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Neuroscience

Rebanadas de cerebro-pituitaria sanas para las investigaciones electrofisiológicas de las células hipofisarias en peces teleósteos

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/57790
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences
* These authors contributed equally

Summary

El artículo describe un protocolo optimizado para hacer rebanadas de tejido viable del cerebro-pituitaria, mediante el medaka (Oryzias latipes), de peces teleósteos y después las grabaciones electrofisiológicas de las células hipofisarias mediante la técnica de patch-clamp con la configuración de parche perforado.

Abstract

Se han realizado investigaciones electrofisiológicas de las células hipofisarias en numerosas especies de vertebrados, pero muy pocos en peces teleósteos. Entre éstos, la mayoría clara se han realizado en células disociadas de primarias. Para mejorar nuestra comprensión de las células hipofisarias como teleósteos, se comportan en un medio ambiente biológicamente más relevante, este protocolo muestra cómo preparar rebanadas de cerebro-pituitaria viables utilizando el medaka (Oryzias latipes) de pequeños peces de agua dulce. Hacer las rebanadas de cerebro-pituitaria, pH y la osmolalidad de las soluciones se ajustaron a valores que se encuentran en los fluidos corporales de peces de agua dulce viven en 25 a 28 ° C. Tras la preparación de la rebanada, el protocolo muestra cómo llevar a cabo las grabaciones electrofisiológicas usando la técnica del perforado celulares-abrazadera del remiendo. La técnica de patch-clamp es una potente herramienta con resolución temporal sin precedentes y la sensibilidad, permitiendo la investigación de las propiedades eléctricas de las células intactas todo hasta canales de iones individuales. Parche perforado es el único que mantiene el medio intracelular intacto impide elementos reguladores en el citosol se diluye por la solución de electrodo pipeta patch. En cambio, cuando se realizan grabaciones de celulares tradicionales, se observó que las células pituitarias medaka pierden rápidamente su capacidad para disparar potenciales de acción. Entre las diferentes técnicas de perforación disponibles, este protocolo muestra cómo lograr la perforación de la membrana parcheada con el fungicida anfotericina B.

Introduction

La hipófisis es un órgano endocrino clave en vertebrados situados debajo del hipotálamo y posteriores al quiasma óptico. Produce y secreta hormonas de seis a ocho de los tipos celulares específicos. Hormonas hipofisarias constituyen un intermedio entre el cerebro y los órganos periféricos y manejar una amplia gama de procesos fisiológicos esenciales, incluyendo el crecimiento, la reproducción y la regulación de la homeostasis. Similar a las neuronas, las células endocrinas de la hipófisis son eléctricamente excitables con capacidad para disparar potenciales de acción espontáneamente 1. El papel de estos potenciales de acción es dependiente de la célula. En varios tipos celulares de la hipófisis mamífero, potenciales de acción pueden elevar el Ca intracelular2 + suficientemente para una liberación sostenida de hormonas 2. Además, la hipófisis recibe información tanto estimulante como inhibitoria en el cerebro que afecta el potencial de membrana de las células 3,4,5,6. Por lo general, entrada estimulante aumenta la excitabilidad y a menudo implica la liberación de Ca2 + de los almacenes intracelulares así como mayor frecuencia 7de disparo. Entendimiento de cómo la célula utiliza la composición de la canal de ion y se adapta a estas señales de entrada en el cerebro es clave para la síntesis de la hormona de comprensión y liberación.

La técnica de patch-clamp fue desarrollada a finales de 1970 por Sakmann y Neher 8,9,10 y mejorada por Hamill 11y permite investigaciones detalladas de las propiedades electrofisiológicas de las células hasta canales de iones individuales. Por otra parte, la técnica puede utilizarse para el estudio de corriente y voltaje. Hoy en día, parche-es el estándar de oro para la medición de las propiedades electrofisiológicas de la célula. Cuatro configuraciones principales de la técnica de patch-clamp de cierre hermético han sido desarrollado 11; la célula adjunta, dentro, la exterior y el parche de células completas. Las tres primeras configuraciones se utilizan típicamente para las investigaciones de canal de iones individuales. Para el cuarto, después de la configuración de conexión de celda, un agujero en la membrana celular se realiza mediante presión sub-atmosférica. Esta configuración también permite que las investigaciones de la composición de la canal de ion de la célula entera 12. Sin embargo, una limitación de esta técnica es que moléculas citoplásmicas se diluyen por el parche pipeta solución 13 (figura 1A), pues afecta las respuestas eléctricas y fisiológicas de las células estudiadas. De hecho, algunas de esas moléculas pueden jugar papeles importantes en la transducción de la señal o en la regulación de canales iónicos diferentes. Para evitar esto, Lindau y Fernandez 14 desarrolló un método donde se agrega un compuesto formando poros a la pipeta del parche. Tras la configuración de conexión de celular, el compuesto se incorporan en la membrana de plasma bajo el parche y lentamente perfore la membrana creando contacto eléctrico con el citosol (figura 1B). Pueden utilizar varios diferentes antifúngicos como la nistatina y la anfotericina B 15 16o surfactantes como la saponina beta-escina 17,18 . Estos compuestos crean poros lo suficientemente grandes como para permitir que los cationes monovalentes y Cl– difusión entre el citosol y la pipeta patch conservando los niveles citosólicas de macromoléculas y los iones más grandes como Ca2 + 15, 16.

El reto de usar parche perforado es la resistencia serie potencialmente alto. Resistencia en serie (Rs) o acceso de resistencia es la resistencia combinada sobre la pipeta patch concerniente a la tierra. Durante las grabaciones de la abrazadera del remiendo, Rs estará en paralelo con la resistencia de la membrana (Rm). Rm y Rs en trabajo paralelo como un divisor de tensión. Con la alta Rs, la tensión caerá sobre la Rs dando errores en las grabaciones. El error será mayor con las corrientes más grandes registradas. Además, el divisor del voltaje también es frecuencia dependiente creando un filtro de paso bajo, afectando así a la resolución temporal. En efecto, el parche perforado no siempre permiten grabaciones de grandes y rápidas corrientes como el voltaje bloqueado las corrientes Na+ (para lecturas detalladas ver referencia 19). También, Rs puede variar durante la grabaciones de la abrazadera del remiendo, otra vez conduce a cambios en la corriente registrada. Así, pueden ocurrir falsos positivos en situaciones donde Rs cambia durante el uso de la droga.

La electrofisiología en el tejido en rodajas se introdujo por el laboratorio de Andersen para estudiar características electrofisiológicas de las neuronas en el cerebro de 20. La técnica allanó el camino para investigaciones detalladas de las células así como circuitos comunicaciones y celular de la célula en un ambiente más intacto. Una técnica similar para hacer rebanadas de hipófisis fue introducida en 1998 por Guérineau et al. 21. sin embargo, no fue antes de 2005, que la preparación de corte de cerebro-pituitaria fue utilizada con éxito para estudios de patch-clamp en teleósteos 22. En este estudio, los autores también informaron el uso de grabaciones de la abrazadera del remiendo perforada. Sin embargo, en gran medida, la mayoría de las investigaciones electrofisiológicas de las células hipofisarias se han realizado en mamíferos y sólo un puñado de otros vertebrados, incluyendo peces teleósteos 1,2,22,23 . En teleósteos, casi todos los estudios fueron realizados en las células disociadas primarias 24,25,26,27,28,29,30 .

En el presente artículo, esbozamos un protocolo optimizado para la preparación de saludables rebanadas de cerebro-pituitaria de la medaka de pescado modelo. El enfoque representa varias ventajas en comparación con cultivos primarios de células disociadas. En primer lugar, las células se guardan en un medio ambiente relativamente preservado frente a disociarse de las condiciones de cultivo celular. En segundo lugar, preparaciones de corte nos permiten estudiar vías indirectas mediadas por célula comunicación 22, que no es posible en condiciones de cultivo de células disociadas. Además, demostramos cómo llevar a cabo las grabaciones electrofisiológicas en los cortes de tejido obtenidos usando la técnica del perforado celulares-abrazadera del remiendo con la anfotericina B como agente de formación de poro.

Medaka es un pequeño pez de agua dulce originario de Asia, se encuentran principalmente en Japón. La fisiología, la embriología y la genética de medaka se ha estudiado ampliamente por más de 100 años 31, y es un modelo de investigación utilizado en muchos laboratorios. De particular importancia para este trabajo es la distinta organización morfológica del complejo hipotálamo-hipofisario en los peces teleósteos: mientras que en mamíferos y aves las neuronas hipotalámicas suelte sus neuro-las hormonas que regulan las células endocrinas hipófisis en el sistema del portal de la eminencia media, hay una directa proyección nerviosa de las neuronas hipotalámicas en las células endocrinas de la hipófisis en los peces teleósteos 32. Así, cortar cuidadosamente realizados de cerebro-pituitaria es de particular importancia en los peces, lo que nos permite investigar características electrofisiológicas de las células hipofisarias en una bien conservada red de cerebro-pituitaria y las células de la pituitarias en particular cómo control de la excitabilidad y de tal modo homeostasis de Ca2 + .

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Protocol

Manejo de los animales se realizan según las recomendaciones para el cuidado y bienestar de los animales de investigación en la Universidad Noruega de Ciencias de la vida y bajo la supervisión de investigadores autorizados.

1. preparación de instrumentos y soluciones

Nota: Todas las soluciones deben ser estériles. Debe prestarse atención cuidadosa para el pH y la osmolalidad (osmol/kg agua) de todas las soluciones, que debe ser cuidadosamente adaptada al ambiente extracelular de las especies estudiadas. pH y la osmolalidad deben ajustarse con precisión equipos electrónicos tales como medidor de pH y punto de congelación osmómetro respectivamente.

  1. Tomar 500 mL de la solución extracelular sin Ca2 + (Ca2 + CE libre): 150 mM NaCl, KCl, 1,3 mM MgCl2, de 5 mM glucosa de 4 mM, 10 mM Hepes.
    1. Disolver 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, a 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de glucosa y 1,19 g de HEPES en 450 mL de alta pureza (0,055 uS / cm a 25 ° C, la resistividad de 18,2 megaohmios) H2O en un vaso de vidrio utilizando un agitador magnético.
    2. Ajustar el pH a 7.75 con NaOH.
    3. Transferir la solución a un matraz aforado de 500 mL. Llene el matraz aforado con ultrapura de H2O hasta 500 mL.
    4. Mezclar la solución antes de medir la osmolalidad. Ajuste a 290-300 mOsm con manitol. Filtro de esterilizar la solución mediante sistema de vacío de agua y filtro de 0,2 μm.
  2. Tomar 500 mL de la solución extracelular (EC): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, glucosa de 4 mM, 10 mM Hepes.
    1. Disolver 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 147,01 mg de CaCl2, 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de glucosa y 1,19 g de HEPES en 450 mL de ultrapura de H2O en un vaso de vidrio utilizando un agitador magnético.
    2. Ajustar el pH a 7.75 con NaOH.
    3. Transferir la solución a un matraz aforado de 500 mL. Llene el matraz aforado con ultrapura de H2O hasta 500 mL.
    4. Mezclar la solución antes de medir la osmolalidad. Ajuste a 290-300 mOsm con manitol. Filtro de esterilizar la solución mediante sistema de vacío de agua y filtro de 0,2 μm.
  3. Tomar 500 mL de la solución extracelular con 0,1% de seroalbúmina bovina (CE-BSA): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, glucosa de 4 mM, 10 mM Hepes.
    1. Disolver 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 147,01 mg de CaCl2, 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de glucosa y 1,19 g de HEPES en 450 mL de ultrapura de H2O en un vaso de vidrio utilizando un agitador magnético.
    2. Ajustar el pH a 7.75 con NaOH.
    3. Transferir la solución a un matraz aforado de 500 mL. Llene el matraz aforado con ultrapura de H2O hasta 500 mL.
    4. Mezclar la solución antes de medir la osmolalidad. Ajuste a 290-300 mOsm con manitol. Filtro de esterilizar la solución mediante sistema de vacío de agua y filtro de 0,2 μm. Agregar 50 mg de BSA.
  4. Tomar 250 mL de solución intracelular (IC): 110 mM KOH, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, sacarosa 20 mM.
    1. Disolver 1,54 g KOH, 327,75 mg de KCl, 595,75 mg de HEPES y 1,712 g de sacarosa en 450 mL de ultrapura de H2O en un vaso de vidrio utilizando un agitador magnético.
    2. Ajustar el pH a 7,2 con ácido sulfónico de (MES) (N-morfolino) etano.
    3. Transferir la solución a un matraz aforado de 250 mL. Llene el matraz aforado con ultrapura de H2O hasta 250 mL.
    4. Mezclar la solución antes de medir la osmolalidad. Ajuste a 280-290 mOsm (10 mOsm inferior CE) con sacarosa. Filtro de esterilizar la solución mediante sistema de vacío de agua y filtro de 0,2 μm.
  5. Hacer 100 mL de solución de agarosa de fusión baja de 2% de BSA libre CE y Ca2 + (2 g de agarosa baja fusión en 100 mL de Ca2 + libre CE). Disolver usando el microondas y colocar la agarosa fundida en un baño de agua a 40 ° C. Deje que se enfríe hasta 40 ° C antes de su uso en los tejidos.
    Nota: EC, Ca2 + CE libre puede ser almacenada a 4 ° C durante varias semanas si estériles y soluciones IC a-20 ° C, durante varios meses. Agarosa se puede conservar durante una semana a 4 ° C y puede ser reutilizada 3 a 5 veces por microondas brevemente. Reutilización excesiva dará lugar a la evaporación y la alteración de la agarosa y la concentración de la sal y la calidad.
  6. Hacen puente de agar:
    1. Calor de Capillares de vidrio de borosilicato largo de 7,5 mm con diámetro exterior (D.E.) de 2 mm y diámetro (I.D.) 1,16 mm utilizando un mechero Bunsen en un focal interior punto aproximadamente 1/3 de un extremo hasta que el cristal comienza a doblar. Retire el vaso de la llama y deje que el vidrio doblar con un ángulo de 120 grados (figura 2A).
    2. Derretir 2% agar en CE normal sin glucosa usando un microondas, y mientras la agarosa es líquido llenar el capilar mediante capilaridad de vidrio hecha de antemano las fuerzas por poner uno de los extremos del vidrio en el líquido y a la espera de algunos minutos. Tienda puentes hasta su uso a 4 ° C en CE sin glucosa.
  7. Preparar vidrio de borosilicate con pipetas de parche de filamento utilizando un extractor de la pipeta adecuada. Consulte el manual de tirador de la pipeta para obtener la resistencia deseada del electrodo.
    Nota: La forma cónica de la pipeta debe ser tan corta como sea posible. Forma cónica corta pipeta se logra tirando pasos de 4 – 6. La resistencia del electrodo debe ser entre 2 y 6 MΩ dependiendo del tamaño de la célula.
  8. Para evitar el movimiento del tejido durante los experimentos de patch-clamp cubra la superficie de la sala de grabación con 0.1% de polietilenimina (PEI) en solución tampón de borato.
    1. Preparar 500 mL de tampón de borato (25 mM):
      1. Disolver 4,768 g de Na2B4O710 H2O en 450 mL de ultrapura de H2O en un vaso de vidrio utilizando un agitador magnético.
      2. Ajustar el pH a 8.4 con HCl.
      3. Transferir la solución a un matraz aforado de 500 mL. Llene el matraz aforado con ultrapura de H2O hasta 500 mL y 0,2 μm filtro esterilización la solución mediante sistema de vacío de agua.
    2. Preparar una solución stock de 1% de PEI (PEI de 50% 1 mL de tampón de borato de 25 mM mL 49) y una dilución de 0,1% PEI diluyendo 10 μl de solución stock de 1% en 100 μl de tampón de borato para uso final.
    3. Añadir 2 mL de 0.1% de PEI en el cristal del titular del sector y dejar la capa incubar durante 1 minuto. Luego brevemente lavar el vidrio dos veces con 5 mL de la poste-limpieza de H2O y deje secar hasta el uso al aire.
  9. Preparar soluciones de anfotericina B.
    1. Hacen 60 mg/mL solución stock disolviendo 3 mg de anfotericina B polvo en 50 μl dimetil sulfóxido (DMSO), en un tubo de 1 mL protegido de la luz. Vortex a máxima velocidad durante 30 s y someter a ultrasonidos durante 15 minutos homogeneizar. Guardar alícuotas en tubos de 3 a 5 a-20 ° C y utilizar una alícuota por día.
      Nota: Si la solución madre de anfotericina B no es claro y amarillo color pero lechoso (amarillo todavía) después de la sonicación de 15 – 20 minutos hace una nueva solución.
    2. Hacer solución de IC con la anfotericina B pipetear 2 mL de la IC en un vaso limpio de vidrio con más de 10 mL de capacidad. Añadir 8 μl de la solución madre de anfotericina B en la solución de la pipeta y mezclar mediante pipeteo. Envuelva el vaso con papel de aluminio y coloque en hielo hasta su utilización y renovarlo cada 3 h.

2. disección y corte con Vibratome

  1. Preparar las herramientas de disección antes de disección, incluyendo una fuerte y una pinza fuerte con unas tijeras. Limpiar las herramientas (soporte para papel higiénico, cepillo, pinzas) con etanol y asegúrese de que se utilizan solamente para los propósitos de la disección y nunca en contacto con los tejidos fijos. Guárdalos en una caja separada para evitar la contaminación.
  2. Eutanasia a los peces de agua fría de hielo durante 1 minuto.
  3. Siga los pasos siguientes para disecar rápidamente el medaka cerebro y la hipófisis con pinzas afiladas (uso no más de 3 minutos).
    1. Mientras que sostiene el pescado con el fórceps fuerte severa los dos nervios ópticos detrás de los ojos con unas tijeras o pinzas de sharp.
    2. Abra la parte dorsal del cráneo desde la parte posterior hacia el anterior rompiendo los huesos del cráneo paso a paso con fuertes pinzas.
    3. Pele el cráneo por un lado con pinzas fuertes.
    4. Severa de la médula espinal con tijeras o pinzas afiladas.
    5. Suavemente, agarrar la médula espinal con el fórceps, voltear el cerebro de posterior a anterior y coloque en un plato con la helada Ca2 + gratis CE.
  4. Llenar un molde de metal de 1,5 – 2 cm3 con agarosa líquida y coloque en el hielo.
  5. Justo antes de que la agarosa se solidifica (en alrededor de 25 – 30 ° C), suavemente agarra el cerebro por la médula espinal con el fórceps, secar las pinzas con un pedazo de papel fino y poner el tejido en la agarosa. Mezclar rápidamente la agarosa para diluir los rastros de la CE a la izquierda alrededor del tejido y orientar el tejido y dejar el molde en hielo durante unos segundos hasta que la agarosa se endurezca.
    Nota: Es esencial para este paso a ser rápido. La agarosa se solidifica rápidamente como el molde de metal es enfriado por el hielo.
  6. Recortar un bloque cuadrado de agarosa que contiene el tejido con una hoja de bisturí y goma en el soporte de espécimen de vibratome con pegamento (no tóxico) de la cirugía.
  7. Llene la cubeta de vibratome recibiendo las mordazas (cerebro-pituitaria) con helado Ca2 + libre EC.
  8. Coloque el soporte del espécimen en el vibratome y corte el bloque de agarosa para hacer secciones de parasagittal de 150 μm, usando alta frecuencia y la velocidad baja para el seccionamiento. Recopilar las secciones seleccionadas y colocarlas en la cámara de grabación de patch-clamp con 3 mL de helado Ca2 + gratis CE.
  9. Coloque el arpa de rejilla (figura 2B) en la sección del tejido.
    Nota: El arpa junto con la capa estabilizarán el tejido y evitar que se mueva durante las grabaciones de patch-clamp.
  10. Después de que el arpa está en su lugar, cambie el Ca2 + CE medio libre a la CE normal con Ca2 + y BSA. Deje que el resto de tejido por 10 min.

3. perforado de Patch-clamp y las grabaciones electrofisiológicas

  1. Antes de comenzar el experimento, de cloruro de plata alambre electrodos por los siguientes pasos: en primer lugar, utilice un papel de lija fino (p180) para limpiar los electrodos de alambre de plata. En segundo lugar, lave con 2 mL, etanol al 70%. En tercer lugar, sumergir los cables en 2 mL, 2 – 5% de cloro durante 10 minutos. Por último, lave con 2 mL, ultrapura H2O.
  2. La sala de grabación con la rebanada del cerebro-pituitaria en la platina del microscopio y localizar la zona de destino (pituitaria) con objetivo de 10 X e Inspeccione las células utilizando el objetivo 40 X.
    Nota: Si la preparación es correcta, muy pocas células redondas deben ser visibles. Estas células redondas son células generalmente dañadas que son desprendimiento del tejido.
  3. Coloque el electrodo de puesta a tierra a través del puente de agar al 2% en el baño de la EC.
  4. Localizar una célula sana utilizando el objetivo 40 X.
    Nota: Una célula sana debe ser firmemente unida a la rodaja de tejido y no redondeada y separada de la rebanada.
  5. Ajuste el amplificador en tensión-abrazadera (VC; Modo de punto 1 de la Figura 4A ). Abierto el sello prueba ventana y pulse Configuración de la bañera (Figura 4B los puntos 1 y 2. Utilizar un pulso de 5-mV para supervisar pipeta resistencia (punto 3 dela Figura 4B ).
  6. Rellene la punta de la pipeta de parche con el antimicótica solución gratuita de IC antes de agregar la solución de la IC con la anfotericina B utilizando una jeringa de micro relleno (ver figura 3).
  7. Añadir una presión ligeramente positiva en la pipeta patch usando jeringa de 1 mL.
    Nota: Esto hace que un pequeño flujo de líquido de la pipeta de parche que evite la contaminación de la punta.
  8. Una vez en el baño, evaluar la resistencia de la pipeta de parche y asegúrese de que ninguna partícula se une a la punta de la pipeta (figura 4).
    Nota: Se adjunta un pequeño trozo de cinta en el monitor mostrando la forma de grabación de vídeo del campo de visión. Esto hace que la colocación de la pipeta del parche en relación con la célula más fácil cuando el objetivo no se centra en la célula.
  9. Guía de la pipeta del parche hacia la célula utilizando micromanipuladores.
    Nota: Asegúrese de que la pipeta esté limpia buscando pequeñas partículas que puedan haber conectado a la punta de la pipeta. Cambios bruscos en la resistencia también pueden ser el resultado de partículas en la punta de la pipeta.
  10. Reajustar la pipeta cuando unos pocos micrones sobre la célula para que la punta de la pipeta toque la celda 1/3 desde el centro de la célula, como se muestra en la figura 5. Al tocar la celda, libere la presión y aplica una succión suave para hacer un sello.
    Nota: El tiempo de la pipeta de parche entra en el baño a un acertado sello debe ser lo más corto posible. No más de 1 – 1,5 min para evitar llegar a la punta de la pipeta y fugas en el baño de la anfotericina B.
  11. Inmediatamente cambie a la ventana de parche en el software de patch-clamp (punto 1 de lafigura 4 D ) y tienen un potencial de explotación entre-50 y -60 mV (punto 2 de lafigura 4 ). Cero fuera la capacitancia rápida hecho por la pipeta de vidrio (punto 3 de lafigura 4 ).
  12. Cambiar a la ventana de la celda en software de patch-clamp (figura 4E los puntos 1 y 2) y comenzar el monitoreo de la resistencia de acceso, Ra, aparece en la ventana. Cero a la capacitancia de la membrana en el software de amplificador (figura 4E punto 3) acceso suficiente.
    Nota: Acceso suficiente puede tomar de 10 a 30 min (figura 4E punto 2). Un buen acceso para las grabaciones de abrazadera actual debe estar por debajo de 20 M.
  13. Cambiar a mordaza corriente, IC, en la ventana del software amplificador (figura 4F punto 1). Ajustar las corrientes de rápido-capacitivo en la ventana - abrazadera del software amplificador (figura 4F puntos 2 y 3) con el mismo valor como en 3.12. Comprobar el potencial de la membrana (figura 4F punto 1).
    Nota: Lo importante es que, si el potencial de membrana es poco profunda (típicos por encima de -35 mV) el celular se ha dañado. Cancelar el registro y encontrar una nueva célula.
  14. Después de encontrar una célula sana (unida firmemente al tejido con membrana potencial por debajo de -40 mV), comenzar las grabaciones experimentales como se detalla en protocolo 33,34 el fabricante.

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Representative Results

Este protocolo muestra un protocolo paso a paso de cómo lograr confiables grabaciones electrofisiológicas de las células de la pituitaria (gonadotrope), utilizando una línea transgénica de medaka [Tg (lhb- hrGfpII)] donde el objetivo de las células (productoras de Lh gonadotropes) están marcados con proteína verde fluorescente (GFP).

Inicialmente, se llevaron a cabo las investigaciones electrofisiológicas con configuración de célula entera. Sin embargo, los potenciales de acción espontáneos no fueron observados en ninguna de las células estudiadas. En un subconjunto de las células, los potenciales de acción podrían activarse mediante pequeñas inyecciones actuales (5-9 pA) de un potencial de reposo entre-50 y -60 mV (figura 6). Estos potenciales de acción tenían un resumen rápido, y después de unos 4 – 6 minutos activa los potenciales de acción ya no eran posibles. Resumen particularmente rápida observada puede explicarse por el tamaño pequeño de la célula. En general, las células de la pituitarias son más pequeñas que las neuronas 30. Por ejemplo, un promedio de capacitancia de la membrana de las gamas de las células del gonadotrope entre 4 y 10 pF 3,30,35. Similar a estos medaka resultados gonadotrope células tenían una capacitancia de membrana promedio de (media ± S.D) 3.4 ± 0.9 picofaradio (n = 67).

Cambiar a la configuración de parche perforado con anfotericina B, los potenciales de acción espontáneos fueron observados en aproximadamente el 50% de las células registradas (figura 7A, n = 63 células de 21 animales). Por otra parte, los potenciales de acción podría activarse en el 95% de estas células con no Resumen observable incluso después de grabaciones prolongadas (hasta 1 h). Lo importante, para lograr grabaciones fiables y de alta calidad, es necesario llenar primero la punta con solución de IC sin antifúngico. Si pequeñas cantidades de medicamentos antifúngicos escapan la punta de la pipeta antes de hacer el gigaseal, puede dañar la célula diana como células bien como circundantes.

Con el fin de comprobar si las células en la configuración de parche perforado son capaces de responder a su principal hormona de liberación, se aplicaron 1 puff de Gnrh1 μm expulsado en las células diana. Los experimentos se realizaron en la abrazadera actual que permitirá monitorear los cambios en el voltaje. Estos experimentos revelaron una respuesta bifásica (figura 7B). La primera fase es una hiperpolarización en la liberación de Ca2 + de los almacenes internos activar Ca2 + activa K+ canales causando la hiperpolarización. La primera fase es seguida por una despolarización y potencial de acción de mayor frecuencia de 1 a 2 Hz hasta alrededor de 3 Hz. En algunas de las grabaciones, la segunda fase tenía potenciales de pseudo meseta donde se observaron picos pequeños de 2 o 3 antes de la repolarización.

Figure 1
Figura 1 : Diferencia entre la célula entera (A) y las configuraciones de parche perforada (B) de la técnica de patch-clamp. En la configuración de celulares (A), después gigaseal está en su lugar, un agujero se hace en la membrana aplicando una pequeña presión negativa en la pipeta de parche. En esta configuración, se pueden diluir en la solución de la pipeta de parche pues afecta las respuestas eléctricas y fisiológicas de la célula moléculas intracelulares importantes como moléculas de señalización. Este fenómeno es aún más importante en pequeñas células, como las células de la pituitarias. En cambio, en la configuración de parche perforado (B), después gigaseal, contacto eléctrico entre el citosol y el parche pipeta se compone de antifúngicos o surfactantes. El antifúngico o surfactante es cargado a la pipeta patch antes de parchear y será incorporado a la membrana de plasma bajo el parche, de tal modo lentamente perforando la membrana, permitiendo que sólo las moléculas pequeñas como los iones monovalentes para pasar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Fotos del puente de Agar (A) y el arpa (B) utilizados en el protocolo. Escala en mm haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Llenado de la pipeta patch. (A) antihongos libre IC solución (líquido azul) es rellenados por las fuerzas capilares debido a los filamentos dentro de la pipeta. (B) después de llenar la pipeta con antihongos libre IC, la parte posterior de la pipeta se llena con solución de IC con anfotericina B (líquido amarillo) utilizando una aguja de jeringa (micro relleno). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4A
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Figure 4B
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Figure 4C
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Figure 4D
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Figure 4E
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Figure 4F
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Figura 4 : Software imágenes. (A) que muestra la ventana de software de amplificador. 1. Resumen (círculo rojo) el área de modo que permite cambiar entre voltaje abrazadera (VC), actual sin ninguna inyección de corriente (I = 0) y pinza de corriente con posibilidad de inyecciones de corriente (IC). 2 Resumen (círculo rojo) la zona de ajuste de corriente rápido capacitiva en la abrazadera de tensión así como ajustes corriente capacitivos celulares. (B) muestra el software de la abrazadera del remiendo con la ventana de prueba de la membrana abierta. 1. Resumen (círculo rojo) el botón de prueba de la membrana. 2. Resumen (círculo rojo) el pulso diferentes configuraciones, baño, parche y celular. 3. Resumen (círculo rojo) la amplitud de la configuración de pulso y la frecuencia. (C-F) muestra a una viuda combinada de la abrazadera del remiendo software (izquierda) y amplificador (derecha). (C) Resumen (círculo rojo) la resistencia cuando la pipeta está en el baño y correcta conexión a tierra usando agar puente (en modo del baño). (D) 1. se destaca la conmutación a modo de parche siguiendo gigaseal (círculo rojo). 2. reflejos (círculo rojo) la configuración de pulso (pulso de 10 mV) y el potencial de explotación ajustados a -60 mV. 3. Resumen (círculo rojo) la ventana para corregir o poner a cero las corrientes capacitiva rápida después de un sello de giga. (E) 1. Resumen (círculo rojo) el modo de celular utilizado para el monitoreo de la resistencia de acceso. 2 destaca (círculo rojo) los parámetros de celda, capacitancia de membrana (Cm), sello de calidad (Rm), acceder a resistencia (Ra), la constante de tiempo (Tau) y la corriente de retención (Hold). 3. Resumen (círculo rojo) el botón para la corrección de las corrientes capacitivas de la membrana. (F) 1. Se destaca el modo IC para control de potencial de membrana (círculo rojo). 2. Resumen (círculo rojo) el botón para cambiar a los ajustes de abrazadera actual (I-clamp). 3. Resumen (círculo rojo) la ventana para la corrección de la corriente capacitiva de rápida.

Figure 5
Figura 5 : Micrografía de una abrazadera del remiendo de grabación en un pituitarios de la célula usando la configuración de parche perforado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Grabaciones de abrazadera actual un GFP marcado Lh-producción de la célula siguiendo las inyecciones actuales usando la configuración normal de la célula entera. Las células se mantuvieron entre-50 y -60 mV. Potenciales de acción típicos podría activarse en un subconjunto de células mediante inyecciones actual de 5 a 10 pA inmediatamente después de lograr el acceso a la célula (trazo negro). Después de 1 a 3 minutos la amplitud del potencial de acción comenzó a disminuir, un signo típico de resumen (rastro cian). Después de 4 – 6 minutos la amplitud del potencial de acción casi completamente desaparecida (trazo magenta). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7 : Pinza de corriente de grabación de una célula GFP marcado productoras de Lh mediante la configuración de parche perforado, después de estimulación con la hormona liberadora de gonadotropina Gnrh1. (A) grabación abrazadera actual demostración espontáneos potenciales de acción de una célula de gonadotrope producción de Lh. (B) una respuesta de bifásica donde Gnrh1 estimulación para 10 s primero inducida por una hiperpolarización de la membrana de la célula seguida por una despolarización y mayor frecuencia (de 1 a 2 Hz a 3 Hz) de disparo de potenciales de acción en una célula que disparó previamente potenciales de acción espontáneos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Las grabaciones electrofisiológicas mediante la técnica de patch-clamp en rebanadas de cerebro-pituitaria requieren cuidadosa optimización. Protocolos bien optimizados para llevar a cabo las investigaciones de células vivas en teleósteos se limitan, con la mayoría de publicaciones utilizando protocolos basados en sistemas mamíferos. En este sentido, es importante ser consciente del hecho de que varios parámetros fisiológicos como pH y la osmolalidad son no sólo las especies dependientes, pero también mucho depende de si el organismo en cuestión vive en tierra o en agua. Para los peces, también es necesario, tener en cuenta, si viven en un entorno marino o agua dulce. Por ejemplo, la presión parcial del CO2 es mucho menor en los peces, en comparación con los mamíferos con niveles que van desde 1.7 – 3.4 mmHg pCO2 en peces y 40 – 46 mmHg pCO2 en mamíferos 36. En base a esto, ajustar el pH a 7,75 37,38,39,40 en todas las soluciones utilizadas en el protocolo actual. También usamos buffer HEPES como se ha demostrado poseer excelente capacidad de almacenamiento en búfer en la región de pH de 7.4 – 7.8 41. Para la osmolalidad, utilizamos 290-300 mOsm, que es lo que se ha medido en el ambiente extracelular de medaka 42. La temperatura empleada durante las grabaciones electrofisiológicas ha sido seleccionada según el ambiente de los peces. De hecho, medaka vive en aguas con un amplio rango de temperaturas (de 4 a 40 ° C), mientras que en nuestro laboratorio se crían en un ambiente controlado en 26 – 28 ° C. En base a esto, realizamos nuestras grabaciones a temperatura ambiente (aproximadamente 25 ° C), diferente de lo que se utiliza para los tejidos mamíferos (37 ° C) o de especies de peces de aguas frías como el bacalao del Atlántico (12 ° C) 18.

Para poder parchear las células hipofisarias, es crítico generar rebanadas de tejido sano. Es imperativo utilizar herramientas limpias (Portarollos, cepillo, pinzas, etcetera) que sólo en contacto con tejido vivo (sin fijadores). Una rápida disección de cerebro y la pituitaria y el mantenimiento de los tejidos a baja temperatura (4 ° C) mientras que la disección y corte son otros factores clave para proporcionar secciones viables. También debe prestarse atención específica a la temperatura de la agarosa sobre la inclusión de tejido. Agarosa demasiado calor podría dañar el tejido mientras agarosa demasiado frío no te dejará tiempo para orientar el tejido para seccionamiento adecuado. Además, el corte se debe hacer con solución CE sin Ca2 + para evitar que las células dañadas después de seccionamiento para entrar en apoptosis. Burbujas no es necesario, pero los cortes de tejido deben recogerse inmediatamente después de seccionamiento. Deje la rebanada unos 15 min después de seccionamiento para permitir que las células a descansar un poco antes de parchear.

Peces teleósteos son excelentes modelos para investigar propiedades electrofisiológicas de las células hipofisarias. De hecho, contrariamente a mamíferos y aves, peces no poseen una eminencia media, lo que significa que las neuronas hipotalámicas controlan la hipófisis directamente proyectar sus axones sobre sus células blanco del 32. Así, en un trozo de cerebro-pituitaria, las células pituitarias se mantienen en un entorno más intacto en comparación con cultivos primarios de células hipofisarias donde las células son disociadas con tratamientos químicos y mecánicos. Curiosamente, con rebanadas de cerebro-pituitaria de medaka, pudimos observar que el potencial de acción disparo frecuencia en células Lh, después de la activación de Gnrh1, aumentado (figura 5). Estas observaciones están de acuerdo con lo que se ha reportado en estudios del cultivo celular hipofisaria de nuestro propio laboratorio 29 que indica que la utilización de cultivos primarios de células hipofisarias son todavía relevantes para caracterizar las propiedades de la membrana de las células hipofisarias. Sin embargo, rebanadas de cerebro-pituitaria nos permiten estudiar también los efectos indirectos de diferentes compuestos, así como las interacciones entre las células, ya que mantiene conexiones estructurales que se pierden en cultivos primarios de células hipofisarias. Además, preparación de slice es más rápido preparar en comparación con un cultivo celular primario disociado, y las grabaciones electrofisiológicas pueden llevarse a cabo en los siguiente 30 min después de la disección. Esto significa que, contrariamente a una cultura de célula primaria, los ritmos circadianos pueden abordarse en forma significativa usando rebanadas recién preparadas.

Debido al pequeño tamaño de las células pituitarias de peces (capacitancia de la membrana alrededor de 3-10 pF) y nuestras propias observaciones que muestran que las células del gonadotrope pierden su capacidad de disparar potenciales de acción (figura 3) y así perder su capacidad para responder a liberación de hormonas al grabar en configuración de celulares, decidimos usar y presentar la técnica de parche perforado en este documento. De hecho, se ha demostrado que la configuración del conjunto de células podría conducir a la difusión de importantes moléculas citoplasmáticas así cambiar la propiedades electrofisiológicas celulares del 13. Utilizar en su lugar las configuraciones parche perforado con anfotericina B a perforar la membrana de la célula con la pipeta patch, hacer sólo pequeños agujeros permitiendo sólo pequeños iones pasar a través de 15,16,43, 44, podríamos evitar esta dilución y grabar la actividad eléctrica de la célula durante un tiempo prolongado.

Un punto importante en la técnica de parche perforado es primer back-llenar la pipeta con la solución de IC sin antifúngicos para evitar liberación de antifúngicos en el medio y dañar todas las celdas de la sección mientras se acerca con la pipeta de parche. De hecho, debido a la presión positiva aplicada a la pipeta del parche mientras se aproxima el tejido, líquido gotea a través de la pipeta de parche hasta que el parche. Este flujo ayuda a mantener la punta limpia hasta llegar a la célula específica pero si antihongos es liberado en el medio antes de la revisión, pueden perforar todas las membranas de todas las células, cambiando dramáticamente las características de permeabilidad de las membranas celulares y así sus propiedades eléctricas.

El procedimiento presentado ha sido optimizado y utilizado con éxito para estudiar la actividad eléctrica de las células del gonadotrope medaka. Además, puede utilizarse el protocolo para el estudio de todos los tipos de célula (endocrino) encontrados la hipófisis de medaka y otras especies de peces teleósteos. Tenga en cuenta solamente que la osmolalidad y el pH de todas las soluciones deben ajustarse a la de los líquidos del cuerpo de la especie en cuestión.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar

Acknowledgments

Agradecemos a la Sra. LourdesCarreon G Tan por su ayuda en el mantenimiento de las instalaciones de medaka y Anthony Peltier para las Figuras ilustrativas. Este trabajo fue financiado por NMBU y por el Consejo de investigación de Noruega, números de concesión 244461 (programa de acuicultura) y 248828 (programa de Noruega vida Digital).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000 S
Chirurgical glue WPI VETBOND 3M Vetbond Tissue Adhesive
Stainless steel blades Campden Instruments 752-1-SS
metal molds SAKURA 4122
steel harp Warner instruments 64-1417
PBS SIGMA D8537
Ultrapure LMP agarose invitrogen 166520-100
patch pipettes Sutter Instrument BF150-110-10HP Borosilicate with filament O.D.:1.5 mm, I.D.:1.10 mm
Microscope Slicescope Scientifica pro6000
P-Clamp10 Molecular Devices #1-2500-0180 sofware
Digitizer Digidata 1550A1 Molecular Devices DD1550
Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B Molecular Devices 1-CV-7B
GnRH Bachem 4108604 H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt 
pipette puller Sutter Instrument P-1000
amphotericin B SIGMA A9528 pore-forming antibiotic
polyethylenimine  SIGMA P3143 50% PEI solution
microfiler syringe WPI MF28/g67-5
glass for the agar bridge Sutter Instrument BF200-116-15 Borosilicate with filament O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm Fire polished
Micro-Manager software Open Source Microscopy Software
optiMOS sCMOS camera Qimaging  01-OPTIMOS-R-M-16-C
sonicator Elma D-7700 singen
NaCl SiGMA S3014
KCl SiGMA P9541
MgCl2 SiGMA M8266
D-Glucose SiGMA G5400
Hepes SiGMA H4034
CaCl2 SiGMA C8106
Sucrose SiGMA 84097
D-mannitol SiGMA 63565
MES-acid SIGMA M0895
BSA SIGMA A2153

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. J. Vis. Exp. (138), e57790, doi:10.3791/57790 (2018).

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