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Neuroscience

Fatias de cérebro-hipófise saudáveis para investigações eletrofisiológicas das células da hipófise em peixes teleósteos

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/57790
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences
* These authors contributed equally

Summary

O artigo descreve um protocolo otimizado para fazer fatias de tecido cerebral-hipófise viável, usando o medaka peixes teleósteos (Oryzias latipes), seguido por gravações eletrofisiológicas de células da hipófise, usando a técnica de remendo-braçadeira com o configuração de remendo perfurada.

Abstract

Foram realizadas investigações eletrofisiológicas das células da hipófise em numerosas espécies de vertebrados, mas muito poucos em peixes teleósteos. Entre estes, a maioria clara foram realizada na dissociadas as células primárias. Para melhorar a nossa compreensão de como teleósteos células da hipófise, comportar-se em um ambiente mais biologicamente relevante, este protocolo mostra como preparar fatias de cérebro-hipófise viáveis usando o medaka pequenos peixes de água doce (Oryzias latipes). Fazendo as fatias de cérebro-pituitária, pH e pressão osmótica de todas as soluções foram ajustados aos valores encontrados em fluidos do corpo dos peixes de água doce, vivendo a 25 a 28 ° C. Após a preparação da fatia, o protocolo demonstra como realizar gravações eletrofisiológicas, usando a técnica de perfurada remendo-braçadeira de células inteiras. A técnica patch-clamp é uma ferramenta poderosa com resolução temporal sem precedentes e sensibilidade, permitindo a investigação das propriedades elétricas das células inteira intactas até canais iônicos único. Remendo perfurado é o único que mantém o ambiente intracelular intacto impedindo que elementos reguladores no citosol sendo diluído pela solução de eletrodo de pipeta de remendo. Em contraste, ao realizar gravações de células inteiras tradicionais, observou-se que as células da hipófise medaka rapidamente perdem a capacidade de disparar potenciais de ação. Entre as várias técnicas de perfuração disponíveis, este protocolo demonstra como realizar a perfuração da membrana remendada usando o fungicida anfotericina b.

Introduction

A hipófise é um órgão endócrino chave nos vertebrados, localizados abaixo do hipotálamo e posteriores para o quiasma óptico. Produz e secreta hormônios de seis a oito dos tipos de célula específica. Hormônios hipofisários constituem um intermediário entre o cérebro e os órgãos periféricos e conduzir a uma grande variedade de processos fisiológicos essenciais, incluindo o crescimento, reprodução e regulação da homeostase. Semelhante a neurônios, células endócrinas da hipófise são eletricamente excitáveis com a capacidade de potenciais de ação de fogo espontaneamente 1. O papel destes potenciais de ação é dependente de célula. Em vários tipos de células da hipófise mamíferos, potenciais de ação podem elevar o intracelular Ca2 + suficientemente para uma liberação sustentada de hormônio 2. Além disso, a hipófise recebe informações estimulatórios e inibitórias do cérebro que afeta o potencial de membrana das células 3,4,5,6. Normalmente, entrada estimulatório aumenta a excitabilidade e muitas vezes envolve a liberação de Ca2 + de lojas intracelulares bem como aumentou a frequência 7a disparar. Compreender como a célula utiliza a composição de canais de íon e adapta-se a estes sinais de entrada do cérebro é chave para a síntese de hormônio de compreensão e libertação.

A técnica da remendo-braçadeira foi desenvolvida na década de 1970 pela Sakmann e Neher 8,9,10 e melhorada pelo Hamill 11e permite investigações detalhadas das propriedades eletrofisiológicas das células até canais de íon único. Além disso, a técnica pode ser usada para estudar a corrente e a tensão. Hoje, remendo de aperto é o padrão de ouro para medir propriedades eletrofisiológicas da célula. Quatro configurações principais da técnica patch-clamp selo apertado foram desenvolvidos 11; o celular conectado, de dentro para fora, o fora-out e o patch de células inteiras. As três primeiras configurações são normalmente utilizadas para investigações de canal único íon. Para o quarto, seguindo a configuração de conexão de celular, um buraco na membrana celular é feito usando a pressão atmosférica sub. Esta configuração também permite que as investigações da composição iônica canal do celular total 12. No entanto, uma limitação dessa técnica é que moléculas citoplasmáticas são diluídas pelo patch pipeta solução 13 (Figura 1A), afetando as respostas elétricas e fisiológicas das células estudadas. Na verdade, algumas dessas moléculas podem desempenhar um papel importante na transdução do sinal ou na regulação dos canais iônicos diferentes. Para evitar isso, Lindau e Fernandez 14 desenvolveu um método onde um composto formadoras de poros é adicionado para a pipeta de remendo. Após a configuração de conexão de celular, o composto irá incorporar a membrana plasmática sob o patch e lentamente perfurar a membrana criando contato elétrico com o citosol (Figura 1B). Podem ser usado vários diferentes antifúngicos tais como nistatina 15 e anfotericina B 16, ou surfactantes como o beta-escina de saponina 17,18 . Estes compostos criar poros grandes o suficiente para permitir que o cátion monovalente e Cl– difusão entre o citosol e a pipeta de remendo, preservando os níveis citosólico de macromoléculas e o maiores íons como Ca2 + 15, 16.

O desafio de usar patch perfurada é a resistência série potencialmente elevados. Resistência série (Rs) ou acesso de resistência é a resistência combinada sobre a pipeta de remendo em relação ao solo. Durante as gravações do remendo-braçadeira, o Rs será em paralelo com a resistência da membrana (Rm). Rm e Rs em trabalho paralelo como um divisor de tensão. Com a alta Rs, a tensão vai cair o Rs dando erros nas gravações. O erro se tornará maior com maiores correntes gravadas. Além disso, o divisor de tensão é também frequência dependente, criando um filtro passa-baixa, afectando assim a resolução temporal. Com efeito, o patch perfurado pode não sempre permitir gravações do grandes e rápidas as correntes como a voltagem dependente correntes at+ (para leituras detalhadas consulte referência 19). Além disso, Rs pode variar durante gravações de remendo-braçadeira, novamente, levando a mudanças na corrente gravada. Assim, falsos positivos podem ocorrer em situações onde Rs muda durante a aplicação da droga.

A eletrofisiologia no tecido cortado foi introduzida primeiramente pelo laboratório para o estudo eletrofisiológicas características dos neurônios no cérebro 20Andersen. A técnica pavimentou o caminho para investigações detalhadas de células únicas, bem como circuitos de comunicações e célula célula célula num ambiente mais intacto. Uma técnica semelhante para fazer fatias da hipófise foi introduzida em 1998 por Guérineau et al 21. no entanto, não foi antes de 2005, que a preparação da fatia do cérebro-hipófise foi usada com sucesso para estudos de remendo-braçadeira em teleósteos 22. Neste estudo, os autores também relataram o uso de gravações de remendo-braçadeira perfurada. No entanto, de longe, a maioria das investigações eletrofisiológicas das células da hipófise foram realizada em mamíferos e apenas um punhado de outros vertebrados, incluindo peixes teleósteos 1,2,22,23 . Em teleósteos, quase todos os estudos foram realizados em células dissociadas primária 24,25,26,,27,28,29,30 .

No presente trabalho, descrevem um protocolo otimizado para preparação de fatias de cérebro-hipófise saudáveis de medaka de peixe o modelo. A abordagem representa várias vantagens em comparação com as culturas de células dissociadas primário. Primeiro, as células são gravadas em um ambiente relativamente preservado em relação ao dissociar as condições de cultura celular. Em segundo lugar, preparações de fatia nos permitem estudar vias indiretas, mediadas por célula-célula comunicação 22, que não é possível em condições de cultura de células dissociadas. Além disso, demonstraremos como realizar gravações eletrofisiológicas sobre as fatias de tecido obtidos utilizando a técnica de perfurada células inteiras remendo-braçadeira com anfotericina B como o agente de formação de poros.

Medaka é um pequeno peixe de água doce nativo da Ásia, encontrada principalmente no Japão. A fisiologia, embriologia e genética do medaka têm sido muito estudadas por mais de 100 anos, 31, e é um modelo de pesquisa comumente usado em muitos laboratórios. De particular importância para este papel é a organização morfológica distinta do complexo hipotálamo-hipófise em peixes teleósteos: Considerando que em mamíferos e aves, os neurônios do hipotálamo liberar os neuro-hormônios regulam as células endócrinas da hipófise para o sistema portal da Eminência mediana, há uma projeção nervosa direta dos neurônios hipotalâmicas para as células endócrinas da hipófise em peixes teleósteos 32. Assim, corte cuidadosamente conduzido de cérebro-hipófise é de particular importância no peixe, que nos permite investigar características eletrofisiológicas das células da hipófise em uma rede de cérebro-hipófise bem preservada e em particular como na hipófise células controlar sua excitabilidade e, assim, a homeostase de Ca2 + .

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Protocol

Todo animal manipulação foi realizada de acordo com as recomendações para o cuidado e bem-estar dos animais de pesquisa na Universidade Norueguesa de Ciências da vida e sob a supervisão de pesquisadores autorizados.

1. preparação de soluções e instrumentos

Nota: Todas as soluções devem ser esterilizadas. Cuidadosa atenção deve ser dada para o pH e a pressão osmótica (osmol/kg de água) de todas as soluções, que deve ser cuidadosamente adaptada para o ambiente extracelular das espécies estudadas. pH e pressão osmótica devem ser ajustados com equipamentos eletrônicos precisos como o medidor de pH e ponto de congelamento aparelhos respectivamente.

  1. Fazer 500 mL de solução extracelular sem Ca2 + (Ca2 + livre CE): 150 mM de NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM MgCl2, glicose de 4 mM, 10 mM Hepes.
    1. Dissolver 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de glicose e 1,19 g de HEPES em 450 mL de ultrapura (0,055 uS / cm a 25 ° C, a resistividade de 18,2 MOhm) H2O num copo de vidro, utilizando um agitador magnético.
    2. Ajuste o pH a 7.75 com NaOH.
    3. Transferi a solução para um balão volumétrico de 500 mL. Encha o balão volumétrico com ultrapura H2O até 500 mL.
    4. Misture a solução bem antes de medir a osmolalidade. Ajuste para 290 – 300 mOsm com manitol. Filtro de esterilizar a solução usando o sistema de aspiração de água e filtro de 0,2 µm.
  2. Fazer 500 mL de solução extracelular (CE): 150 mM de NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, glicose de 4 mM, 10 mM Hepes.
    1. Dissolva 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 147,01 mg de CaCl2, 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de glicose e 1,19 g de HEPES em 450 mL de ultrapura H2O num copo de vidro, utilizando um agitador magnético.
    2. Ajuste o pH a 7.75 com NaOH.
    3. Transferi a solução para um balão volumétrico de 500 mL. Encha o balão volumétrico com ultrapura H2O até 500 mL.
    4. Misture a solução bem antes de medir a osmolalidade. Ajuste para 290 – 300 mOsm com manitol. Filtro de esterilizar a solução usando o sistema de aspiração de água e filtro de 0,2 µm.
  3. Fazer 500 mL de solução extracelular com 0,1% albumina de soro bovino (CE com BSA): 150 mM de NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, glicose de 4 mM, 10 mM Hepes.
    1. Dissolva 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 147,01 mg de CaCl2, 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de glicose e 1,19 g de HEPES em 450 mL de ultrapura H2O num copo de vidro, utilizando um agitador magnético.
    2. Ajuste o pH a 7.75 com NaOH.
    3. Transferi a solução para um balão volumétrico de 500 mL. Encha o balão volumétrico com ultrapura H2O até 500 mL.
    4. Misture a solução bem antes de medir a osmolalidade. Ajuste para 290 – 300 mOsm com manitol. Filtro de esterilizar a solução usando o sistema de aspiração de água e filtro de 0,2 µm. Adicione 50 mg de BSA.
  4. Fazer 250 mL de solução intracelular (IC): 110 mM KOH, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, sacarose 20 mM.
    1. Dissolva 1,54 g KOH, 327,75 mg de KCl, 595,75 mg de HEPES e 1,712 g de sacarose em 450 mL de ultrapura H2O num copo de vidro, utilizando um agitador magnético.
    2. Ajuste o pH para 7.2 com (N-Morpholinos) etano (MES) sulfônico.
    3. Transferi a solução para um balão aferido de 250 mL. Encha o balão volumétrico com ultrapura H2O até 250 mL.
    4. Misture a solução bem antes de medir a osmolalidade. Ajuste a 280 – 290 mOsm (10 mOsm inferior CE) com sacarose. Filtro de esterilizar a solução usando o sistema de aspiração de água e filtro de 0,2 µm.
  5. Fazer 100 mL de solução de agarose derretimento baixo de 2% de Ca2 + e BSA CE livre (livre de 2 g de agarose derretimento baixo em 100 mL de Ca2 + CE). Dissolver usando um microondas e coloque o agarose derretido em um banho de água a 40 ° C. Deixe arrefecer até atingir 40 ° C antes de usar sobre os tecidos.
    Nota: CE, Ca2 + CE livre pode ser armazenado a 4 ° C por várias semanas se estéril e soluções de IC a-20 ° C, durante vários meses. Agarose pode ser armazenado por uma semana a 4 ° C e pode ser reutilizado em 3 a 5 vezes por microondas brevemente. Reutilização excessiva conduzirá a evaporação e alteração de agarose e concentração de sal e de qualidade.
  6. Fazer a ponte de ágar:
    1. Capilares de vidro de borosilicato longa 7,5 mm com diâmetro externo (OD) 2mm de calor e dentro diâmetro (identificação) 1,16 mm, utilizando um bico de Bunsen em um focal ponto cerca de 1/3 de uma ponta até o vidro começa a dobrar. Retirar o vidro da chama e deixar o vidro dobrar com um ângulo de cerca de 120 graus(Figura 2).
    2. Derreta 2% de ágar na CE normal sem glicose usando um microondas, e enquanto a agarose é líquido preencher o capilar usando a capilaridade de vidro pré-fabricados forças, colocando uma das extremidades do vidro no líquido e, esperando por alguns minutos. Loja pontes até o uso em 4 ° C na CE sem glicose.
  7. Prepare-se vidro de borosilicato com pipetas de remendo de filamento usando um extrator de pipeta apropriada. Consulte o manual do extrator de pipeta para obter a resistência desejada do eletrodo.
    Nota: O cone da pipeta deve ser tão curto quanto possível. Atarraxamento curta pipeta é conseguida usando-se puxando passos 4-6. A resistência do eletrodo deve ser entre 2 e 6 MΩ dependendo do tamanho da célula.
  8. Para evitar o movimento do tecido durante os experimentos de remendo-braçadeira revestir a superfície da câmara de gravação com 0,1% do polyethylenimine (PEI) em tampão de borato.
    1. Prepare 500 mL de tampão de borato (25 mM):
      1. Dissolva 4,768 g de Na2B4O710 H2O em 450 mL de ultrapura H2O num copo de vidro, utilizando um agitador magnético.
      2. Ajuste o pH para 8,4 com HCl.
      3. Transferi a solução para um balão volumétrico de 500 mL. Encha o balão volumétrico com ultrapura H2O até 500 mL e 0,2 µm filtro esterilizar a solução usando o sistema de aspiração de água.
    2. Prepare uma solução de 1% das ações de PEI (1 mL 50% PEI para 49 mL de tampão de borato 25 mM) e uma diluição de PEI 0,1% diluição 10 µ l de solução 1% em 100 µ l de tampão de borato para utilização final.
    3. Adicione 2 mL de 0.1% PEI no vidro do titular da fatia e deixe o revestimento incubar durante 1 minuto. Então brevemente lavar o copo duas vezes com 5 mL de ultrapura H2O... e deixe o ar seco até o uso.
  9. Prepare soluções de anfotericina B.
    1. Faça 60 mg/mL de solução dissolvendo-se 3 mg de anfotericina B em pó em 50 µ l dimetil sulfóxido (DMSO), em um tubo de 1 mL, protegido da luz. Vórtice na velocidade máxima por 30 s e proceda à sonicação durante 15 min homogeneizar. Armazenar as alíquotas para tubos de 3 – 5 a-20 ° C e usar a alíquota de um por dia.
      Nota: Se a solução estoque de anfotericina B não é clara e amarela cor mas leitoso (amarelo ainda), depois de 15 – 20 min sonication tornar-se uma nova solução.
    2. Fazer solução de IC com anfotericina B por pipetagem 2ml do IC para um copo de vidro limpo com mais de 10 mL de capacidade. Adicionar 8 µ l de solução-mãe de anfotericina B para a solução da pipeta e misture por pipetagem. Envolva o copo com folha de alumínio e coloque no gelo até o uso e renová-lo a cada 3h.

2. dissecção e cortar com Vibratome

  1. Prepare as ferramentas de dissecação antes de dissecar, incluindo uma afiada e uma pinça forte com uma tesoura. Limpar as ferramentas (suporte do tecido, pincel, pinça) com etanol e certifique-se de que eles são usados apenas para fins de dissecação e nunca em contacto com tecidos fixos. Mantê-los em uma caixa separada para evitar contaminação.
  2. Eutanásia o peixe em água fria de gelo por 1 min.
  3. Siga as etapas subsequentes para dissecar rapidamente o medaka cérebro e hipófise com Pinças afiadas (usar não mais que 3 min).
    1. Enquanto segurando o peixe com a pinça forte grave os dois nervos ópticos atrás dos olhos com uma tesoura ou pinça em ponto.
    2. Abra a parte dorsal do crânio do posterior para o lado anterior por quebrar os ossos do crânio passo a passo com pinça forte.
    3. Retire o crânio de um lado com pinça forte.
    4. Grave da medula espinhal com tesoura ou pinça afiada.
    5. Suavemente, pegar a medula espinhal com a pinça, virar o cérebro de posterior para anterior e coloque-o em um prato com o gelado Ca2 + grátis CE.
  4. Encher um molde de metal3 1,5 a 2 cm com agarose líquido e coloque-o no gelo.
  5. Antes da agarose solidifica (em torno de 25 – 30 ° C), gentilmente agarrar o cérebro pela medula espinhal com o fórceps, secar a pinça com um pedaço de papel fino e coloque o tecido no agarose. Misture rapidamente o agarose para diluir os vestígios da CE o tecido parietal esquerdo e orientar o tecido e deixar o molde em gelo por alguns segundos até que a agarose endurece.
    Nota: É essencial para esta etapa ser rápido. A agarose solidifica rapidamente como o molde metálico é arrefecido pelo gelo.
  6. Corte um bloco quadrado de agarose contendo o tecido com uma lâmina de bisturi e cola-lo no porta-amostra vibratome usando cola de cirurgia (tóxicos).
  7. Encher a cubeta do vibratome receber o suporte de amostra (cérebro-pituitária) com gelado Ca2 + grátis CE.
  8. Introduza o suporte do espécime a vibratome e cortar o bloco de agarose para tornar parasagital seções de 150 µm, usando a alta frequência e a baixa velocidade para o corte. Recolher as seções selecionadas e colocá-los na câmara de gravação de remendo-braçadeira com 3ml da gelada Ca2 + grátis CE.
  9. Coloque a harpa de grade (Figura 2B) na seção de tecido.
    Nota: A harpa será junto com o revestimento estabilizar o tecido e impedir a movimentação durante as gravações de remendo-braçadeira.
  10. Depois a harpa está no lugar, mude o Ca2 + grátis CE médio para o CE normal com Ca2 + e BSA. Deixe o resto de tecido por 10 min.

3. perfurado Patch-clamp e eletrofisiológicas gravações

  1. Antes de iniciar o experimento, o cloreto de prata fio eletrodos pelas seguintes etapas: primeiro, use uma lixa fina (p180) para limpar os eletrodos de fio de prata. Em segundo lugar, enxague com 2 mL, de etanol a 70%. Em terceiro lugar, mergulhe os fios em 2 mL, 2 – 5% de cloro por 10 min. Finalmente, enxaguar com 2 mL, ultrapura H2O.
  2. Coloque a câmara de gravação com a fatia de cérebro-hipófise na fase de microscópio e localizar a área de alvo (hipófise) com objetivo de X 10 e inspecionar as células com o objectivo de X 40.
    Nota: Se a preparação for bem sucedida, muito poucas células redondas devem ser visíveis. Esses redondos são células geralmente danificadas que são desanexação do tecido.
  3. Coloque o eletrodo de aterramento através da ponte de ágar de 2% para o banho do CE.
  4. Localize uma célula saudável usando o objectivo X 40.
    Nota: Uma célula saudável deve ser firmemente anexada para o pedaço de tecido e não arredondada e desanexada da fatia.
  5. Definir o amplificador em tensão-braçadeira (VC; Modo de Figura 4A ponto 1). Abrir o selo teste janela e pressione o banho configuração (Figura 4B os pontos 1 e 2. Use um pulso de 5-mV para monitorar a resistência de pipeta (Figura 4B ponto 3).
  6. A ponta da pipeta com a solução de IC antifúngica gratuita antes de adicionar a solução de IC com anfotericina B, utilizando uma seringa de enchimento microremendo de aterramento (ver Figura 3).
  7. Adicione uma pressão ligeiramente positiva de ar dentro da pipeta de remendo usando a seringa de 1 mL.
    Nota: Isto faz um pequeno fluxo líquido da pipeta remendo que evite a contaminação da ponta.
  8. Uma vez no banho, avaliar a resistência de uma pipeta de remendo e certifique-se de que nenhuma partícula é anexada a ponta da pipeta (Figura 4).
    Nota: Um pequeno pedaço de fita é anexado para o monitor exibindo a forma de gravação de vídeo, o campo de visão. Isso faz com que o posicionamento da pipeta remendo em relação à célula mais fácil quando o objetivo é não focando a célula.
  9. Guia da pipeta de remendo para baixo a célula usando Micromanipuladores.
    Nota: Certifique-se que a pipeta é limpa, procurando por pequenas partículas que podem ter ligado para a ponta da pipeta. Mudanças súbitas na resistência também podem ser um resultado de partículas preso na ponta da pipeta.
  10. Reajustar a pipeta quando alguns mícrons acima a célula para que a ponta da pipeta tocará a célula 1/3 do meio da célula, como mostrado na Figura 5. Quando tocar o celular, liberar a pressão e aplicar a sucção suave para fazer uma vedação.
    Nota: O tempo da pipeta remendo entra o banho para uma bem sucedida selo deve ser mantido tão curtos quanto possível. Não mais do que 1 – 1,5 min para evitar a anfotericina B, atingindo a ponta da pipeta e fuga para o banho.
  11. Imediatamente, alterne para a janela de remendo no software remendo-braçadeira (Figura 4 D ponto 1) e têm um potencial de exploração entre-50 e a-60 mV (ponto4 da figura 2). Zero fora a capacitância rápida composta pela pipeta de vidro (ponto4 da figura 3).
  12. Alterne para a janela da cela no software remendo-braçadeira (Figura 4E os pontos 1 e 2) e iniciar o monitoramento de resistência de acesso, Ra, exibida na janela. Zerar a capacitância de membrana no software do amplificador (Figura 4E ponto 3) após acesso suficiente.
    Nota: Acesso suficiente pode demorar de 10 a 30 min (Figura 4E ponto 2). Um bom acesso para gravações de braçadeira atual deve estar abaixo de 20 M.
  13. Alternar para braçadeira atual, IC, na janela de software do amplificador (Figura 4F ponto 1). Ajuste as correntes rápido-capacitivo na janela - braçadeira do software para o mesmo valor 3.12 amplificador (Figura 4F ponto 2 e 3). Verifica o potencial de membrana (Figura 4F ponto 1).
    Nota: Importante, se o potencial de membrana é superficial (típico acima -35 mV) a célula pode estar danificada. Cancelar a gravação e encontrar uma nova célula.
  14. Depois de encontrar uma célula saudável (firmemente ligado ao tecido com membrana potencial abaixo de -40 mV), começam as gravações experimentais como detalhadas do fabricante protocolo 33,34.

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Representative Results

Este protocolo demonstra um protocolo passo a passo de como conseguir confiança gravações eletrofisiológicas de células da hipófise (gonadotróficas), usando uma linha de transgénicos medaka [Tg (CLB- hrGfpII)] onde o alvo células (Lh-produzindo gonadotropes) são etiquetados com proteína verde fluorescente (GFP).

Inicialmente, as investigações eletrofisiológicas foram realizadas usando a configuração de células inteiras. No entanto, potenciais de ação espontâneos não foram observados em qualquer uma das células estudadas. Em um subconjunto de células, potenciais de ação pode ser acionados usando injeções atuais pequenas (5-9-pA) de um potencial de repouso entre-50 e a-60 mV (Figura 6). Estes potenciais de ação tinha um resumo rápido e potenciais de ação desencadeadas após cerca de 4-6 min já não eram possíveis. A particularmente rápida degradação observada pode ser explicada do tamanho de pequenas células. Em geral, as células da hipófise são menores que os neurônios 30. Por exemplo, a membrana média capacitância de intervalos de células gonadotróficas entre 4 e 10 pF 3,30,35. Semelhante ao medaka descobertas células gonadotróficas tinham uma capacitância de membrana média de pF de 3,4 ± 0,9 (média ± SD) (n = 67).

Mudar para configuração do remendo perfurada usando a anfotericina B, potenciais de ação espontâneos foram observados em cerca de 50% das células gravadas (Figura 7A, n = 63 células de 21 animais). Além disso, potenciais de ação pode ter sido causadas em 95% dessas células não observáveis Resumo mesmo após gravações prolongadas (até 1 h). Importante, para realizar gravações confiáveis e de alta qualidade, é necessário primeiro preencher a ponta com solução IC antifúngico. Se pequenas quantidades de antifúngicos escapam a ponta da pipeta antes de fazer o gigaseal, pode danificar a célula-alvo como células bem como circundantes.

Para testar se as células na configuração do patch perfurada são capazes de responder às sua principal hormônio liberador, aplicamos 1 sopro de Gnrh1 µM ejetado nas células alvo. Os experimentos foram realizados no grampo atual para permitir-nos monitorar as alterações na tensão. Estas experiências revelaram uma resposta bifásica (Figura 7-B). A primeira fase é uma hiperpolarização onde a liberação de Ca2 + de lojas internas ativar Ca2 + ativado K+ canais causando a hiperpolarização. A primeira fase é seguida por uma despolarização e frequência de maior potencial de ação de 1 a 2 Hz para cerca de 3 Hz. Em algumas das gravações, a segunda fase teve pseudo potenciais de platô onde 2 ou 3 pequenos picos foram observados antes de repolarização.

Figure 1
Figura 1 : Diferença entre a célula inteira (A) e as configurações de remendo perfuradas (B) da técnica patch-clamp. Na configuração de células inteiras (A), depois que gigaseal está no lugar, um buraco é feito na membrana aplicando uma pequena pressão negativa dentro da pipeta de remendo. Nesta configuração, moléculas intracelulares importantes, tais como moléculas de sinalização podem ser diluídas em solução de pipeta o remendo afetando as respostas elétricas e fisiológicas da célula. Este fenómeno é ainda mais importante em pequenas células, como células da hipófise. Em contraste, na configuração perfurado-remendo (B), gigaseal, contato elétrico entre o citosol e o patch a seguir pipeta é composta de antifúngicos ou surfactantes. O antifúngico ou surfactante é carregado dentro da pipeta de remendo antes de remendar e será incorporada a membrana plasmática sob o patch, assim lentamente perfurando a membrana, permitindo apenas pequenas moléculas como íons monovalentes para passar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Fotos da ponte de ágar (A) e a harpa (B) usadas no protocolo. Escala em mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Enchimento da pipeta-patch. (A) solução IC antifúngico livre (líquido azul) é backfilled por forças capilares devido o filamento dentro da pipeta. (B) depois de encher a ponta da pipeta com antifúngico IC livre, a parte posterior da pipeta é preenchido com solução de IC contendo anfotericina B (líquido amarelo) usando uma agulha de seringa (enchimento do micro). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4A
Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4B
Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4C
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Figure 4D
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Figure 4E
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Figure 4F
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Figura 4 : Software screenshots. Janela de software amplificador mostrando (A). 1. destaques (círculo vermelho) a área de modo que permite alternar entre grampo de tensão (VC), braçadeira atual sem qualquer injeção atual (eu = 0) e pinça atual com possibilidade para injeções de corrente (IC). 2 destaques (círculo vermelho) a área para ajustar a corrente capacitiva rápido no grampo de tensão, bem como ajustes de corrente capacitivos célula inteira. (B) mostra o software remendo-braçadeira com a janela de teste de membrana aberto. 1. destaques (círculo vermelho) o botão de teste de membrana. 2. o pulso de diferentes configurações, banho, Patch e célula, destaca (círculo vermelho). 3. destaques (círculo vermelho) a frequência e a amplitude de pulso configuração. (C-F) mostra uma viúva combinada do remendo-braçadeira software (à esquerda) e software (direito) do amplificador. (C) destaques (círculo vermelho) a resistência quando a pipeta é no banheiro e adequado aterramento usando a ponte de ágar (no modo de banho). (D) 1. Destaques (círculo vermelho) a mudar para o modo de Patch gigaseal a seguir. 2. destaques (círculo vermelho) a configuração do pulso (pulso de 10 mV) e o potencial de exploração ajustadas de -60 mV. 3. destaques (círculo vermelho) a janela para corrigir ou zerar as rápido-capacitivo correntes seguindo um selo de giga. (E) 1. Destaques (círculo vermelho) o modo celular para monitorar a resistência de acesso. 2 destaques (círculo vermelho) os parâmetros de célula, a capacitância de membrana (Cm), selem de qualidade (Rm), resistência de acesso (Ra), a constante de tempo (Tau) e segurando a corrente (Hold). 3. realça (círculo vermelho) o botão para corrigir as correntes capacitivas de membrana. (F) 1. Destaques (círculo vermelho) o modo de IC para o monitoramento do potencial de membrana. 2. destaques (círculo vermelho) o botão para mudar para ajustes de braçadeira atual (I-braçadeira). 3. destaques (círculo vermelho) a janela para corrigir as correntes rápido-capacitivo.

Figure 5
Figura 5 : Micrografia de uma remendo-braçadeira de gravação em uma célula na hipófise, usando a configuração de remendo perfurada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 : Gravações de braçadeira atual de um GFP-etiquetado Lh-produzir células após injeções atuais usando a configuração normal de células inteiras. As células foram mantidas entre-50 e a-60 mV. Potenciais de ação típicas poderia ser acionados em um subconjunto de células usando injeções atual de 5 a 10 pA imediatamente após ter conseguido acesso à célula (traço preto). Após 1 a 3 min a amplitude do potencial de ação começou a diminuir, um sinal típico de resumo (rastreamento ciano). Depois de 4-6 min a amplitude do potencial de ação desapareceu quase completamente (traço magenta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7 : Braçadeira atual de gravação em uma célula de GFP-etiquetado Lh-produzir usando a configuração de remendo perfurada, após estimulação com o hormônio liberador de gonadotrofinas Gnrh1. (A) atual gravação de braçadeira demonstrando potenciais de ação espontâneas de uma célula de gonadotróficas produção de Lh. (B) A resposta de bifásico onde Gnrh1 estimulação para 10 s primeiro induziu uma hiperpolarização da membrana celular, seguido por uma despolarização e aumentaram a queima de frequência (de 1 a 2 Hz-3 Hz) dos potenciais de ação em uma célula que anteriormente demitido potenciais de ação espontâneos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Eletrofisiológicas gravações usando a técnica patch-clamp em fatias de cérebro-hipófise exigem cuidadosa otimização. Protocolos bem otimizados para a realização de investigações de viver-pilha especificamente em teleósteos são limitados, com a maioria das publicações usando protocolos baseados em sistemas de mamíferos. A este respeito, é importante estar ciente do fato de que vários parâmetros fisiológicos como pH e pressão osmótica são não só espécies dependentes, mas também muito dependente se o organismo em questão vive na terra ou na água. Para os peixes, é também necessário, ter em conta, se eles vivem em um ambiente marinho ou de água doce. Por exemplo, a pressão parcial do CO2 é muito menor nos peixes em comparação aos mamíferos, com níveis variando de 1,7-3,4 mmHg pCO2 em peixes e 40 – 46 mmHg pCO2 em mamíferos 36. Com base nisso, podemos ajustar o pH a 7,75 37,38,39,40 em todas as soluções utilizadas no protocolo atual. Também utilizamos tampão HEPES, como tem sido mostrado possuir excelentes capacidades de buffer na região de pH de 7,4-7,8 41. Para a osmolalidade, usamos 290 – 300 mOsm, que é o que foi medido no meio extracelular do medaka 42. A temperatura utilizada durante as gravações eletrofisiológicas foi selecionada de acordo com o ambiente do peixe. Com efeito, medaka é viver em águas com uma ampla faixa de temperatura (de 4 a 40 ° C), enquanto em nosso laboratório que são criados em um ambiente controlado, 26 e 28 ° c. Com base nisso, realizamos nossas gravações à temperatura ambiente (aproximadamente 25 ° C), diferente do que é usado para tecidos de mamíferos (37 ° C) ou para espécies de peixes de água fria como o bacalhau do Atlântico (12 ° C) 18.

Para ser capaz de corrigir as células da hipófise, é fundamental para gerar fatias de tecido saudável. É imperativo usar ferramentas limpas (suporte do tecido, pincel, pinça, etc) que são apenas em contacto com tecidos vivos (sem álcool). Uma rápida dissecação do cérebro e hipófise e manter o tecido em baixa temperatura (4 ° C) enquanto dissecando e corte são outros fatores-chave para fornecer seções viáveis. Deve também prestar-se atenção específica para a temperatura da agarose mediante incorporação de tecido. Agarose demasiado quente pode danificar o tecido enquanto agarose muito frio não vai deixar você tempo para orientar o tecido para corte adequada. Além disso, o corte deve ser feito com solução de CE sem Ca2 + para evitar as células danificadas após seccionamento para entrar em apoptose. Borbulhando não é necessário, mas as fatias de tecido devem ser coletadas imediatamente após o corte. Embora a fatia de cerca de 15 min após o corte para permitir que as células descansar um pouco antes de remendar.

Peixes teleósteos são excelentes modelos para investigar Propriedades eletrofisiológicas das células da hipófise. Com efeito, ao contrário de mamíferos e aves, peixes não possuem uma eminência mediana, significa que os neurônios hipotálamo controla a hipófise diretamente projectam seus axônios em suas células de destino 32. Assim, em uma fatia do cérebro-hipófise, as células da hipófise são mantidas em um ambiente mais intacto, em comparação com as culturas de células da hipófise primária onde as células são dissociadas usando tratamentos químicos e mecânicos. Curiosamente, usando o cérebro-hipófise fatias de medaka, pudemos observar que o potencial de ação disparando com frequência nas células Lh, após a ativação de Gnrh1, aumentada (Figura 5). Estas observações estão de acordo com o que tem sido relatado em estudos de cultura de células da hipófise de nosso próprio laboratório 29 indicando que o uso de culturas de células da hipófise primária ainda são relevantes para caracterizar as propriedades da membrana das células da hipófise. No entanto, fatias de cérebro-hipófise nos permitem estudar também efeitos indiretos de diferentes compostos, bem como as interações entre as células, como ele mantém conexões estruturais que são perdidas em culturas de células da hipófise primário. Além disso, fatia de preparação é mais rápido para preparar em comparação com uma cultura dissociada célula primária e eletrofisiológicas gravações podem ser realizadas nos seguinte 30 min após a dissecação. Isto significa que, ao contrário de uma cultura de células primárias, ritmos circadianos podem ser abordados de uma forma significativa usando fatias preparadas na hora.

Por causa do pequeno tamanho das células da hipófise de peixes (capacitância da membrana em torno de 3-10 pF) e nossas próprias observações, mostrando que as células gonadotróficas perdem a capacidade de disparar potenciais de ação (Figura 3) e, portanto, perdem a capacidade de responder a liberando hormônios durante a gravação na configuração de célula inteira, decidimos usar e apresentar a técnica de patch perfurada neste documento. Com efeito, ficou demonstrado que a configuração da célula inteira poderia levar para a difusão de moléculas citoplasmáticas importantes, alterando assim a célula eletrofisiológicos propriedades 13. Em vez disso usando as configurações de remendo perfurada com anfotericina B para perfurar a membrana celular para a pipeta de remendo, fazendo apenas pequenos orifícios permitindo apenas pequenos íons para passar por 15,16,43, 44, poderíamos evitar esta diluição e registro da atividade elétrica da célula durante um tempo prolongado.

Um ponto importante na técnica de patch perfurada é para primeira volta-encher a pipeta com a solução de IC sem antifúngicos para evitar liberando antifúngicos para o meio e danificar todas as células da seção enquanto se aproximava com a pipeta de remendo. Na verdade, por causa da pressão positiva aplicada a pipeta remendo enquanto se aproximava do tecido, algum líquido está vazando através da pipeta de remendo até o patch é feito. Este fluxo ajuda a manter a ponta limpa até chegar a célula alvo, mas se antifúngico é liberado no meio antes que o patch é feito, ele pode perfurar todas as membranas de todas as células, mudando drasticamente as características permeáveis das membranas celulares e, portanto, suas propriedades elétricas.

O procedimento apresentado foi otimizado e utilizado com sucesso para estudar a atividade elétrica das células gonadotróficas de medaka. Além disso, o protocolo pode ser usado para estudar todos os tipos de células (endócrino) encontrados na hipófise de medaka e outras espécies de peixes teleósteos. Lembre-se apenas que a pressão osmótica e o pH de todas as soluções devem ser reguladas para que os fluidos do corpo da espécie em questão.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar

Acknowledgments

Agradecemos a Sra. LourdesCarreon G Tan para lhe ajuda a manter as instalações de medaka e Anthony Peltier para as figuras ilustrativas. Este trabalho foi financiado pelo NMBU e pelo Conselho de pesquisa da Noruega, concessão números 244461 (programa de aquicultura) e 248828 (programa de vida Digital Noruega).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000 S
Chirurgical glue WPI VETBOND 3M Vetbond Tissue Adhesive
Stainless steel blades Campden Instruments 752-1-SS
metal molds SAKURA 4122
steel harp Warner instruments 64-1417
PBS SIGMA D8537
Ultrapure LMP agarose invitrogen 166520-100
patch pipettes Sutter Instrument BF150-110-10HP Borosilicate with filament O.D.:1.5 mm, I.D.:1.10 mm
Microscope Slicescope Scientifica pro6000
P-Clamp10 Molecular Devices #1-2500-0180 sofware
Digitizer Digidata 1550A1 Molecular Devices DD1550
Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B Molecular Devices 1-CV-7B
GnRH Bachem 4108604 H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt 
pipette puller Sutter Instrument P-1000
amphotericin B SIGMA A9528 pore-forming antibiotic
polyethylenimine  SIGMA P3143 50% PEI solution
microfiler syringe WPI MF28/g67-5
glass for the agar bridge Sutter Instrument BF200-116-15 Borosilicate with filament O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm Fire polished
Micro-Manager software Open Source Microscopy Software
optiMOS sCMOS camera Qimaging  01-OPTIMOS-R-M-16-C
sonicator Elma D-7700 singen
NaCl SiGMA S3014
KCl SiGMA P9541
MgCl2 SiGMA M8266
D-Glucose SiGMA G5400
Hepes SiGMA H4034
CaCl2 SiGMA C8106
Sucrose SiGMA 84097
D-mannitol SiGMA 63565
MES-acid SIGMA M0895
BSA SIGMA A2153

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References

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Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. J. Vis. Exp. (138), e57790, doi:10.3791/57790 (2018).

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