Summary
Burada erken tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti için standart protokol ve kesit ve counterstaining parafin için yöntemi açıklanmaktadır. Gen ekspresyonu doku bölümlerine de uygulanabilir geliştirme sırasında izlemek için kolay ve hızlı bir prosedür bu organ veya kültürlü hücreleri.
Abstract
Escherichia coli LacZ gene, β-galaktozidaz, kodlama büyük ölçüde gen ekspresyonu için muhabirlik ve hücre lineage çalışmalarda bir izleyici olarak kullanılır. Klasik histochemical reaksiyon görselleştirmek kolay bir çözünmez mavi çökelti üreten demir ve demir iyonları, birlikte substrat X-gal hidroliz temel alır. Bu nedenle, geliştirme ilerledikçe β-galaktozidaz etkinliği ilgi gen ifade desenini avans olarak hizmet vermektedir. Burada erken tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti için standart protokol ve kesit ve counterstaining parafin için sonraki yöntemi açıklanmaktadır. Ayrıca, tüm embriyoların açıkladığınız için bir yordam X-gal embriyo, daha derin bölgelerinde boyama daha iyi görmek için sağlanmıştır. Reaksiyon koşulları duruma getirilmesi arka plan etkinliği en aza indirmek için gerekli, ancak tutarlı sonuçlar bu yordamı uygulanarak elde edilir. Tahlil sınırlamalar da, özellikle bütün Dağı boyama içinde embriyo boyutu ile ilgili olarak düşünülmelidir. Bizim iletişim kuralı bir duyarlı ve daha fazla cryostat bölümler hem de bütün organları uygulanabilir fare geliştirme sırasında β-galaktozidaz algılama için güvenilir bir yöntem sağlar. Böylece, dinamik gen ifade desen geliştirme boyunca tüm embriyoların bu protokolü kullanarak kolayca çözümlenebilir, ama Ayrıca hücresel düzeyde ayrıntılı ifade parafin kesit sonra tespit edilebilir.
Introduction
Belirli bir gen ifade desenlerini tanımlamak için muhabir gen işaretleyici olarak kullanımı memeliler Drosophila en önemli olmuştur. Transgenik ve nakavt hayvanların deneylerde, Escherichia coli (e.coli) bakteriyel β-galaktozidaz gen (LacZ) en çok kullanılan1,2,3, biridir 4. β-galaktozidaz (β-gal) tromboksan β-galactosides (laktoz gibi) hidroliz onun bol (glikoz ve galaktoz)5. En sık kullanılan, substrat X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), β-galaktozidaz veren yükselmeye 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole ve galaktoz tarafından hidrolize bir parçalanma olduğunu. İlk bir dimer okside, kullanıldığında potasyum ferri ile kombine- ve ferro-siyanür, karakteristik çözünmez üretir, mavi renk çökelti (Şekil 1)6.
Otuz yıl önce bir muhabir gen kullanılacak LacZ gene başladı7,8. Genellikle, LacZ eklenen aşağı endojen bir organizatörü açık okuma çerçevesi yerine belirli bir INSERT içeren hücreler görselleştirmek için bakteri ve hücre kültür yanı sıra transjenik hayvanlar, endojen bir izleyici kullanılabilmesi için bu yüzden gen ifade desen geliştirme9sırasında. Bu bağlamda, β-galaktozidaz etkinliği görselleştirme kapsamlı Drosophila içinde tek hücrelerden gelişimsel ve hücresel süreçler tüm dokulara anlamak için kullanılmıştır. Drosophila genetik kararlı hatları içinde LacZ değil muhabiri gen içeren değiştirilmiş bir P-öğe yapısı eklenen rasgele genom yerlerde nesil lehine. Böylece, artırıcı unsurların etkisi altında yerleştirildiğinde bu ifadesini birçok genlerin ifade kalıplarının sistematik analizi sırasında son yirmi yılda10izin verdi bir doku belirli şekilde sürücü. Buna ek olarak, LacZ gen ekspresyonu izlemek için transgenik fareler de gen rekombinasyon olaylar Cre-loxP tarafından algılanmasını rekombinasyon ve yerelleştirme chimeric analizlerde mutasyona uğramış embriyonik kök hücre türevleri aracılı kullanılmasına 11, hangi geçici olarak de LacZ ifade belirli dokularda kontrolünü kolaylaştırır. Ayrıca, tüm embriyoların, algılama β-galaktozidaz faaliyetinin uygun gen ekspresyonu zamansal değişiklikleri analiz etmek için farklı gelişim dönemleri arasında gözlenen farklı yoğunluklarda, farklı boyama desenleri neden olabilir 8,12.
Bu makalede, biz bütün Dağı dokusunda fare embriyo erken gelişim aşamalarında boyama gen ekspresyonu ile X-gal görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Biz histochemical bu yöntem doku veya embriyo parafin gömülü sonra bütün Dağı örnekler veya hücresel düzeyde etiketli hücrelerinin doğru algılama iyilik bir son derece hassas ve ucuz teknik mevcut. Yöntemi diğer yöntemleri13ile karşılaştırıldığında en az arka plan ile fare dokusunda boyama doğrudan görüntüleme için sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel prosedürler CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) ve Comunidad Autonoma de Madrid çok az hayvan acı sağlamak için hayvan deneyleri Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
1. embriyo hamile fareler (E12.5 E8.5)'dan gelen topluluğu
- Servikal yerinden çıkması veya CO2 inhalasyon hamile fareler kurban. İlk gün gözlenen vajinal tak olarak embriyonik kabul gün 0,5 (E0.5).
- Fare % 70 etanol ile karın deri temiz ve emici Ped sırtüstü pozisyonda hayvan yatıyordu.
Not: Aşağıdaki adımlarda kısırlık gerekli değildir. - Çimdik ve karın deri fare-diş forseps kullanarak kaldırın.
- Bir kesik deri ve karın duvarı, 2-4 cm dikey olarak cerrahi makas kullanarak karın orta hat üzerinden yapmak.
- Karın maruz ve cerrahi makas ile rahim iç eğim boyunca forseps kesme kan damarları ile anneden rahim boynuzları kaldırmak.
- Ve 10 mL buz gibi 0.01 M fosfat tampon serum fizyolojik pH 7,4 (PBS) içeren buzda bir petri transfer embriyoların dizi çıkarın.
- Dikkatlice dışarı embriyolar rahim Petri kabına 10 mL taze buz gibi PBS ile bir stereomicroscope altında gelen incelemek. Kas duvar amniyotik kese ortaya çıkarmak için saatçilik forseps ile kavramak ve amniyotik membran kapalı embriyo ve forseps ipuçlarını kullanarak sarısı sac kaldırmak için gözyaşı.
- (E12.5 E8.5)'dan erken aşamalarında hamile fareler littermate embriyo toplamak (Şekil 2).
- Eğri forseps kullanarak 10 mL soğuk 1 x PBS ile taze yemek için embriyo transfer veya (E8.5-E9.5) çok küçük embriyolar için plastik transfer pipetler embriyo zarar vermeden örnekleri toplamak için kullanın.
- Fiksasyonun başlamadan önce embriyonik bir örnek bir microcentrifuge tüp Genotipleme için embriyo küçük bir parça kesme veya amniyotik membran (E9.5 E8.5)'dan küçük embriyo saatçilik forseps ile alarak getirin.
Not: LacZ Genotipleme polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) astar tarafından belirlenir: ileri, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´; tersine, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´.
2. fare embriyo fiksasyonu
- Her embriyo ile bir yuvarlak taban 1 mL 1 x PBS içeren 2 mL microcentrifuge tüp içine aktarın.
Not: bütün adımları Bu tüpler protokolünde ajitasyon ile çalışırken bir shaker kullanarak gerçekleştirin. - Embriyo için oda sıcaklığında 1 dk içinde 1 x PBS kalan kan ortadan kaldırmak için yıkayın. Kullanım plastik transfer pipetler tüpler sıvılarda değiştirmek için.
- Embriyo %0.125 oxazolidin buz üzerinde 1 mL fix.
Not: Fiksasyon zaman embriyo boyutuna bağlıdır: E8.5-E9.5 embriyo, 30 dk E10.5 embriyo ve E12.5 embriyo için 1 h 20 min. - Sabitleştirici kaldırmak ve örnek için X-gal boyama işleme önce embriyolardan 1 x PBS oda sıcaklığında 10 dakika için iki kere yıkayın.
3. bütün Dağı β-galaktozidaz Histochemistry fare embriyolar
- Hazırlama X-Gal durulama tampon ve X-Gal boyama yordamına başlamadan önce çözüm ( Tablo 1 ve Tablo reçetesibakınız). Vahşi-tipi (WT) littermate embriyo için enzimatik reaksiyon negatif denetimleri kullanın.
- X-Gal durulama arabelleği (Şekil 2) Oda sıcaklığında 10 dakika için embriyo kuluçkaya.
- X-Gal boyama çözümde embriyo ışıktan korunan 37 ° C'de bir gecede 2 h kuluçkaya. Mavi boyama yeterli yoğunluğu olmadan arka planda embriyo görülmektedir kadar renk reaksiyonu sürekli yayın yolu ile diseksiyon mikroskop monitör. 8 ve 9 arka plan bütün boyama sırasında azaltmak için arasında çözüm pH tutun. Boyama çözüm ışığı başlarsa, enzimatik reaksiyon genişletmek için taze substrat çözeltisi ile değiştirin.
- Bir microcentrifuge tüp ile 1 mL 1 x PBS oda sıcaklığında her 10 min için iki kez embriyoların yıkayarak istenen sinyal alındığında tepki bırak.
- 4 ° C'de bir gecede 1 h için 1 mL % 4 paraformaldehyde (PFA), yeniden düzeltmek için lekeli embriyo transferi
Not: Embriyo %4 oranında saklanabilir PFA/PBS için daha uzun süreleri 4 ° C'de veya kesit için hemen işlenebilir. Bu son fiksasyon boyama desen uzun vadeli korunması için çok önemli bir adımdır. - Embriyolardan 1 mL 1 x PBS oda sıcaklığında 10 dakika için iki kere yıkayın.
- Seçenek 1: embriyo daldırma çözümleri ile gliserol (1 x PBS içinde % 20, % 40, % 60 ve % 80 gliserol) her çözümde oda sıcaklığında 1 h için konsantrasyonları artan bir dizi tarafından temizleyin.
Not: embriyo için daha uzun zaman % 80 gliserol içinde yıkayın, hatta günler kadar temizlenir ve sonra onları bu adımda (Şekil 2) 4 ° C'de % 80 gliserol saklayın. Sodyum azid ora kristal thymol, çok küçük bir miktar 4 ° C'de gliserol veya 1 x saklanan embriyolar ekleme PBS küf gelişimi önlemek için önerilir. Takas sonra bütün Dağı embriyo (adım 4) fotoğraf çekmek için kullanılabilir. - Seçenek 2: gömme ve bir microtome (Şekil 2) kullanarak kesit parafin için embriyo işlemek. Tüm lekeli embriyo ifade desende (adım 4 ve 5) kesit önce belge.
4. fotoğraf bütün Dağı embriyolar
- Bütün Dağı kesit önce embriyo lekeli fotoğraf, onları bir tabanı ile hazırlanmış Petri kabına aktarmak için 1 x PBS % 1-2 özel katılaşmış.
- Dehidratasyon ve yansıma sıvı fotoğraf çekimi sırasında önlemek için tamamen 10 mL 1 x PBS özel kaplamalı yemekler ile embriyo kapsar.
- 1 x PBS forseps kullanarak dalmış embriyo yönlendirmek. (E10.5-E12.5) büyük embriyolar için forseps yerleştirin ve numune içindeki farklı açılarda konumlandırın ve serbest dalgalanma fotoğraf sırasında önlemek için ile özel küçük bir delik açmak.
- Çanak iletilen (altında sahne) ışık kullanarak stereomicroscope sahnede yerleştirin. 'Karanlık-alanın' ve 'alan parlak' ayarlamaları istenen aydınlatma Fotoğrafçılık sırasında ayarlamak ve örnek kalınlığı en iyi duruma getirmek için arasında değiştirin.
Not: sonraki aşamada embriyolar için fiber optik aydınlatma embriyo yüzeyi yansıması önlemek için kullanın. Temizlenen embriyo fotoğrafı çekerken, aynı yordamı izleyin ama bunları % 100 gliserol içeren bir Petri kabına aktarmak ve onları koltuğunuza.
5. parafin gömme ve X-gal kesit embriyo lekeli
- Parafin mumu katıştırma
- X-gal embriyo 4 ° c (adım 3.5) lekeli kaldırmak ve sabitleştirici fazlalığı ortadan kaldırmak için üç kez 1 mL 1 x PBS ile yıkayın.
- Her embriyo forseps kullanarak bir Histoloji kaset aktarın.
- Embriyo bir ölçek içeren kaset yerleştirin ve sonra oda sıcaklığında kademeli etanol yoluyla geçirerek kurutmak: % 70 etanol, bir kez 30 dakika; % 96 etanol, 30 dk için iki kez; % 100 etanol, 30 dk için iki kez.
Not: Embriyo dehidratasyon işlemine başlamadan kadar belirsiz bir kez 4 ° C'de % 70 etanol içinde depolanabilir. - İsopropanol oda sıcaklığında 30 dakika tüm kasete kuluçkaya.
- Forseps kullanarak, önceden ısıtılmış isopropanol içeren yalak boyama bir cam kasetleri aktarmak ve 60 ° c için 30 dk fırında bırakın.
- Yeni bir bardakta olsun % 50 isopropanol karışımı içeren yalak boyama kaset yerleştirin / % 50 Parafin balmumu erimiş ve 4 h 60 ° C fırında bırakın.
- Kaset erimiş Parafin balmumu, 60 ° c 30 dk iki değişiklik ile embriyo ile kuluçkaya.
- Son parafin yıkama sonunda, kaset açın ve örnek bir stereomicroscope altında görüntülemek için kalıp katıştırma ayrı bir doku her embriyo transfer.
- 60 ° C'de erimiş parafin mum ile iyi doldurun Isıtmalı forseps erimiş mum tutmak ve dikkatle kalıp embriyo yönlendirmek için kullanın.
Not: Örnek uygun yönlendirmeyi istenen düzlemde embriyo kesit için kritik bir adımdır. - Önce kalıp içinde parafin katılaşır, blok üst kapağı olmadan bir kaset yerleştirin ve erimiş parafin mum ile doldurun. Gecede oda sıcaklığında katılaşmış kadar kalan balmumu soğumaya bırakın.
- Parafin tamamen katılaşmış bir kez sağlam blok kalıptan çıkarın ve parafin blok oda sıcaklığında veya 4 ° c14kesit kadar saklayın.
- Parafin kesit
- Microtome üzerinde bıçak yönlendirmek ve kalınlığı 5-7 µm kadar ayarla. 5.2.2. cool parafin blok buz üzerinde ve bir küp veya bir piramit üretmek için trim.
- Blok microtome sahibine erimiş mum küçük bir miktar kullanarak ekleyin.
- En uygun kesme blok gelecek şekilde yönlendirin. Bölüm parafin blok standart microtome kullanarak oda sıcaklığında 5-7 µm kalınlığında dilimler halinde.
- İyi bir fırça kullanarak, bir su banyosu manipüle ve dilim seçmek için oda sıcaklığında bölümleri yerleştirin.
- Mikroskop kaydıraklı su banyosu bölümlerden almak ve germe için 42 ° c su banyosu içine aktarabilirsiniz.
- Su banyosundan bölümleri kaldır ve yavaşça yapışma mikroskop slaytlar koyun.
- Slaytlar 37 ° C'de bölümleri tamamen bağlı kalmak izin vermek için bir gecede de fırında kuru, aksi takdirde, onlar boyama sırasında kayıp alabilirsiniz.
Not: 4 ° C'de slaytları yordamlar boyama başlangıç kadar depolama.
- Deparaffinization ve X-Gal-lekeli parafin bölümlerini Counterstaining
- Bir fırın daha sıvı Parafin balmumu yapmak en az 45 dakika için 60 ° C'de mikroskop-slayt tepside slaytları koymak.
- Slaytlar bir raf üzerine transfer edecek ve yemekleri boyama cam aşağıdaki adımları gerçekleştirmek için: konsantrasyonları tam parafin kaldırma ve dokuları hidrasyon için azalan alkoller içeren boyama kavanoz rafa batırılma: isopropanol 5 min için 60 ° C; isopropanol 3 dk için; % 100 etanol 2 min için; 1 dk. için % 96 etanol; % 70 etanol için oda sıcaklığında 1 dak.
- İki kez yok alkol artıkları olduğundan emin olmak için distile su bölümlerde durulayın.
- Bölümleri (Örneğin nükleer hızındaki kırmızı çözüm) (Şekil 2) Oda sıcaklığında (genellikle 3-8 dk arasında) 5 min için bir leke ile counterstain.
Not: Bu boyama bölümleri genel doku yapısı ortaya çıkarmak için yardımcı olur. - Boyama sonra slaytlar 1 dk. için distile suda yıkayın ve mikroskobu boyama bölümüne bakın.
Not: istediğiniz boyama çok zayıf ise, counterstain daha uzun süre bölümleri. - Etanol konsantrasyonları artan ile aşağıdaki serisi bölümlerde kurutmak: iki yıkar % 95 etanol için 2 dk içinde iki % 100 etanol için 2 dk içinde yıkar ve mavi eriterek önlemek için renk precipitates, ksilen içinde sadece bir hızlı yıkama.
- Raf tek tek slaytları kaldırmak ve bir kağıt parçası koyun. Sonra mount ve coverslip her bir sentetik, kalıcı montaj orta kullanarak kaydırın.
Not: Ksilen rahatsız edici ve insan sağlığı ve Sucul organizmalar için zararlı olan buharlar yanıcı bir üründür. Bu bir başlık içinde manipüle edilebilir gerekir ve uygun koruyucu ekipman kullanımı gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İşte tüm fare embriyo (resim 1 ve Şekil 2) substrat olarak X-gal kullanarak β-galaktozidaz histochemical reaksiyon için standart protokol uygulanmasının sonuçları göstermektedir. Bu iletişim kuralını kullanarak, biz membran tipi 4-Matriks metalloproteinaz (Mt4-mmp) ifade farklı embriyonik gelişim dönemleri (E9.5, E11.5 ve E12.5) de incelemek LacZ muhabir endojen kontrolü altında hızlı Mt4 mmp mutant fare kullanarak MT4 mmp organizatörü (Şekil 3, Şekil 4ve Şekil 5)9,15. MT4 mmp glycophosphatidyl inositol çapa (GPI) aracılığıyla hücre zarı için gergin bir endopeptidase var. MT4 mmp tespit birkaç insan kanser ve tümör büyüme ilerleme ile ilgili olsa da, proteolitik faaliyete karşı hücre dışı matriks bileşenleri hakkında bilgi bugüne kadar çok sınırlıdır. Ayrıca, hemen hemen hiçbir şey rol ve Mt4 mmp ifade sırasında embriyonik geliştirme9,16bildirilmiştir.
Vahşi türü (WT), Mt4 mmpLacZ / + Heterozigoz (HT) ve nakavt (KO) littermate embriyo için X-gal boyama Protokolü (Şekil 2) paralel olarak işlenir. Birden çok denetimi yordamı özgüllük doğrulamak için boyama işlemi sırasında dahil edilmelidir. Bu nedenle, WT embriyo negatif denetim histochemical reaksiyon için kullanılır ve non-spesifik X-gal etiketleme izlemek için hizmet (bkz. Şekil 3A-B ve Şekil 4A-C). Ayrıca, belirsiz arka plan önlemek için X-Gal boyama çözüm pH 8 ve 9 bütün boyama boyunca arasında muhafaza edilmelidir. Şekil 3Eiçinde β-gal-pozitif hücreler içinde bütün Dağı HT embriyo somites ve intersomitic damarlara E9.5 aşamada görüntülenir. Ancak, tam yerini lekeli hücreleri raporlamak için embriyo kesit gereklidir mikroskop altında görselleştirmek için gen ekspresyonu hücresel çözünürlükte doku bölümlerde bildirdi. Bu durumda, LacZ pozitif hücre doku bölümlerde (oklar Şekil 3F-S) somites, dorsal aort, intersomitic damarlara gibi perineural vasküler pleksus bulunur. Bu sonuçlar Mt4-mmp için bu tekniği kolayca tekrarlanabilir ve güvenilir olduğunu belirten bu fare embriyonik aşamada9' da bildirilen ifade deseni ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Beklendiği gibi β-gal faaliyet düzeylerindeki KO embriyo iki bol-in LacZ muhabir gen (Şekil 3I-L) varlığı nedeniyle HT ile karşılaştırıldığında daha yüksek. Ancak, sadece HT LacZ / + embriyo gen ifade desen çalışmalarında analiz ve KO doku kavramının bir kanıtı olarak hedeflenen gen ilgi eksikliği nedeniyle beri yönteminin fizibilite göstermek için kullanılan, β-gal pozitif hücrelerinin olabilir normal olmayan bir şekilde yer alan ikincisi.
Bu iletişim kuralı gerçekleştirirken, (E12.5 E10.5)'dan büyük embriyo yarı saydam değildir ve bu nedenle, en görünür X-gal lekeli bölgeler yüzeye yakın olanları vardır. Böylece, bu yöntem için alternatif bir adım embriyo yıkar gliserol konsantrasyonları artan çözümlerinde tarafından temizlemektir. Şekil 4, X-gal boyama koruyarak LacZ lekeli E12.5 embriyo netleşti, bize daha derin fotoğraf izin stereomicroscope embriyo bölgelerinde lekeli. Önceden bildirildiği gibi bu embriyonik aşamada, etiketleme, beyin, bacaklarda, vibrissa folikül ve9kuyruk ucu farklı bölgelerinde lokalize. Ancak, Eğer bir hücresel bir çözünürlük elde etmek dilek, embriyo olmalı parafin içinde gömülü, kesitli ve mikroskobik incelenmesi.
Şekil 5' te, immünhistokimya anti-β-gal antikorlar ile muhabir LacZ boyama yoluyla Mt4 mmp ifade gözlenen onaylamak için kullanıldı. Böylece, β-gal-pozitif hücreler motoneurons fare omurilik E11.5, havuzdaki her iki yaklaşımın rapor burada (Şekil 5A, B) iletişim kuralı özgüllük doğrulayan kullanarak tespit edildi.
Resim 1 . E. coli LacZ muhabir gen β-galaktozidaz ve bu enzim tarafından katalize histochemical reaksiyon için kodlama şematik. Geleneksel boyama β-galaktozidaz substrat 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) için 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole hidrolize. Daha sonra bu orta, dimerization ve nihai mavi renkli ürün (5, 5'-dibromo-4, 4'-dichloro Indigo) oluşumuna yol açan okside. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . β-galaktozidaz aktivite tespiti için standart protokol ana adımları gösteren diyagram. Fare embriyo toplanan ve bütün mount X-gal boyama için işlenir. Histochemical boyama protokole göre gerçekleştirmesinden sonra bütün Dağı embriyo (seçenek 1) gliserol konsantrasyonları artan çözümlerinde yıkama ile temizlenir ve daha sonra bir stereomicroscope fotoğrafı veya (seçenek 2) gömülü olabilir Parafin, kesitli ve counterstained. Kısaltmalar: RT, oda sıcaklığında. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . X-gal E9.5 WT ve Mt4 mmp boyamaLacZ / + bütün-mount embriyo ve doku bölümler. Standart X-gal histochemical tahlil kullanarak, transgenik embriyo Mt4 mmp organizatörü kontrol altında LacZ gen taşıyan β-gal etkinlik için analiz edildi. WT(a), HT (E) ve (ben) KO E9.5 bütün Dağı embriyo β-galaktozidaz ifade tespiti için işlendi. Spinal kord düzeyinde bu embriyo elde edilen parafin bölümler hücresel çözünürlükte boyama görselleştirme olanak sağlar. Beklendiği gibi β-gal pozitif hücrelerinin yoktun (etiketleme şiddeti ile karşılaştırıldığında HT doku bölümler (F-H) KO (J-L) daha yüksek ikenB-D), WT bölümlerde. Kesitleri nöral tüp yoluyla gelişmekte olan somites, dorsal aort ve perineural vasküler pleksus β-gal faaliyet göstermektedir. Kısaltmalar: da, dorsal aort; FLB, forelimb bud; h, kalp; m, mesencephalon; NT, notochord; OTV ve vezikül; ov, optik vezikül; PNVP, perineural vasküler pleksus; s, somite; t, telencephalon. Ölçek çubukları: 500 mikron (A, E, ı); 100 mikron (B, F, J); 50 mikron (C, G, K); 20 mikron (D, H, M). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Photomicrographs WT ve HT X-gal lekeli fare embriyolar, E12.5 (A, D) önce ve sonra (B, C, E, F) artan gliserol yıkama ile takas. Etiketleme algılandı beklendiği gibi WT embriyo hiçbir gazeteci LacZ ifade (A-C) bacaklarda (beyaz ok uçları), vibrissa (beyaz ok) folikül, kuyruk (siyah ok) ucu ve Mt4 mmp beyin primordium gösterirkenLacZ / + Bu embriyolar (D-F)9sahne. (E, F) Gliserol takas sonra embriyo yarı saydam oldu ve etiketleme mesencephalon ve telencephalon (FA beyaz ok) gösterildiği gibi daha kolay, embriyo, daha derin bölgelerinde görüntülenmeyecektir olabilir. Ölçek çubuğu: 1 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . Histochemical ve immunohistokimyasal olarak algılanması β-galaktozidaz. (A)X-gal (mavi olarak) boyama Mt4-mmp parafin bölümünde omurilik motoneurons havuzunda ifade E11.5 embriyonik aşamada ortaya koymaktadır. (B) immünhistokimya anti-β-gal antikorlar (kırmızılı) ile ifade Mt4 mmp spinal kord motoneurons içinde aynı embriyonik aşamada cryostat bölümlerde doğruladı. Kısaltmalar: fp, zemin plakası; MN, motoneurons; Ölçek çubuğu: 100 mikron. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tablo 1. Yemek tarifleri ve bu iletişim kuralı için gerekli çözümler. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
E. coli LacZ gene yaygın gen ifade kalıplarının çalışmalarda bir muhabir olarak kendi yüksek hassasiyet ve algılama kolaylığı nedeniyle kullanılmıştır. Mevcut Protokolü β-gal ifade yanı sıra ucuz gerçekleştirmek hızlı ve kolay bir enzimatik reaksiyon dayalı tespit için klasik bir yöntem açıklanır. Bu yöntem bütün Dağı embriyolar, sağlam organları, cryostat doku bölümleri veya kültürlü hücreler büyük değişiklik yapmadan da uygulanabilir.
Bu yöntemin doğru uygulama içinde bir boyama sağlam ve yorumlanabilir sonuçlanır. Ancak, aynı zamanda yapılan denetimler ve sonraki doğrulama adımları son derece tavsiye edilir. Bu bağlamda, mevcut Protokolü paralel non-spesifik X-gal boyama izlemek için hizmet negatif denetimleri kullanılan vahşi türü littermate embriyo olarak yapılır. Ayrıca, ifade elde edilen veriler β-gal boyama kullanarak western-blot ve kantitatif PCR (Q-PCR) tarafından onaylandığında analiz veya β-gal aracılığıyla diğer antikorlar ile kombine immünhistokimya (Şekil 5), aynı zamanda kimliği sağlar belirli hücre tipleri LacZ9ifade. Fiksasyon adımları β-galaktozidaz enzimatik aktivite korumak için ve arka plan boyama sırasında en aza indirmek için göz önüne alınması gerekir. Böylece, embriyo paraformaldehyde fiksasyon17ile karşılaştırıldığında en tutarlı ve güvenilir sonuçlar verir oxazolidin sabit gerekir. Ayrıca, fiksasyon zaman önemlidir ve aşırı fiksasyon β-galaktozidaz etkinliğini azaltmak bu yana her embriyonik evre için ampirik olarak tespit edilmelidir. Bu bağlamda, Bütün Dağı embriyo daldırma veya perfüzyon embriyonik evre ve boyutu. bağlı olarak sabit olabilir Böylece, transcardial perfüzyon embriyo E14.5 büyük ve postnatal numuneler sabitleştirici örnek tüm bölgeler ulaştığından emin olmak için tavsiye edilir. (Dan E8.5 E12.5 kadar) daha küçük embriyo daldırma tarafından sabit ve doğrudan toto için X-gal işlenen boyama (Şekil 2). Söylenmesi bu X-gal fare embriyo E14.5 bütün Dağı gerçekleştirilebilir daha genç boyama. Bu durumda, yüzeye yakın lekeli hücreleri kolayca β-gal boyama yoluyla tespit edilir. Yine de, daha derin etiketleme bulanık görünür veya hatta boya doku, özellikle büyük embriyo nüfuz etmez oluşabilir. Bu durumda, her iki organ veya yetişkin fareler doku disseke, X-gal lekeli ve bir stereomicroscope altında görüntülenir. Yine de, parça ve mikroskobik inceleme ilgi lekeli doku, daha uygun (Şekil 2) nedir.
Protokolün verimlilik rağmen bütün embriyo ve algılama boyama zahmetli olabilir. Örnek, böbrek, testis, salgı bezleri için epididim ve gastrointestinal sistem arka plan etkinliği nedeniyle sonuçların yorumlanması engelleyebilir endojen asidik β-galaktozidaz18 yüksek miktarda içerir. Bu nedenle, histochemical reaksiyon koşullarında E. coli β-galaktozidaz 7,3 bir optimum pH olduğundan, boyama boyunca hafifçe alkali pH (pH 8-9) yapılmalıdır. Bu arka plan önemli ölçüde azaltmak ve bakteriyel β-galaktozidaz etkinlik19,20,21,22iyilik için yardımcı olacaktır. Ayrıca uzun kez boyama çözüm boyama, artan bir arka plan lehine X-gal asitleştirme içinde neden olabilir dikkat edilmelidir. Ayrıca, β-galaktozidaz etkinlik inkübasyon sıcaklığı 50 ° C üzerindeki ama 42 ° c altında altında kaybolur Elimizde, kuluçka X-gal substrat ile daha iyi gecede 37 ° C'de terk ettiğinde çalışır Boyama sonra ve sonrası fiksasyon adım önce dikkatli bir şekilde ve kısa zamanda precipitates doku bölümünde tevdi histochemical reaksiyon gelen ortadan kaldırmak tüm X-gal tepki malzeme yıkayın önemlidir.
Burada gösterildiği gibi gliserol embriyo takas doku yarı saydam X-gal koruyarak boyama ve doku histolojisi yapmak için önemlidir. Bu nedenle, embriyoların ortaya çıkıyor ve etiketleme stereomicroscope altında derin bölgelerde görüntülenir. Ancak, lekeli hücreleri tam yerini analiz için numune kesit gereklidir ve bu nedenle, takas gerekli değildir. Bu durumda, aşağıdaki önerileri yönteminde belirtilen tarafından örnekleri olmak dikkatli bir şekilde alkol katıştırılmış ve kesitli. Gömme işlemi sırasında etanol doku isopropanol-parafin bir karışımı olarak dalmış gerekiyor susuz. Isopropanol etanol örnek değiştirme lehine ve parafin23' te katıştırma doku kolaylaştırmak için kullanılır. Bazı protokoller, ksilen isopropanol yerine aynı amaçla kullanılır. Yine de, ksilen kullanımı karşı isopropanol, büzülme ve örnek bir yanıcı ve tahriş edici ürün25olarak doku lipidler24 ve toksikolojik onun profil kaldırılması nedeniyle sertliği gibi dezavantajları sunar. Ksilen yanı sıra mükemmel doku yapısı koruma26toksisitesi takas hızlı izin beri turuncu yağ bazlı takas ajanlar ksilen en güvenli alternatifler bulunmaktadır. X-gal boyama diffüz ve19kayıp beri Ayrıca, ksilen kullanılıyorsa, bu protokolün bir parçası en yüksek seviyede azaltılmalıdır. Sonra kesit, boyalar ile counterstaining (Örneğin nükleer hızlı kırmızı) hücreleri ifade histolojik kimlik kolaylaştırmak için tavsiye edilir. Bu boyama hızlı, sadece bir adım, gerektiren bir işlemdir ve iyi kontrast mavi renkli X-gal çökelti ile pembe görünümünü sağlar. Ancak, bu counterstaining sadece sulu montaj medya (yani DPX) ile kullanım için uygundur.
Bu klasik yöntem β-galaktozidaz etkinlik, algılama X-gal ile potasyum ferro - birlikte beri için uygundur ve ferricyanide bir değil fade karakteristik mavi çökelti veya çamaşır suyu kolayca üreten ve su kuyusu-yapılı, olabilir Hatta diseksiyon mikroskop altında algıladı. Diğer değişiklikler özgün iletişim kuralı vardır. Somon-gal (6-Chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), eflatun-gal (5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) veya Bluo-gal (5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside)13,19 gibi kullanılabilir yüzeylerde kullanarak , veya yerine klasik X-gal/FeCN için Tetrazolium tuzları hassasiyeti algılama13,19büyük ölçüde geliştirebilirsiniz. Bu özellikle yüksek hassasiyet algılama protein ve mRNA malzeme düzeylerinin düşük ifade izin vermek için önerilir. Ancak, çok uzun süre kullanıldığında, bu yordamlardan birini yüksek arka plan düzeylere neden olabilir ve bu yüzden dikkatli yönetim koşulları her zaman tavsiye edilir, özellikle göz önüne alındığında bu uzun süreli kuluçka nedeniyle belirsiz boyama dönemleri kolaylaştırabilir endojen β-galaktozidaz etkinlik13,27. İkincisi ile ilgili olarak, her zaman teknik güvenilirliği optimize etmek ve tuzaklardan kaçınmak için ferrik Potasyum tuzları kullanmak için tavsiye edilir.
Bu yöntemin önemli bir sınırlama klasik X-gal boyama yordam kolayca ışık mikroskobu tarafından tespit edilebilir, ancak ortak yerelleştirme çalışmalar floresan veya confocal mikroskobu doku tarafından izin vermez bir çözünmez mavi çökelti üretir olduğunu bölümler. Bu sınırlamayı aşmak için bir şekilde β-gal karşı antikor kullanmak olurdu özel hücre türü için immunodetection ile birlikte (bkz Şekil 5). Ancak, ifade düzeyleri düşük veya yüksek arka, immunolabeling tespit etmek zor yapabilirsiniz olup muhabir gen belirli bir hücre ifade edilir. Özellikle, yeni bir teknik tarafından X-gal acele28üretilen floresans emisyon dayalı yüksek kaliteli confocal görüntüler elde etmek için rapor edildi. Ayrıca, bu yöntem ayirt ile uyumludur ve X-gal pozitif hücrelerinin28açıkça tanımlayabilirsiniz. LacZ gen gibi enzimatik gazetecilere ifadenin seviyeleri özellikle düşükse hangi etiketleme zaman dikkat çekicidir floresan olanlardan daha daha duyarlı olmak avantaj sunuyor. Bu bağlamda, mevcut teknik mikroRNA29bu nedenle hem nitel değerlendirme ifade kalıplarının ve miktar ifade düzeylerinin erişimine izin verme, tespiti için ideal kanıtlanmıştır. Çift Kişilik boyama endojen genlerin ifade deseni aynı örnek içinde β-gal etkinliğini izleme sırasında incelemek için çok yararlı bilgiler sağlayabilir in situ hibridizasyon teknikleri ile β-gal etkinlik ve mRNA olup olmadığını belirlemek için kullanılır 30. Bununla birlikte, her iki β-gal leke ve in situ hibridizasyon algılama tepkiler kişilik boyama sırasında renk uyumsuzluğu görüntüleyebilir. S-gal gibi daha uygun bir substrat seçme içinde özellikle30en iyi duruma getirilmiş yöntemleri önerilir.
Bu çok yönlü yöntemi yoğun gen işlev bağlamında gelişim biyolojisi, eğitim için kullanılmıştır. Böylece, LacZ gen gen ifade desenleri analiz için embriyonik gelişim sırasında hedeflenen gen locus çalıyor tarafından kabul edilmiştir. LacZ faiz31 organizatörü transkripsiyon etkinliği bilgilerinizi CIS etkili düzenleyici elemanlarının (arttırıcılar) embriyo, kısıtlı bölgelere gen ekspresyonu yönetmenlik dahil çalışmak için ortak bir muhabir gen yoktur ,32,33. Ayrıca, bu sık sık Genetik rekombinasyon olayları algılama içinde Cre-aracılı rekombinasyon loxP sitelerin tarafından embriyonik kök hücre türevleri hücre kader eşleme deneyler veya hücre nakli tespiti için özellikle yararlı olan kullanılır. Embriyonik kök hücre, gen-tuzak mutagenesis kesilmiş proteinler organizatörü etkinlik fizyolojik şartlarda34altında değerlendirilmesi izni β-gal için erimiş üretir. Bütün bu yaklaşımlar için37,38, Xenopus39 transjenik hayvanlar LacZ taşıyan ve bakteriyel β-galaktozidaz ifade sıçan35,36, oluşturdu tavuk veya zebra balığı40. Şimdiye kadar bu teknik Drosophila içinde gen ekspresyonu görselleştirme dağınık şekilde ve geçici nedeniyle indüklenebilir gen ifade sistemleri ve doku ve hücre özgü p-LacZ işaretçisi satırları41 kullanılabilirliğini artırmak için kullanılmıştır ,10. Bunların dışında birçok uygulama transgenik nakavt hayvanlar, içeren LacZ muhabir gen bütün dokularda oluşturulduğunu dikkati çekiyor gibi Biyomedikal araştırma hastalığında genlerin rol tahmin etmek için hücreler kültürlü. İkinci bir ilgili örnek yaşlanma süreci ile ilgili yanıt için stres, tümör bastırma veya geliştirme çalışmadır. Senescent hücreler in situ ve in vivo karakteristik overexpression ve endojen lizozomal beta galaktozidaz42,43birikimi nedeniyle tespit etmek kolaydır. Bu nedenle, β-galaktozidaz44senescent bir biyomarker yılında niceliksel deneyleri kültürlü kanser hücreleri gibi kullanılır.
Özetle, β-galactoside faaliyet fare embriyonik doku kolay algılama kolaylaştırmak için mümkün ve en iyi duruma getirilmiş bir yordam açıklanmaktadır. Mevcut yöntemi değişiklikleri seçili doku ve kullanılan substrat dayalı sağlar. Dolayısıyla, bu çok yönlü ve maliyet-etkin yöntem uygun denetimleri ile istihdam özellikle ince histolojik bölümlerinde yanı sıra tüm fare embriyo ile kullanım için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip mali niyetimiz yok bildirin.
Acknowledgments
Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) histopatolojik hizmet onların teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Biz de Dr. Motoharu SEIKI nazikçe sağlayan Mt4 mmpLacZ fareler için ve Dr. Alicia G. Arroyo projemize destek için ve el yazması onun eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Peter Bonney Bu makale redaksiyon için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Universidad Europea de Madrid tarafından C.S.C. için layık bir hibe (# 2017UEM01) aracılığıyla destek verdi
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
| 99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
| 99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
| Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
| Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
| Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
| Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
| Microscope Cover Glasses 24x60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
| Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
| Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
| Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
| Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
| Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
| Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
| Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
| Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
| pHmeter | Crison | Basic 20 | |
| Optic fiber | Optech | PL2000 |
References
- Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
- Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182 (1994).
- Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
- Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
- Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
- Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
- Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
- Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767 (2017).
- Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux's Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
- Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
- Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
- Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
- Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797 (2011).
- Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
- Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
- Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
- Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
- Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
- Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
- Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937 (2013).
- Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
- Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
- Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
- Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
- Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
- Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
- Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
- Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
- Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
- Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
- Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
