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Neuroscience

Fette di cervello-ipofisi sane per le indagini elettrofisiologiche delle cellule ipofisarie in pesci teleostei

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/57790
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences
* These authors contributed equally

Summary

L'articolo descrive un protocollo ottimizzato per fare fette di tessuto vitale del cervello-ipofisi, utilizzando il medaka pesci teleostei (Oryzias latipes), seguita da registrazioni elettrofisiologiche delle cellule ipofisarie utilizzando la tecnica del patch-clamp con il configurazione di patch perforato.

Abstract

Sono state condotte indagini elettrofisiologiche delle cellule ipofisarie in numerose specie di vertebrati, ma molto pochi in pesci teleostei. Tra questi, la netta maggioranza è stata effettuata su cellule primarie dissociate. Per migliorare la nostra comprensione di come Teleostei cellule ipofisarie, si comportano in un ambiente più biologicamente rilevante, questo protocollo viene illustrato come preparare fette di cervello-ipofisi vitali utilizzando il medaka (Oryzias latipes) di piccoli pesci d'acqua dolce. Rendendo le fette di cervello-ipofisi, pH e osmolalità di tutte le soluzioni sono stati adeguati ai valori trovati nei liquidi corporei di pesci d'acqua dolce che vivono a 25-28 ° C. Dopo la preparazione della fetta, il protocollo viene illustrato come effettuare registrazioni elettrofisiologiche usando la tecnica perforata della intero-cellula patch-clamp. La tecnica del patch-clamp è un potente strumento con risoluzione temporale senza precedenti e sensibilità, che permette di indagine delle proprietà elettriche da cellule intatte tutta giù per canali ionici singolo. Patch di perforata è unico in quanto mantiene l'ambiente intracellulare intatto impedendo elementi regolatori nel citosol di essere diluito la soluzione di elettrodo pipetta patch. Al contrario, quando si eseguono registrazioni della intero-cellula tradizionale, è stato osservato che cellule ipofisarie medaka perdono rapidamente la capacità di potenziali di azione del fuoco. Tra le varie tecniche di perforazione disponibili, questo protocollo viene illustrato come ottenere la perforazione della membrana con patch utilizzando il fungicida anfotericina b.

Introduction

L'ipofisi è un organo endocrino chiave nei vertebrati situati sotto l'ipotalamo e posteriormente al chiasma. Produce e secerne ormoni di sei-otto dai tipi cellulari specifici. Ormoni ipofisari costituiscono un intermedio tra il cervello e gli organi periferici e pilotare un'ampia gamma di processi fisiologici essenziali tra cui la crescita, la riproduzione e la regolazione dell'omeostasi. Simili ai neuroni, cellule endocrine dell'ipofisi sono eccitabili elettricamente con la capacità di fuoco spontaneamente i potenziali di azione 1. Il ruolo di questi potenziali di azione è cella dipendente. In diversi tipi di cellule dell'ipofisi dei mammiferi, i potenziali di azione possono elevare l'intracellulare Ca2 + sufficientemente per un rilascio prolungato dell'ormone 2. Inoltre, l'ipofisi riceve informazioni sia stimolatori e inibitori del cervello che colpisce il potenziale di membrana delle cellule 3,4,5,6. In genere, stimolatori input aumenta l'eccitabilità e spesso comporta il rilascio di Ca2 + dai depositi intracellulari nonché aumentata frequenza 7di infornamento. Comprendere come la cella utilizza la composizione di canale ionico e si adatta a questi segnali di input dal cervello è la chiave alla comprensione dell'ormone sintesi ed il rilascio.

La tecnica del patch-clamp è stata sviluppata nel tardo 1970 da Sakmann e Neher 8,9,10 e ulteriormente migliorata da Hamill 11e permette indagini dettagliate delle proprietà elettrofisiologiche delle cellule giù per i canali ionici singolo. Inoltre, la tecnica può essere utilizzata per lo studio di tensione e corrente. Oggi, patch di bloccaggio è il gold standard per le proprietà elettrofisiologiche della cella di misura. Quattro configurazioni principali della tecnica del patch-clamp tenuta sono stati sviluppati 11; la cella collegata, dentro-fuori, fuori-fuori e la patch di cellule intere. Le tre configurazioni prime in genere sono utilizzate per le indagini di canale singolo ione. Per il quarto, dopo la configurazione di cella-associata, un buco nella membrana cellulare avviene tramite pressione sub-atmosferica. Questa configurazione consente inoltre di indagini della composizione canale ionico dell' intera cellula 12. Tuttavia, una limitazione di questa tecnica è che molecole citoplasmatiche sono diluiti dai patch pipetta soluzione 13 (Figura 1A), influenzando così le risposte elettriche e fisiologiche delle cellule studiate. Infatti, alcune di queste molecole possono svolgere ruoli importanti nella trasduzione del segnale o nella regolazione dei canali ionici diversi. Per evitare questo, Lindau e Fernandez 14 ha sviluppato un metodo dove un composto pore-forming viene aggiunto alla pipetta patch. In seguito la configurazione collegata alla cella, il composto sarà incorporare nella membrana del plasma sotto la patch e lentamente perforare la membrana creazione contatto elettrico con il citosol (Figura 1B). Parecchi diversi antimicotici quali nistatina 15 e amfotericina B 16, o tensioattivi come le saponine beta-escina 17,18 possono essere utilizzato. Questi composti creare pori abbastanza grandi da permettere di cationi monovalenti e Cl– diffusione tra il citosol e la pipetta patch preservando i livelli citosolici di macromolecole e più grandi ioni come Ca2 + 15, 16.

La sfida di utilizzare perforato patch è la resistenza serie potenzialmente elevato. Resistenza in serie (Rs) o accesso resistenza è la resistenza combinata sopra la pipetta patch rispetto al suolo. Durante le registrazioni di patch-clamp, la Rs sarà in parallelo con la resistenza di membrana (Rm). Rm e Rs a lavoro parallelo come un partitore di tensione. Con l'alta Rs, la tensione cadrà sopra la Rs dà errori nelle registrazioni. L'errore diventerà più grande con correnti elevate registrate. Inoltre, il partitore di tensione è anche frequenza dipendente dalla creazione di un filtro passa-basso, influenzando così la risoluzione temporale. In effetti, la patch perforata potrebbe non sempre consentire registrazioni delle ampie e veloci correnti come la tensione gated le correnti Na+ (per letture dettagliate vedi riferimento 19). Inoltre, Rs possono variare durante le registrazioni di patch-clamp, nuovamente portando a cambiamenti nella corrente registrata. Così, falsi positivi possono verificarsi in situazioni dove Rs cambia durante l'applicazione del farmaco.

L'elettrofisiologia sul tessuto affettato è stato introdotto al laboratorio di Andersen per studiare le caratteristiche elettrofisiologiche dei neuroni nel cervello 20. La tecnica ha aperto la strada per indagini dettagliate delle singole cellule così come i circuiti di comunicazioni e cellula-cellula in un ambiente intatto. Una tecnica simile per fare fette pituitari è stato introdotto nel 1998 da Guérineau et al. 21. Tuttavia, non era prima del 2005, quella fetta di cervello-ipofisi preparazione è stata utilizzata con successo per gli studi di patch-clamp in teleostei 22. In questo studio, gli autori hanno segnalato anche l'utilizzo di registrazioni perforato patch clamp. Tuttavia, di gran lunga, la maggior parte delle indagini elettrofisiologiche delle cellule ipofisarie sono stati condotti nei mammiferi e solo una manciata di altri vertebrati, tra cui pesci teleostei 1,2,22,23 . In teleostei, quasi tutti gli studi sono stati effettuati su cellule dissociate primarie 24,25,26,27,28,29,30 .

Nel presente documento, abbiamo delineare un protocollo ottimizzato per la preparazione di fette di cervello-ipofisi sane da medaka di pesce il modello. L'approccio rappresenta diversi vantaggi rispetto alle colture primarie di cellule dissociate. In primo luogo, le cellule vengono registrate in un ambiente relativamente conservato rispetto al dissociato condizioni di coltura delle cellule. In secondo luogo, fetta preparazioni ci permettono di studiare percorsi indirette mediate dalla cella comunicazione 22, che non è possibile in condizioni di coltura delle cellule dissociate. Inoltre, dimostriamo come condurre le registrazioni elettrofisiologiche sulle fette di tessuto ottenuti usando la tecnica perforata della intero-cellula patch-clamp con amfotericina B come l'agente pore-forming.

Medaka è un piccolo pesce d'acqua dolce originario dell'Asia, trovato principalmente in Giappone. La fisiologia, embriologia e genetica di medaka è stata studiata estesamente per oltre 100 anni 31, ed è un modello di ricerca comunemente utilizzati in molti laboratori. Di particolare importanza per questa carta è l'organizzazione morfologica distinta del complesso ipotalamo-ipofisario nei pesci Teleostei: considerando che nei mammiferi e uccelli i neuroni ipotalamici rilasciano loro neuro-ormoni che regolano le cellule endocrine ipofisarie nel sistema portale dell'eminenza mediana, c'è una proiezione nervosa diretta dei neuroni ipotalamici sulle cellule endocrine dell'ipofisi in pesci teleostei 32. Così, attentamente condotta cervello-ipofisi affettare è di particolare importanza nei pesci, che ci permette di studiare le caratteristiche elettrofisiologiche delle cellule ipofisarie in una rete di cervello-ipofisi ben conservata e cellule in particolare come ipofisi controllare loro eccitabilità e quindi omeostasi del Ca2 + .

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Protocol

Tutti gli animali gestione è stata eseguita secondo le raccomandazioni per la cura e il benessere degli animali di ricerca presso l'Università norvegese di Scienze della vita e sotto la supervisione di ricercatori autorizzati.

1. preparazione di strumenti e soluzioni

Nota: Tutte le soluzioni devono essere sterili. Attenzione occorre prestare attenzione per il pH e l'osmolalità (osmol/kg di acqua) di tutte le soluzioni, che dovrebbe essere attentamente adattato all'ambiente extracellulare delle specie studiate. pH e osmolalità deve essere regolati con precisione apparecchiature elettroniche, quali pH-metro e punto di congelamento Osmometro rispettivamente.

  1. Fare 500 mL di soluzione extracellulare senza Ca2 + (Ca2 + libero CE): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM MgCl2, glucosio di 4 mM, 10 mM Hepes.
    1. Sciogliere 4,38 g di NaCl, 186,37 mg di KCl, 61,89 mg di MgCl2, 360,32 mg di glucosio e 1,19 g di HEPES in 450 mL di ultrapura (0,055 uS / cm a 25 ° C, la resistività del 18,2 MOhm) H2O in un becher di vetro usando un agitatore magnetico.
    2. Regolare il pH a 7.75 con NaOH.
    3. Trasferire la soluzione in un matraccio tarato da 500 mL. Riempire il matraccio tarato con ultrapura H2O fino a 500 mL.
    4. Mescolare bene prima di misurare il osmolality. Regolare a 290-300 mOsm con mannitolo. Filtro sterilizzare la soluzione utilizzando il sistema di vuoto di acqua e filtro di 0,2 µm.
  2. Fare 500 mL di soluzione extra-cellulare (CE): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2mm CaCl2, 1,3 mM MgCl2, glucosio di 4 mM, 10 mM Hepes.
    1. Sciogliere 4,38 g di NaCl, 186,37 mg di KCl, 147,01 mg di CaCl2, 61,89 mg di MgCl2, 360,32 mg di glucosio e 1,19 g di HEPES in 450 mL di ultrapura H2O in un becher di vetro usando un agitatore magnetico.
    2. Regolare il pH a 7.75 con NaOH.
    3. Trasferire la soluzione in un matraccio tarato da 500 mL. Riempire il matraccio tarato con ultrapura H2O fino a 500 mL.
    4. Mescolare bene prima di misurare il osmolality. Regolare a 290-300 mOsm con mannitolo. Filtro sterilizzare la soluzione utilizzando il sistema di vuoto di acqua e filtro di 0,2 µm.
  3. Fare 500 mL di soluzione extracellulare con 0,1% di sieroalbumina bovina (CE con BSA): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2mm CaCl2, 1,3 mM MgCl2, glucosio di 4 mM, 10 mM Hepes.
    1. Sciogliere 4,38 g di NaCl, 186,37 mg di KCl, 147,01 mg di CaCl2, 61,89 mg di MgCl2, 360,32 mg di glucosio e 1,19 g di HEPES in 450 mL di ultrapura H2O in un becher di vetro usando un agitatore magnetico.
    2. Regolare il pH a 7.75 con NaOH.
    3. Trasferire la soluzione in un matraccio tarato da 500 mL. Riempire il matraccio tarato con ultrapura H2O fino a 500 mL.
    4. Mescolare bene prima di misurare il osmolality. Regolare a 290-300 mOsm con mannitolo. Filtro sterilizzare la soluzione utilizzando il sistema di vuoto di acqua e filtro di 0,2 µm. Aggiungere 50 mg di BSA.
  4. Fare 250 mL di soluzione intracellulare (IC): 110 mM KOH, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, saccarosio 20 mM.
    1. Sciogliere 1,54 g KOH, 327,75 mg di KCl, 595,75 mg di HEPES e 1,712 g di saccarosio in 450 mL di ultrapura H2O in un becher di vetro usando un agitatore magnetico.
    2. Regolare il pH a 7,2 con (N-morfolino) etano (MES) acidi solfonici.
    3. Trasferire la soluzione in un matraccio tarato da 250 mL. Riempire il matraccio tarato con ultrapura H2O fino a 250 mL.
    4. Mescolare bene prima di misurare il osmolality. Regolare a 280-290 mOsm (10 mOsm inferiore CE) con saccarosio. Filtro sterilizzare la soluzione utilizzando il sistema di vuoto di acqua e filtro di 0,2 µm.
  5. Fare 100 mL di soluzione di agarosio fusione basso di 2% in Ca2 + e CE gratis BSA (2 g di agarosio bassa fusione in 100 mL di Ca2 + gratis CE). Sciogliere utilizzando un forno a microonde e posizionare l'agarosio fuso in un bagno di acqua a 40 ° C. Lasciate raffreddare fino a quando non raggiunge i 40 ° C prima dell'uso sui tessuti.
    Nota: CE, Ca2 + gratis CE può essere conservati a 4 ° C per diverse settimane se sterile e soluzioni IC a-20 ° C, per diversi mesi. Agarosio può essere conservato per una settimana a 4 ° C e può essere riutilizzato 3 – 5 volte da brevemente microwaving. Eccessivo riutilizzo porterà ad evaporazione e alterazione di agarosio e la concentrazione di sale e la qualità.
  6. Fare ponte di agar:
    1. Riscaldare i capillari di vetro borosilicato lungo 7,5 mm con diametro esterno (O.D.) 2 mm e diametro interno (I.D.) 1,16 mm utilizzando un bruciatore di Bunsen a una focale punto circa 1/3 da un'estremità fino a quando il vetro comincia a piegarsi. Togliere il vetro dal fuoco e lasciare il vetro da piegare con un angolo di circa 120 gradi (Figura 2A).
    2. Sciogliere 2% agar CE normale senza glucosio facendo uso di un forno a microonde, e mentre l'agarosio è liquido riempire il vetro pre-fatto capillare utilizzando capillarità forze mettendo una delle estremità del vetro nel liquido e un'attesa di pochi minuti. Negozio ponti fino all'utilizzo a 4 ° C in CE senza glucosio.
  7. Preparare in vetro borosilicato con pipette di patch di filamento con l'estrattore adatto pipetta. Consultare il manuale di estrattore di pipetta per ottenere la resistenza desiderata dell'elettrodo.
    Nota: Il cono della pipetta deve essere più corto possibile. Breve pipetta cono è realizzato usando 4 – 6 operazioni di trazione. La resistenza dell'elettrodo dovrebbe essere tra 2 e 6 MΩ a seconda delle dimensioni della cella.
  8. Per evitare il movimento del tessuto durante gli esperimenti di patch-clamp rivestire la superficie della camera di registrazione con 0,1% di polyethylenimine (PEI) in tampone borato.
    1. Preparare 500 mL di tampone borato (25 mM):
      1. Sciogliere g 4,768 di Na2B4O710 H2O in 450 mL di ultrapura H2O in un becher di vetro usando un agitatore magnetico.
      2. Regolare il pH a 8.4 con HCl.
      3. Trasferire la soluzione in un matraccio tarato da 500 mL. Riempire il matraccio tarato con ultrapura H2O fino a 500 mL e 0,2 µm filtro sterilizzare la soluzione utilizzando acqua sistema di vuoto.
    2. Preparare una soluzione stock di 1% di PEI (1 mL 50% PEI per tampone borato di 49 mL 25 mM) e una diluizione di PEI 0,1% da diluire 10 µ l di soluzione di riserva 1% a 100 µ l di tampone borato per uso finale.
    3. Aggiungere 2 mL di 0,1% PEI sul vetro del titolare fetta e lasciare che il rivestimento Incubare per 1 minuto. Poi brevemente lavare il vetro due volte con 5 mL di ultrapura H2O e lasciare asciugare fino all'utilizzo aria.
  9. Preparare soluzioni di anfotericina B.
    1. Fanno 60 mg/mL di soluzione madre sciogliendo 3 mg di polvere di amfotericina B in 50 µ l dimetil solfossido (DMSO), in un tubo di 1 mL al riparo dalla luce. Vortice alla velocità massima per 30 s e Sonicare per 15 min omogeneizzare. Conservare le aliquote in 3 – 5 provette a-20 ° C e utilizzare un'aliquota al giorno.
      Nota: Se la soluzione di riserva di anfotericina B non è chiaro e giallo colore ma latteo (ancora giallo) dopo 15 – 20 min sonicazione assicurarsi una nuova soluzione di riserva.
    2. Rendono il IC soluzione con anfotericina B pipettaggio 2 mL di IC in un becher di vetro pulito con più di 10 mL di capacità. Aggiungere 8 µ l di soluzione madre di amfotericina B nella soluzione pipetta e Miscelare pipettando. Avvolgere il becher con foglio di alluminio e posto sul ghiaccio fino all'utilizzo e rinnovarlo ogni 3 h.

2. dissezione e affettare con Vibratome

  1. Preparare gli strumenti di dissezione prima di dissezione, tra cui uno sharp e un forcipe forte con le forbici. Pulire gli attrezzi (Portarotolo, pennello, forcipe) con etanolo e assicurarsi che essi sono utilizzati solo a fini di dissezione e mai a contatto con tessuti fissi. Tenerli in una scatola separata per evitare la contaminazione.
  2. Eutanasia il pesce in acqua fredda ghiaccio per 1 min.
  3. Seguire i passaggi successivi per sezionare rapidamente medaka cervello e ipofisi con pinze taglienti (utilizzare non più di 3 min).
    1. Tenendo il pesce con il forcipe forte severa dei due nervi ottici dietro gli occhi con le forbici o pinze di taglienti.
    2. Aprire la parte dorsale del cranio da posteriore al lato anteriore rompendo le ossa del cranio passo dopo passo con il forcipe forte.
    3. Staccare il cranio su un lato con il forcipe forte.
    4. Grave del midollo con forbici o pinze taglienti.
    5. Delicatamente, afferrare il midollo spinale con il forcipe, capovolgere il cervello da posteriore ad anteriore e metterlo in un piatto con la gelida Ca2 + gratis CE.
  4. Riempire uno stampo di metallo3 1,5-2 cm con agarosio liquido e collocarlo sul ghiaccio.
  5. Poco prima l'agarosio si solidifica (a circa 25 – 30 ° C), delicatamente afferrare il cervello dal midollo spinale con il forcipe, asciugare il forcipe con un pezzo di carta fine e mettere il tessuto in agarosio. Mescolare rapidamente l'agarosio per diluire le tracce della CE a sinistra intorno al tessuto e orientare il tessuto e lasciate lo stampo sul ghiaccio per pochi secondi fino a quando l'agarosio si indurisce.
    Nota: È essenziale per questo passaggio di essere veloce. L'agarosio si solidifica rapidamente come lo stampo di metallo si è raffreddato dal ghiaccio.
  6. Tagliare un blocco quadrato di agarosio contenente il tessuto con un bisturi e colla sul portacampioni vibratome utilizzando colla di chirurgia (non tossico).
  7. Riempire la cuvetta del vibratome ricevendo il portacampioni (cervello-ipofisi) con gelida Ca2 + gratis CE.
  8. Inserire il portacampioni del vibratome e tagliare il blocco di agarosio per rendere parasagittal sezioni di 150 µm, utilizzando ad alta frequenza e bassa velocità per il sezionamento. Raccogliere le sezioni selezionate e metterli nella camera di registrazione di patch-clamp con 3 mL della ghiacciata Ca2 + gratis CE.
  9. Posizionare l'arpa di griglia (Figura 2B) sulla sezione del tessuto.
    Nota: L'arpa sarà insieme con il rivestimento stabilizzare il tessuto ed evitare che si sposti durante le registrazioni di patch-clamp.
  10. Dopo l'arpa è a posto, è possibile modificare il Ca2 + CE mezzo libero alla CE normale con Ca2 + e BSA. Lasciate riposare il tessuto per 10 min.

3. perforata del Patch-clamp e registrazioni elettrofisiologiche

  1. Prima di iniziare l'esperimento, cloruro di argento filo elettrodi mediante le seguenti fasi: in primo luogo, utilizzare una carta vetrata fine (p180) per pulire gli elettrodi di filo d'argento. In secondo luogo, lavare con 2 mL, etanolo al 70%. In terzo luogo, immergere i fili in 2 mL, 2 – 5% di cloro per 10 min. Infine, risciacquare con 2 mL, ultrapura H2O.
  2. Posizionare la camera di registrazione con la fetta di cervello-ipofisi in fase di microscopio e individuare l'area di destinazione (pituitaria) utilizzando obiettivo 10x e ispezionare le celle utilizzando obiettivo 40x.
    Nota: Se la preparazione è successo, molto poche cellule rotonde devono essere visibile. Queste cellule rotonde sono solitamente danneggiate le cellule che sono lo scollegamento dal tessuto.
  3. Posizionare l'elettrodo di messa a terra attraverso il ponte di 2% agar nel bagno di CE.
  4. Individuare una cellula sana usando l'obiettivo 40x.
    Nota: Una cellula sana dovrebbe essere saldamente attaccata alla fetta di tessuto e non arrotondata e staccata dal slice.
  5. Impostare l'amplificatore in tensione-morsetto (VC; Modalità del punto 1 di Figura 4A ). Aprire il sigillo test finestra e premere il bagno configurazione (Figura 4B punto 1 e 2. Utilizzare un impulso di 5-mV per monitorare pipetta resistenza (Figura 4B punto 3).
  6. Recupero informazioni la punta della pipetta patch con la soluzione di IC antifungina gratuita prima di aggiungere la soluzione di IC con anfotericina B utilizzando una siringa di micro-filler (Vedi Figura 3).
  7. Aggiungere una pressione d'aria leggermente positivo nella pipetta patch usando la siringa da 1 mL.
    Nota: In questo modo un piccolo flusso di liquido dalla pipetta patch che evitare la contaminazione della punta.
  8. Una volta nel bagno, valutare la resistenza di pipetta patch e assicurarsi che le particelle non sono attaccate alla punta della pipetta (Figura 4).
    Nota: Un piccolo pezzo di nastro è collegato sul monitor visualizzare il form di registrazione video, il campo di vista. Questo rende il posizionamento della pipetta patch relativa cella più facile quando l'obiettivo non mette a fuoco sulla cella.
  9. Guida la pipetta patch fino alla cella utilizzando micromanipolatori.
    Nota: Assicurarsi che la pipetta sia pulita cercando di piccole particelle che possono avere attaccato alla punta della pipetta. Improvvisi cambiamenti di resistenza possono anche essere un risultato di particelle bloccato nella punta della pipetta.
  10. Regolare di nuovo la pipetta quando alcuni micron sopra la cella affinché la punta della pipetta toccherà la cella 1/3 dalla metà della cella, come illustrato nella Figura 5. Quando si tocca la cella, rilasciare la pressione e applicare l'aspirazione delicata per fare un sigillo.
    Nota: Il tempo dalla pipetta patch entra il bagno ad un successo guarnizione dovrebbe essere tenuto più corto possibile. Non più di 1 – 1,5 min al fine di evitare di anfotericina B raggiungendo la punta della pipetta e perdita nel bagno.
  11. Immediatamente passare alla finestra di patch del software di patch-clamp (Figura 4 D punto 1) e hanno un potenziale di tenuta tra-50 e -60 mV (Figura 4 punto 2). Zero out la capacitanza veloce composto dalla pipetta di vetro (Figura 4 punto 3).
  12. Passare alla finestra delle cellule nel software di patch-clamp (Figura 4E punto 1 e 2) e avviare il monitoraggio resistenza di accesso, Ra, visualizzato nella finestra. Azzerare la capacità di membrana nel software amplificatore (Figura 4E punto 3) dopo un accesso sufficiente.
    Nota: Diritti di accesso sufficienti potrebbe richiedere 10 a 30 min (Figura 4E punto 2). Un buon accesso per le registrazioni di morsetto corrente dovrebbe essere inferiore a 20 M.
  13. Passare alla pinza amperometrica, IC, nella finestra del software di amplificatore (Figura 4F punto 1). Regolare le correnti fast-capacitivo nella finestra del software amplificatore (Figura 4F punto 2 e 3) sul valore stesso come 3.12 - morsetto . Controllare il potenziale di membrana (Figura 4F punto 1).
    Nota: La cosa importante, se il potenziale di membrana è bassa (tipico sopra -35 mV) la cella potrebbe essere danneggiata. Annullare la registrazione e trovare una nuova cella.
  14. Dopo aver trovato una cellula sana (saldamente attaccato al tessuto con membrana potenziale sotto -40 mV), avviare le registrazioni sperimentali come dettagliate nel protocollo 33,34 del produttore.

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Representative Results

Questo protocollo viene illustrato un protocollo passo dopo passo di come realizzare registrazioni elettrofisiologiche affidabile dalle cellule di ipofisi (gonadotrope), utilizzando una linea transgenica di medaka [Tg (lhb- hrGfpII)] dove il bersaglio delle cellule (produzione di Lh gonadotropes) sono etichettati con la proteina fluorescente verde (GFP).

Inizialmente, le indagini elettrofisiologiche sono stati condotti utilizzando Configurazione di cellule intere. Tuttavia, i potenziali di azione spontanei non sono stati osservati in una qualsiasi delle cellule studiate. In un sottogruppo di cellule, i potenziali di azione potrebbe essere attivati tramite piccole iniezioni corrente (5-9 pA) da un potenziale di riposo tra-50 e -60 mV (Figura 6). Questi potenziali d'azione aveva una carrellata veloce, e dopo circa 4 – 6 min i potenziali di azione innescati non erano più possibili. La riduzione di attività particolarmente veloce osservato può essere spiegato dalle dimensioni piccole cellule. In generale, le cellule ipofisarie sono più neuroni 30piccole. Per esempio, media capacità di membrana delle gamme di cellule gonadotrope tra 4 e 10 pF 3,30,35. Simili a questi medaka scoperte cellule gonadotrope avevano una capacità di membrana medio (media ± SD) 3,4 ± 0,9 PF (n = 67).

Commutazione alla configurazione patch perforato con anfotericina B, i potenziali di azione spontanei sono stati osservati in circa il 50% delle cellule registrate (Figura 7A, n = 63 celle da 21 ani). Inoltre, i potenziali di azione potrebbe essere innescati nel 95% di queste cellule con nessun carrellata osservabile anche dopo registrazioni prolungate (fino a 1 h). Importante, per realizzare registrazioni affidabili e di alta qualità, è necessario innanzitutto compilare la punta con soluzione di IC antimicotico-free. Se piccole quantità di antimicotici sfuggire la punta della pipetta prima di fare il gigaseal, può danneggiare la cella di destinazione come cellule ben circostanti.

Al fine di verificare se le cellule nella configurazione perforato patch sono in grado di rispondere a loro principale ormone di rilascio, abbiamo applicato 1 soffio di Gnrh1 µM espulso sulle cellule bersaglio. Gli esperimenti sono stati effettuati nella pinza amperometrica per permetterci di monitorare i cambiamenti nella tensione. Questi esperimenti hanno rivelato una risposta bifase (Figura 7B). La prima fase è un hyperpolarization dove il rilascio di Ca2 + da negozi interni attivare canali Ca2 + attivato K+ causando il hyperpolarization. La prima fase è seguita da una depolarizzazione e frequenza maggiore potenziale di azione da 1 – 2 Hz a circa 3 Hz. In alcune delle registrazioni, la seconda fase ha avuto potenziali di pseudo altopiano dove 2 o 3 piccoli aculei sono stati osservati prima di ripolarizzazione.

Figure 1
Figura 1 : Differenza tra l'intero-cellula (A) e le configurazioni di patch perforata (B) della tecnica del patch-clamp. Nella configurazione di cellule intere (A), dopo gigaseal è a posto, un foro è fatto nella membrana applicando una piccola pressione negativa nella pipetta patch. In questa configurazione, importanti molecole intracellulari quali molecole di segnalazione possono essere diluiti nella soluzione pipetta patch influenzando le risposte elettriche e fisiologiche della cella. Questo fenomeno è ancora più importante in piccole celle, come ad esempio cellule ipofisarie. Al contrario, in configurazione perforata-patch (B), dopo gigaseal, contatto elettrico tra il citosol e la patch pipetta si compone di antimicotici o tensioattivi. L'antimicotico o tensioattivo viene caricato nella pipetta patch prima patch e sarà inserito nella membrana del plasma sotto la patch, quindi lentamente perforare la membrana, permettendo solo piccole molecole come ioni monovalenti per passare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Immagini del ponte Agar (A) e l'arpa (B) utilizzate nel protocollo. Scala in mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Riempimento della patch-pipetta. (A) soluzione antifungino gratuita IC (liquido blu) è riempita da forze capillari dovuto il filamento all'interno della pipetta. (B) dopo la punta della pipetta di riempimento con antimicotico libero IC, la parte posteriore della pipetta è riempito con IC soluzione contenente amfotericina B (liquido giallo) utilizzando un ago di siringa (micro filler). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4A
Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4B
Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4C
Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4D
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Figure 4E
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Figure 4F
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Figura 4 : Software screenshots. Finestra del software (A) visualizzando amplificatore. 1. evidenzia (cerchio rosso) l'area di modalità che consente di alternare tra tensione morsetto (VC), attuale senza alcuna iniezione di corrente (I = 0) e pinza amperometrica con possibilità per iniezioni corrente (IC). 2 sintesi highlights (cerchio rosso) l'area per la regolazione veloce capacitivo corrente nel morsetto di tensione, nonché a cellule intere capacitivo attuale adeguamento. (B) Mostra che il software di patch-clamp con finestrella membrana aperta. 1. evidenzia (cerchio rosso) il pulsante di test di membrana. 2. gli highlights (cerchio rosso), l'impulso differenti configurazioni, vasca, Patch e cella. 3. gli highlights (cerchio rosso), l'impulso configurazione ampiezza e frequenza. (C-F) Mostra una vedova combinata del software di patch-clamp (a sinistra) e amplificatore (a destra). (C) mette in evidenza (cerchio rosso) la resistenza quando la pipetta è nel bagno e corretta messa a terra utilizzando agar bridge (in modalità di vasca). (D) 1. mette in evidenza il passaggio alla modalità Patch seguendo gigaseal (cerchio rosso). 2. punti salienti (cerchio rosso) la configurazione di impulso (impulso 10 mV) e il potenziale di detenzione regolati a -60 mV. 3. evidenzia (cerchio rosso) la finestra per correggere o azzeramento delle correnti fast-capacitivo seguendo un sigillo di giga. (E) 1. gli highlights (cerchio rosso) la modalità di cella utilizzata per il monitoraggio di accesso resistenza. 2 sintesi highlights (cerchio rosso) i parametri di cella, capacità di membrana (Cm), sigillo di qualità (Rm), accedere a resistenza (Ra), la costante di tempo (Tau) e corrente di mantenimento (Hold). 3. gli highlights (cerchio rosso) il pulsante per la correzione delle correnti di membrana capacitivo. (F) 1. Gli highlights (cerchio rosso) la modalità di IC per il monitoraggio del potenziale di membrana. 2. gli highlights (cerchio rosso) il pulsante per passare alla corrente regolazioni morsetto (clamp). 3. evidenzia (cerchio rosso) la finestra per la correzione delle correnti fast-capacitivo.

Figure 5
Figura 5 : Micrografo da un patch-clamp di registrazione su una cella pituitaria utilizzando la configurazione patch perforata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 : Le registrazioni da un GFP-etichettato Lh-producendo corrente-morsetto cella dopo iniezioni corrente utilizzando la normale configurazione di cellule intere. Le cellule erano tenute tra-50 e -60 mV. I potenziali di azione tipici può essere attivati in un sottogruppo di cellule mediante iniezioni di 5 – 10 pA corrente immediatamente dopo aver ottenuto accesso alla cella (traccia nera). Dopo 1 – 3 min l'ampiezza del potenziale d'azione ha cominciato a diminuire, un segno tipico di rundown (ciano traccia). Dopo 4 – 6 min l'ampiezza del potenziale d'azione quasi completamente scomparso (magenta traccia). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7 : Pinza amperometrica registrazione da una cella di GFP-etichettato Lh producenti utilizzando la configurazione di patch perforato, dopo stimolazione con l'ormone diliberazione Gnrh1. (A) registrazione corrente morsetto dimostrando i potenziali di azione spontanei da una cella gonadotrope produzione di Lh. (B) una risposta bifase dove Gnrh1 stimolazione per 10 s in primo luogo ha indotto un hyperpolarization della membrana cellulare seguita da una depolarizzazione e aumentata frequenza (da 1 – 2 a 3 Hz) di infornamento di potenziali di azione in una cella che precedentemente licenziato potenziali di azione spontanei. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Le registrazioni elettrofisiologiche usando la tecnica del patch-clamp su fettine di cervello-ipofisi richiedono attenta ottimizzazione. Protocolli ben ottimizzati per lo svolgimento di indagini di cellule vive specificamente in teleostei sono limitati, con la maggior parte delle pubblicazioni che utilizzano protocolli basati su sistemi mammiferi. A questo proposito, è importante essere consapevoli del fatto che diversi parametri fisiologici come pH e osmolalità sono non solo specie dipendente, ma anche molto dipende se l'organismo in questione vive sulla terra o in acqua. Per i pesci, è anche necessario tener conto, se vivono in ambienti marini o d'acqua dolce. Ad esempio, la pressione parziale di CO2 è molto più bassa nei pesci rispetto ai mammiferi con livelli che vanno da 1,7 – 3,4 mmHg pCO2 in pesce e 40 – 46 mmHg pCO2 in mammiferi 36. Su questa base, abbiamo regolare il pH a 7,75 37,38,39,40 in tutte le soluzioni utilizzate nel protocollo corrente. Utilizziamo anche tampone HEPES, come è stato dimostrato di possedere eccellenti capacità tampone della regione di pH di 7,4 – 7,8 41. Per il osmolality, usiamo 290 – 300 mOsm, che è quello che è stato misurato nell'ambiente extracellulare di medaka 42. La temperatura impiegata durante le registrazioni elettrofisiologiche è stata selezionata in base all'ambiente del pesce. Infatti, medaka è vivendo in acque con una gamma di temperature larga (da 4 a 40 ° C), mentre nel nostro laboratorio che vengono generati in un ambiente controllato a 26 – 28 ° C. Su questa base, abbiamo effettuato le nostre registrazioni a temperatura ambiente (circa 25 ° C), diverso da quello che viene utilizzato per tessuti di mammiferi (37 ° C) o per specie di pesci di acqua fredda come il merluzzo bianco (12 ° C) 18.

Per essere in grado di patch cellule ipofisarie, è fondamentale per generare fette di tessuto sano. È imperativo utilizzare attrezzi puliti (Portarotolo, pennello, pinze, ecc.) che sono solo in contatto con il tessuto vivo (gratuito di fissativi). Una rapida dissezione del cervello e ipofisi e mantenere il tessuto a bassa temperatura (4 ° C) durante la dissezione e affettare sono altri fattori chiave per fornire sezioni vitali. Inoltre si dovrebbe prestare un'attenzione specifica alla temperatura dell'agarosio all'inclusione di tessuti. Agarosio troppo calda potrebbe danneggiare il tessuto mentre agarosio troppo freddo non vi lascerà tempo ad orientarsi il tessuto per il sezionamento corretto. Inoltre, affettare dovrebbe essere fatto con soluzione CE senza Ca2 + per evitare le cellule danneggiate dopo il sezionamento per entrare in apoptosi. Bubbling non è necessaria, ma le fette di tessuto devono essere raccolti subito dopo il sezionamento. Lasciare la fetta circa 15 min dopo il sezionamento per lasciare che le celle di riposare un po' prima patch.

Pesci teleostei sono modelli eccellenti per indagare le proprietà elettrofisiologiche delle cellule ipofisarie. Infatti, contrariamente ai mammiferi e uccelli, pesci non possiedono un'eminenza mediana, che significa che i neuroni ipotalamici controllare l'ipofisi direttamente proiettano loro assoni sulla loro destinazione cellule 32. Così, in una fetta di cervello-ipofisi, le cellule ipofisarie sono mantenute in un ambiente più intatto rispetto alle colture primarie di cellule ipofisarie dove le cellule sono dissociate utilizzando trattamenti chimici e meccanici. È interessante notare che, usando le fette di cervello-ipofisi di medaka, abbiamo potuto osservare che il potenziale di azione frequenza nelle cellule Lh, al momento dell'attivazione di Gnrh1, di infornamento aumentato (Figura 5). Queste osservazioni sono in accordo con ciò che è stato segnalato in studi su colture cellulari ipofisarie dal nostro laboratorio 29 che indica che l'utilizzo di colture primarie di cellule ipofisarie sono ancora rilevanti per caratterizzare le proprietà della membrana delle cellule ipofisarie. Tuttavia, fette di cervello-ipofisi ci consentono di studiare anche gli effetti indiretti di diversi composti, nonché le interazioni tra cellule, come mantiene collegamenti strutturali che si perdono in colture primarie di cellule ipofisarie. Inoltre, fetta preparazione è più veloce da preparare rispetto ad una cultura dissociata cellula primaria e registrazioni elettrofisiologiche possono essere condotta nel seguente 30 min dopo la dissezione. Ciò significa che, contrariamente a una cultura di cellule primarie, i ritmi circadiani possono essere affrontati in modo significativo utilizzando fette preparate al momento.

A causa delle piccole dimensioni delle cellule ipofisarie nel pesce (capacità di membrana intorno a 3-10 pF) e le nostre proprie osservazioni mostrando che le cellule gonadotrope perdono la capacità di fuoco di potenziali di azione (Figura 3) e così perdono la loro capacità di rispondere alle rilasciare gli ormoni durante la registrazione nella configurazione di cellule intere, abbiamo deciso di utilizzare e presentare la tecnica del patch perforato nel presente documento. Infatti, è stato dimostrato che la configurazione della intero-cellula potrebbe portare alla diffusione di importanti molecole citoplasmatiche modificandone le proprietà elettrofisiologiche delle cellule 13. Utilizzando invece le configurazioni di patch perforato con anfotericina B per perforare la membrana delle cellule nella pipetta patch, realizzare solo piccoli fori che permette solo piccoli ioni di passare attraverso 15,16,43, 44, potremmo evitare la diluizione e registrare l'attività elettrica della cella per un tempo prolungato.

Un punto importante nella tecnica patch perforato è primo retro-riempimento della pipetta con soluzione IC senza antimicotici al fine di evitare il rilascio di antimicotici nel mezzo e danneggiare tutte le celle della sezione mentre si avvicina con la pipetta di patch. Infatti, a causa della pressione positiva applicata per la pipetta patch mentre si avvicina il tessuto, un po' di liquido fuoriesce attraverso la pipetta patch fino a quando la patch è fatta. Questo flusso aiuta a mantenere pulita la punta fino a quando si raggiunge la cella mirata ma se antimicotico viene rilasciato nel mezzo prima la patch è fatta, possono forare tutte le membrane di tutte le cellule, cambiando radicalmente le caratteristiche permeabili delle membrane cellulari e quindi loro proprietà elettriche.

La procedura presentata è stata ottimizzata e utilizzata con successo per studiare l'attività elettrica delle cellule gonadotrope medaka. Inoltre, il protocollo può essere utilizzato per studiare tutti i tipi di cellule (endocrino) trovati nella ghiandola pituitaria di medaka e altre specie di pesci teleostei. Tenete a mente solo che l'osmolarità e pH di tutte le soluzioni deve essere regolati a quella dei fluidi corpo della specie in questione.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Acknowledgments

Grazie Sig. ra LourdesCarreon G Tan per il suo aiuto mantenere la struttura di medaka e Anthony Peltier per le figure illustrative. Questo lavoro è stato finanziato da NMBU e dal Consiglio della ricerca della Norvegia, grant numeri 244461 (programma di acquacoltura) e 248828 (programma di vita digitale Norvegia).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000 S
Chirurgical glue WPI VETBOND 3M Vetbond Tissue Adhesive
Stainless steel blades Campden Instruments 752-1-SS
metal molds SAKURA 4122
steel harp Warner instruments 64-1417
PBS SIGMA D8537
Ultrapure LMP agarose invitrogen 166520-100
patch pipettes Sutter Instrument BF150-110-10HP Borosilicate with filament O.D.:1.5 mm, I.D.:1.10 mm
Microscope Slicescope Scientifica pro6000
P-Clamp10 Molecular Devices #1-2500-0180 sofware
Digitizer Digidata 1550A1 Molecular Devices DD1550
Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B Molecular Devices 1-CV-7B
GnRH Bachem 4108604 H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt 
pipette puller Sutter Instrument P-1000
amphotericin B SIGMA A9528 pore-forming antibiotic
polyethylenimine  SIGMA P3143 50% PEI solution
microfiler syringe WPI MF28/g67-5
glass for the agar bridge Sutter Instrument BF200-116-15 Borosilicate with filament O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm Fire polished
Micro-Manager software Open Source Microscopy Software
optiMOS sCMOS camera Qimaging  01-OPTIMOS-R-M-16-C
sonicator Elma D-7700 singen
NaCl SiGMA S3014
KCl SiGMA P9541
MgCl2 SiGMA M8266
D-Glucose SiGMA G5400
Hepes SiGMA H4034
CaCl2 SiGMA C8106
Sucrose SiGMA 84097
D-mannitol SiGMA 63565
MES-acid SIGMA M0895
BSA SIGMA A2153

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Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. J. Vis. Exp. (138), e57790, doi:10.3791/57790 (2018).

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