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Neuroscience

स्वस्थ मस्तिष्क-पिट्यूटरी Teleost मछली में पिट्यूटरी कोशिकाओं की Electrophysiological जांच के लिए स्लाइस

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/57790
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences
* These authors contributed equally

Summary

लेख व्यवहार्य मस्तिष्क पिट्यूटरी ऊतक स्लाइस बनाने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन, teleost मछली medaka का उपयोग (Oryzias latipes), पिट्यूटरी पैच का उपयोग कर कोशिकाओं के electrophysiological रिकॉर्डिंग के द्वारा पीछा-clamping तकनीक के साथ छिद्रित पैच विंयास ।

Abstract

पिट्यूटरी कोशिकाओं की Electrophysiological जांच कई हड्डीवाला प्रजातियों में आयोजित किया गया है, लेकिन teleost मछली में बहुत कुछ । इन के अलावा, स्पष्ट बहुमत असंबद्ध प्राथमिक कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया है । कैसे teleost पिट्यूटरी कोशिकाओं के बारे में हमारी समझ में सुधार करने के लिए, एक अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक वातावरण में व्यवहार, इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कैसे व्यवहार्य मस्तिष्क पिट्यूटरी स्लाइसें छोटे मीठे पानी मछली medaka (Oryzias latipes) का उपयोग कर तैयार करने के लिए. मस्तिष्क पिट्यूटरी स्लाइसिंग बनाना, पीएच और सभी समाधान के परासरणीयता 25 से 28 डिग्री सेल्सियस पर रहने वाले मीठे पानी में मछली के शरीर के तरल पदार्थ में पाया मूल्यों के लिए समायोजित किया गया । टुकड़ा तैयारी के बाद, प्रोटोकॉल दर्शाता है कैसे electrophysiological छिद्रित पूरे सेल पैच-दबाना तकनीक का उपयोग कर रिकॉर्डिंग का संचालन करने के लिए । पैच-दबाना तकनीक अभूतपूर्व लौकिक संकल्प और संवेदनशीलता के साथ एक शक्तिशाली उपकरण है, एक आयन चैनलों के लिए नीचे बरकरार पूरे कोशिकाओं से बिजली के गुणों की जांच की अनुमति । छिद्रित पैच यह intracellular पर्यावरण पैच पिपेट इलेक्ट्रोड समाधान द्वारा पतला किया जा रहा से cytosol में नियामक तत्वों को रोकने बरकरार रहता है कि में अद्वितीय है. इसके विपरीत, जब पारंपरिक पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्रदर्शन, यह है कि medaka पिट्यूटरी कोशिकाओं को जल्दी से कार्रवाई की क्षमता को आग की क्षमता खो देखा गया था । विभिंन वेध उपलब्ध तकनीक के अलावा, इस प्रोटोकॉल को दर्शाता है कि कैसे पैच फंजीसाइड Amphotericin बी का उपयोग कर झिल्ली के छिद्र को प्राप्त करने के लिए ।

Introduction

पिट्यूटरी hypothalamus और ऑप्टिक chiasm के पीछे के नीचे स्थित रीढ़ में एक प्रमुख अंत-स्रावी अंग है. यह उत्पादन और विशिष्ट कोशिका प्रकार से छह से आठ हार्मोन स्रावित करता है । पिट्यूटरी हार्मोन मस्तिष्क और परिधीय अंगों के बीच एक मध्यवर्ती का गठन और विकास, प्रजनन सहित आवश्यक शारीरिक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला ड्राइव, और homeostasis के विनियमन. न्यूरॉन्स के समान, अंत में पिट्यूटरी की कोशिकाओं को कार्रवाई क्षमता को सहज रूप से आग की क्षमता के साथ विद्युत उत्तेजित कर रहे हैं 1. इन कार्रवाई क्षमता की भूमिका कक्ष निर्भर है । स्तनधारी पिट्यूटरी के कई सेल प्रकार में, कार्रवाई की क्षमता intracellular Ca2 + पर्याप्त रूप से हार्मोन 2की एक निरंतर रिलीज के लिए तरक्की कर सकते हैं । इसके अलावा, पिट्यूटरी दोनों stimulatory और निरोधात्मक जानकारी मस्तिष्क कि कोशिकाओं 3,4,5,6की झिल्ली की क्षमता को प्रभावित करता है । आमतौर पर, stimulatory इनपुट उत्तेजित बढ़ जाती है और अक्सर 2 सीए की रिहाई शामिल है+ intracellular स्टोर से और साथ ही बढ़ फायरिंग आवृत्ति 7। समझ कैसे सेल आयन चैनल संरचना का उपयोग करता है और मस्तिष्क से इन इनपुट संकेतों के लिए अनुकूल है हार्मोन संश्लेषण और रिहाई को समझने के लिए महत्वपूर्ण है.

पैच-दबाना तकनीक देर से 1970 के दशक में Sakmann और Neher द्वारा विकसित किया गया था 8,9,10 और आगे Hamill द्वारा सुधार 11, और कोशिकाओं के electrophysiological गुणों की विस्तृत जांच की अनुमति देता है एकल आयन चैनलों के लिए नीचे । इसके अलावा, तकनीक दोनों वर्तमान और वोल्टेज का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । आज, पैच-clamping सेल के electrophysiological गुणों को मापने के लिए सोने के मानक है । तंग सील पैच-दबाना तकनीक के चार प्रमुख विन्यास 11विकसित किया गया है; सेल-संलग्न, अंदर-बाहर, बाहर बाहर, और पूरे सेल पैच । तीन पहले विन्यास आमतौर पर एकल आयन चैनल जांच के लिए उपयोग किया जाता है. चौथे के लिए, सेल संलग्न विंयास के बाद, कोशिका झिल्ली में एक छेद उप वायुमंडलीय दबाव का उपयोग किया जाता है । इस विंयास भी पूरे 12सेल के आयन चैनल संरचना की जांच की अनुमति देता है । हालांकि, इस तकनीक की एक सीमा है कि cytoplasmic अणुओं पैच पिपेट 13 समाधान (चित्रा 1ए) द्वारा पतला कर रहे हैं, इस प्रकार अध्ययन किया कोशिकाओं के विद्युत और शारीरिक प्रतिक्रियाओं को प्रभावित. दरअसल, उन अणुओं में से कुछ संकेत के transduction में या विभिन्न आयन चैनलों के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं. इस से बचने के लिए, लिंडाऊ और फर्नांडीज 14 एक तरीका है जहां एक ताकना बनाने यौगिक पैच पिपेट में जोड़ा जाता है विकसित की है । सेल संलग्न विंयास के बाद, यौगिक पैच के तहत प्लाज्मा झिल्ली में शामिल करने और धीरे cytosol (चित्रा 1ख) के साथ विद्युत संपर्क बनाने झिल्ली छिद्र होगा । ऐसे nystatin 15 और amphotericin बी 16, या सर्फेक्टेंट जैसे saponin बीटा-escin 17,18 के रूप में कई अलग विरोधी रोधी इस्तेमाल किया जा सकता है । इन यौगिकों बनाने के लिए काफी बड़े pores cytosol और पैच पिपेट के बीच monovalent कटियन और सीएल प्रसार की अनुमति है, जबकि cytosolic के अणुओं स्तर और Ca2 + 15की तरह बड़ा आयनों के संरक्षण, 16.

छिद्रित पैच का उपयोग करने की चुनौती संभावित उच्च श्रृंखला प्रतिरोध है । श्रृंखला प्रतिरोध (आरएस) या उपयोग प्रतिरोध पैच जमीन के सापेक्ष पिपेट पर संयुक्त प्रतिरोध है । पैच-दबाना रिकॉर्डिंग के दौरान, आरएस झिल्ली प्रतिरोध (आरएम)के साथ समानांतर में हो जाएगा । आरएम और आरएस एक वोल्टेज डिवाइडर के रूप में समानांतर काम में । उच्च आर एस के साथ, वोल्टेज रिकॉर्डिंग में त्रुटियों दे आरएस पर गिर जाएगी । त्रुटि दर्ज की गई बड़ी धाराओं के साथ बड़ा हो जाएगा । इसके अलावा, वोल्टेज डिवाइडर भी आवृत्ति एक कम पास फिल्टर बनाने निर्भर है, इस प्रकार लौकिक संकल्प को प्रभावित करने । प्रभाव में, छिद्रित पैच हमेशा वोल्टेज gated Na+ धाराओं की तरह बड़े और तेजी से धाराओं की रिकॉर्डिंग की अनुमति नहीं हो सकता है (विस्तृत रीडिंग के लिए संदर्भ 19देखें). इसके अलावा, आरएस पैच दबाना रिकॉर्डिंग के दौरान भिंन हो सकते हैं, फिर से दर्ज वर्तमान में परिवर्तन के लिए अग्रणी । इस प्रकार, झूठी सकारात्मक स्थितियों जहां आरएस दवा आवेदन के दौरान परिवर्तन में हो सकता है ।

कटा हुआ ऊतक पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पहले एंडरसन प्रयोगशाला द्वारा शुरू किया गया था मस्तिष्क में न्यूरॉन्स की electrophysiological विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए 20. तकनीक ने एकल कक्षों की विस्तृत जांच के साथ ही सेल-सेल संचार और सेल सर्किट को अधिक अक्षुण्ण वातावरण में करने का मार्ग प्रशस्त कर रखा है । पिट्यूटरी स्लाइस करने के लिए एक समान तकनीक Guérineau एट अल द्वारा १९९८ में पेश किया गया था । 21. हालांकि, यह २००५ से पहले नहीं था, कि मस्तिष्क-पिट्यूटरी टुकड़ा तैयारी सफलतापूर्वक teleost 22में पैच-क्लैंप अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था । इस अध्ययन में, लेखकों को भी छिद्रित पैच दबाना रिकॉर्डिंग के उपयोग की सूचना दी । हालांकि, अब तक, पिट्यूटरी कोशिकाओं की electrophysiological जांच के अधिकांश स्तनधारियों में आयोजित किया गया है, और केवल एक मुट्ठी भर अन्य रीढ़, teleost मछली सहित 1,2,22,23 . teleosts में लगभग सभी अध्ययनों से प्राथमिक असंबद्ध कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया 24,25,26,27,28,29,30 .

वर्तमान अखबार में, हम मॉडल मछली medaka से स्वस्थ मस्तिष्क पिट्यूटरी स्लाइस की तैयारी के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल रूपरेखा । दृष्टिकोण कई प्राथमिक असंबद्ध सेल संस्कृतियों की तुलना में लाभ का प्रतिनिधित्व करता है । सबसे पहले, कोशिकाओं असंबद्ध सेल संस्कृति की स्थिति की तुलना में एक अपेक्षाकृत संरक्षित वातावरण में दर्ज कर रहे हैं । दूसरा, स्लाइस तैयारी हमें अप्रत्यक्ष मार्ग सेल-सेल संचार 22, जो असंबद्ध सेल संस्कृति की स्थिति में संभव नहीं है द्वारा मध्यस्थता का अध्ययन करने के लिए अनुमति देते हैं । इसके अलावा, हम कैसे प्राप्त ऊतक के लिए छिद्रित पूरे सेल पैच-amphotericin बी के साथ ताकना बनाने एजेंट के रूप में तकनीक का उपयोग कर स्लाइस पर electrophysiological रिकॉर्डिंग का संचालन करने के लिए प्रदर्शन ।

Medaka एक छोटे मीठे पानी एशिया के लिए देशी मछली है, मुख्य रूप से जापान में पाया । फिजियोलॉजी, भ्रूणविज्ञान, और medaka के आनुवंशिकी बड़े पैमाने पर १०० साल 31के लिए अध्ययन किया गया है, और यह कई प्रयोगशालाओं में एक सामान्य रूप से इस्तेमाल किया अनुसंधान मॉडल है. इस कागज के लिए विशेष महत्व के hypothalamus के विशिष्ट रूपात्मक संगठन-teleost मछली में पिट्यूटरी जटिल है: जबकि स्तनधारियों और पक्षियों में हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स उनके न्यूरो हार्मोनों को विनियमित पिट्यूटरी स्रावी कोशिकाओं जारी औसत उभार के पोर्टल प्रणाली में, वहां teleost मछली ३२में पिट्यूटरी के अंत में स्रावी कोशिकाओं पर हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स के एक प्रत्यक्ष तंत्रिका प्रक्षेपण है. इस प्रकार, ध्यान से मस्तिष्क पिट्यूटरी टुकड़ा करने की क्रिया का आयोजन मछली में विशेष महत्व का है, हम एक अच्छी तरह से संरक्षित मस्तिष्क-पिट्यूटरी नेटवर्क में पिट्यूटरी कोशिकाओं के electrophysiological विशेषताओं की जांच करने के लिए अनुमति देता है, और विशेष रूप से कैसे पिट्यूटरी कोशिकाओं नियंत्रण उनकी उत्तेजितता और इस तरह2 सीए + homeostasis ।

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Protocol

सभी पशु हैंडलिंग की देखभाल और नार्वे के जीवन विज्ञान विश्वविद्यालय में अनुसंधान पशुओं के कल्याण के लिए सिफारिशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया था, और अधिकृत जांचकर्ताओं की देखरेख में ।

1. उपकरण और समाधान की तैयारी

नोट: सभी समाधान बाँझ होना चाहिए । सावधानी से पीएच और परासरणीयता (osmol/केजी पानी) के सभी समाधानों का ध्यान रखा जाना चाहिए, जो अध्ययन की गई प्रजातियों के extracellular वातावरण के लिए सावधानीपूर्वक अनुकूलित किए जाने चाहिए । पीएच और परासरणीयता ऐसे पीएच मीटर और फ्रीज बिंदु osmometer क्रमशः के रूप में सटीक इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों के साथ समायोजित किया जाना चाहिए ।

  1. 2 सीए के बिना अतिरिक्त सेलुलर समाधान के ५०० मिलीलीटर बनाओ+ (ca2 + मुक्त ईसी): १५० मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, १.३ मिमी MgCl2, 4 मिमी ग्लूकोज, 10 मिमी Hepes.
    1. NaCl के ४.३८ जी भंग, १८६.३७ मिलीग्राम की KCl, ६१.८९ मिलीग्राम की MgCl2, ३६०.३२ मिलीग्राम ग्लूकोज और १.१९ ग्राम में HEPES की ४५० मिलीलीटर ultrapure (०.०५५ अमेरिका/25 डिग्री सेल्सियस पर, १८.२ प्रतिरोधकता के MOhm) एच2ओ एक ग्लास चोंच में एक चुंबकीय आंदोलनकारी का उपयोग कर ।
    2. NaOH के साथ ७.७५ के लिए पीएच समायोजित करें ।
    3. एक ५०० मिलीलीटर volumetric कुप्पी में समाधान स्थानांतरण । ultrapure एच2ओ के साथ volumetric कुप्पी को ५०० मिलीलीटर तक भरें ।
    4. परासरणीयता को मापने से पहले घोल को अच्छी तरह मिला लें । mannitol के साथ 290-300 mOsm को समायोजित करें । फिल्टर पानी वैक्यूम प्रणाली और ०.२ µm फिल्टर का उपयोग कर समाधान निष्फल ।
  2. अतिरिक्त सेलुलर समाधान (ईसी): १५० मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 2 मिमी CaCl2, १.३ मिमी MgCl2, 4 मिमी ग्लूकोज, 10 मिमी Hepes के ५०० मिलीलीटर बनाओ ।
    1. NaCl के ४.३८ जी को भंग, १८६.३७ मिलीग्राम की KCl, १४७.०१ मिलीग्राम की CaCl2, ६१.८९ मिलीग्राम की MgCl2, ३६०.३२ मिलीग्राम की ग्लूकोज और १.१९ ग्राम HEPES की ४५० मिलीलीटर में ultrapure एच2ओ एक ग्लास चोंच में एक चुंबकीय आंदोलनकारी का उपयोग कर ।
    2. NaOH के साथ ७.७५ के लिए पीएच समायोजित करें ।
    3. एक ५०० मिलीलीटर volumetric कुप्पी में समाधान स्थानांतरण । ultrapure एच2ओ के साथ volumetric कुप्पी को ५०० मिलीलीटर तक भरें ।
    4. परासरणीयता को मापने से पहले घोल को अच्छी तरह मिला लें । mannitol के साथ 290-300 mOsm को समायोजित करें । फिल्टर पानी वैक्यूम प्रणाली और ०.२ µm फिल्टर का उपयोग कर समाधान निष्फल ।
  3. ०.१% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA के साथ ईसी) के साथ अतिरिक्त सेलुलर समाधान के ५०० मिलीलीटर बनाओ: १५० मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 2 मिमी CaCl2, १.३ मिमी MgCl2, 4 मिमी ग्लूकोज, 10 मिमी Hepes ।
    1. NaCl के ४.३८ जी को भंग, १८६.३७ मिलीग्राम की KCl, १४७.०१ मिलीग्राम की CaCl2, ६१.८९ मिलीग्राम की MgCl2, ३६०.३२ मिलीग्राम की ग्लूकोज और १.१९ ग्राम HEPES की ४५० मिलीलीटर में ultrapure एच2ओ एक ग्लास चोंच में एक चुंबकीय आंदोलनकारी का उपयोग कर ।
    2. NaOH के साथ ७.७५ के लिए पीएच समायोजित करें ।
    3. एक ५०० मिलीलीटर volumetric कुप्पी में समाधान स्थानांतरण । ultrapure एच2ओ के साथ volumetric कुप्पी को ५०० मिलीलीटर तक भरें ।
    4. परासरणीयता को मापने से पहले घोल को अच्छी तरह मिला लें । mannitol के साथ 290-300 mOsm को समायोजित करें । फिल्टर पानी वैक्यूम प्रणाली और ०.२ µm फिल्टर का उपयोग कर समाधान निष्फल । जोड़ें ५० मिलीग्राम BSA ।
  4. intracellular समाधान (आईसी) की २५० मिलीलीटर: ११० मिमी KOH, 20 मिमी KCl, 10 मिमी Hepes, 20 मिमी सुक्रोज बनाओ ।
    1. भंग १.५४ जी कोह, ३२७.७५ मिलीग्राम की KCl, ५९५.७५ मिलीग्राम की HEPES और १.७१२ ग्राम की ४५० मिलीलीटर में ultrapure एच2ओ एक ग्लास चोंच में एक चुंबकीय आंदोलनकारी का उपयोग कर ।
    2. (N-morpholino) एतान sulfonic (एमईएस) एसिड के साथ ७.२ के लिए पीएच समायोजित करें ।
    3. एक २५० मिलीलीटर volumetric कुप्पी में समाधान स्थानांतरण । ultrapure एच2ओ के साथ volumetric कुप्पी को २५० मिलीलीटर तक भरें ।
    4. परासरणीयता को मापने से पहले घोल को अच्छी तरह मिला लें । सुक्रोज के साथ 280-290 mOsm (ईसी से कम 10 mOsm) को समायोजित करें । फिल्टर पानी वैक्यूम प्रणाली और ०.२ µm फिल्टर का उपयोग कर समाधान निष्फल ।
  5. 2% ca 2% में कम पिघलने agarose समाधान के १०० मिलीलीटर बनाओ+ और BSA मुक्त चुनाव आयोग (2 सीए के १०० मिलीलीटर में कम पिघलने के agarose 2+ मुक्त चुनाव आयोग) । एक माइक्रोवेव का उपयोग कर भंग और ४० डिग्री सेल्सियस पर एक पानी में स्नान में पिघला agarose जगह है । जब तक यह ऊतकों पर उपयोग करने से पहले ४० डिग्री सेल्सियस तक पहुँच इसे शांत करते हैं ।
    नोट: चुनाव आयोग, Ca2 + मुक्त चुनाव आयोग कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है अगर बाँझ और आईसी समाधान-20 ° c, कई महीनों के लिए. Agarose 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सप्ताह के लिए संग्रहीत किया जा सकता है और संक्षिप्त microwaving द्वारा 3-5 बार reused किया जा सकता है । अत्यधिक पुनः प्रयोग वाष्पीकरण और agarose और नमक एकाग्रता और गुणवत्ता के परिवर्तन के लिए नेतृत्व करेंगे ।
  6. बना आगर पुल:
    1. बाहर व्यास के साथ ७.५ मिमी लंबे borosilicate ग्लास केशिकाओं गर्मी (ओडी) 2 मिमी और अंदर व्यास (आईडी) १.१६ mm एक छोर से 1/3 के बारे में एक केंद्र बिंदु पर एक Bunsen बर्नर का उपयोग कर जब तक गिलास मोड़ शुरू होता है । लौ से गिलास निकालें और कांच के बारे में १२० डिग्री (चित्रा 2ए) के एक कोण के साथ झुकने के लिए अनुमति देते हैं ।
    2. पिघला 2% सामांय चुनाव आयोग में एक माइक्रोवेव का उपयोग कर के बिना आगर, और जबकि agarose तरल है पूर्व बनाया गिलास केशिका तरल में कांच के सिरों में से एक डाल और कुछ मिनट के लिए इंतज़ार कर केशिकाओं बलों का उपयोग कर भरें । चुनाव आयोग में 4 डिग्री सेल्सियस पर ग्लूकोज के बिना उपयोग तक पुलों की दुकान ।
  7. एक उपयुक्त पिपेट खींचने का उपयोग कर रेशा पैच पिपेट के साथ borosilicate ग्लास तैयार करें । पिपेट खींचने के लिए वांछित इलेक्ट्रोड प्रतिरोध प्राप्त करने के लिए मैनुअल देखें.
    नोट: पिपेट के शंकु के रूप में संभव के रूप में कम होना चाहिए । लघु पिपेट शंकु 4-6 खींच कदम का उपयोग करके हासिल की है । इलेक्ट्रोड प्रतिरोध कक्ष आकार के आधार पर 2 और 6 MΩ के बीच होना चाहिए ।
  8. पैच-दबाना प्रयोगों कोट बोराटे बफर में polyethylenimine (पी) के ०.१% के साथ रिकॉर्डिंग चैंबर की सतह के दौरान ऊतक की आवाजाही से बचने के लिए ।
    1. बोराटे बफर की ५०० मिलीलीटर तैयार करें (25 मिमी):
      1. भंग ४.७६८ जी का ना2ख4ओ7/10H2ओ में ४५० एमएल का ultrapure एच2ओ एक ग्लास चोंच में एक चुंबकीय आंदोलनकारी के प्रयोग से ।
      2. एचसीएल के साथ ८.४ को पीएच समायोजित करें ।
      3. एक ५०० मिलीलीटर volumetric कुप्पी में समाधान स्थानांतरण । ultrapure एच2के साथ volumetric कुप्पी भरें हे जब तक ५०० मिलीलीटर और ०.२ µm फिल्टर पानी वैक्यूम प्रणाली का उपयोग कर समाधान निष्फल ।
    2. पी के 1% शेयर समाधान तैयार (1 मिलीलीटर ५०% बेई को ४९ मिलीलीटर 25 mM बोराटे बफर) और एक ०.१% पी कमजोर पड़ने से कमजोर 10 µ एल 1% शेयर समाधान के १०० µ एल में अंतिम उपयोग के लिए बोराटे बफर की ।
    3. स्लाइस धारक के गिलास पर ०.१% बेई के 2 मिलीलीटर जोड़ें और 1 मिनट के लिए कोटिंग मशीन चलो । फिर संक्षेप में गिलास ultrapure एच2ओ के 5 मिलीलीटर के साथ दो बार धोने और हवा का उपयोग करें जब तक शुष्क ।
  9. amphotericin बी समाधान तैयार करें ।
    1. amphotericin बी पाउडर के 3 मिलीग्राम को भंग करके ६० मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान करें ५० µ l dimethyl sulfoxide (DMSO) में, एक 1 मिलीलीटर ट्यूब में प्रकाश से सुरक्षित । 30 एस के लिए अधिकतम गति पर भंवर और homogenize के लिए 15 मिनट के लिए sonicate । स्टोर aliquots में 3-5 ट्यूबों में-20 ° c और प्रति दिन एक aliquot का उपयोग करें ।
      नोट: यदि amphotericin बी स्टॉक समाधान स्पष्ट और पीले रंग लेकिन दूधिया (अभी भी पीले) के बाद 15 – 20 मिनट sonication एक नया स्टॉक समाधान बनाने के लिए नहीं है ।
    2. 10 मिलीलीटर क्षमता से अधिक के साथ एक साफ गिलास चोंच में आईसी के 2 मिलीलीटर pipetting द्वारा amphotericin बी के साथ आईसी समाधान बनाओ । पिपेट समाधान और pipetting द्वारा मिश्रण में amphotericin बी शेयर समाधान के 8 µ एल जोड़ें । एल्यूमीनियम पंनी और बर्फ पर जगह के साथ चोंच लपेटें उपयोग जब तक और यह हर 3 एच नवीनीकृत ।

2. विच्छेदन और Vibratome के साथ टुकड़ा करने की क्रिया

  1. विच्छेदन उपकरण को विच्छेदन से पहले तैयार करें, जिसमें एक तेज और एक मजबूत संदंश कैंची के साथ हो । इथेनॉल के साथ उपकरण (ऊतक धारक, ब्रश, संदंश) साफ और सुनिश्चित करें कि वे केवल विच्छेदन प्रयोजनों के लिए उपयोग किया जाता है और कभी नहीं तय ऊतकों के साथ संपर्क में । इन्हें संदूषण से बचने के लिए अलग डब्बे में रखें ।
  2. 1 मिनट के लिए ठंडे बर्फ के पानी में मछली Euthanize ।
  3. जल्दी से तेज संदंश के साथ medaka मस्तिष्क और पिट्यूटरी काटना के लिए अनुवर्ती चरणों का पालन करें (कोई अधिक से अधिक 3 मिनट का उपयोग करें).
    1. जबकि मजबूत संदंश के साथ मछली पकड़ कैंची या तेज संदंश के साथ आंखों के पीछे दो ऑप्टिक नसों गंभीर ।
    2. खोपड़ी के पीछे से पूर्वकाल की ओर खोपड़ी के पृष्ठीय भाग खोलने के लिए मजबूत संदंश के साथ कदम से चरण के द्वारा कपाल हड्डियों को तोड़ने ।
    3. मजबूत संदंश के साथ एक तरफ खोपड़ी छील लें ।
    4. कैंची या तेज संदंश के साथ रीढ़ की हड्डी गंभीर ।
    5. धीरे, संदंश के साथ रीढ़ की हड्डी हड़पने के लिए, पीछे से पूर्वकाल करने के लिए मस्तिष्क फ्लिप और यह बर्फ ठंडा सीए2 + मुक्त चुनाव आयोग के साथ एक डिश में जगह है ।
  4. तरल agarose के साथ एक 1.5-2 सेमी3 धातु मोल्ड भरें और यह बर्फ पर जगह है ।
  5. बस से पहले agarose जम (लगभग 25-30 डिग्री सेल्सियस), धीरे संदंश के साथ रीढ़ की हड्डी से मस्तिष्क हड़पने, ठीक कागज के एक टुकड़े के साथ संदंश सूखी और agarose में ऊतक डाल दिया । जल्दी agarose मिश्रण चुनाव आयोग के निशान को पतला ऊतक के आसपास छोड़ दिया और ऊतक मालूम और बर्फ पर एक कुछ सेकंड के लिए मोल्ड agarose कठोर जब तक ।
    नोट: यह इस कदम के लिए जरूरी है कि तेजी से हो । agarose जल्दी जम के रूप में धातु मोल्ड बर्फ से नीचे ठंडा है ।
  6. एक स्केलपेल ब्लेड के साथ ऊतक युक्त agarose के एक वर्ग ब्लॉक ट्रिम और सर्जरी (गैर विषैले) गोंद का उपयोग कर vibratome नमूना धारक पर गोंद ।
  7. बर्फ ठंडा सीए2 + मुक्त चुनाव आयोग के साथ नमूना (मस्तिष्क-पिट्यूटरी) धारक प्राप्त vibratome के cuvette भरें ।
  8. vibratome में नमूना धारक प्लेस और agarose ब्लॉक कट १५० µm के parasagittal वर्गों बनाने के लिए, उच्च आवृत्ति और अनुभाग के लिए कम गति का उपयोग कर । चयनित वर्गों लीजिए और उन्हें पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग चैंबर में 3 मिलीलीटर आइस-कोल्ड सीए2 + मुक्त चुनाव आयोग के साथ रखें ।
  9. टिशू सेक्शन पर ग्रिड वीणा (चित्रा 2बी) लगाएं ।
    नोट: वीणा कोटिंग ऊतक को स्थिर और पैच-दबाना रिकॉर्डिंग के दौरान जाने से रोकने के साथ साथ होगा ।
  10. वीणा के स्थान पर होने के बाद, ca 2 + और BSA के साथ सामांय चुनाव आयोग के लिए नि : शुल्क चुनाव आयोग मध्यम बदलें । 10 मिनट के लिए ऊतक आराम करते हैं ।

3. छिद्रित पैच-दबाना और Electrophysiological रिकॉर्डिंग

  1. प्रयोग शुरू करने से पहले, निम्न चरणों द्वारा चांदी के तार इलेक्ट्रोड क्लोराइड: सबसे पहले, चांदी के तार इलेक्ट्रोड को साफ करने के लिए एक ठीक सैड (p180) का उपयोग करें । दूसरा, 2 मिलीलीटर, ७०% इथेनॉल के साथ कुल्ला । तीसरे, 10 मिनट के लिए 2 मिलीलीटर, 2-5% क्लोरीन में तारों डुबकी । अंत में, 2 मिलीलीटर, ultrapure एच2ओ के साथ कुल्ला ।
  2. मस्तिष्क के साथ रिकॉर्डिंग चैंबर रखें-माइक्रोस्कोप चरण में पिट्यूटरी टुकड़ा और लक्ष्य क्षेत्र का पता लगाने (पिट्यूटरी) 10x उद्देश्य का उपयोग और 40X उद्देश्य का उपयोग कर कोशिकाओं का निरीक्षण.
    नोट: यदि तैयारी सफल होती है, तो बहुत कम गोल कक्ष दिखाई देने चाहिए. इन गोल कोशिकाओं को आम तौर पर क्षतिग्रस्त कोशिकाओं है कि ऊतक से अलग कर रहे हैं ।
  3. ईसी बाथ में 2% आगर ब्रिज के माध्यम से जमीनी इलेक्ट्रोड लगाएं ।
  4. 40X उद्देश्य का उपयोग करके एक स्वस्थ कक्ष का पता लगाएं ।
    नोट: एक स्वस्थ कोशिका मजबूती से ऊतक टुकड़ा से जुड़ा होना चाहिए और गोल नहीं और टुकड़ा से अलग ।
  5. वोल्टेज दबाना में एम्पलीफायर सेट (कुलपति; चित्रा 4a बिंदु 1) मोड. सील परीक्षण खिड़की खोलने के लिए और स्नान विंयास प्रेस (चित्रा 4B बिंदु 1 और 2 । पिपेट प्रतिरोध (चित्रा 4B प्वाइंट 3) की निगरानी के लिए एक 5 एमवी पल्स का प्रयोग करें.
  6. Backfill एक माइक्रो भराव सिरिंज का उपयोग कर amphotericin बी के साथ आईसी समाधान जोड़ने से पहले रोधी मुक्त आईसी समाधान के साथ पैच पिपेट की नोक ( चित्रा 3देखें) ।
  7. 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर पिपेट पैच में एक थोड़ा सकारात्मक हवा का दबाव जोड़ें ।
    नोट: यह पैच पिपेट से एक छोटा सा तरल प्रवाह है कि टिप के संदूषण से बचने बनाता है ।
  8. स्नान में एक बार, पैच पिपेट प्रतिरोध का आकलन और सुनिश्चित करें कि कोई कण पिपेट (चित्रा 4c) की नोक से जुड़े होते हैं ।
    नोट: टेप का एक छोटा सा टुकड़ा वीडियो रिकॉर्डिंग दृश्य के क्षेत्र फार्म प्रदर्शित मॉनिटर पर संलग्न है । यह जब उद्देश्य कक्ष पर ध्यान केंद्रित नहीं है, तो कक्ष के सापेक्ष पैच पिपेट की स्थिति आसान बनाता है ।
  9. गाइड micromanipulators का उपयोग कर सेल के लिए नीचे पिपेट पैच ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि पिपेट पिपेट की नोक से अनुलग्न हो सकता है छोटे कणों के लिए देख कर साफ है । प्रतिरोध में अचानक परिवर्तन भी पिपेट टिप में फंस कणों का एक परिणाम हो सकता है ।
  10. कक्ष के ऊपर कुछ माइक्रोन की पिपेट को पुनः समायोजित करें, ताकि पिपेट की नोक कक्ष के मध्य से कक्ष 1/3 को स्पर्श करेगी, जैसा चित्र 5में दिखाया गया है । जब कोशिका को छूने, दबाव जारी है और कोमल चूषण लागू करने के लिए एक मुहर बनाने ।
    नोट: पैच पिपेट से समय एक सफल सील करने के लिए स्नान में प्रवेश करती है के रूप में संभव के रूप में कम रखा जाना चाहिए । नहीं से अधिक 1-1.5 मिनट के क्रम में amphotericin बी से बचने के लिए पिपेट और स्नान में रिसाव की नोक तक पहुंचने ।
  11. तुरंत पैच में पैच विंडो में स्विच-क्लैंप सॉफ्टवेयर (चित्रा 4d प्वाइंट 1) और के बीच एक होल्डिंग क्षमता है-५० और-६० एमवी (चित्रा 4d प्वाइंट 2) । तेजी से बाहर शूंय गिलास पिपेट (चित्रा 4d प्वाइंट 3) द्वारा बनाई गई समाई ।
  12. पैच में सेल विंडो में स्विच-क्लैंप सॉफ्टवेयर (चित्रा 4E बिंदु 1 और 2) और निगरानी का उपयोग प्रतिरोध, रा, खिड़की पर प्रदर्शित शुरू. पर्याप्त पहुँच के बाद एम्पलीफायर सॉफ्टवेयर में झिल्ली समाई (चित्रा 4E प्वाइंट 3) बाहर शून्य.
    नोट: पर्याप्त पहुंच ले सकता है 10 करने के लिए 30 मिनट (चित्रा 4E 2 बिंदु) । वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग के लिए एक अच्छा उपयोग 20 मीटर नीचे होना चाहिए ।
  13. एम्पलीफायर सॉफ्टवेयर विंडो में वर्तमान दबाना, आईसी, के लिए स्विच (चित्रा 4F प्वाइंट 1). एम्पलीफायर सॉफ्टवेयर की I-दबाना खिड़की में तेजी से समाई धाराओं को समायोजित (चित्रा 4F बिंदु 2 और 3) ३.१२ में के रूप में एक ही मूल्य के लिए. झिल्ली की क्षमता (चित्रा 4F प्वाइंट 1) की जांच करें ।
    नोट: महत्वपूर्ण बात, अगर झिल्ली क्षमता उथले है (ठेठ ऊपर-३५ एमवी) सेल क्षतिग्रस्त हो सकता है । रिकॉर्डिंग रद्द करें और कोई नया कक्ष ढूंढें ।
  14. एक स्वस्थ कोशिका खोजने के बाद (दृढ़ता से नीचे झिल्ली क्षमता के साथ ऊतक से जुड़ा-४० एमवी), निर्माता के प्रोटोकॉल में विस्तृत रूप में प्रयोगात्मक रिकॉर्डिंग शुरू ३३,३४.

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल कैसे पिट्यूटरी (gonadotrope) कोशिकाओं से विश्वसनीय electrophysiological रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए एक कदम प्रोटोकॉल द्वारा एक कदम दर्शाता है, एक medaka ट्रांसजेनिक लाइन [टीजी (lhb-hrGfpII)] का उपयोग कर जहां लक्ष्य कोशिकाओं (Lh उत्पादक gonadotropes) ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ लेबल कर रहे हैं ।

शुरू में, electrophysiological जांच पूरे सेल विंयास का उपयोग कर आयोजित की गई । हालांकि, सहज कार्रवाई संभावित अध्ययन कोशिकाओं में से किसी में नहीं देखा गया । कोशिकाओं के एक सबसेट में, कार्रवाई संभावितों-५० और ६० एमवी (चित्रा 6) के बीच एक आराम की क्षमता से छोटे वर्तमान इंजेक्शन (5-9 फिलीस्तीनी अथॉरिटी) का उपयोग कर ट्रिगर किया जा सकता है । इन कार्रवाई क्षमता एक तेजी से खड़ा होनेवाला था, और के बारे में 4 के बाद-6 मिनट ट्रिगर कार्रवाई क्षमता अब संभव नहीं थे । विशेष रूप से तेजी से खड़ा होनेवाला छोटा सेल आकार द्वारा समझाया जा सकता है । सामांय में, पिट्यूटरी कोशिकाओं से छोटे है ंयूरॉंस 30। उदाहरण के लिए, gonadotrope कोशिकाओं की औसत झिल्ली समाई 4 और 10 पीएफ 3,30,३५के बीच पर्वतमाला । इन निष्कर्षों के समान medaka gonadotrope कोशिकाओं की एक औसत झिल्ली समाई थी (मतलब ± एस डी) ३.४ ± ०.९ पीएफ (n = ६७) ।

amphotericin बी का उपयोग कर छिद्रित पैच विन्यास के लिए स्विचन, सहज कार्रवाई संभावितों दर्ज की कोशिकाओं के बारे में ५०% में मनाया गया (चित्रा 7ए, n = ६३ कोशिकाओं 21 जानवरों से). इसके अलावा, कार्रवाई संभावितों भी लंबे समय तक रिकॉर्डिंग (1 एच) के बाद कोई चौकसी खड़ा होनेवाला साथ इन कोशिकाओं के ९५% में ट्रिगर किया जा सकता है । महत्वपूर्ण बात, आदेश में विश्वसनीय और उच्च गुणवत्ता रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए, यह पहले रोधी मुक्त आईसी समाधान के साथ टिप भरने के लिए आवश्यक है । यदि gigaseal बनाने से पहले रोधी पिपेट टिप को कम मात्रा में ले जाते हैं, तो यह लक्ष्य कोशिका के साथ-साथ आसपास के कक्षों को भी नुकसान पहुंचा सकता है ।

आदेश में अगर छिद्रित पैच विंयास में कोशिकाओं को उनके मुख्य जारी हार्मोन का जवाब करने में सक्षम हैं, हम 1 µ एम Gnrh1 लक्ष्य कोशिकाओं पर बेदखल कश लागू होता है । प्रयोगों वर्तमान दबाना में प्रदर्शन किया गया हमें वोल्टेज में परिवर्तन की निगरानी करने की अनुमति । इन प्रयोगों से एक biphasic प्रतिक्रिया (चित्रा ७बी) का पता चला. पहला चरण एक hyperpolarization जहां ca के रिलीज2 + आंतरिक स्टोर से + सक्रिय ca2 + सक्रिय कश्मीर+ hyperpolarization के कारण चैनल । पहले चरण के बाद एक ध्रुवीकरण और वृद्धि हुई कार्रवाई संभावित आवृत्ति से 1-2 हर्ट्ज के आसपास 3 हर्ट्ज के लिए है. रिकॉर्डिंग में से कुछ में, दूसरे चरण छद्म पठार क्षमता जहां 2 या 3 छोटे spikes ध्रुवीकरण से पहले मनाया गया था ।

Figure 1
चित्रा 1 : पूरे सेल (A) और छिद्रित पैच (B) पैच-दबाना तकनीक के विन्यास के बीच अंतर. पूरे-सेल विन्यास (ए) में, gigaseal जगह में है के बाद, एक छेद झिल्ली में पैच पिपेट में एक छोटे से नकारात्मक दबाव लागू करने के द्वारा किया जाता है । इस विंयास में, इस तरह के अणुओं संकेत के रूप में महत्वपूर्ण intracellular अणुओं पैच पिपेट समाधान में पतला किया जा सकता है इस प्रकार कोशिका के विद्युत और शारीरिक प्रतिक्रियाओं को प्रभावित । इस घटना को और भी अधिक महत्वपूर्ण है छोटे कोशिकाओं में, जैसे पिट्यूटरी कोशिकाओं. इसके विपरीत, छिद्रित-पैच विन्यास (बी) में, निम्नलिखित gigaseal, cytosol और पैच पिपेट के बीच बिजली के संपर्क रोधी या सर्फेक्टेंट से बना है. रोधी या surfactant पैच और पैच के तहत प्लाज्मा झिल्ली में शामिल किया जाएगा पहले patch पिपेट में भरी हुई है, जिससे धीरे झिल्ली छिद्रित, monovalent आयनों की तरह केवल छोटे अणुओं को पारित करने की अनुमति । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : आगर ब्रिज (ए) और वीणा (बी) प्रोटोकॉल में प्रयुक्त होने वाले चित्र । मिमी में पैमाने. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : पैच के भरने-पिपेट । (क) रोधी मुक्त आईसी समाधान (ब्लू लिक्विड) पिपेट के अंदर रेशा के कारण केशिका ताकतों द्वारा backfilled है. (ख) रोधी मुक्त आईसी के साथ पिपेट टिप भरने के बाद, पिपेट के पीछे भाग विष amphotericin बी युक्त समाधान (पीला तरल) एक सिरिंज सुई (माइक्रो भराव) का उपयोग कर से भर जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4A
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Figure 4B
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Figure 4C
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Figure 4D
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Figure 4E
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Figure 4F
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चित्र 4 : सॉफ्टवेयर स्क्रीनशॉट । (क) एम्पलीफायर सॉफ्टवेयर विंडो दिखा. 1. हाइलाइट्स (लाल वृत्त) मोड क्षेत्र है कि वोल्टेज दबाना (कुलपति), किसी भी वर्तमान इंजेक्शन के बिना वर्तमान दबाना (मैं = 0) और वर्तमान इंजेक्शन (आईसी) के लिए संभावना के साथ वर्तमान दबाना के बीच स्विचन की अनुमति देता है । 2 हाइलाइट्स (लाल वृत्त) वोल्टेज दबाना में तेजी से समाई वर्तमान समायोजन के लिए क्षेत्र के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पूरे सेल समाई वर्तमान समायोजन । (ख) झिल्ली परीक्षण खिड़की खोलने के साथ पैच दबाना सॉफ्टवेयर दिखाता है । 1. हाइलाइट्स (लाल वृत्त) झिल्ली परीक्षण बटन । 2. हाइलाइट्स (लाल वृत्त) अलग पल्स विन्यास, स्नान, पैच, और सेल. 3. हाइलाइट्स (लाल वृत्त) पल्स विन्यास आयाम और आवृत्ति. (सी एफ) पैच दबाना सॉफ्टवेयर (बाएं) और एम्पलीफायर (सही) सॉफ्टवेयर की एक संयुक्त विधवा से पता चलता है । (ग) पर प्रकाश डाला गया (लाल वृत्त) प्रतिरोध जब पिपेट स्नान में है और उचित जमीन का उपयोग कर आगर ब्रिज (स्नान मोड में) । (D) 1. gigaseal निंनलिखित पैच मोड के लिए स्विचन (लाल वृत्त) पर प्रकाश डाला गया । 2. हाइलाइट्स (लाल वृत्त) पल्स विंयास (10 एमवी पल्स) और धारण क्षमता समायोजित करने के लिए-६० एमवी । 3. हाइलाइट्स (लाल वृत्त) को सही करने या एक गीगा सील के बाद तेजी से समाई धाराओं शून्य के लिए खिड़की. (ङ) 1. हाइलाइट्स (लाल वृत्त) कक्ष मोड का उपयोग प्रतिरोध की निगरानी के लिए उपयोग किया जाता है । 2 हाइलाइट्स (लाल वृत्त) सेल पैरामीटर, झिल्ली समाई (सेमी), सील गुणवत्ता (Rm), उपयोग प्रतिरोध (आरए), समय लगातार (ताऊ) और होल्डिंग वर्तमान (पकड़ो) । 3. हाइलाइट्स (लाल वृत्त) झिल्ली समाई धाराओं को सही करने के लिए बटन । (च) 1. हाइलाइट्स (लाल वृत्त) झिल्ली क्षमता की निगरानी के लिए आईसी मोड । 2. हाइलाइट्स (लाल वृत्त) बटन वर्तमान दबाना समायोजन करने के लिए स्विच करने के लिए (I-दबाना). 3. हाइलाइट्स (लाल वृत्त) तेजी से समाई धाराओं को सही करने के लिए खिड़की ।

Figure 5
चित्रा 5 : एक पैच से Micrograph छिद्रित पैच कॉन्फ़िगरेशन का उपयोग कर एक पिट्यूटरी सेल पर रिकॉर्डिंग दबाना. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : वर्तमान इंजेक्शन सामान्य पूरे सेल विन्यास का उपयोग कर के बाद एक GFP-लेबल Lh-उत्पादक सेल से मौजूदा दबाना रिकॉर्डिंग । कोशिकाओं के बीच रखा गया था-५० और-६० एमवी । विशिष्ट कार्रवाई संभावित सेल (ब्लैक ट्रेस) के लिए पहुंच प्राप्त करने के तुरंत बाद 5-10 पीए वर्तमान इंजेक्शन का उपयोग कर कोशिकाओं का एक सबसेट में ट्रिगर किया जा सकता है । 1-3 मिनट के बाद कार्रवाई संभावित आयाम को कम करने के लिए शुरू कर दिया, खड़ा होनेवाला (सियान ट्रेस) का एक विशिष्ट संकेत. 4 के बाद-6 मिनट कार्रवाई संभावित आयाम लगभग पूरी तरह से गायब हो (रानी ट्रेस) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : एक GFP से वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग-लेबल Lh-उत्पादन कोशिका छिद्रित पैच विंयास का उपयोग, गोनॉडोट्रॉफिन-रिलीज हार्मोन Gnrh1 के साथ उत्तेजना के बाद । (क) वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग एक Lh उत्पादन gonadotrope सेल से सहज कार्रवाई की क्षमता का प्रदर्शन । (ख) एक biphasic प्रतिक्रिया जहां 10 एस के लिए Gnrh1 उत्तेजना एक कोशिका में एक ध्रुवीकरण और वृद्धि की गोलीबारी आवृत्ति के बाद सेल झिल्ली की एक hyperpolarization प्रेरित (से 1-2 हर्ट्ज के लिए 3 हर्ट्ज) कार्रवाई क्षमता के एक सेल में जो पहले से निकाल दिया सहज क्रिया क्षमता । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

Electrophysiological रिकॉर्डिंग मस्तिष्क पर पैच-दबाना तकनीक का उपयोग-पिट्यूटरी स्लाइसें सावधान अनुकूलन की आवश्यकता होती है. teleosts में विशेष रूप से लाइव सेल जांच के संचालन के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित प्रोटोकॉल सीमित हैं, स्तनधारी सिस्टम के आधार पर प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए प्रकाशनों के बहुमत के साथ । इस संबंध में, यह तथ्य यह है कि पीएच और परासरणीयता जैसे कई शारीरिक मापदंडों ही निर्भर प्रजाति नहीं है के बारे में पता होना जरूरी है, लेकिन यह भी बहुत ज्यादा है कि सवाल में जीव भूमि पर या पानी में रहता है पर निर्भर है । मछली के लिए, यह भी आवश्यक है, खाते में ले, अगर वे एक समुद्री या मीठे पानी के माहौल में रहते हैं । उदाहरण के लिए, सीओ2 आंशिक दबाव बहुत मछली में 1.7 से लेकर स्तरों के साथ स्तनधारियों की तुलना में बहुत कम है-3.4 mmHg मछली और 40 में पीसीओ2 -46 mmHg पीसीओ2 स्तनधारियों में ३६। इस के आधार पर, हम सभी वर्तमान प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया समाधान में ७.७५ ३७,३८,३९,४० के लिए पीएच समायोजित करें । हम भी HEPES बफर का उपयोग के रूप में यह 7.4-7.8 ४१के पीएच क्षेत्र में उत्कृष्ट बफ़रिंग क्षमता के अधिकारी के लिए दिखाया गया है । परासरणीयता के लिए, हम 290-300 mOsm जो है जो medaka ४२के extracellular वातावरण में मापा गया है का उपयोग करें । electrophysiological रिकॉर्डिंग के दौरान इस्तेमाल किए गए तापमान को मछलियों के पर्यावरण के हिसाब से चुना गया है । दरअसल, medaka पानी में एक विस्तृत तापमान रेंज (4 से ४० डिग्री सेल्सियस) के साथ रह रहा है, जबकि हमारी प्रयोगशाला में वे एक नियंत्रित वातावरण में 26-28 डिग्री सेल्सियस में उठाया जाता है । इस के आधार पर, हम कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस के आसपास), क्या स्तनधारी ऊतकों (३७ डिग्री सेल्सियस) के लिए या ऐसे अटलांटिक कॉड (12 डिग्री सेल्सियस) 18के रूप में ठंडे पानी मछली प्रजातियों के लिए प्रयोग किया जाता है से अलग पर हमारी रिकॉर्डिंग प्रदर्शन किया ।

पिट्यूटरी कोशिकाओं पैच करने के लिए सक्षम होने के लिए, यह स्वस्थ ऊतक स्लाइस उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह साफ उपकरण (ऊतक धारक, ब्रश, संदंश, आदि) है कि केवल जीवित ऊतक (fixatives से मुक्त) के साथ संपर्क में है का उपयोग करने के लिए आवश्यक है । मस्तिष्क और पिट्यूटरी के एक त्वरित विच्छेदन और कम तापमान पर ऊतक रखने (4 डिग्री सेल्सियस) जबकि विदारक और टुकड़ा करने की क्रिया व्यवहार्य वर्गों प्रदान करने के लिए अन्य प्रमुख कारक हैं. विशिष्ट ध्यान भी ऊतक embedding पर agarose के तापमान के लिए दिया जाना चाहिए । बहुत गर्म agarose ऊतक नुकसान कर सकता है, जबकि भी ठंड agarose आप समय नहीं छोड़ करने के लिए उचित अनुभाग के लिए ऊतक मालूम होगा । इसके अलावा, टुकड़ा करने की क्रिया के बिना चुनाव आयोग समाधान के साथ किया जाना चाहिए2 Ca + क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को apoptosis में प्रवेश करने के लिए अनुभाग के बाद से बचने के लिए । bubbling आवश्यक नहीं है, लेकिन ऊतक स्लाइसें तुरंत अनुभाग के बाद एकत्र किया जाना चाहिए । 15 मिनट के बारे में टुकड़ा छोड़ दो कोशिकाओं patching से पहले थोड़ा आराम करने के लिए अनुभाग के बाद ।

Teleost मछली पिट्यूटरी कोशिकाओं के electrophysiological गुणों की जांच करने के लिए उत्कृष्ट मॉडल हैं । वास्तव में, स्तनधारियों और पक्षियों के विपरीत, मछली एक औसत उभार के अधिकारी नहीं है, जिसका अर्थ है कि हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स पिट्यूटरी को नियंत्रित सीधे अपने लक्ष्य ३२कोशिकाओं पर अपने axons परियोजना. इस प्रकार, एक मस्तिष्क में पिट्यूटरी स्लाइस, पिट्यूटरी कोशिकाओं को एक और अधिक बरकरार वातावरण में प्राथमिक पिट्यूटरी कोशिका संस्कृतियों की तुलना में बनाए रखा जाता है जहां कोशिकाओं रासायनिक और यांत्रिक उपचार का उपयोग कर असंबद्ध हैं. मजे की बात है, मस्तिष्क पिट्यूटरी medaka के स्लाइस का उपयोग कर, हम निरीक्षण कर सकता है कि Lh कोशिकाओं में कार्रवाई संभावित फायरिंग आवृत्ति, Gnrh1 सक्रियण पर, वृद्धि हुई (चित्रा 5) । इन टिप्पणियों के साथ समझौते में क्या पिट्यूटरी सेल संस्कृति के अध्ययन में बताया गया है हमारे अपने 29 प्रयोगशाला से संकेत मिलता है कि प्राथमिक पिट्यूटरी कोशिका संस्कृतियों का उपयोग अभी भी पिट्यूटरी कोशिकाओं के झिल्ली गुणों की विशेषता के लिए प्रासंगिक हैं. हालांकि, मस्तिष्क पिट्यूटरी स्लाइस हमें भी विभिन्न यौगिकों के अप्रत्यक्ष प्रभाव के साथ ही कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने की अनुमति, के रूप में यह संरचनात्मक कनेक्शन है कि प्राथमिक पिट्यूटरी कोशिका संस्कृतियों में खो रहे हैं का कहना है. इसके अलावा, टुकड़ा तैयारी एक असंबद्ध प्राथमिक सेल संस्कृति की तुलना में तैयार करने के लिए तेजी से है, और electrophysiological रिकॉर्डिंग विच्छेदन के बाद निंनलिखित 30 मिनट में आयोजित किया जा सकता है । इसका मतलब यह है कि, एक प्राथमिक कोशिका संस्कृति के विपरीत, circadian लय एक सार्थक तरीके से ताजा तैयार स्लाइस का उपयोग कर संबोधित किया जा सकता है ।

क्योंकि मछली में पिट्यूटरी कोशिकाओं के छोटे आकार के (3-10 पीएफ के आसपास झिल्ली समाई), और हमारी अपनी टिप्पणियों दिखा रहा है कि gonadotrope कोशिकाओं को कार्रवाई की क्षमता (आंकड़ा 3) आग करने की क्षमता खो देते है और इस तरह अपने को जवाब देने की क्षमता खो जब पूरे सेल विन्यास में रिकॉर्डिंग हार्मोन जारी, हम का उपयोग करें और छिद्रित पैच तकनीक इस के साथ साथ पेश करने का फैसला किया. दरअसल, यह दिखाया गया है कि पूरे सेल विंयास इस प्रकार electrophysiological सेल गुण 13बदलने महत्वपूर्ण cytoplasmic अणुओं के प्रसार के लिए नेतृत्व कर सकता है । इसके बजाय amphotericin बी के साथ छिद्रित पैच विंयास का उपयोग करने के लिए पैच पिपेट में कोशिका झिल्ली छिद्र , केवल छोटे आयनों 15,16,४३के माध्यम से पारित करने की अनुमति केवल छोटा छेद बना रही है, ४४, हम इस कमजोर पड़ने से बचने और एक लंबे समय के लिए सेल के विद्युत गतिविधि रिकॉर्ड सकता है ।

छिद्रित पैच तकनीक में एक महत्वपूर्ण बिंदु पहले वापस करने के लिए है-रोधी के बिना आईसी समाधान के साथ पिपेट भरने के लिए मध्यम और क्षति खंड के सभी कोशिकाओं को नुकसान जबकि पैच पिपेट के साथ आ से बचने के लिए । वास्तव में, क्योंकि सकारात्मक दबाव के पैच पिपेट के लिए आवेदन किया, जबकि ऊतक आ रहा है, कुछ तरल पैच पिपेट के माध्यम से रिसाव है जब तक पैच बनाया है । यह प्रवाह टिप साफ रखने के लिए जब तक आप लक्षित सेल तक पहुंचने में मदद करता है, लेकिन अगर रोधी पैच किया जाता है इससे पहले कि मध्यम में जारी किया है, यह सभी कोशिकाओं के सभी झिल्ली छिद्र कर सकते हैं, नाटकीय रूप से बदल कोशिका झिल्ली के पारगंय विशेषताओं और इस प्रकार उनके बिजली के गुण हैं ।

प्रस्तुत प्रक्रिया अनुकूलित किया गया है और सफलतापूर्वक medaka gonadotrope कोशिकाओं के विद्युत गतिविधि का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया । इसके अलावा, प्रोटोकॉल medaka और अन्य teleost मछली प्रजातियों के पिट्यूटरी में पाया सभी (अंत: स्रावी) कोशिका प्रकार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ध्यान रखें कि केवल परासरणीयता और पीएच सभी समाधानों के प्रश्न में प्रजातियों के शरीर के तरल पदार्थ के लिए समायोजित किया जाना चाहिए ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

हम उसके medaka सुविधा बनाए रखने में मदद के लिए सुश्री LourdesCarreon जी टैन धंयवाद और उदाहरण के आंकड़े के लिए एंथनी Peltier । यह काम NMBU द्वारा और नॉर्वे, अनुदान संख्या २४४४६१ (जलीय कृषि कार्यक्रम) और २४८८२८ (डिजिटल जीवन नॉर्वे कार्यक्रम) के अनुसंधान परिषद द्वारा वित्त पोषित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000 S
Chirurgical glue WPI VETBOND 3M Vetbond Tissue Adhesive
Stainless steel blades Campden Instruments 752-1-SS
metal molds SAKURA 4122
steel harp Warner instruments 64-1417
PBS SIGMA D8537
Ultrapure LMP agarose invitrogen 166520-100
patch pipettes Sutter Instrument BF150-110-10HP Borosilicate with filament O.D.:1.5 mm, I.D.:1.10 mm
Microscope Slicescope Scientifica pro6000
P-Clamp10 Molecular Devices #1-2500-0180 sofware
Digitizer Digidata 1550A1 Molecular Devices DD1550
Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B Molecular Devices 1-CV-7B
GnRH Bachem 4108604 H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt 
pipette puller Sutter Instrument P-1000
amphotericin B SIGMA A9528 pore-forming antibiotic
polyethylenimine  SIGMA P3143 50% PEI solution
microfiler syringe WPI MF28/g67-5
glass for the agar bridge Sutter Instrument BF200-116-15 Borosilicate with filament O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm Fire polished
Micro-Manager software Open Source Microscopy Software
optiMOS sCMOS camera Qimaging  01-OPTIMOS-R-M-16-C
sonicator Elma D-7700 singen
NaCl SiGMA S3014
KCl SiGMA P9541
MgCl2 SiGMA M8266
D-Glucose SiGMA G5400
Hepes SiGMA H4034
CaCl2 SiGMA C8106
Sucrose SiGMA 84097
D-mannitol SiGMA 63565
MES-acid SIGMA M0895
BSA SIGMA A2153

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १३८ मस्तिष्क-पिट्यूटरी ऊतक-स्लाइस इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी मछली पैच-दबाना अंत में स्रावी कोशिकाओं
स्वस्थ मस्तिष्क-पिट्यूटरी Teleost मछली में पिट्यूटरी कोशिकाओं की Electrophysiological जांच के लिए स्लाइस
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Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien,… More

Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. J. Vis. Exp. (138), e57790, doi:10.3791/57790 (2018).

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