequena de cristal de ora de azida de sódio de timol para os embriões armazenados a 4 ° C em glicerol ou 1X PBS é recomendado para evitar o crescimento de molde. Após limpeza, embriões de montagem inteira podem ser usados para fotografar (passo 4). - Opção 2: Processo de embriões para parafina incorporação e corte usando um micrótomo (Figura 2). Documente o padrão de expressão em toda manchados embriões antes de seccionamento (passos 4 e 5).
4. fotografia de toda montagem de embriões
- Para fotografar o monte todo manchado embriões antes da corte, transferi-los para um prato de Petri preparada com uma base de solidificou-se 1-2% de agarose em 1X PBS.
- Cobrir o embrião completamente com 10 mL 1X PBS nos pratos agarose-revestido para evitar desidratação e reflexão enquanto fotografa através do líquido.
- Oriente o embrião imergido em 1X PBS usando fórceps. Para os mais antigos embriões (E10.5-E12.5), faça um pequeno furo no agarose com pinças para colocar e posicionar a amostra dentro dele, em ângulos diferentes e para evitar a livre flutuação durante a fotografia.
- Coloque o prato no palco estereomicroscópio, usando a luz transmitida (fase Under). Mudar entre o 'campo escuro' e ajustes 'brilhante-campo' para definir a iluminação desejada durante a fotografia e para otimizar a translucidez da amostra.
Nota: Uso da fibra óptica iluminação para fase posterior embriões evitar a reflexão na superfície do embrião. Quando fotografar embriões limpos, siga o mesmo procedimento mas transferi-los para uma placa de Petri contendo 100% de glicerol e imergi-los completamente.
5. parafina incorporação e seccionamento de X-galão manchado de embriões
- Incorporação de cera de parafina
- Remover o X-gal manchado embriões a partir de 4 ° C (passo 3.5) e lave-os com 1 mL 1X PBS três vezes para eliminar o excesso de fixador.
- Transferi cada embrião para uma gaveta de histologia usando fórceps.
- Coloque as fitas contendo os embriões em um copo e depois desidrata-se, passando-os através de uma série gradual do etanol na temperatura de quarto: etanol a 70%, uma vez por 30 min; etanol a 96%, duas vezes por 30 min cada; 100% de etanol, duas vezes por 30 min cada.
Nota: Os embriões podem ser armazenados em etanol a 70% por um tempo indeterminado a 4 ° C até iniciar o processo de desidratação. - Incube a gaveta inteira em isopropanol por 30 min à temperatura ambiente.
- Com o uso de fórceps, transferir as fitas para um vidro de coloração calha contendo isopropanol previamente aquecido e deixar na estufa a 60 ° C por 30 min.
- Coloque as fitas em um vidro novo coloração calha contendo uma mistura de isopropanol 50% / 50% derreteu a cera de parafina e deixe por 4 horas em um forno de 60 ° C.
- Incube as fitas com os embriões com duas mudanças de cera de parafina derretida, 30 min a 60 ° C.
- No final da lavagem final de parafina, abrir a gaveta e transferir cada embrião para um tecido separado incorporação molde para exibir a amostra sob um estereomicroscópio.
- Encher o poço com cera de parafina fundida a 60 ° C. Use pinça aquecida para manter a cera derretida e orientar cuidadosamente o embrião no molde.
Nota: A orientação adequada da amostra é uma etapa crítica para secionar o embrião no plano desejado. - Antes parafina solidifica no molde, coloque uma fita sem a tampa na parte superior do bloco e preenchê-lo com cera de parafina derretida. Deixe arrefecer o restante da cera até que solidificou a noite à temperatura ambiente.
- Uma vez que a parafina é completamente solidificada, remover o bloco sólido do molde e armazenar os blocos de parafina ou à temperatura ambiente ou a 4 ° C até14de seccionamento.
- Corte de parafina
- Orientar a lâmina sobre o micrótomo e configurar 5-7 µm de espessura. 5.2.2. esfriar o bloco de parafina no gelo e aparar para produzir um cubo ou uma pirâmide.
- Coloque o do titular do micrótomo, usando uma pequena quantidade de cera derretida.
- Oriente o bloco para o corte ideal. Os blocos de parafina em 5-7 µm de espessura em temperatura ambiente usando padrão micrótomo de seção.
- Usando um pincel fino, coloca as seções em um banho de água à temperatura ambiente para manipulação e seleção de fatias.
- Buscar em seções do banho de água com uma lâmina de microscópio e transferi-los para um banho-maria a 42 ° C para alongamento.
- Remover seções do banho e gentilmente colocá-los em corrediças do microscópio de adesão.
- Secar as lâminas bem em estufa a 37 ° C durante a noite para permitir que as seções de aderir completamente, caso contrário, eles podem se perder durante a coloração.
Nota: Guarde os slides a 4 ° C até iniciar procedimentos de coloração.
- Deparaffinization e Counterstaining de cortes de parafina X-Gal-manchado
- Coloque os slides em uma bandeja de lâmina de microscópio em estufa a 60 ° C durante pelo menos 45 min fazer a cera de parafina mais fluido.
- Transferir os slides em um rack e usar vidro, pratos de coloração para executar as seguintes etapas: submergir o rack nos potes de coloração álcoois de diminuir as concentrações de parafina completa remoção e hidratação dos tecidos: isopropanol durante 5 min à 60 ° C; isopropanol para 3 min; 100% de etanol por 2 min; etanol a 96% para 1 min; etanol a 70% por 1 min à temperatura ambiente.
- Enxague as seções em água destilada duas vezes para ter certeza de que não se encontram álcool.
- Counterstain seções com uma mancha (por exemplo, solução de vermelho de Nuclear-Fast) por 5 min (geralmente entre 3-8 min) à temperatura ambiente (Figura 2).
Nota: Esta coloração ajuda a revelar a estrutura geral do tecido nas seções. - Depois da coloração, lavar as lâminas em água destilada por 1 min e verifique a seção coloração no microscópio.
Nota: Se a coloração desejada é muito fraca, corante de contraste das seções novamente por mais tempo. - Desidrata-se seções na série seguinte com concentrações crescentes de etanol: duas lavagens em etanol a 95% por 2 min cada, dois lava em etanol 100% por 2 min cada, e, para evitar a dissolução do azul cor precipita-se, apenas uma lavagem rápida em xilol.
- Remover as lâminas de um rack e colocá-los em um pedaço de papel. Em seguida, monte e lamela cada deslize usando um meio de montagem sintética, permanente.
Nota: O xileno é um produto inflamável, cujos vapores são irritantes e nocivas para a saúde humana e para os organismos aquáticos. Tem de ser manipulada dentro de uma capa e requer o uso de equipamento de proteção adequado.
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Representative Results
Aqui nós mostramos os resultados da aplicação do protocolo padrão para a reação de β-galactosidase histochemical usando X-galão como substrato em embriões de rato inteiro (Figura 1 e Figura 2). Usando este protocolo, podemos examinar a membrana tipo 4-matriz de metaloproteinase (mmp-Mt4) expressão em diferentes fases do desenvolvimento embrionários (E9.5, E11.5 e E12.5) usando Mt4-mmp ratos mutantes que expressam o repórter LacZ sob o controle da endógena MT4-mmp promotor (Figura 3, Figura 4e Figura 5)9,15. MT4-mmp é uma endopeptidase que é amarrado à membrana celular através de uma glycophosphatidyl âncora de inositol (GPI). Embora Mt4-mmp foi detectada em vários cânceres humanos e tem sido relacionada com a progressão do crescimento do tumor, informações sobre sua atividade proteolítica contra componentes da matriz extracelular são muito limitadas até à data. Além disso, quase nada foi relatado sobre o papel e a expressão de mmp-Mt4 durante o desenvolvimento embrionário9,16.
Tipo selvagem (WT), mmp-Mt4LacZ / + heterozigoto (HT) e nocaute (KO) littermate embriões são processados em paralelo para o protocolo de coloração X-gal (Figura 2). Vários controles devem ser incluídos durante o processo de coloração para validar a especificidade do procedimento. Assim, WT embriões são usados como controles negativos para a reação histochemical e servir para monitorar específico X-galão rotulagem (ver Figura 3A-D e Figura 4A-C). Além disso, para evitar o fundo inespecíficos, o pH da solução coloração X-Gal deve ser mantido entre 8 e 9 em toda a mancha toda. Na Figura 3E, células β-gal-positivo são visualizadas em embriões de toda montagem de HT nas somitas e vasculatura intersomitic na fase E9.5. No entanto, para relatar a localização precisa das células coradas, embrião de corte é necessário Visualizar ao microscópio relatou expressão gênica em cortes de tecido em resolução de celular. Neste caso, células de LacZ-positivo são encontradas nas somitas, a aorta dorsal, vasculatura intersomitic, bem como o plexo vascular perineural em cortes de tecido (setas na Figura 3F-H). Estes resultados se correlacionam com o padrão de expressão relatado para Mt4-mmp nesses rato estágios embrionários9, indicando que esta técnica é facilmente reprodutível e confiável. Como esperado, os níveis de atividade de β-gal são mais elevados nos embriões KO em comparação com o HT devido à presença de duas cópias do gene repórter LacZ (Figura 3I-L). No entanto, somente LacZ de HT / + embriões devem ser analisados em estudos de padrões de expressão de gene e KO tecido é usado como uma prova de conceito para demonstrar a viabilidade do método desde devido à falta do gene alvo de interesse, β-gal células positivas podem ser anormalmente localizado neste último.
Ao realizar este protocolo, os embriões mais velhos (a partir de E10.5 para E12.5) não são translúcidos, e, portanto, o mais visível X-galão manchado regiões são aqueles perto da superfície. Assim, um passo alternativo para este método é para limpar os embriões por lavagens em soluções com o aumento da concentração de glicerol. Na Figura 4, os embriões de LacZ manchada de E12.5 tornou-se claro, mantendo a coloração X-gal, permitindo-nos fotografar mais fundo manchado regiões do embrião no microscópio estereoscópico. Como relatado anteriormente nesta fase embrionária, a rotulagem era localizada em regiões distintas do cérebro, os membros, o folículo de vibrissa e a ponta da cauda9. No entanto, se deseja obter uma resolução de celular, embriões devem ser incorporados em parafina, seccionados e examinados microscopicamente.
Na Figura 5, imuno-histoquímica com anticorpos anti-β-gal foi usado para confirmar que a expressão de mmp-Mt4 observada através de coloração de repórter LacZ. Assim, as células β-gal-positivos foram detectadas na piscina de motoneurônios da medula espinhal do mouse em E11.5 usando ambas as abordagens, que confirma a especificidade do protocolo aqui relatado (Figura 5A, B).
Figura 1 . Ilustração esquemática da codificação de gene de repórter LacZ de Escherichia coli para a β-galactosidase e a histochemical reação catalisada por esta enzima. Na coloração tradicional, β-galactosidase hidrolisa o substrato 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) para 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole. Posteriormente, este intermediário é oxidado, o que provoca dimerização e formação do produto final cor azul (5, 5'-dibromo-4, 4'-dicloro indigo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Diagrama mostrando as etapas principais do protocolo padrão para a detecção de atividade de β-galactosidase. Embriões do rato são recolhidos e tratados para toda montagem X-galão coloração. Após a coloração histoquímicos realizado de acordo com o protocolo, toda montagem embriões podem ser (opção 1) limpos com lavagens em soluções com o aumento da concentração de glicerol e posteriormente fotografado em um estereomicroscópio, ou (opção 2) incorporado em parafina, seccionado e counterstained. Abreviaturas: RT, temperatura ambiente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . X-galão coloração de E9.5 WT e Mt4-mmpLacZ / + toda a montagem em embriões e cortes histologicos. Usando o padrão X-galão do ensaio histoquímico, embriões transgênicos que carreg o gene LacZ sob o controle do promotor Mt4-mmp foram analisados para a atividade de β-gal. WT (A), HT (E) e KO (eu) E9.5 toda montagem embriões foram processados para a detecção da expressão da β-galactosidase. Cortes de parafina, obtidos a partir destes embriões a nível da medula espinhal permitem a visualização da coloração em resolução de celular. Como esperado, β-gal células positivas estavam ausentes nas seções WT (B-D), enquanto a intensidade da rotulagem foi maior para o KO (J-L), em comparação com as seções de tecido HT (F-H). Seções transversais através do tubo neural revelam atividade β-gal no plexo vascular perineural, aorta dorsal e as desenvolvimento somitas. Abreviaturas: promotor, aorta dorsal; FLB, broto do membro anterior; h, coração; m, mesencéfalo; NT, notocorda; OTV, vesícula ótica; OV, vesícula óptica; PNVP, perineural plexo vascular; s, somite; t, telencéfalo. Barras de escala: 500 μm (A, E, eu); 100 μm (B, F, J); 50 μm (C, G, K); 20 μm (D, H, L). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Fotomicrografias de WT e HT X-galão manchado embriões do rato em E12.5 antes (A, D) e depois (B, C, E, F) limpando com lavagens em glicerol aumento. Como esperado, embriões WT não mostram nenhum repórter LacZ expressão (A-C) enquanto rotulagem foi detectado nos Membros (setas brancas), o Primórdio do folículo de vibrissa (seta branca), a ponta da cauda (seta preta) e cérebro do Mt4-mmpLacZ / + embriões para este estágio (D-F)9. (E, F) Após a limpeza em glicerol, embriões tornou-se translúcida e rotulagem pode ser mais facilmente visualizado em regiões mais profundas do embrião, conforme o mesencéfalo e o telencéfalo (setas brancas em F). Barra de escala: 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Histochemical e imuno-histoquímica da deteção do β-galactosidase. (A) X-galão, coloração (em azul) revela a expressão de mmp-Mt4 na piscina de motoneurônios em uma seção de parafina da medula espinhal na fase embrionária de E11.5. (B) imuno-histoquímica com anticorpos anti-β-gal (em vermelho) confirmou a expressão de mmp-Mt4 em motoneurônios da medula espinhal na fase embrionária mesmo nas seções do criostato. Abreviaturas: fp, placa de fundo; MN, motoneurônios; Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1. Receitas e soluções necessárias para esse protocolo. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O gene LacZ Escherichia coli tem sido amplamente utilizado como um repórter em estudos de padrões de expressão de gene, devido à sua alta sensibilidade e facilidade de deteção. O presente protocolo descreve um método clássico para detectar a expressão de β-gal, baseado em uma reação enzimática que é fácil e rápido para executar, bem como o baixo custo. Esse método pode ser aplicado também sem grandes modificações em embriões de toda montagem, órgãos intactos, seções do criostato do tecido ou células cultivadas.
Aplicação precisa desse método resulta em uma coloração robusto e interpretável. No entanto, controlos simultâneos e etapas subsequentes de confirmação são altamente recomendadas. Neste sentido, o presente protocolo é realizado em paralelo em embriões de tipo selvagem littermate usado como controles negativos que servem para monitorar específico X-galão de coloração. Além disso, a expressão dados obtidos quando usar β-gal coloração é confirmada pelo western-blot e PCR quantitativo (Q-PCR) análise ou por meio de β-gal imuno-histoquímica (Figura 5), que combinadas com outros anticorpos também permite a identificação de tipos de célula específica expressando LacZ9. Etapas de fixação devem ser tomadas em consideração a fim de preservar a atividade enzimática da β-galactosidase e minimizar o fundo durante a coloração. Assim, os embriões devem ser fixados em glutaraldeído, que dá os resultados mais consistentes e confiáveis em comparação com paraformaldeído fixação17. Além disso, o tempo de fixação é crucial e deve ser determinado empiricamente para cada fase embrionária, desde a fixação excessiva pode reduzir a atividade de β-galactosidase. A este respeito, toda montagem embriões podem ser corrigidos por imersão ou perfusão dependendo da fase embrionária e tamanho. Assim, transcardial perfusão é recomendada para os embriões mais velhos do que E14.5 e para espécimes pós-natal garantir que o fixador atinge todas as regiões da amostra. Menor dos seus embriões (8.5 até E12.5) podem ser corrigidos por imersão e processados diretamente para em toto X-galão coloração (Figura 2). Deve ser mencionado que X-galão mais jovem do E14.5 pode ser realizada como a montagem de toda a coloração de embriões do rato. Nesse caso, células coradas perto da superfície são facilmente detectadas por meio de coloração de β-gal. Mesmo assim, pode ocorrer que uma rotulagem mais profundo aparece turva ou mesmo tintura não penetra o tecido, especialmente em embriões mais velhos. Neste caso, ou órgãos ou tecidos de ratos adultos podem ser dissecado, X-galão manchado e visualizado sob um estereomicroscópio. Não obstante, o exame microscópico e corte do tecido manchado de interesse é mais adequado (Figura 2).
Apesar da eficiência do protocolo, manchar embriões todo e deteção pode ser problemático. Para instância, o rim, testículo, glândulas secretoras, epidídimo e trato gastrointestinal contêm quantidades elevadas de ácidos endógenos do β-galactosidase18 que possam interferir com a interpretação dos resultados devido a atividade de segundo plano. Por esse motivo, a reação histochemical deve ser realizada sob condições de pH ligeiramente alcalino (pH 8-9) em toda a coloração, desde que o β-galactosidase de e. coli tem um pH ótimo de 7,3. Isto ajudará a reduzir significativamente o plano de fundo e para favorecer a β-galactosidase bacteriana atividade19,20,21,22. Também deve ser notado que há muito tempo a coloração vezes pode resultar em acidificação da X-gal solução de coloração, favorecendo um aumento do fundo. Além disso, a atividade de β-galactosidase é perdida sob temperaturas de incubação acima de 50 ° C, mas não inferior a 42 ° C. Em nossas mãos, incubação com o substrato X-gal funciona melhor quando deixadas durante a noite a 37 ° C. Depois da coloração e antes da etapa pós-fixação, é importante lavar todo o material de reação X-galão como cuidadosamente e tão rapidamente quanto possível eliminar precipitados da reação histochemical que pode ser depositada na seção de tecido.
Como mostrado aqui, limpar embriões em glicerol é importante para fazer o tecido translúcido, preservando o X-gal histologia manchando e tecido. Assim, os embriões tornam-se claras e rotulagem pode ser visualizada em regiões mais profundas sob o microscópio. No entanto, para analisar a localização exata das células coradas, o corte da amostra é necessária e, portanto, a compensação não é essencial. Neste caso, por seguir as recomendações indicadas no método, as amostras podem ser cuidadosamente parafina incorporado e seccionado. Durante o processo de incorporação, etanol desidratado tecido precisa estar imerso em uma mistura de isopropanol-parafina. Isopropanol é usado para favorecer a substituição de etanol na amostra e para facilitar a incorporação em parafina23o tecido. Em alguns protocolos, xileno é usado em vez de isopropanol para a mesma finalidade. No entanto, o uso do xilol apresenta desvantagens contra isopropanol, tais como o encolhimento e o endurecimento da amostra devido à remoção de tecido lipídios24 e seu perfil toxicológico como um produto inflamável e irritante de25. Agentes de compensação laranja à base de óleo são uma das alternativas mais seguras para xileno desde que permitem rápidas compensação sem a toxicidade do xileno, bem como a estrutura de tecido excelente preservação26. Também, se usando o xileno, esta parte do protocolo deve ser reduzido ao máximo, desde que X-galão coloração pode difundir e ser perdeu19. Após corte, counterstaining com corantes (por exemplo, Fast Red Nuclear) é recomendado para facilitar a identificação histológica de expressar as células. Este procedimento de coloração é rápido, exigindo apenas um passo, e sua aparência rosa fornece bom contraste com o precipitado de X-galão de cor azul. No entanto, esta counterstaining só é adequado para o uso com meios aquosos de montagem (ou seja, DPX).
Este método clássico é adequado para a detecção de atividade de β-galactosidase, desde X-gal em combinação com ferro de potássio - e ferricianeto produz um precipitado azul característico que não se desvanece ou lixívia facilmente e, quando bem construído, pode ser detectado, mesmo sob o microscópio de dissecação. Existem outras modificações do protocolo original. Usando substratos disponíveis como salmão-gal (6-Chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), Magenta-gal (5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) ou Bluo-gal (5-Bromo-3-indol β-D-galactopyranoside)13,19 , ou substituindo o clássico X-gal/BECN para sais de tetrazólio podem aumentar consideravelmente a sensibilidade da deteção13,19. Isso é especialmente recomendado para permitir a detecção de alta sensibilidade de expressão baixo níveis de proteína e mRNA material. No entanto, quando usado por muito tempo, qualquer um desses procedimentos pode levar a níveis de fundo elevado e gestão cuidadosa das condições sempre é recomendada, especialmente considerando que incubação prolongada períodos podem facilitar a coloração inespecíficos devido a endógena de β-galactosidase atividade13,27. Em relação a último, é sempre aconselhável a utilização de sais de potássio férrico para otimizar a confiabilidade da técnica e evitar armadilhas.
Uma limitação importante desse método é que o procedimento clássico de coloração X-gal produz um precipitado azul insolúvel que pode ser facilmente detectado por microscopia de luz, mas não permite estudos de localização co pela microscopia confocal ou fluorescente em tecido seções. Uma maneira de superar essa limitação seria usar anticorpos contra β-gal (ver Figura 5) combinado com immunodetection para um tipo específico de célula. No entanto, se os níveis de expressão são baixos ou o fundo elevado, immunolabeling pode tornar difícil detectar se o gene repórter está expressa em uma célula específica. Nomeadamente, uma nova técnica tem sido relatada para obter imagens de alta qualidade confocal baseadas a emissão de fluorescência produzida por X-galão precipitado28. Além disso, este método é compatível com imunofluorescência e pode identificar claramente o X-gal células positivas28. Enzimáticos repórteres como o gene LacZ oferecem a vantagem de ser mais sensível do que os fluorescentes, que é notável quando a rotulagem, se os níveis de expressão são especialmente baixos. A este respeito, a presente técnica mostrou-se ideal para a detecção de microRNA29, permitindo, portanto, tanto a avaliação qualitativa dos padrões de expressão e a quantificação dos níveis de expressão. A coloração dupla é usada para detectar a presença de atividade e mRNA de β-gal através em situ da hibridação técnicas, que podem fornecer informações muito úteis para examinar o padrão de expressão de genes endógenos enquanto monitora a atividade de β-gal na mesma amostra 30. no entanto, ambas as reações β-gal mancha e em situ da hibridação deteção podem apresentar incompatibilidade de cor durante coloração dupla. Escolher um substrato mais adequado, como S-gal, recomenda-se de métodos otimizado especificamente30.
Esse método versátil tem sido extensivamente usado para estudar a função do gene no contexto da biologia do desenvolvimento. Assim, o gene LacZ tem sido adotado para a análise de padrões de expressão de genes durante o desenvolvimento embrionário por batê-lo em um locus de gene alvo. LacZ é um gene repórter comum para estudar cis-agindo elementos reguladores (intensificadores) envolvidos na direção de expressão gênica em regiões restritas do embrião, fornecendo informações sobre a atividade de transcrição do promotor de interesse31 ,de32,33. Além disso, é frequentemente usado na detecção de eventos de recombinação genética por Cre-mediated recombination de sites loxP, que é especialmente útil para a detecção de derivados de células-tronco embrionárias em experimentos de mapeamento de destino de célula ou em transplantes de células. Mutagênese de gene-armadilha em células-tronco embrionárias produz proteínas truncadas fundidas a β-gal, o que permite a avaliação da atividade do promotor sob condições fisiológicas,34. Para todas estas abordagens, animais transgénicos carregando LacZ e expressando a β-galactosidase bacteriana foi gerados no rato35,,36,37,38, Xenopus39 de frango ou zebrafish40. Até então, esta técnica tem sido usada em Drosophila para melhorar a visualização da expressão genética espacial e temporalmente, devido à disponibilidade de sistemas de expressão do gene inducible e tecido e linhas de marcador de célula específica p-LacZ41 ,10. Isso é importante notar que para além destes muitas aplicações que envolvam animais transgénicos e nocaute, LacZ gene do repórter tem sido usada em tecidos bem como culto células para prever o papel dos genes na doença na investigação biomédica. Um exemplo relevante deste último é o estudo do processo de envelhecimento sobre as respostas ao estresse, supressão de tumor ou desenvolvimento. As células senescentes são fáceis de detectar tanto in situ e em vivo devido a sua característica superexpressão e acúmulo lisossomal endógeno da beta-galactosidase42,43. Daí, β-galactosidase é usado como um biomarcador senescente em ensaios quantitativos em câncer cultivadas células44.
Em resumo, nós descrevemos um procedimento viável e otimizado para facilitar a fácil detecção de atividade de β-galactoside em tecido embrionário de rato. O presente método permite modificações baseadas o tecido selecionado e o substrato utilizado. Portanto, esse método versátil e econômico empregado com controlos adequados é especialmente apropriado para o uso com embriões do rato inteiro, bem como em finos cortes histológicos.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm nenhum interesse financeiro concorrente.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer o serviço histopatológico para sua assistência técnica com o Centro Nacional de investigações Cardiovasculares (CNIC). Também agradecemos a Dr. Motoharu Seiki para fornecer gentilmente Mt4-mmpLacZ ratos e Dr. Alicia G. Arroyo para apoiar nosso projeto e para a leitura crítica do manuscrito. Gostaríamos de agradecer Peter Bonney para revisão deste artigo. Este trabalho foi apoiado pela Universidad Europea de Madrid por meio de uma subvenção (# 2017UEM01) atribuída a C.S.C
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
| 99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
| 99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
| Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
| Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
| Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
| Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
| Microscope Cover Glasses 24x60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
| Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
| Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
| Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
| Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
| Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
| Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
| Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
| Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
| pHmeter | Crison | Basic 20 | |
| Optic fiber | Optech | PL2000 |
References
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