Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Friska hjärnan-hypofys skivor för elektrofysiologiska undersökningar av hypofysen celler i lever fisk

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/57790
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences
* These authors contributed equally

Summary

I artikeln beskrivs en optimerad protokollet för att göra lönsamma hjärnan-hypofys vävnad skivor, använder den lever fisk medaka (Oryzias latipes), följt av elektrofysiologiska inspelningar av hypofysen celler med hjälp av patch-clamp teknik med den perforerad patch konfiguration.

Abstract

Elektrofysiologiska utredningar av hypofysen celler har utförts i många ryggradsdjur, men väldigt få i lever fisk. Bland dessa, har en klar majoritet utförts på dissocierade primära celler. Att förbättra vår förståelse av hur lever hypofysen celler, beter sig i en mer biologiskt relevant miljö, visar detta protokoll hur man förbereder livskraftig hjärnan-hypofys skivor med de små sötvattensfisk medaka (Oryzias latipes). Att göra hjärnan-hypofys skivor, justerades pH och osmolalitet på alla lösningar till värdena i kroppsvätskor sötvattensfisk lever vid 25 till 28 ° C. Efter slice beredningen skall visar protokollet hur man genomför elektrofysiologiska inspelningar med perforerade hela-cell patch-clamp teknik. Patch-clamp tekniken är ett kraftfullt verktyg med oöverträffad temporal upplösning och känslighet, så att utredningen av elektriska egenskaper från intakt hela celler ned till enstaka jonkanaler. Perforerad plåstret är unikt genom att det håller intracellulära miljön intakt hindrar reglerande element i cytosolen från späds ut av patch pipett elektrod lösningen. Däremot när du utför traditionella hela-cell inspelningar, observerades det att medaka hypofysen celler snabbt förlorar sin förmåga att brand handlingspänningar. Bland de olika perforering teknikerna tillgängliga visar detta protokoll hur att uppnå perforering av lappat membranet med fungicid amfotericin B.

Introduction

Hypofysen är en nyckel endokrina organ hos ryggradsdjur ligger nedanför hypotalamus och posteriort den optiska chiasm. Den producerar och utsöndrar sex till åtta hormoner från de specifika celltyper. Hypofysen hormoner utgör en intermediär mellan hjärnan och perifera organ och köra ett brett utbud av grundläggande fysiologiska processer, inklusive tillväxt, reproduktion och reglering av homeostas. Liknande till nervceller, endokrina celler i hypofysen är elektriskt retbara med möjlighet att avfyra handlingspänningar spontant 1. Dessa nervimpulsernas roll är cellen beroende. I flera celltyper av däggdjur hypofysen, kan handlingspänningar höja den intracellulära Ca2 + tillräckligt för en fördröjd frisättning av hormon 2. Dessutom får hypofysen både stimulerande och hämmande information från hjärnan som påverkar membranet potential celler 3,4,5,6. Typiskt, stimulerande input ökar retbarhet och ofta involverar frisättning av Ca2 + från intracellulära butiker samt ökade bränning frekvens 7. Förstå hur cellen använder ion kanal sammansättning och anpassar sig till dessa signaler från hjärnan är nyckeln till förståelse hormon syntes och frisättning.

Patch-clamp tekniken utvecklades i slutet av 1970 av Sakmann Stuttgart och Neher 8,9,10 och förbättras ytterligare genom Hamill 11, och tillåter detaljerade undersökningar av elektrofysiologiska egenskaper hos celler ner till enda jonkanaler. Tekniken kan dessutom användas för att studera både ström och spänning. Idag är patch-fastspänning den gyllene standarden för att mäta elektrofysiologiska egenskaper av cellen. Fyra stora konfigurationer av tät förslutning patch-clamp teknik har varit utvecklade 11; den cell-anslutna, inifrån och ut, utsidan-out och hela-cell plåstret. De tre första konfigurationerna används vanligtvis för enda Jonen kanaliserar utredningar. För det fjärde, efter den cell-anslutna konfigurationen, görs ett hål i cellmembranet med hjälp av sub atmosfäriska trycket. Denna konfiguration tillåter också utredningar av ion kanal sammansättningen av hela cellen 12. En begränsning med denna teknik är dock att cytoplasmiska molekyler späds av patch pipett lösning 13 (figur 1A), vilket påverkar de elektriska och fysiologiska Svaren studerade celler. Några av dessa molekyler kan faktiskt spelar viktiga roller i transduktion av signalen eller i regleringen av olika jonkanaler. För att undvika detta, utvecklat Lindau och Fernandez 14 en metod där en por-bilda förening läggs till patch pipetten. Efter den cell-anslutna konfigurationen, föreningen kommer att införliva i plasmamembranet under plåstret och långsamt perforate membranet att skapa elektrisk kontakt med cytosolen (figur 1B). Flera olika antimykotika såsom nystatin 15 och amfotericin B 16eller ytaktiva ämnen såsom den saponin beta-escin 17,18 kan användas. Dessa föreningar skapa porer som är tillräckligt stor för att tillåta monovalenta ering och Cl– diffusion mellan cytosolen och patch pipetten samtidigt bevara de cytosoliska nivåerna av makromolekyler och större joner som Ca2 + 15, 16.

Utmaningen att använda perforerade patch är potentiellt hög serie motstånd. Serie motstånd (Rs) eller access motstånd är det kombinera motståndet över patch pipetten i förhållande till marken. Under patch-clamp inspelningar, den Rs kommer vara parallellt med membran motstånd (Rm). Rm och Rs i parallell arbete som en spänningsavdelare. Med hög Rs, faller spänningen över den Rs ger fel i inspelningarna. Felet blir större med större strömmar registreras. Spänningsavdelaren är dessutom också frekvens beroende skapar ett lågpassfilter, vilket påverkar den temporal upplösningen. I praktiken tillåta perforerade plåstret inte alltid inspelningar av stora och snabba strömmar som spänningen gated Na+ strömmar (för detaljerade avläsningar se referens 19). Rs kan dessutom variera under patch-clamp inspelningar, igen leder till förändringar i den inspelade aktuellt. Således, falska positiva kan uppstå i situationer där Rs ändras under drog ansökan.

Elektrofysiologi på skivad vävnad introducerades av Andersen lab att studera elektrofysiologiska egenskaper av nervcellerna i hjärnan 20. Tekniken banade väg för detaljerade undersökningar av enstaka celler liksom cell-cell kommunikation och cell kretsar i en mer intakt miljö. En liknande teknik för att göra hypofysen skivor introducerades 1998 av Guérineau et al. 21. det var dock inte före 2005, hjärnan-hypofys slice preparatet används framgångsrikt för patch-clamp studier i lever 22. I denna studie rapporterade författarna också användningen av perforerade patch-clamp inspelningar. Dock överlägset har de flesta av de elektrofysiologiska undersökningarna av hypofysen celler utförts hos däggdjur, och endast en handfull andra ryggradsdjur, inklusive lever fisk 1,2,22,23 . I Benfiskar utfördes nästan alla studier på primära dissocierade celler 24,25,26,27,28,29,30 .

I detta dokument beskriver vi en optimerad protokollet för beredning av friska hjärnan-hypofys skivor från den modell fisk medaka. Metoden representerar flera fördelar jämfört med primär dissocierade cellkulturer. Först registreras cellerna i en relativt bevarad miljö jämfört med separerade cell odlingsbetingelser. Andra, slice preparat tillåter oss att studera indirekta vägar medieras av cell-cell kommunikation 22, vilket inte är möjligt i dissocierade cell odlingsbetingelser. Dessutom visar vi hur man genomför elektrofysiologiska inspelningar på erhållna vävnad skivor med perforerade hela-cell patch-clamp teknik med amfotericin B som por-bilda agent.

Medaka är en liten sötvattensfisk som infödda till Asien, främst hittat i Japan. I fysiologi, embryologi och genetik av medaka har studerats för över 100 år 31, och det är en vanligt förekommande forskning modell i många laboratorier. Av särskild betydelse för denna uppsats är den distinkta morfologiska organisationen av hypotalamus-hypofys komplexet i lever fisk: medan hos däggdjur och fåglar hypotalamus nervceller släpper sin neuro-hormoner reglerar hypofysen endokrina celler in i portalen systemet av den medianen eminens finns det en direkt nervös projektion av hypotalamus nervceller på hypofysen i lever fisk 32endokrina celler. Därför är noggrant genomförda hjärnan-hypofys skivning av särskild betydelse i fisk, vilket tillåter oss att undersöka elektrofysiologiska egenskaper av hypofysen celler i en välbevarad hjärnan-hypofys-nätverk, och i synnerhet hur hypofysen celler styra sin retbarhet och därmed Ca2 + homeostas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurhantering utfördes enligt rekommendationer för vård och välfärd av försöksdjur vid norska universitetet av biovetenskap, och under överinseende av auktoriserade utredare.

1. beredning av instrument och lösningar

Obs: Alla lösningar bör vara sterila. Noggrann uppmärksamhet bör ägnas pH och osmolalitet (osmol/kg vatten) för alla lösningar, som noga bör anpassas till den extracellulära miljön i de studera arterna. pH och osmolalitet bör justeras med exakt elektronisk utrustning såsom pH-mätare och fryspunkt osmometer respektive.

  1. Gör 500 mL extra-cellulära lösning utan Ca2 + (Ca2 + fri EG): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.3 mM MgCl2, 4 mM glukos, 10 mM Hepes.
    1. Lös 4,38 g NaCl, 186.37 mg kaliumklorid, 61.89 mg MgCl2, 360.32 mg glukos och 1,19 g HEPES i 450 mL ultrarent (0,055 uS / cm vid 25 ° C, resistivitet av 18,2 MOhm) H2O i en glasbägare med en magnetisk omrörare.
    2. Justera pH till 7,75 med NaOH.
    3. Över lösningen till en 500 mL-mätkolv. Fyll mätkolven med ultrarena H2O fram till 500 mL.
    4. Blanda lösningen väl före mäta osmolalitet. Justera till 290 – 300 mOsm med mannitol. Filter sterilisera lösningen med vatten vakuumsystem och 0,2 µm filter.
  2. Gör 500 mL extra-cellulära lösning (EG): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, 4 mM glukos, 10 mM Hepes.
    1. Lös upp 4,38 g NaCl, 186.37 mg KCl, 147.01 mg CaCl2, 61.89 mg MgCl2, 360.32 mg glukos och 1,19 g HEPES i 450 mL av ultrarena H2O i en glasbägare med en magnetisk omrörare.
    2. Justera pH till 7,75 med NaOH.
    3. Över lösningen till en 500 mL-mätkolv. Fyll mätkolven med ultrarena H2O fram till 500 mL.
    4. Blanda lösningen väl före mäta osmolalitet. Justera till 290 – 300 mOsm med mannitol. Filter sterilisera lösningen med vatten vakuumsystem och 0,2 µm filter.
  3. Gör 500 mL extra-cellulära lösning med 0,1% bovint serumalbumin (EG med BSA): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, 4 mM glukos, 10 mM Hepes.
    1. Lös upp 4,38 g NaCl, 186.37 mg KCl, 147.01 mg CaCl2, 61.89 mg MgCl2, 360.32 mg glukos och 1,19 g HEPES i 450 mL av ultrarena H2O i en glasbägare med en magnetisk omrörare.
    2. Justera pH till 7,75 med NaOH.
    3. Över lösningen till en 500 mL-mätkolv. Fyll mätkolven med ultrarena H2O fram till 500 mL.
    4. Blanda lösningen väl före mäta osmolalitet. Justera till 290 – 300 mOsm med mannitol. Filter sterilisera lösningen med vatten vakuumsystem och 0,2 µm filter. Tillsätt 50 mg BSA.
  4. Gör 250 mL intracellulära lösning (IC): 110 mM KOH, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, 20 mM sackaros.
    1. Lös upp 1,54 g KOH, 327.75 mg KCl, 595.75 mg HEPES och 1.712 g sackaros i 450 mL ultrarena H2O i en glasbägare med en magnetisk omrörare.
    2. Justera pH-värdet till 7,2 med (N-morpholino) etan sulfonsyra (MES).
    3. Över lösningen till en 250 mL-mätkolv. Fyll mätkolven med ultrarena H2O fram till 250 mL.
    4. Blanda lösningen väl före mäta osmolalitet. Justera till 280-290 mOsm (10 mOsm lägre än EG) med sackaros. Filter sterilisera lösningen med vatten vakuumsystem och 0,2 µm filter.
  5. Gör 100 mL 2% låg smälttemperatur agaros lösning i Ca2 + och BSA gratis EG (2 g av låg smälttemperatur agaros i 100 mL Ca2 + fri EG). Lös upp i mikrovågsugn och placera smält Agarens i ett vattenbad vid 40 ° C. Låt den svalna tills den når 40 ° C före användning på vävnader.
    Obs: EG, Ca2 + gratis EG kan lagras vid 4 ° C i flera veckor om steril och IC lösningar vid-20 ° C, i flera månader. Agaros kan lagras i en vecka vid 4 ° C och kan återanvändas 3 – 5 gånger av kort mikrovågsugnen. Överdriven återanvändning leder till avdunstning och ändring av agaros och salt koncentration och kvalitet.
  6. Se agar bridge:
    1. Värma 7.5 mm lång borosilikatglas kapillärer med ytterdiameter (OD) 2 mm och innerdiameter (I.D.) 1,16 mm med hjälp av en bunsenbrännare på en fokal punkt ca 1/3 från ena änden tills glaset börjar att böja. Ta bort glaset från lågan och låta glaset att böja med en vinkel på ca 120 grader (figur 2A).
    2. Smält 2% agar i normala EG utan glukos i mikrovågsugn, och medan Agarens är flytande fyllning färdiga glaset kapillär använder kapillaritet tvingar genom att sätta en av ändarna på glaset i vätskan och väntar några minuter. Lagra broar tills användning vid 4 ° C i EG utan glukos.
  7. Förbereda borosilikatglas med glödtråden patch pipetter med hjälp av lämplig pipett avdragare. Bruksanvisningen till den pipett avdragare att erhålla önskad elektrod motståndet.
    Obs: Koniska i pipetten bör vara så kort som möjligt. Kort pipett Kona uppnås med hjälp av 4 – 6 dragande steg. Elektroden motståndet bör vara mellan 2 och 6 MΩ beroende på Cellstorlek.
  8. För att undvika rörelse av vävnad under patch-clamp experimenten coat ytan av inspelning kammaren med 0,1% av polyethylenimine (PEI) i Borat buffert.
    1. Förbereda 500 mL Borat buffert (25 mM):
      1. Lös 4.768 g Na2B4O710 H2O i 450 mL av ultrarena H2O i en glasbägare med en magnetisk omrörare.
      2. Justera pH till 8,4 med HCl.
      3. Över lösningen till en 500 mL-mätkolv. Fyll mätkolven med ultrarena H2O tills 500 mL och 0,2 µm filter sterilisera lösningen med vatten vakuumsystem.
    2. Förbereda en 1% stamlösning av PEI (1 mL 50% PEI till 49 mL 25 mM Borat buffert) och en 0,1% PEI utspädning genom att späda 10 µL av 1% stamlösning i 100 µL av Borat buffert för slutlig användning.
    3. Tillsätt 2 mL av 0,1% PEI på glaset av innehavaren av slice och låt beläggningen Inkubera i 1 minut. Sedan kort tvätta glaset två gånger med 5 mL av ultrarena H2O och låt lufttorka fram till användning.
  9. Förbereda amfotericin B lösningar.
    1. Gör 60 mg/mL stamlösning av upplösning 3 mg amfotericin B pulver i 50 µL dimetyl sulfoxid (DMSO), i en 1 mL tub skyddas från ljus. Vortex med maximal hastighet för 30 s och Sonikera i 15 min för att homogenisera. Lagra alikvoter i 3 – 5 rör vid-20 ° C och Använd en alikvot per dag.
      Obs: Om amfotericin B lager lösningen inte är klar och gul färg men mjölkig (fortfarande gul) efter 15 – 20 min. ultraljudsbehandling gör en ny stamlösning.
    2. Gör IC lösning med amfotericin B av spruta 2 mL av IC till en rent glasbägare med mer än 10 mL kapacitet. Tillsätt 8 µL av amfotericin B stamlösning i pipett lösningen och blanda genom pipettering. Wrap bägaren med aluminiumfolie och plats på is fram till användning och förnya det varje 3 h.

2. dissektion och skivning med Vibratome

  1. Förbereda verktygen dissektion innan dissekera, inklusive en skarp och en stark pincett med sax. Rengör verktygen (vävnad innehavaren, borste, tången) med etanol och se till att de används endast för dissektion och aldrig i kontakt med fasta vävnader. Förvara dem i en separat låda att undvika kontaminering.
  2. Avliva fisken i kallt isvatten för 1 min.
  3. Följ de efterföljande stegen för att snabbt dissekera medaka hjärna och hypofys med vass pincett (Använd inte mer än 3 min).
    1. Samtidigt håller fisken med starka tången svår de två synnerverna bakom ögonen med sax eller vassa pincetten.
    2. Öppna den dorsala delen av skallen från bakre till främre sida genom att bryta skallar steg med stark pincett.
    3. Skrapa av skallen på ena sidan med stark pincett.
    4. Svår ryggmärgen med sax eller vassa pincetten.
    5. Försiktigt, greppa ryggmärgen med tången, flip hjärnan från bakre till främre och placera det i en skål med iskallt Ca2 + gratis EG.
  4. Fyll en 1,5 – 2 cm3 metall mögel med flytande agaros och placera den på isen.
  5. Precis innan Agarens stelnar (vid cirka 25 – 30 ° C), försiktigt greppa hjärnan genom ryggmärgen med tången, torka tången med fina papper och sätta vävnaden i Agarens. Snabbt blanda Agarens späd tracesna av EG lämnade runt vävnaden och orientera vävnaden och låt mögel på is i några sekunder tills Agarens hårdnar.
    Obs: Det är nödvändigt för detta steg att vara snabb. Agarens stelnar snabbt som metall formen kyls av isen.
  6. Trimma en fyrkantig block av agaros som innehåller vävnaden med en skalpell blad och limma den på preparathållaren vibratome med kirurgi (giftfri) lim.
  7. Fyll i kyvetten av den vibratome som fick preparathållaren (hjärnan-hypofys) med iskall Ca2 + gratis EG.
  8. Placera preparathållaren i vibratome och skär agaros blocket för att göra parasagittal delar av 150 µm, med hög frekvens och låg hastighet för den snittning. Samla in de markerade sektioner och placera dem i patch-clamp inspelning kammaren med 3 mL i iskall Ca2 + gratis EG.
  9. Placera rutnätet harpa (figur 2B) på avsnittet vävnad.
    Obs: Harpa kommer tillsammans med beläggningen stabilisera vävnaden och förhindra att den rör sig under patch-clamp inspelningarna.
  10. Efter harpa är på plats, ändra Ca2 + gratis EG mediet till normala EG med Ca2 + och BSA. Låt vävnad vila 10 min.

3. perforerade Patch-clamp och elektrofysiologiska Recordings

  1. Innan du börjar experimentet, klorid silver tråd elektroder genom följande steg: först, Använd ett fint sandpapper (p180) för att rengöra silver tråd elektroderna. För det andra, skölj med 2 mL, 70% etanol. För det tredje, doppa trådarna i 2 mL, 2 – 5% klor i 10 min. Slutligen, skölj med 2 mL, ultrarent H2O.
  2. Placera inspelning kammaren med hjärnan-hypofys segmentet i Mikroskop scenen och leta upp målområdet (hypofysen) använder 10 X-objektiv och inspektera cellerna med 40 X objektiv.
    Obs: Om preparatet är framgångsrik, mycket få runda celler ska synas. Dessa runda celler är vanligtvis skadade celler som koppla loss från vävnaden.
  3. Placera jordning elektroden genom 2% agar bron in i EG-badet.
  4. Leta upp en frisk cell med målsättningen 40 X.
    Obs: En frisk cell bör vara ordentligt fäst vävnad segmentet och inte avrundas uppåt och lossnat från segmentet.
  5. Ställa in förstärkaren i spänning-clamp (VC; Figur 4A punkt 1) läge. Öppna tätningen testa fönster och tryck på badet konfiguration (figur 4B punkt 1 och 2. Använd en 5-mV puls för att övervaka pipett motstånd (figur 4B punkt 3).
  6. Återfyllning spets patch pipetten med svampdödande gratis IC lösningen innan du lägger till IC lösningen med amfotericin B med en mikro-filler spruta (se figur 3).
  7. Tillsätt en svagt positiv lufttrycket i patch pipetten med 1 mL spruta.
    Obs: Detta gör ett litet flytande flöde från patch pipetten att undvika kontaminering av spetsen.
  8. En gång i badet, bedöma patch pipett motståndet och kontrollera att inga partiklar är kopplade till spetsen på pipetten (figur 4 c).
    Obs: En liten bit tejp är kopplad till den bildskärm som visar formuläret videoinspelning synfältet. Detta gör att placeringen av patch pipetten i förhållande till cellen lättare när målet inte fokuserar på cellen.
  9. Guide patch pipetten ner till cellen med hjälp av micromanipulators.
    Obs: Kontrollera att pipetten är ren genom att leta små partiklar som kan ha kopplat till spetsen på pipetten. Plötsliga förändringar i motstånd kan också vara en följd av partiklar som fastnat i pipettspetsen.
  10. Justera pipetten när några mikrometer ovanför cellen så att spetsen på pipetten kommer att beröra cellen 1/3 från mitten av cellen, som visas i figur 5. När vidröra cellen, släpp trycket och applicera den skonsam sugkraft för att göra en tätning.
    Obs: Tiden från patch pipetten kommer in badet till en framgångsrik tätning bör hållas så kort som möjligt. Inte mer än 1-1,5 min för att undvika amfotericin B når toppen av pipetten och läcka in i badet.
  11. Omedelbart växla till fönstret patch i programvaran patch-clamp (figur 4 D punkt 1) och har en anläggning potential mellan-50 och -60 mV (figur 4 d punkt 2). Noll ut den snabba kapacitansen som består av glas pipetten (figur 4 d punkt 3).
  12. Växla till fönstret cell i patch-clamp programvara (figur 4E punkt 1 och 2) och börja övervaka åtkomst motstånd, Ra, visas i fönstret. Noll ut den membran kapacitansen i programvaran förstärkare (figur 4E punkt 3) efter tillräcklig åtkomst.
    Obs: Tillräcklig åtkomst kan ta 10 till 30 min (figur 4E punkt 2). En bra tillgång för nuvarande klämma inspelningar bör vara under 20 M.
  13. Växla till nuvarande clamp, IC, förstärkare programvara fönster (figur 4F punkt 1). Justera de snabb-kapacitiva strömmarna i fönstret jag-klämma av programvaran förstärkare (figur 4F punkt 2 och 3) till samma värde som i 3.12. Kolla membranet potential (figur 4F punkt 1).
    Obs: Allt om membranet potential är grunt (typiska ovan -35 mV) cellen kan vara skadad. Avbryta inspelningen och hitta en ny cell.
  14. Efter att hitta en frisk cell (fast vävnaden med membranpotential som nedan -40 mV), starta de experimentella inspelningarna som beskrivs i tillverkarens protokollet 33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll visar ett steg protokoll för hur man kan uppnå tillförlitlig elektrofysiologiska inspelningar från hypofysen (gonadotrope) celler, med hjälp av en medaka transgena [Tg (lhb- hrGfpII)] där målet celler (Lh-producerande gonadotropes) är märkt med grönt fluorescerande protein (GFP).

Inledningsvis, genomfördes elektrofysiologiska undersökningarna med hela-cell-konfiguration. Spontan handlingspänningar observerades dock inte i någon av de studera cellerna. I en delmängd av celler, kunde handlingspänningar utlösas med små nuvarande injektioner (5-9 pA) från en vilande potential mellan-50 och -60 mV (figur 6). Dessa handlingspänningar hade en snabb genomgång, och efter ca 4-6 min utlösta handlingspänningar inte längre var möjligt. Särskilt snabb nedsliten observerade kan förklaras av liten Cellstorlek. Hypofysen celler är i allmänhet mindre än nervceller 30. Exempelvis genomsnittliga membran kapacitans av gonadotrope celler varierar mellan 4 och 10 pF 3,30,35. Liknar dessa fynd medaka gonadotrope celler hade en genomsnittlig membran kapacitans (medelvärde ± SD) 3,4 ± 0,9 PF (n = 67).

Byta till perforerad patch konfigurationen använder amfotericin B, spontana handlingspänningar observerades hos ca 50% av de inspelade cellerna (figur 7A, n = 63 celler från 21 djur). Dessutom kunde handlingspänningar utlösas i 95% av dessa celler med inga observerbara nedsliten även efter långvarig recordings (upp till 1 h). Allt för att uppnå tillförlitliga och högkvalitativa inspelningar, är det nödvändigt att först fylla spetsen med svampdödande-fri IC lösning. Om små mängder av antimykotika fly pipettspetsen innan gigaseal, kan det skada målcellen som samt omgivande celler.

För att testa om celler i perforerad patch konfigurationen är kunna bemöta deras viktigaste släppa hormonet, tillämpat vi 1 µM Gnrh1 puff utkastade på målceller. Experimenten utfördes i nuvarande klämman att tillåta oss att övervaka förändringar i spänning. Dessa experiment visade en bifasisk reaktion (figur 7B). Den första fasen är en hyperpolarisering där utsläpp av Ca2 + från interna butiker aktivera Ca2 + aktiverat K+ kanaler orsakar hyperpolarisering. Den första fasen följs av en depolarisation och ökad aktionspotential frekvens från 1 – 2 Hz till runt 3 Hz. I några av inspelningarna hade den andra fasen pseudo plateau potentials där 2 eller 3 små spikar observerades före repolarisering.

Figure 1
Figur 1 : Skillnaden mellan hela-cellen (A) och perforerade patch (B) konfigurationer av patch-clamp teknik. I den hela-cell konfigurationen (A), efter gigaseal är på plats, görs ett hål i membranet genom att tillämpa ett litet undertryck i patch pipetten. I den här konfigurationen kan viktiga intracellulära molekyler såsom signalmolekyler spädas i patch pipett lösning vilket påverkar de elektriska och fysiologiska Svaren av cellen. Detta fenomen är ännu viktigare i små celler, som hypofysen celler. Däremot i perforerade-patch konfiguration (B), efter gigaseal, elektrisk kontakt mellan cytosolen och plåstret består pipetten av antimykotika eller tensider. Den svampdödande eller tensid är laddad i patch pipetten framför lapp och kommer att införlivas i plasmamembranet under plåstret, därmed långsamt perforerande membranet, så att endast små molekyler som monovalenta joner att passera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Bilder på bron Agar (A) och harpa (B) används i protokollet. Skala i mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Fyllning av patch-pipetten. (A) svampdödande gratis IC lösning (blå vätska) är återfyllt med kapillära krafter på grund av glödtråden inuti pipetten. (B) efter fylla pipettspetsen med svampdödande gratis IC, den bakre delen av pipetten är fylld med IC lösning som innehåller amfotericin B (gul vätska) med hjälp av en spruta nål (micro filler). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4A
Klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4B
Klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4C
Klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4D
Klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4E
Klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4F
Klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 4 : Programvara skärmdumpar. (A) visar förstärkare programvara fönster. 1. Europaparlamentet framhåller (röd cirkel) lägesområdet som tillåter växling mellan spänningen klämman (VC), nuvarande klämma utan någon nuvarande injektion (jag = 0) och nuvarande klämma med möjlighet för nuvarande injektioner (IC). 2 belyser (röda cirkeln) i området för att justera snabbt kapacitiv ström i spänningen klämman samt hela-cell kapacitiv aktuella justeringar. (B) visar programvaran patch-clamp med membran testfönstret öppet. 1. Europaparlamentet framhåller (röd cirkel) membran testknappen. 2. Europaparlamentet framhåller (röda cirkeln) i olika puls-konfigurationer, bad, Patch och Cell. 3. belyser (röd cirkel) puls konfiguration amplitud och frekvens. (C-F) visar en kombinerad änka av patch-clamp programvara (vänster) och förstärkare (höger) programvara. (C) belyser (röd cirkel) motståndet när pipetten är i badet och ordentlig jordning med agar bridge (i Bad läge). (D) 1. belyser (röd cirkel) byte till Patch läge efter gigaseal. 2. höjdpunkter (röd cirkel) puls konfiguration (10 mV puls) och anläggning potential justeras till -60 mV. 3. belyser (röda cirkeln) i fönstret för korrigering eller nollställning snabb-kapacitiv strömmarna efter en giga tätning. (E) 1. belyser (röda cirkeln) i Cell-läge används för att övervaka tillgång motstånd. 2 höjdpunkter (röd cirkel) parametrarna cell, membran kapacitans (Cm), täta kvalitet (Rm), tillgång till motstånd (Ra), tidskonstanten (Tau) och hålla aktuell (håll). 3. Europaparlamentet lyfter fram (röd cirkel) knappen för att korrigera de membran kapacitiva strömmarna. (F) 1. Belyser (röd cirkel) IC läget för övervakning membranpotential. 2. Europaparlamentet framhåller (röd cirkel) knappen för att växla till nuvarande klämma justeringar (I-clamp). 3. Europaparlamentet framhåller (röda cirkeln) i fönstret för att korrigera de snabb-kapacitiva strömmarna.

Figure 5
Figur 5 : Mikrograf från en patch-clamp inspelning på en hypofysen cell med perforerade patch konfiguration. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Nuvarande klämma inspelningar från en GFP-märkta Lh-producerande cell efter nuvarande injektioner med normal hela-cell konfiguration. Cellerna hölls mellan-50 och -60 mV. Typiska handlingspänningar kunde utlösas i en delmängd av celler med 5 – 10 pA nuvarande injektioner direkt efter att uppnå tillgång till cellen (svart trace). Efter 1 – 3 min började aktionspotential amplituden minska, ett typiskt tecken på nedsliten (cyan trace). Efter 4 – 6 min försvunnit aktionspotential amplituden nästan helt (magenta trace). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 : Nuvarande klämma inspelning från en GFP-märkta Lh-producerande cell med perforerade patch konfiguration, efter stimulering med den gonadotropinfrisättande hormon Gnrh1. (A) nuvarande klämma inspelning visar spontan handlingspänningar från en Lh producerande gonadotrope cell. (B) en bifasisk reaktion där Gnrh1 stimulering för 10 s inducerad först en hyperpolarisering av cellmembranet följt av en depolarisation och ökade bränning frekvens (från 1 – 2 Hz-3 Hz) av handlingspänningar i en cell som tidigare sparken spontan handlingspänningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Elektrofysiologiska inspelningar med hjälp av patch-clamp teknik på hjärnan-hypofys skivor kräver noggrann optimering. Väl optimerade protokoll för genomför live-cell undersökningar särskilt i Benfiskar är begränsade, med majoriteten av publikationer med protokoll baserat på däggdjur system. I detta sammanhang är det viktigt att vara medveten om det faktum att flera fysiologiska parametrar som pH och osmolalitet är inte bara arter beroende, men också mycket beroende av huruvida den ifrågavarande organismen lever på land eller i vatten. För fisk är det också nödvändigt, att ta hänsyn till om de bor i en Marina eller sötvatten. CO2 partialtrycket är exempelvis mycket lägre i fisk jämfört med däggdjur med nivåer alltifrån 1,7 – 3,4 mmHg pCO2 i fisk och 40 – 46 mmHg pCO2 i däggdjur 36. Utifrån detta kan justera vi pH till 7,75 37,38,39,40 i alla lösningar som används i det nuvarande protokollet. Vi använder också HEPES buffert eftersom det har visat sig ha utmärkt buffert kapacitet i regionen pH 7,4 – 7,8 41. För osmolalitet använder vi 290 – 300 mOsm vilket är vad har mätts i den extracellulära miljön medaka 42. Den temperatur som används under elektrofysiologiska inspelningarna har valts enligt miljön av fisken. Faktiskt, medaka lever i vatten med ett brett temperaturområde (från 4 till 40 ° C), medan i vårt laboratorium som de föds upp i en kontrollerad miljö vid 26 – 28 ° C. Baserat på detta, utfört vi våra inspelningar i rumstemperatur (cirka 25 ° C), skiljer sig från vad som används för däggdjur vävnader (37 ° C) eller för kallt vatten fiskarter såsom atlanttorsk (12 ° C) 18.

För att kunna lapp hypofysen celler, är det viktigt att generera frisk vävnad skivor. Det är absolut nödvändigt att använda rena verktyg (vävnad innehavaren, borste, pincett, etc) som är endast i kontakt med levande vävnad (utan fixativ). En snabb dissektion av hjärna och hypofys och att hålla vävnaden vid låg temperatur (4 ° C) medan dissekera och skivning är andra viktiga faktorer att ge livskraftiga sektioner. Särskild uppmärksamhet bör också ägnas temperaturen Agarens vid vävnad inbäddning. Alltför varma agaros kan skada vävnaden medan för kallt agaros inte skall lämna er tid att orientera vävnaden för korrekt snittning. Dessutom skivning bör göras med EG lösning utan Ca2 + att undvika skadade cellerna efter snittning för att träda i apoptos. Bubblande är inte nödvändigt, men vävnad skivor bör tas ut omedelbart efter snittning. Lämna biten ca 15 min efter snittning låta cellerna vila lite framför lapp.

Lever fisk är utmärkta modeller att undersöka elektrofysiologiska egenskaper av hypofysen celler. Faktiskt, till skillnad från däggdjur och fåglar, fisk äger inte en medianen eminens, vilket innebär att hypotalamus nervceller styr hypofysen direkt projicera sina axoner på deras mål celler 32. Således i en hjärna-hypofys slice, hypofysen cellerna bibehålls i en mer intakt miljö jämfört med primär hypofysen cellkulturer där cellerna dissocieras använda kemiska och mekaniska behandlingar. Intressant nog kunde använder hjärnan-hypofys skivor av medaka, vi konstatera att den aktionspotential bränning frekvens i Lh celler, vid Gnrh1 aktivering, ökat (figur 5). Dessa iakttagelser är överens med vad har rapporterats i hypofysen cellkulturstudier från vårt eget lab 29 som anger att använda primära hypofysen cellkulturer är fortfarande relevanta att karakterisera hypofysära cellerna membran egenskaper. Men tillåter hjärnan-hypofys skivor oss att studera även indirekta effekter av olika föreningar samt interaktioner mellan celler, som underhåller det strukturella anslutningar som går förlorade i primära hypofysen cellkulturer. Dessutom slice förberedelse är snabbare att förbereda jämfört med en dissocierade primära cellkultur och elektrofysiologiska inspelningar kan genomföras i den följande 30 min efter dissektion. Detta innebär att, tvärtemot en primär cellkultur, dygnsrytmen kan behandlas på ett meningsfullt sätt med nylagade skivor.

På grund av den lilla storleken på hypofysen celler i fisk (membran kapacitans runt 3-10 pF), och våra egna observationer som visar att gonadotrope celler förlorar sin förmåga att brand handlingspänningar (figur 3) och därmed förlora sin förmåga att reagera på släppa hormoner vid inspelning i hela-cell konfiguration, beslutade vi att använda och presentera den perforerade patch-tekniken häri. Det har faktiskt visat att hela-cell konfigurationen kan leda till diffusionen av viktiga cytoplasmiska molekyler vilket ändrar den elektrofysiologiska cell boende 13. Använder istället de perforerade patch konfigurationerna med amfotericin B för att perforera cellmembranet in patch pipetten, gör bara små hål så att endast små joner passera 15,16,43, 44, vi kunde undvika denna utspädning och registrera den elektriska aktiviteten i cellen under en längre tid.

En viktig punkt i den perforerade patch-tekniken är att första back-Fyll pipetten med IC lösning utan antimykotika för att undvika att släppa antimykotika till medium och skadar alla celler i avsnittet samtidigt närmar sig med patch pipetten. Faktiskt, på grund av positiva påtryckningar som tillämpas på patch pipetten samtidigt närmar sig vävnaden, lite vätska läcker genom patch pipetten tills plåstret görs. Detta flöde hjälper till att hålla spetsen ren tills du når cellen riktade men om antimykotisk släpps på medellång innan plåstret görs, det kan perforera alla membran av alla celler, ändrar dramatiskt genomsläpplig egenskaperna av cellmembranen och därmed sina elektriska egenskaper.

Presenterade förfarandet har optimerat och framgångsrikt använts för att studera den elektriska aktiviteten i medaka gonadotrope celler. Protokollet kan dessutom användas för att studera alla (endokrina) celltyper som finns i hypofysen medaka och andra lever fiskarter. Kom ihåg bara att de osmolalitet och pH i alla lösningar måste anpassas till det av kroppsvätskorna av arten i fråga.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja

Acknowledgments

Vi tackar Ms. LourdesCarreon G Tan för hennes hjälp att upprätthålla medaka anläggningen och Anthony Peltier för belysande siffrorna. Detta arbete finansierades av NMBU och av Norges forskningsråd, grant nummer 244461 (vattenbruk program) och 248828 (Digital liv Norge program).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000 S
Chirurgical glue WPI VETBOND 3M Vetbond Tissue Adhesive
Stainless steel blades Campden Instruments 752-1-SS
metal molds SAKURA 4122
steel harp Warner instruments 64-1417
PBS SIGMA D8537
Ultrapure LMP agarose invitrogen 166520-100
patch pipettes Sutter Instrument BF150-110-10HP Borosilicate with filament O.D.:1.5 mm, I.D.:1.10 mm
Microscope Slicescope Scientifica pro6000
P-Clamp10 Molecular Devices #1-2500-0180 sofware
Digitizer Digidata 1550A1 Molecular Devices DD1550
Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B Molecular Devices 1-CV-7B
GnRH Bachem 4108604 H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt 
pipette puller Sutter Instrument P-1000
amphotericin B SIGMA A9528 pore-forming antibiotic
polyethylenimine  SIGMA P3143 50% PEI solution
microfiler syringe WPI MF28/g67-5
glass for the agar bridge Sutter Instrument BF200-116-15 Borosilicate with filament O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm Fire polished
Micro-Manager software Open Source Microscopy Software
optiMOS sCMOS camera Qimaging  01-OPTIMOS-R-M-16-C
sonicator Elma D-7700 singen
NaCl SiGMA S3014
KCl SiGMA P9541
MgCl2 SiGMA M8266
D-Glucose SiGMA G5400
Hepes SiGMA H4034
CaCl2 SiGMA C8106
Sucrose SiGMA 84097
D-mannitol SiGMA 63565
MES-acid SIGMA M0895
BSA SIGMA A2153

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. Ion channels and signaling in the pituitary gland. Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).
  2. Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling. Trends Endocrinol Metab. 16 (4), 152-159 (2005).
  3. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Dopamine-D2 actions on voltage-dependent calcium current and gonadotropin-II secretion in cultured goldfish gonadotrophs. J Neuroendocrinol. 10 (3), 175-186 (1998).
  4. Chang, J. P., Pemberton, J. G. Comparative aspects of GnRH-Stimulated signal transduction in the vertebrate pituitary - Contributions from teleost model systems. Mol Cell Endocrinol. , (2017).
  5. Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. Inward membrane currents and electrophysiological responses to GnRH in ovine gonadotropes. Neuroendocrinology. 61 (6), 609-621 (1995).
  6. Ben-Jonathan, N., Hnasko, R. Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor. Endocrine Reviews. 22 (6), 724-763 (2001).
  7. Sanchez-Cardenas, C., Hernandez-Cruz, A. GnRH-Induced [Ca2+]i-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
  8. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  9. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  10. Neher, E. Techniques in cellular physiology. Baker, P. F. , Elsevier/North. Holland. 4-19 (1981).
  11. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  12. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).
  13. Marty, A., Neher, E. Single Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 113-114 (1983).
  14. Lindau, M., Fernandez, J. M. IgE-mediated degranulation of mast cells does not require opening of ion channels. Nature. 319 (6049), 150-153 (1986).
  15. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).
  16. Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B. J Neurosci Methods. 37 (1), 15-26 (1991).
  17. Fan, J. S., Palade, P. Perforated patch recording with beta-escin. Pflugers Arch. 436 (6), 1021-1023 (1998).
  18. Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO(2), and pH. Gen Comp Endocrinol. 178 (2), 206-215 (2012).
  19. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. US. 3-35 (1983).
  20. Andersen, P. Brain slices - a neurobiological tool of increasing usefulness. Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).
  21. Guerineau, N. C., Bonnefont, X., Stoeckel, L., Mollard, P. Synchronized spontaneous Ca2+ transients in acute anterior pituitary slices. J Biol Chem. 273 (17), 10389-10395 (1998).
  22. Levavi-Sivan, B., Bloch, C. L., Gutnick, M. J., Fleidervish, I. A. Electrotonic coupling in the anterior pituitary of a teleost fish. Endocrinology. 146 (3), 1048-1052 (2005).
  23. Guerineau, N. C., McKinney, R. A., Debanne, D., Mollard, P., Gahwiler, B. H. Organotypic cultures of the rat anterior pituitary: morphology, physiology and cell-to-cell communication. J Neurosci Methods. 73 (2), 169-176 (1997).
  24. Yu, Y., Ali, D. W., Chang, J. P. Characterization of ionic currents and electrophysiological properties of goldfish somatotropes in primary culture. Gen Comp Endocrinol. 169 (3), 231-243 (2010).
  25. Price, C. J., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Voltage-activated ionic currents in goldfish pituitary cells. Gen Comp Endocrinol. 92 (1), 16-30 (1993).
  26. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Electrical membrane properties and ionic currents in cultured goldfish gonadotrophs. Can J Physiol Pharmacol. 74 (6), 729-743 (1996).
  27. Xu, S., Shimahara, T., Cooke, I. M. Capacitance increases of dissociated tilapia prolactin cells in response to hyposmotic and depolarizing stimuli. Gen Comp Endocrinol. 173 (1), 38-47 (2011).
  28. Haug, T. M., Hodne, K., Weltzien, F. A., Sand, O. Electrophysiological properties of pituitary cells in primary culture from Atlantic cod (Gadus morhua). Neuroendocrinology. 86 (1), 38-47 (2007).
  29. Strandabo, R. A., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Mol Cell Endocrinol. 372 (1-2), 128-139 (2013).
  30. Hodne, K., et al. Electrophysiological differences between fshb- and lhb-expressing gonadotropes in primary culture. Endocrinology. 154 (9), 3319-3330 (2013).
  31. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka--a model organism from the far East. Nat Rev Genet. 3 (1), 53-64 (2002).
  32. Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. Gen Comp Endocrinol. 44 (2), 135-170 (1981).
  33. pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis For Comprehensive Electrophysiology User Guide. Molecular Devices Corporation. , (2006).
  34. MultiClamp 700B COMPUTER-CONTROLLED MICROELECTRODE AMPLIFIER Theory and Operation. Axon Instruments / Molecular Devices Corp. , (2005).
  35. Dominguez-Mancera, B., et al. Leptin regulation of inward membrane currents, electrical activity and LH release in isolated bovine gonadotropes. Biochem Biophys Res Commun. 491 (1), 53-58 (2017).
  36. Schmidt-Nielsen, K. Animal Physiology : adptation and environment fifth edition. , Cambridge university press. 613 (1997).
  37. Burton, R. F. Evolutionary determinants of normal arterial plasma pH in ectothermic vertebrates. J Exp Biol. 205, Pt 5 641-650 (2002).
  38. Burton, R. F. The dependence of normal arterial blood pH on sodium concentration in teleost fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 114 (2), 111-116 (1996).
  39. Heming, T. A., Blumhagen, K. A. Plasma acid-base and electrolyte states of rainbow trout exposed to alum (aluminum sulphate) in acidic and alkaline environments. Aquatic Toxicology. 12 (2), 125-139 (1988).
  40. Reeves, R. B. The interaction of body temperature and acid-base balance in ectothermic vertebrates. Annu Rev Physiol. 39, 559-586 (1977).
  41. Baicu, S. C., Taylor, M. J. Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency. Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).
  42. Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Lett. 2, 12 (2016).
  43. Cass, A., Finkelstein, A., Krespi, V. The ion permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 100-124 (1970).
  44. Holz, R., Finkelstein, A. The water and nonelectrolyte permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 125-145 (1970).

Tags

Neurovetenskap fråga 138 hjärnan-hypofysen elektrofysiologi patch-clamp fisk vävnad-slice endokrina celler
Friska hjärnan-hypofys skivor för elektrofysiologiska undersökningar av hypofysen celler i lever fisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien,… More

Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. J. Vis. Exp. (138), e57790, doi:10.3791/57790 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter