Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Sağlıklı beyin hipofiz dilimleri Teleost balık hipofiz hücreleri elektrofizyolojik araştırmalar için

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/57790
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Hipofiz hücreleri ile yama-klemp tekniği kullanarak elektrofizyolojik kayıtlar ardından kalıcı beyin hipofiz doku dilimleri, teleost balık medaka (Oryzias latipes), kullanarak yapmak için en iyi duruma getirilmiş bir protokol makalede delikli yama yapılandırma.

Abstract

Çok sayıda omurgalı tür, ama çok az teleost balık hipofiz hücreleri elektrofizyolojik araştırmalar yapılmıştır. Bunlar arasında açık çoğunluk Disosiye primer hücre gerçekleştirdiniz. Daha biyolojik ilgili bir ortamda davranır, nasıl teleost hipofiz hücreleri anlayışımızı geliştirmek için bu protokol küçük tatlı su balığı medaka (Oryzias latipes) kullanarak kalıcı beyin hipofiz dilimleri hazırlamak gösterilmiştir. Beyin hipofiz dilimleri yapma, pH ve tüm çözümleri osmolalite vücut sıvıları 25-28 ° C'de yaşayan tatlı su balık içinde bulunan değerleri için ayarlandı Dilim hazırlık protokol elektrofizyolojik kayıtlar delikli bütün hücreli yama-klemp tekniği kullanarak yapmak gösterilmiştir. Yama-klemp tekniği benzeri görülmemiş zamansal çözünürlük ve hassasiyet, soruşturma tek iyon kanalları aşağı olduğu gibi tüm hücrelerden elektriksel özellikleri sağlayan güçlü bir araçtır. Delikli yama yama pipet elektrot çözüm tarafından seyreltilmiş sitozol düzenleyici elemanlarının bozulmadan önleme hücre içi çevre tutar benzersizdir. Buna ek olarak, geleneksel bütün hücreli kayıtları yapılırken, bu medaka hipofiz hücreleri hızlı bir şekilde Aksiyon potansiyelleri ateş yeteneklerini kaybedecekler gözlendi. Çeşitli perforasyon teknikleri arasında bu iletişim kuralını perforasyon Amfoterisin B. mantar ilacı kullanma yamalı membran ulaşmak gösterilmiştir

Introduction

Hipofiz omurgalılarda hipotalamus aşağıda yer alan ve posterior optik hemisferlerine için anahtar bir endokrin organdır. Bu üretir ve altı ya da sekiz hormonlar belirli hücre türleri salgılar. Hipofiz hormonları beyin ve periferik organlarda arasında bir ara oluşturmaktadır ve temel fizyolojik süreçleri büyüme, üreme ve homeostasis düzenlenmesi de dahil olmak üzere geniş bir sürücü. Nöronlar, hipofiz endokrin hücreleri benzeri elektrikle heyecanlı aksiyon potansiyelleri kendiliğinden ateş yeteneği ile 1. Bu aksiyon potansiyelleri hücre bağımlı roldür. Birkaç hücre tür memeli hipofiz, Aksiyon potansiyelleri intrasellüler Ca2 + hormon 2sürekli bir sürümü için yeteri kadar yükseltebilir. Buna ek olarak, hipofiz hücreleri 3,4,5,6membran potansiyelini etkileyen beyin uyarıcı ve inhibitör bilgilerini alır. Genellikle, uyarıcı giriş uyarılabilirlik artırır ve sık sık açıklaması, Ca2 + hücre içi mağaza içerir yanı sıra frekans 7ateş arttı. Nasıl hücre iyon kanal kompozisyon kullanır ve bu giriş sinyalleri beyinden adapte anlayış hormon sentezi ve serbest bırakmak için anahtardır.

Yama-klemp tekniği 1970'lerin sonunda Sakmann ve Neher 8,9,10 tarafından geliştirilen ve Hamill 11tarafından daha da geliştirilmiş ve ayrıntılı araştırmalar hücrelerin elektrofizyolojik özellikleri sağlar tek iyon kanalları aşağı. Ayrıca, teknik akım ve gerilim eğitim için kullanılabilir. Bugün, yama sıkma elektrofizyolojik hücre özelliklerini ölçmek için altın standart 's. Dört büyük yapılandırmaları sıkı mühür yama-klemp tekniği, Gelişmiş 11gelmiş; hücre bağlı, Inside out, dış-out ve bütün hücreli yama. Üç ilk yapılandırmasından genellikle tek iyon kanal araştırmalar için kullanılır. Hücre bağlı yapılandırma aşağıdaki 4 Temmuz'da, hücre zarının delik alt atmosferik basınç kullanılarak yapılır. Bu yapılandırma aynı zamanda araştırmalar iyon kanal kompozisyon tüm cep telefonu 12sağlar. Ancak, bir bu teknik sitoplazmik molekülleri böylece okudu hücrelerinin elektrik ve fizyolojik tepkileri etkileyen yama pipet çözüm 13 tarafından (Şekil 1A), seyreltilmiş kısıtlamasıdır. Nitekim, bazı bu moleküller sinyal iletim veya farklı iyon kanalları düzenlenmesi önemli rol oynayabilir. Bunu önlemek için bir gözenek oluşturmayan bileşik yama pipet eklendiği Lindau ve Fernandez 14 bir yöntem geliştirdi. Hücre bağlı yapılandırma bileşik yama altında plazma zarı içine dahil ve yavaş yavaş elektriksel temas sitozol (Şekil 1B) ile oluşturma membran sorgulamaktı. Nistatin 15 ve Amfoterisin B 16gibi birkaç farklı antifungaller veya yüzey saponin beta-escin 17,18 gibi kullanılabilir. Bu bileşiklerin gözenekleri monovalent katyon ve Cl- difüzyon sitozol ve yama pipet arasında sitozolik düzeyini oluştururlar ve Ca2 + 15gibi daha büyük iyonları korunması sırasında izin vermek için yeterince büyük oluşturmak, 16.

Delikli yama kullanılarak meydan potansiyel yüksek serisi dirençtir. Seri direnç (Rs) ya da erişim direnç yama pipet yere göre kombine direniş bitti. Yama-kelepçe kayıtları sırasında Rs membran direnci ile paralel olacak (Rm). Rm ve Rs bir gerilim bölücü olarak paralel çalışma. İle yüksek Rs, gerilim hataları kayıtları veren Rs üzerine düşecek. Hata kaydedilen büyük akımları ile daha büyük olacak. Buna ek olarak, gerilim bölücü de böylece zamansal çözünürlük etkileyen bir alçak geçiren filtre oluşturma bağımlı sıklığıdır. (Bkz: ayrıntılı okumalar referans 19için) gerilim Na+ akımları geçişli gibi sonuç olarak, delikli yama her zaman daha büyük ve hızlı akıntılar kayıtları izin vermeyebilir. Ayrıca, Rs yama-kelepçe kayıtları, yeniden kaydedilen geçerli değişiklikleri önde gelen sırasında değişebilir. Bu nedenle, yanlış pozitif Rs ilaç uygulama sırasında değiştiği durumlarda oluşabilir.

Elektrofizyoloji dilimlenmiş doku üzerinde ilk beyin 20nöronlarda elektrofizyolojik özellikleri çalışmaya Andersen laboratuvar tarafından kullanılmıştır. Tekniği detaylı araştırmalar tek hücreleri hem de daha sağlam bir ortamda hücre-hücre iletişim ve hücre devreleri açtı. Hipofiz dilimleri yapmak için benzer bir teknik Guérineau ve ark. tarafından 1998 yılında tanıtıldı 21. ancak, değildi 2005'ten önce bu beyin hipofiz dilim hazırlık şekilde teleost 22çalışmalarda yama-kelepçe için kullanıldı. Bu çalışmada yazarlar da delikli yama-kelepçe kayıtları kullanımı bildirdi. Ancak, uzak, hipofiz hücreleri elektrofizyolojik araştırmalar çoğu memeliler ve diğer omurgalı teleost balık 1,2,22,23 de dahil olmak üzere, sadece bir avuç yapılmıştır . Teleosts içinde birincil Disosiye hücreleri 24,25,26,27,28,29tarihinde,30 neredeyse tüm çalışmaları yapıldı .

Bugünkü yazıda, sağlıklı beyin hipofiz dilimleri modeli balık medaka üzerinden hazırlanması için en iyi duruma getirilmiş bir protokol anahat. Yaklaşım birçok avantaj birincil Disosiye hücre kültürleri için karşılaştırıldığında temsil eder. İlk olarak, hücreleri ayrışmış olan hücre kültür koşulları ile karşılaştırıldığında göreceli olarak korunmuş bir ortamda kaydedilir. İkinci olarak, dilim hazırlıklar dolaylı yollar hücre-hücre iletişim 22tarafından hangi Disosiye hücre kültür koşullarda mümkün değildir aracılı çalışma izin. Ayrıca, biz nasıl yürütüleceği delikli bütün hücreli yama-klemp tekniği Amfoterisin B ile gözenek oluşturan Aracısı olarak kullanarak elde edilen doku dilimleri üzerinde elektrofizyolojik kayıtları göstermek.

Medaka Asya, öncelikle Japonya'da bulunan yerel bir küçük tatlı su balığı var. Fizyoloji, Embriyoloji ve genetik medaka, 100'den fazla yıl 31için kapsamlı bir şekilde incelenmiştir ve birçok laboratuarlarında yaygın olarak kullanılan araştırma modeli. Bu kağıt için özellikle önem farklı morfolojik teleost balık hipotalamus-hipofiz kompleks organizasyondur: memeliler ve kuşlar hipotalamik nöronlar nöro-hipofiz bezi endokrin hücreleri düzenleyen hormonları yayın ise medyan Hazretleri, portal sisteme doğrudan sinir projeksiyon teleost balık 32hipofiz endokrin hücreleri üzerine hipotalamik nöronların vardır. Böylece, dikkatle yürütülen beyin hipofiz Dilimleme 's ile balık, iyi korunmuş bir beyin hipofiz ağ hipofiz hücreleri ve özellikle nasıl hipofiz hücreleri elektrofizyolojik özellikleri araştırmak bize izin verdiği önem onların uyarılabilirlik kontrol ve böylece Ca2 + homeostazı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan işleme göre bakım ve Norveççe Üniversitesi'nde araştırma hayvan refahı için öneriler yaşam bilimleri ve yetkili müfettişler gözetimi altında gerçekleştirildi.

1. hazırlanması aletleri ve çözümleri

Not: Tüm çözümler steril olmalıdır. Dikkat pH ve dikkatle okudu tür hücre dışı ortama adapte edilmelidir tüm çözümler osmolalite (osmol/kg su) verilmesi gerekir. pH ve osmolalite pH metre ve donma noktası osmometer gibi hassas elektronik ekipman ile anılan sıraya göre ayarlanmalıdır.

  1. 500 mL olmadan Ca2 + ekstra hücresel çözeltisi yapmak (Ca2 + EC ücretsiz): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.3 mM MgCl2, 4 mM glikoz, 10 mM Hepes.
    1. 4,38 gram NaCl, 186.37 mg KCl, MgCl2, 360.32 mg glikoz ve HEPES 1.19 g ultrasaf 450 ml 61.89 mg dağıtılması (0,055 uS / cm 25 ° c, 18,2 MOhm direnci) H2O manyetik karıştırıcı kullanarak bir cam ölçek.
    2. PH 7,75 NaOH ile için ayarlayın.
    3. Çözüm 500 mL volumetric flask aktarın. Volumetric flask ultrasaf H2ile O kadar 500 mL doldurun.
    4. Çözüm de osmolalite ölçme önce karıştırın. 290-300 mOsm mannitol ile için ayarlayın. Filtre su vakum sistemi ve 0.2 µm filtresi kullanarak çözüm sterilize.
  2. Ekstra hücresel çözüm (EC) 500 mL olun: 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.3 mM MgCl2, 4 mM glikoz, 10 mM Hepes.
    1. NaCl 4,38 g, KCl 186.37 mg, CaCl2147.01 mg, MgCl261.89 mg, glikoz 360.32 mg ve HEPES 1.19 g ultrasaf H2O manyetik karıştırıcı kullanarak bir cam kabı içinde 450 ml geçiyoruz.
    2. PH 7,75 NaOH ile için ayarlayın.
    3. Çözüm 500 mL volumetric flask aktarın. Volumetric flask ultrasaf H2ile O kadar 500 mL doldurun.
    4. Çözüm de osmolalite ölçme önce karıştırın. 290-300 mOsm mannitol ile için ayarlayın. Filtre su vakum sistemi ve 0.2 µm filtresi kullanarak çözüm sterilize.
  3. 500 mL %0,1 sığır serum albumin (EC BSA ile) ile ekstra hücresel çözeltisi olun: 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.3 mM MgCl2, 4 mM glikoz, 10 mM Hepes.
    1. NaCl 4,38 g, KCl 186.37 mg, CaCl2147.01 mg, MgCl261.89 mg, glikoz 360.32 mg ve HEPES 1.19 g ultrasaf H2O manyetik karıştırıcı kullanarak bir cam kabı içinde 450 ml geçiyoruz.
    2. PH 7,75 NaOH ile için ayarlayın.
    3. Çözüm 500 mL volumetric flask aktarın. Volumetric flask ultrasaf H2ile O kadar 500 mL doldurun.
    4. Çözüm de osmolalite ölçme önce karıştırın. 290-300 mOsm mannitol ile için ayarlayın. Filtre su vakum sistemi ve 0.2 µm filtresi kullanarak çözüm sterilize. 50 mg BSA ekleyin.
  4. İntraselüler çözeltinin (IC) 250 mL olun: 110 mM KOH, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, 20 mM sükroz.
    1. 1,54 g KOH, KCl 327.75 mg, HEPES 595.75 mg ve ultrasaf H2O manyetik karıştırıcı kullanarak bir cam kabı içinde 450 ml sukroz 1,712 g geçiyoruz.
    2. PH 7.2 asitle (N-morpholino) etan sulfonic (MES) için ayarlayın.
    3. Çözüm 250 mL volumetric flask aktarın. Volumetric flask ultrasaf H2ile O kadar 250 mL doldurun.
    4. Çözüm de osmolalite ölçme önce karıştırın. Sükroz ile 280-290 mOsm (10 mOsm EC düşük) için ayarlayın. Filtre su vakum sistemi ve 0.2 µm filtresi kullanarak çözüm sterilize.
  5. Ca2 + ve BSA ücretsiz EC 100 mL % 2 düşük erime özel çözeltisi yapmak (düşük erime özel Ca2 + 100 ml 2 g ücretsiz EC). Bir mikrodalga kullanılarak dağıtılması ve erimiş özel bir su banyosu 40 ° C'de yerleştirin 40 ° C dokular üzerinde kullanmadan önce ulaşıncaya kadar aşağı soğumaya bırakın.
    Not: EC, ücretsiz EC 4 ° C'de birkaç hafta Eğer steril ve IC çözümleri-20 ° C'de için birkaç ay depolanabilir Ca2 + . Özel bir hafta 4 ° C'de depolanan ve 3-5 kez kısaca mikrodalga tarafından yeniden kullanılabilir. Aşırı yeniden buharlaşma ve değişiklik özel ve tuz konsantrasyonu ve kalite yol açacaktır.
  6. Agar köprü yapmak:
    1. 7.5 mm uzun borosilikat cam kılcal dış çap (OD) 2 mm ile ısı ve cam bend başlayıncaya kadar iç çapı (kimlik) 1.16 Bunsen burner bir odak kullanarak mm yaklaşık 1/3 bir ucundan üzerine gelin. Cam alev kaldırmak ve cam (Şekil 2A) yaklaşık 120 derecelik bir açı ile viraj izin.
    2. Normal EC %2 agar olmadan bir mikrodalga kullanarak glikoz ve özel sıvı dolgu cam ucuna birini sıvı içine koyarak ve birkaç dakika için bekleyen önceden yapılmış cam capillarity kullanarak kapiller kuvvetleri ise boğulmak. EC 4 ° C glikoz olmadan kullanımı kadar köprüleri depolamak.
  7. Borosilikat cam bir uygun pipet çektirmenin kullanarak filaman yama Pipetler ile hazırlayın. İstenen elektrot direnç elde etmek için pipet çektirme el kitabına başvurun.
    Not: Pipet ucu olabildiğince kısa olmalıdır. Kısa pipet konik 4-6 çekerek adımlar kullanılarak elde edilir. Elektrot direnç 2 ve 6 MΩ bağlı olarak hücre boyutu arasında olmalıdır.
  8. Yama-kelepçe deneyler sırasında doku hareketi önlemek için kayıt odası % 0,1 oranında polyethylenimine (PEI) Bor tampon ile yüzey kat.
    1. Bor arabelleği (25 mM) 500 mL hazırlayın:
      1. Na2B4O710 H2O 450 ml ultrasaf H2O manyetik karıştırıcı kullanarak bir cam ölçek 4.768 g geçiyoruz.
      2. PH HCl ile 8,4 için ayarlayın.
      3. Çözüm 500 mL volumetric flask aktarın. Volumetric flask ultrasaf H2ile O su vakum sistemi kullanarak solüsyonu 500 mL ve 0.2 µm filtre sterilize dolduramazsınız.
    2. % 1'stok çözüm PEI (1 mL % 50 PEI 49 mL 25 mM bor arabelleğine) ve % 0.1 PEI seyreltme sulandrarak 10 µL bor arabelleği 100 µL % 1'stok çözümün nihai kullanım için hazırlayın.
    3. Dilim tutucu camın üzerine 2 mL % 0,1 PEI eklemek ve 1 dakikadır kuluçkaya kaplama. O zaman kısaca ultrasaf H2O iki kez ile 5 mL bardak yıkama ve kullanım kadar kuru hava girsin.
  9. Amfoterisin B çözümleri hazırlayın.
    1. 60 mg/mL stok çözüm 3 mg 50 µL dimetil sülfoksit (DMSO), Amfoterisin B tozu çözülerek ışıktan korunan 1 mL tüp içinde olun. Girdap 30 için maksimum hızda s ve 15dk için homojenize solüsyon içeren temizleyicide. -20 ° C'de 3-5 tüpler içine aliquots kapaklarý takýlý günlük bir aliquot.
      Not: Amfoterisin B hisse senedi çözüm açık ve sarı yoksa renk ama sonra 15-20 dk sonication sütlü (hala sarı) yeni bir hisse senedi çözüm alın.
    2. IC çözüm Amfoterisin B ile IC tarafından pipetting 2 mL 10 mL kapasite fazlası ile temiz cam kabı içine olun. Amfoterisin B hisse senedi çözüm 8 µL pipet çözüm içine ve pipetting tarafından karıştırın. Alüminyum folyo ve yer ile kabı buz kadar kullanmak sarın ve her 3 h yenilemek.

2. diseksiyon ve Vibratome ile dilimleme

  1. Diseksiyon araçları dissekan önce bir güçlü forseps ve keskin bir makasla dahil olmak üzere hazırlayın. Etanol araçlarıyla (doku tutucu, fırça, forseps) temiz ve diseksiyon amaçlı ve asla sabit dokular ile temas halinde kullanıldıkları emin olun. Onları kirlenmesini önlemek için ayrı bir kutuda tutun.
  2. 1 dk. için soğuk buz suda balık ötenazi.
  3. Hızlı bir şekilde medaka beyin ve hipofiz keskin forseps (en fazla 3 dk kullanın) incelemek için sonraki adımları izleyin.
    1. Balık güçlü forseps ile şiddetli gözlerinin arkasında iki görme sinirini makasla tutarak iken veya forseps keskin.
    2. Dorsal Kafatası parçası arka ön tarafına güçlü forseps ile adım adım kafatası kemikleri kırarak açın.
    3. Bir tarafta kafatası akasındaki güçlü forseps ile.
    4. Şiddetli makas veya keskin forseps ile spinal kord.
    5. Yavaşça, spinal kord forseps ile kapmak için anterior posterior beyinden flip ve buz gibi Ca2 + ücretsiz EC ile bir çanak içine yerleştirin
  4. İle sıvı özel bir 1,5-2 cm3 metal kalıp doldurmak ve buz üzerinde yerleştirin.
  5. Sadece özel (yaklaşık 25-30 ° C'de) katılaşır önce hafifçe beyin omurilik tarafından forseps ile kapmak, forseps iyi kağıt ile Kuru ve doku özel koymak. Hızlı bir şekilde sol doku EC izleri sulandırmak ve doku yönlendirmek ve kalıp buz üzerinde özel sertleşir kadar birkaç saniye için izin için özel karışımı.
    Not: Hızlı olmak için bu adım gereklidir. Metal kalıp buz tarafından soğuduktan gibi özel çabuk katılaşır.
  6. Bir neşter bıçakla doku içeren özel bir kare blok döşeme ve cerrahi (non-toksik) tutkal kullanarak vibratome numune tutucu üzerinde tutkallayın.
  7. Buz gibi Ca2 + ücretsiz EC ile numune (beyin-hipofiz) sahibi alma vibratome küvet doldurmak
  8. Vibratome yer numune tutucu ve özel blok 150 µm, yüksek frekans ve düşük hızlı kesit için kullanarak parasagittal bölümlerini yapmak için kesti. Seçili bölümleri toplamak ve buz gibi Ca2 + ücretsiz EC 3 mL ile yama-kelepçe kayıt odasına koyun
  9. Kılavuz ARP (Şekil 2B) doku bölümüne yerleştirin.
    Not: ARP kaplama ile birlikte doku stabilize ve yama-kelepçe kayıtları sırasında taşınmasını engelleme.
  10. ARP yer sonra Ca2 + ücretsiz EC orta ile Ca2 + normal EC ve BSA için değiştirin. 10 dk için doku dinlensin.

3. delikli yama-kelepçe ve elektrofizyolojik kayıtlar

  1. Deneme başlamadan önce klorür gümüş tel elektrotlar tarafından aşağıdaki adımları: Öncelikle, gümüş tel elektrot temizlemek için ince zımpara (p180) kullanın. İkinci olarak, 2 mL % 70 etanol ile yıkayın. Üçüncü olarak, 2 ml, 2-%5 klor 10 dk teller daldırma. Son olarak, 2 mL, ultrasaf H2O. durulama
  2. Kayıt odası beyin hipofiz dilim ile mikroskop aşamasında yer ve 10 X objektif kullanarak hedef alan (hipofiz) belirleyin ve 40 X objektif kullanarak hücreleri incelemek.
    Not: hazırlık başarılı olursa, çok az yuvarlak hücre görünür olmalıdır. Dokudan ayırma genellikle zarar görmüş hücreleri bu yuvarlak hücrelerdir.
  3. %2 agar Köprüsü üzerinden Topraklama elektrot EC banyo içine yerleştirin.
  4. 40 X objektif kullanarak bir sağlıklı hücreye bulun.
    Not: Sağlıklı hücre olmalı sıkıca doku dilime bağlı ve değil yuvarlanır ve dilimden ilişkisi kesildi.
  5. Amplifikatör gerilim-kelepçe (VC; ayarla Şekil 4A nokta 1) modu. Açık mühür test pencere ve basın banyo yapılandırması (4B rakam noktası 1 ve 2. 5-mV nabzı pipet direnç (4B rakam noktası 3) izlemek için kullanın.
  6. Backfill IC çözüm Amfoterisin B ile mikro-dolgu kullanarak eklemeden önce antifungal ücretsiz IC çözüm ile yama pipet ucu (bkz. Şekil 3).
  7. Biraz olumlu hava basıncı 1 mL şırınga kullanarak düzeltme eki pipet ekleyin.
    Not: Bu uç kontaminasyon yama pipet küçük bir sıvı akışı yapar.
  8. Bir kez banyo, yama pipet direnç değerlendirmek ve hiçbir parçacıklar pipet (Şekil 4 c) ucuna bağlı emin olun.
    Not: Küçük bir parça bant video kayıt formu görüş alanı gösteren monitör eklenir. Bu ne zaman amaç cepten odaklanarak değil yama pipet hücreye göre daha kolay konumlandırma yapar.
  9. Yama pipet micromanipulators kullanarak hücre aşağı yol.
    Not: pipet pipet ucu bağlı küçük parçacıklar yaşar temiz olduğundan emin olun. Direnç ani değişiklikler de pipet ucu sıkışmış parçacıklar bir sonucu olabilir.
  10. Ne zaman bir kaç pipet yeniden düzenlemek mikron hücrenin üstündeki pipet ucu 1/3 Orta hücre, hücre Şekil 5' te gösterildiği gibi dokunmatik olacak böylece. Ne zaman hücre dokunmadan, basınç ve yumuşak emici bir mühür yapmak uygulamak.
    Not: Yama pipet zaman banyo başarılı bir girer mühür tutulan olabildiğince kısa. Fazla 1-1,5 Amfoterisin B sızıntı ve Pipet Ucu banyo içine ulaşan önlemek için min.
  11. Hemen yama-kelepçe yazılım (Şekil 4 D noktası 1) Düzeltme Eki penceresinde geçiş ve -50 ve -60 mV (Şekil 4 d noktası 2) arasında bir holding potansiyele sahiptir. Sıfır out hızlı kapasite Cam Pipet (Şekil 4 d 3 nokta) tarafından yapılmış.
  12. Yama-kelepçe yazılım (4E rakam noktası 1 ve 2) hücre penceresine geçin ve erişim direnç, Ra, pencerede görüntülenen izleme başlatın. Membran kapasitans amplifikatör yazılım (4E rakam noktası 3) dışarı sonra yeterli erişim sıfır.
    Not: Yeterli erişim 10-30 dk (4E rakam noktası 2) alabilir. Ulaşım için geçerli kelepçe kayıtları 20 M olmalıdır.
  13. Geçerli kelepçe, IC, amplifikatör yazılım penceresinde (4F rakam nokta 1) geçin. Hızlı kapasitif akımlar 3.12 olduğu gibi aynı değere amplifikatör yazılım (4F rakam noktası 2 ve 3) ben-kelepçe penceresinde ayarlayın. Membran potansiyeli (4F rakam nokta 1) kontrol edin.
    Not: Önemlisi, potansiyel membran sığ ise (tipik -35 yukarıda mV) hücre zarar görmüş olabilir. Kaydı iptal et ve yeni bir hücre bulma.
  14. Sağlıklı hücre bulduktan sonra (membran -40 altında potansiyel dokuyla sıkıca bağlı mV), deneysel kayıtları üreticinin iletişim kuralı 33,34detaylı olarak başlatın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu iletişim kuralı bir medaka transgenik hat [Tg (lhb- hrGfpII)] nerede (Lh üreten gonadotropes) hedef hücreleri kullanılarak hipofiz (gonadotrope) hücrelerden güvenilir elektrofizyolojik kayıtları elde etmek nasıl adım adım protokolünden gösterir yeşil flüoresan protein (GFP) ile etiketlenir.

Başlangıçta, tüm hücreli yapılandırma'yı kullanarak elektrofizyolojik araştırmalar yapılmıştır. Ancak, spontan Aksiyon potansiyelleri okudu hücreleri hiçbirinde tespit edildi değil. Hücre alt grubunu içinde Aksiyon potansiyelleri küçük geçerli enjeksiyonları (5-9 pA)-50 ve -60 mV (Şekil 6) arasında bir istirahat potansiyeli üzerinden kullanarak tetiklenen olabilir. Bu aksiyon potansiyelleri hızlı bir Özet vardı ve yaklaşık 4-6 dakika sonra tetiklenen Aksiyon potansiyelleri artık mümkün değildi. Özellikle hızlı özet gözlenen küçük hücreli boyutuna göre açıklanabilir. Genel olarak, hipofiz nöronlar 30' dan daha küçük hücrelerdir. Örneğin, ortalama membran kapasitans gonadotrope hücre aralıkları 4 ve 10 pF 3,30,35arasında. Bu bulgular medaka benzer gonadotrope hücreleri (ortalama ± S.D) 3.4 ± 0.9 pF bir ortalama membran kapasitans vardı (n = 67).

Amfoterisin B kullanarak delikli yama yapılandırma geçişi, spontan Aksiyon potansiyelleri kaydedilen hücre yaklaşık % 50 gözlendi (Şekil 7A, n = 21 hayvanlardan 63 hücre). Ayrıca, Aksiyon potansiyelleri ile hiçbir gözlemlenebilir Özet Bu hücrelerinin % 95 (1 s) en uzun süreli kayıtları sonra bile tetiklenen olabilir. Önemlisi, güvenilir ve yüksek kalite kayıtları elde etmek için ilk ipucu antifungal ücretsiz IC çözüm ile doldurmak gereklidir. Gigaseal yapmadan önce pipet ucu antifungaller küçük miktarlarda kaçmak, bu gibi çevre hücreler olarak hedef hücre zarar verebilir.

Delikli yama yapılandırma hücrelerde onların ana serbest hormon yanıt mümkün olup olmadığını test etmek için biz hedef hücreleri temel atılır 1 µM Gnrh1 puf uygulanır. Deneyler bize voltaj değişiklikleri izlemek izin vermek için geçerli kelepçe içinde gerçekleştirilmiştir. Bu deneyler bifazik yanıt (Şekil 7B) saptandı. Birinci aşama nerede açıklaması, Ca2 + iç mağazaları etkinleştirmek hyperpolarization neden Ca aktif2 + K+ kanalları bir hyperpolarization var. Birinci aşama bir depolarizasyon ve artan Aksiyon potansiyeli frekans yaklaşık 3 Hz ila 1 – 2 Hz den takip eder. Bazı kayıtları, sözde Yaylası potansiyelleri 2 ya da 3 küçük sivri repolarization önce nerede gözlendi ikinci aşama vardı.

Figure 1
Resim 1 : Bütün hücre(a)ve yama-klemp tekniği delikli yama (B) yapılandırmalarını arasındaki fark. Gigaseal yer, sonra bütün hücre yapılandırması(a), yama pipet küçük bir negatif basınç uygulayarak membran içinde bir delik yapılır. Bu yapılandırmada, moleküller sinyal gibi önemli hücre içi molekülleri böylece hücre elektrik ve fizyolojik tepkileri etkileyen yama pipet çözümde seyreltilmiş. Bu olay daha da küçük hücreler, hipofiz hücreleri gibi önemlidir. Buna ek olarak, delikli-yama yapılandırma (B), takip gigaseal, sitozol ve yama arasında elektriksel temas pipet antifungaller veya yüzey aktif maddeleri oluşur. Antifungal veya yüzey aktif önce yama yama pipet yüklenir ve böylece yavaş yavaş sadece küçük moleküller geçmek monovalent iyonlar gibi izin membran, Perfore yama altında plazma zarı içine dahil. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Agar Köprüsü(a)ve (B) Harp resimleri iletişim kuralında kullanılır. Mm. çaplı Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Yama-pipet doldurma. (A)Antifungal ücretsiz IC (mavi sıvı) çözümdür göre backfilled ile pipet içindeki filaman nedeniyle kılcal kuvvetler. (Antifungal ücretsiz IC, arka kısmındaki pipet pipet ucu doldurma Amfoterisin B (sarı sıvı) bir şırınga iğnesi (mikro dolgu) kullanarak içeren IC çözüm ile dolu sonraB). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4A
Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4B
Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4C
Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4D
Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4E
Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4F
Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4 : Yazılım ekran. (A)gösteren amplifikatör LightBox penceresinin. 1. gerilim kelepçe (VC), geçerli herhangi bir enjeksiyon olmadan geçerli kelepçe arasında geçiş yaparak modu alan (kırmızı daire) vurgulamaktadır (ben = 0) ve geçerli enjeksiyonları (IC) için geçerli kelepçe imkanı ile. 2 (kırmızı daire) hızlı kapasitif akım voltaj kelepçe yanı sıra bütün hücreli kapasitif geçerli ayarları ayarlamak için alan vurgulamaktadır. (B) yama-kelepçe yazılımı ile membran test penceresi açık gösterir. 1. (kırmızı daire) membran Sına düğmesini vurgulamaktadır. 2. farklı darbe yapılandırmaları, banyo, yama ve hücre (kırmızı daire) vurgulamaktadır. 3. darbe yapılandırma genlik ve frekans (kırmızı daire) vurgulamaktadır. (C-F) yama-kelepçe yazılım (solda) ve amplifikatör (sağda) yazılım kombine bir dul gösterir. Pipet banyoda ve agar Köprüsü (banyo modunda) kullanarak topraklama uygun olduğunda (C) (kırmızı daire) direnç vurgulamaktadır. (D) 1. (kırmızı daire) gigaseal takip yama moduna geçme vurgulamaktadır. 2. darbe yapılandırma (10 mV darbe) ve holding potansiyel ayarlanır -60 için parlak nokta (kırmızı daire) mV. 3. (kırmızı daire) düzeltme veya giga mühür takip hızlı kapasitif akımlar sıfırlanması için pencere vurgulamaktadır. (E) 1. (kırmızı daire) erişim direnç izlemek için kullanılan hücre modu vurgulamaktadır. 2 önemli noktaları (kırmızı daire) hücre parametreleri, membran kapasite (Cm), kalite (Rm), erişim direnç (Ra), zaman sabit (Tau) ve akım (tutmak) tutan kapatın. 3. (kırmızı daire) membran kapasitif akımlar düzeltmek belgili tanımlık düğme vurgulamaktadır. (F) 1. (Kırmızı daire) membran potansiyel izleme IC mod vurgular. 2. (kırmızı daire) geçerli kelepçe ayarlar (ı-kelepçe) geçmek için düğmesini vurgulamaktadır. 3. hızlı kapasitif akımlar düzeltmek için pencere (kırmızı daire) vurgulamaktadır.

Figure 5
Şekil 5 : Bir yama-kelepçe delikli yama yapılandırması kullanılarak hipofiz cepten kayıt üzerinden test. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 : Geçerli kelepçe kayıtları bir GFP etiketli Lh üreten hücre geçerli enjeksiyonları normal bütün hücreli yapılandırma'yı kullanarak takip. Hücreleri-50 ve -60 mV arasında tutuldu. Tipik aksiyon potansiyelleri hemen hücreye (siyah izle) erişim elde sonra 5-10 pA geçerli enjeksiyonlar kullanarak hücre alt grubunu tetiklenen olabilir. 1-3 dakika sonra aksiyon potansiyeli genlik azaltmak, Özet (Camgöbeği izle) tipik belirtisi başladı. 4-6 dakika sonra aksiyon potansiyeli genlik (kırmızı iz) neredeyse tamamen ortadan kayboldu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7 : Stimülasyon Gonadotropin - releasing hormon Gnrh1 ile takip delikli yama yapılandırma'yı kullanarak bir hücreden GFP etiketli Lh üreten kayıt geçerli kelepçe. (A)geçerli kelepçe kayıt spontan Aksiyon potansiyelleri Lh üreten gonadotrope hücreden gösteren. (B) A bifazik yanıt nerede Gnrh1 stimülasyon 10 s ilk Aksiyon potansiyelleri daha önce ateş bir hücreye, hücre bir depolarizasyon tarafından takip ve atış frekans (--dan 1-2 Hz ila 3 Hz) artan membran hyperpolarization indüklenen spontan Aksiyon potansiyelleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Elektrofizyolojik kayıtlar yama-klemp tekniği beyin hipofiz dilimleri kullanarak dikkatli optimizasyonu gerektirir. Teleosts araştırmalarda özellikle canlı hücre yürütmek için iyi optimize edilmiş memeli sistemlere dayalı iletişim kuralları kullanarak yayınlar çoğunluğu ile sınırlı iletişim kurallarıdır. Bu bağlamda, olmak önemlidir gibi parametreleri çeşitli fizyolojik pH ve osmolalite aslında farkında değil sadece tür bağımlı ama de çok bağımlı olup söz konusu organizma karada veya su'da yaşıyor. Eğer onlar bir deniz veya tatlı su ortamında yaşamak için o da hesaba katmak için gerekli balıktır. Örneğin, CO2 kısmi basınç çok balık memeliler 1.7-3.4 mmHg pCO2 balık ve memeliler 36yılında 40-46 mmHg pCO2 arasında değişen düzeyleri ile karşılaştırıldığında daha düşüktür. Buna göre pH 7.75 37,38,39,40 geçerli protokolünde kullanılan tüm çözümlerinde ayarlayın. Mükemmel tamponlama kapasitesi 7,4-7,8 41pH bölgesinde sahip olduğu gösterilmiştir gibi biz de HEPES tampon kullanın. Osmolalite için ne medaka 42ekstraselüler ortamda ölçülen olan 290-300 mOsm kullanın. Elektrofizyolojik kayıtları sırasında kullanılan sıcaklık balık çevreye göre seçilmiş olabilir. Nitekim, medaka bir geniş sıcaklık aralığı ('dan 4'e 40 ° C) 26-28 ° C'de kontrollü bir ortamda yetiştirilir bizim laboratuvar sularda yaşayan Buna dayanarak, biz bizim kayıtları, oda sıcaklığında (yaklaşık 25 ° C), soğuk su balık türleri gibi Atlantik morina (12 ° C) 18veya memeli dokuları (37 ° C) için kullanılan üzerinden farklı yapılır.

Hipofiz hücreleri yama edebilmek için sağlıklı doku dilimler oluşturmak için önemlidir. Yalnızca canlı doku (fiksajlar ücretsiz) ile temas halinde olan temiz araçlar (doku tutucu, fırça, forseps, vb) kullanmak zorunludur. Beyin ve hipofiz ve tutma hızlı bir diseksiyon anatomi ve dilimleme süre düşük sıcaklıkta (4 ° C) doku uygun bölümlerde diğer önemli faktörler bulunur. Belirli dikkat Ayrıca doku gömme üzerine özel sıcaklığını verilmesi gerekir. Çok sıcak özel çok soğuk özel sen terk etmeyeceğim iken doku zarar verebilir uygun kesit için doku yönlendirmek için zaman. Buna ek olarak, Dilimleme EC çözüm olmadan hasarlı hücreleri önlemek için Ca2 + ile yapılmalıdır takip apoptosis girmek için kesit. Köpüren gerekli değildir, ancak hemen sonra kesit dokusu dilimlerin toplanmalıdır. Dilim yaklaşık 15 dk önce yama, biraz dinlenelim hücreleri izin kesit takip bırakın.

Teleost balık hipofiz hücreleri elektrofizyolojik özelliklerini araştırmak için mükemmel modellerdir. Nitekim, memeliler ve kuşlar aksine, balık doğrudan hipofiz kontrol hipotalamik nöronların kendi aksonlar onların hedef hücreleri 32proje anlamı bir medyan Hazretleri sahip değilsin. Böylece, bir beyin hipofiz dilim hipofiz hücreleri için birincil hipofiz hücre kültürleri kıyasla daha sağlam bir ortamda tutulan hücrelerin kimyasal ve mekanik bakımları kullanarak ayrışmış nerede. İlginçtir, medaka beyin hipofiz dilimleri kullanarak, biz Aksiyon potansiyeli atış frekans Gnrh1 etkinleştirme, üzerine Lh hücrelerdeki (Şekil 5) artış gözlemlemek. Ne ile anlaşma o kullanarak gösteren kendi laboratuvar 29 hipofiz hücre kültür çalışmalarında bildirilmiştir bu gözlemler vardır birincil hipofiz hücre kültürleri hipofiz hücreleri membran özelliklerini tanımlamak alakalı. Ancak, birincil hipofiz hücre kültürleri içinde kaybolur yapısal bağlantıları korur gibi beyin hipofiz dilimleri bize farklı bileşikler hem de hücreleri arasındaki etkileşimler dolaylı etkileri de çalışmaya izin. Buna ek olarak, dilim hazırlık daha hızlı hazırlamak için Disosiye birincil hücre kültürü ile karşılaştırıldığında, ve elektrofizyolojik kayıtlar aşağıdaki 30 dk içinde diseksiyon sonra yapılabilir. Bu anlamlı bir şekilde taze hazırlanmış dilimleri kullanarak sirkadiyen ritim birincil hücre kültürü aksine saptanabilir anlamına gelir.

Balık hipofiz hücreleri küçük boyutu nedeniyle (membran kapasitans çevresinde 3-10 pF) ve gonadotrope hücreleri Aksiyon potansiyelleri (Şekil 3) yangın ve böylece yanıt yeteneklerini kaybedecekler yeteneklerini kaybedecekler gösterilen kendi gözlemleri hormonlar bütün hücreli yapılandırmada kaydederken bırakmadan, kullanın ve delikli yama tekniği burada sunmak karar verdik. Nitekim, o bütün hücreli yapılandırma böylece elektrofizyolojik hücre özellikleri 13değişen önemli sitoplazmik moleküllerin difüzyon gerektirebilecek gösterilmiştir. Bunun yerine sadece sadece küçük iyonları 15,16,43ile, geçmesine izin küçük delikler yapmak yama pipet içine hücre zarı ekleyip için Amfoterisin B ile delikli yama yapılandırmaları kullanarak 44, biz bu seyreltme ve kayıt hücre elektriksel aktivitesinin uzun bir süre için önlemek olabilir.

Bir önemli delikli yama tekniği ilk geri doldurmak için pipet antifungaller antifungaller Orta serbest önlemek ve yama pipet ile yaklaşırken bölümünün tüm hücreleri zarar için olmadan IC çözümle noktasıdır. Nitekim, yama yapılana kadar yama pipet doku yaklaşırken uygulanan pozitif basınç nedeniyle yama pipet ile bazı Sıvı sızdırıyor. Bu akış kadar hedef hücre ulaşmak ama yama yapılmadan önce antifungal ortamda yayımlanırsa, tüm hücre, hücre zarlarında geçirgen özellikleri önemli ölçüde değişen tüm Membranlar sorgulamaktı ucunu temiz tutmak için yardımcı olur ve böylece onların elektriksel özellikleri.

Sunulan yordam en iyi duruma getirilmiş ve başarıyla medaka gonadotrope hücreleri elektriksel aktivitesinin çalışırdım. Ayrıca, protokol medaka ve diğer teleost balık türleri hipofiz bulunan tüm (endokrin) hücre türlerini eğitim için kullanılabilir. Osmolalite ve tüm çözümler pH bu vücut sıvıları türünün ayarlanması gerekir sadece söz konusu unutmayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa yoktur

Acknowledgments

Biz Bayan LourdesCarreon G Tan medaka tesisin bakımı ona yardım için ve Anthony Peltier açıklayıcı rakamları için teşekkür ederim. Bu eser NMBU ve Araştırma Konseyi Norveç, grant numaraları 244461 (su ürünleri programı) ve 248828 (Digital hayat Norveç programı) tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000 S
Chirurgical glue WPI VETBOND 3M Vetbond Tissue Adhesive
Stainless steel blades Campden Instruments 752-1-SS
metal molds SAKURA 4122
steel harp Warner instruments 64-1417
PBS SIGMA D8537
Ultrapure LMP agarose invitrogen 166520-100
patch pipettes Sutter Instrument BF150-110-10HP Borosilicate with filament O.D.:1.5 mm, I.D.:1.10 mm
Microscope Slicescope Scientifica pro6000
P-Clamp10 Molecular Devices #1-2500-0180 sofware
Digitizer Digidata 1550A1 Molecular Devices DD1550
Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B Molecular Devices 1-CV-7B
GnRH Bachem 4108604 H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt 
pipette puller Sutter Instrument P-1000
amphotericin B SIGMA A9528 pore-forming antibiotic
polyethylenimine  SIGMA P3143 50% PEI solution
microfiler syringe WPI MF28/g67-5
glass for the agar bridge Sutter Instrument BF200-116-15 Borosilicate with filament O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm Fire polished
Micro-Manager software Open Source Microscopy Software
optiMOS sCMOS camera Qimaging  01-OPTIMOS-R-M-16-C
sonicator Elma D-7700 singen
NaCl SiGMA S3014
KCl SiGMA P9541
MgCl2 SiGMA M8266
D-Glucose SiGMA G5400
Hepes SiGMA H4034
CaCl2 SiGMA C8106
Sucrose SiGMA 84097
D-mannitol SiGMA 63565
MES-acid SIGMA M0895
BSA SIGMA A2153

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. Ion channels and signaling in the pituitary gland. Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).
  2. Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling. Trends Endocrinol Metab. 16 (4), 152-159 (2005).
  3. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Dopamine-D2 actions on voltage-dependent calcium current and gonadotropin-II secretion in cultured goldfish gonadotrophs. J Neuroendocrinol. 10 (3), 175-186 (1998).
  4. Chang, J. P., Pemberton, J. G. Comparative aspects of GnRH-Stimulated signal transduction in the vertebrate pituitary - Contributions from teleost model systems. Mol Cell Endocrinol. , (2017).
  5. Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. Inward membrane currents and electrophysiological responses to GnRH in ovine gonadotropes. Neuroendocrinology. 61 (6), 609-621 (1995).
  6. Ben-Jonathan, N., Hnasko, R. Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor. Endocrine Reviews. 22 (6), 724-763 (2001).
  7. Sanchez-Cardenas, C., Hernandez-Cruz, A. GnRH-Induced [Ca2+]i-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
  8. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  9. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  10. Neher, E. Techniques in cellular physiology. Baker, P. F. , Elsevier/North. Holland. 4-19 (1981).
  11. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  12. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).
  13. Marty, A., Neher, E. Single Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 113-114 (1983).
  14. Lindau, M., Fernandez, J. M. IgE-mediated degranulation of mast cells does not require opening of ion channels. Nature. 319 (6049), 150-153 (1986).
  15. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).
  16. Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B. J Neurosci Methods. 37 (1), 15-26 (1991).
  17. Fan, J. S., Palade, P. Perforated patch recording with beta-escin. Pflugers Arch. 436 (6), 1021-1023 (1998).
  18. Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO(2), and pH. Gen Comp Endocrinol. 178 (2), 206-215 (2012).
  19. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. US. 3-35 (1983).
  20. Andersen, P. Brain slices - a neurobiological tool of increasing usefulness. Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).
  21. Guerineau, N. C., Bonnefont, X., Stoeckel, L., Mollard, P. Synchronized spontaneous Ca2+ transients in acute anterior pituitary slices. J Biol Chem. 273 (17), 10389-10395 (1998).
  22. Levavi-Sivan, B., Bloch, C. L., Gutnick, M. J., Fleidervish, I. A. Electrotonic coupling in the anterior pituitary of a teleost fish. Endocrinology. 146 (3), 1048-1052 (2005).
  23. Guerineau, N. C., McKinney, R. A., Debanne, D., Mollard, P., Gahwiler, B. H. Organotypic cultures of the rat anterior pituitary: morphology, physiology and cell-to-cell communication. J Neurosci Methods. 73 (2), 169-176 (1997).
  24. Yu, Y., Ali, D. W., Chang, J. P. Characterization of ionic currents and electrophysiological properties of goldfish somatotropes in primary culture. Gen Comp Endocrinol. 169 (3), 231-243 (2010).
  25. Price, C. J., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Voltage-activated ionic currents in goldfish pituitary cells. Gen Comp Endocrinol. 92 (1), 16-30 (1993).
  26. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Electrical membrane properties and ionic currents in cultured goldfish gonadotrophs. Can J Physiol Pharmacol. 74 (6), 729-743 (1996).
  27. Xu, S., Shimahara, T., Cooke, I. M. Capacitance increases of dissociated tilapia prolactin cells in response to hyposmotic and depolarizing stimuli. Gen Comp Endocrinol. 173 (1), 38-47 (2011).
  28. Haug, T. M., Hodne, K., Weltzien, F. A., Sand, O. Electrophysiological properties of pituitary cells in primary culture from Atlantic cod (Gadus morhua). Neuroendocrinology. 86 (1), 38-47 (2007).
  29. Strandabo, R. A., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Mol Cell Endocrinol. 372 (1-2), 128-139 (2013).
  30. Hodne, K., et al. Electrophysiological differences between fshb- and lhb-expressing gonadotropes in primary culture. Endocrinology. 154 (9), 3319-3330 (2013).
  31. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka--a model organism from the far East. Nat Rev Genet. 3 (1), 53-64 (2002).
  32. Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. Gen Comp Endocrinol. 44 (2), 135-170 (1981).
  33. pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis For Comprehensive Electrophysiology User Guide. Molecular Devices Corporation. , (2006).
  34. MultiClamp 700B COMPUTER-CONTROLLED MICROELECTRODE AMPLIFIER Theory and Operation. Axon Instruments / Molecular Devices Corp. , (2005).
  35. Dominguez-Mancera, B., et al. Leptin regulation of inward membrane currents, electrical activity and LH release in isolated bovine gonadotropes. Biochem Biophys Res Commun. 491 (1), 53-58 (2017).
  36. Schmidt-Nielsen, K. Animal Physiology : adptation and environment fifth edition. , Cambridge university press. 613 (1997).
  37. Burton, R. F. Evolutionary determinants of normal arterial plasma pH in ectothermic vertebrates. J Exp Biol. 205, Pt 5 641-650 (2002).
  38. Burton, R. F. The dependence of normal arterial blood pH on sodium concentration in teleost fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 114 (2), 111-116 (1996).
  39. Heming, T. A., Blumhagen, K. A. Plasma acid-base and electrolyte states of rainbow trout exposed to alum (aluminum sulphate) in acidic and alkaline environments. Aquatic Toxicology. 12 (2), 125-139 (1988).
  40. Reeves, R. B. The interaction of body temperature and acid-base balance in ectothermic vertebrates. Annu Rev Physiol. 39, 559-586 (1977).
  41. Baicu, S. C., Taylor, M. J. Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency. Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).
  42. Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Lett. 2, 12 (2016).
  43. Cass, A., Finkelstein, A., Krespi, V. The ion permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 100-124 (1970).
  44. Holz, R., Finkelstein, A. The water and nonelectrolyte permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 125-145 (1970).

Tags

Neuroscience sayı 138 beyin-hipofiz doku dilimli Elektrofizyoloji balık yama-kelepçe endokrin hücreleri
Sağlıklı beyin hipofiz dilimleri Teleost balık hipofiz hücreleri elektrofizyolojik araştırmalar için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien,… More

Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. J. Vis. Exp. (138), e57790, doi:10.3791/57790 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter