Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Sunn hjernen-hypofysen skiver for elektrofysiologiske undersøkelser av hypofysen celler i Teleost fisk

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/57790
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Artikkelen beskriver en optimalisert protokoll for å gjøre levedyktig hjernen-hypofysen vev skiver, bruke teleost fisk medaka (Oryzias latipes), etterfulgt av elektrofysiologiske opptak av hypofysen celler ved hjelp av patch-klemme teknikken med den perforert oppdateringen konfigurasjon.

Abstract

Elektrofysiologiske undersøkelser av hypofysen celler har vært gjennomført i mange virveldyr arter, men svært få i teleost fisk. Blant disse er et klart flertall utført på avstand primære celler. Forbedre vår forståelse av hvordan teleost hypofysen celler, oppfører seg i et mer biologisk relevante miljø, viser denne protokollen hvordan å forberede levedyktig hjernen-hypofysen skiver med liten fisk medaka (Oryzias latipes). Gjør hjernen-hypofysen skiver, ble pH og osmolality av alle løsninger justert til verdiene i kroppsvæsker hos fisk som lever på 25 og 28 ° C. Etter sektor forberedelse demonstrerer protokollen hvordan å gjennomføre elektrofysiologiske opptak med perforert hele celle patch-klemme teknikk. Patch-klemme teknikken er et kraftig verktøy med enestående timelige oppløsning og følsomhet, tillater undersøkelse av elektriske egenskaper fra intakt hele celler ned enkelt ionekanaler. Perforert oppdateringen er unik ved at den holder intracellulær miljøet intakt hindrer regulatoriske elementer i stoffer i å bli utvannet av oppdateringen pipette elektrode løsningen. I kontrast, når du utfører tradisjonell hele celle innspillinger, ble det observert at medaka hypofysen cellene raskt mister evnen til å skyte action potensialer. Blant de ulike perforering teknikkene tilgjengelig demonstrerer denne protokollen hvordan å oppnå perforering av lappet membranen bruker soppdreper amfotericin B.

Introduction

Hypofysen er en nøkkel endokrine organ i virveldyr ligger under hypothalamus og bakenfor optikk chiasm. Det produserer og skiller ut seks til åtte hormoner fra de spesifikke celletyper. Hypofysen hormoner utgjør et mellomledd mellom hjernen og eksterne organer og kjøre en rekke viktige fysiologiske prosesser, inkludert vekst og reproduksjon regulering av homeostase. Lik neurons, endokrine cellene i hypofysen er elektrisk nervøs muligheten til å skyte action potensialer spontant 1. Rollen som disse action potensialene er celle avhengige. I flere celletyper pattedyr hypofysen, kan action potensialer heve den intracellulær Ca2 + tilstrekkelig for en vedvarende release av hormon 2. I tillegg mottar hypofysen både stimulerende og hemmende informasjon fra hjernen som påvirker membran potensialet i celler 3,4,5,6. Vanligvis stimulerende input øker excitability og ofte innebærer utgivelsen av Ca2 + fra intracellulær butikker samt økt avfyring frekvens 7. Forstå hvordan cellen benytter ion kanal sammensetningen og tilpasser seg disse inngangssignaler fra hjernen er nøkkelen til forståelse hormon syntese og slipp.

Patch-klemme teknikken ble utviklet i 1970 av Sakmann og Neher 8,9,10 og ytterligere forbedret av Hamill 11, og gir detaljerte undersøkelser av elektrofysiologiske egenskaper av celler ned enkelt ionekanaler. Videre er kan teknikken brukes for å studere både strøm og spenning. I dag, er patch-klemanordning gull standard for måling av elektrofysiologiske egenskaper av cellen. Fire store konfigurasjoner av tett patch-klemme teknikken har vært utviklet 11; celle-vedlagt, innsiden ut, på utsiden ut og hele celle oppdateringen. De tre første konfigurasjonene brukes vanligvis for enkelt ion kanal undersøkelser. For det fjerde, etter celle tilknyttet konfigurasjonen, er hull i cellemembranen fremstilt med sub atmosfærisk trykk. Denne konfigurasjonen tillater også undersøkelser av ion kanal sammensetningen av hele cellen 12. Imidlertid er en begrensning av denne teknikken at cytoplasmatiske molekyler er utvannet av oppdateringen pipette løsning 13 (figur 1A), noe som påvirker de elektriske og fysiologiske responser av studerte celler. Faktisk kan noen av disse molekyler spille viktige roller i Albin på signalet eller regulering av ulike ionekanaler. For å unngå dette, utviklet Lindau og Fernandez 14 en metode der en pore-forming sammensatt legges til oppdateringen pipette. Etter celle tilknyttet konfigurasjonen, sammensatte vil innlemme i plasma membranen under oppdateringen og sakte autoperforering membranen lage elektrisk kontakt med stoffer (figur 1B). Du kan bruke flere ulike antifungals som nystatin 15 og amfotericin B 16eller tensider som saponin beta-escin 17,18 . Disse forbindelser opprette porene stor nok monovalent kasjon og Cl- spredning mellom stoffer og patch pipette samtidig bevare cytosolic nivåene av makromolekyler og større ioner som Ca2 + 15, 16.

Utfordringen med å bruke perforert oppdateringen er potensielt høy serien motstanden. Serien motstand (Rs) eller access motstand er motstand oppdateringen Pipetter i forhold til bakken. Under oppdateringen-klemme innspillinger, Rs vil være parallelt med membran motstand (Rm). Rm og Rs i parallell arbeid som en spenning skillelinjen. Med høy Rs, faller spenningen over Rs gir feil i opptak. Feilen blir større med større strøm registrert. I tillegg er spenning delelinjen også frekvens avhengige oppretter et low pass-filteret, noe som påvirker timelige oppløsningen. Faktisk kan perforert oppdateringen ikke alltid tillate opptak av stor og raskt strømninger som spenningen gated Na+ strøm (for detaljerte lesninger se referanse 19). Også variere Rs under oppdateringen-klemme innspillinger, igjen fører til endringer i registrert gjeldende. Dermed oppstå falske positiver i situasjoner der Rs endres under medikament programmet.

Elektrofysiologi på skiver vevet ble først introdusert av Andersen lab å studere elektrofysiologiske kjennetegner nervecellene i hjernen 20. Teknikken banet vei for detaljert enkeltceller i tillegg til celle-celle kommunikasjon og celle kretser i et mer intakt miljø. En lignende teknikk for å lage hypofysen stykker ble introdusert i 1998 av Guérineau et al. 21. det var imidlertid ikke før 2005 at hjernen-hypofysen skive forberedelse ble brukt med hell i patch-klemme studier i teleost 22. I denne studien rapportert forfatterne også bruk av perforerte patch-klemme innspillinger. Imidlertid langt, er de fleste av elektrofysiologiske undersøkelser av hypofysen celler utført i pattedyr, og bare en håndfull andre virveldyr, inkludert teleost fisk 1,2,22,23 . I teleoster, ble nesten alle studier utført på primære dissosiert celler 24,25,26,27,28,29,30 .

I dagens papir skissere vi en optimalisert protokoll for utarbeidelse av sunn hjernen-hypofysen skiver fra modellen fisk medaka. Tilnærmingen representerer flere fordeler sammenlignet med primære dissosiert cellekulturer. Først registreres cellene i et relativt bevart miljø forhold til avstand celle kultur forhold. Andre tillate skive forberedelser oss å studere indirekte trasé formidlet av celle-celle kommunikasjon 22, hvilke er ikke mulig i dissosiert celle kultur forhold. Videre viser vi hvordan man skal gjennomføre elektrofysiologiske opptak innhentet vev skiver med perforert hele celle patch-klemme teknikken amfotericin B som pore-forming agent.

Medaka er en liten fisk i Asia hovedsakelig funnet i Japan. Den fysiologi, embryologi og genetikk av medaka har blitt grundig studert for over 100 år 31, og det er en vanligvis anvendt forskning modell i mange laboratorier. Spesielt viktig å dette papiret er forskjellige morfologiske organiseringen av hypothalamus-hypofyse-kompleks i teleost fisk: mens pattedyr og fugler av hypothalamus nevroner løslate deres Nevro-hormoner som regulerer hypofysen endokrine celler i portal system på medianen eminense er det en direkte nervøse projeksjon av hypothalamus nevroner på endokrine cellene i hypofysen i teleost fisk 32. Dermed er nøye gjennomført hjernen-hypofysen kutting av særlig betydning fisk, slik at vi kan undersøke elektrofysiologiske kjennetegner hypofysen cellene i et godt bevart hjernen-hypofysen, og spesielt hvordan hypofysen celler kontrollere deres excitability og dermed Ca2 + homeostase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr behandling ble utført i henhold til anbefalingene og dyrevelferd forskning ved Universitetet biovitenskap og under tilsyn av autoriserte etterforskere.

1. forberedelse av instrumenter og løsninger

Merk: Alle løsninger skal sterilt. Spesiell oppmerksomhet bør gis til pH og osmolality (osmol/kg vann) av alle løsninger, som bør være nøye tilpasset ekstracellulære miljøet av studerte arter. pH og osmolality burde være innstilt med presis elektronisk utstyr som pH meter og frysepunktet osmometer henholdsvis.

  1. Gjøre 500 mL ekstra-mobile løsning uten Ca2 + (Ca2 + gratis EC): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM MgCl2, 4 mM glukose, 10 mM Hepes.
    1. Oppløse 4,38 g NaCl, 186.37 mg av KCl, 61.89 mg av MgCl2, 360.32 mg av glukose og 1,19 g av HEPES i 450 mL ultrapure (0.055 uS / cm ved 25 ° C, resistivitet av 18.2 MOhm) H2O i et glass beaker med en magnetisk agitator.
    2. Justere pH til 7,75 med NaOH.
    3. Overføre løsningen til en 500 mL volumetriske kolbe. Fyll volumetriske kolbe med ultrapure H2O til 500 mL.
    4. Bland løsningen godt før måling av osmolality. Justere 290-300 mOsm med mannitol. Filteret sterilisere løsningen bruker vann vakuum system og 0,2 µm filter.
  2. Gjøre 500 mL ekstra-mobile løsningen (EC): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, 4 mM glukose, 10 mM Hepes.
    1. Oppløse 4,38 g NaCl, 186.37 mg av KCl, 147.01 mg av CaCl2, 61.89 mg av MgCl2, 360.32 mg av glukose og 1,19 g HEPES i 450 mL av ultrapure H2O i et glass beaker med en magnetisk agitator.
    2. Justere pH til 7,75 med NaOH.
    3. Overføre løsningen til en 500 mL volumetriske kolbe. Fyll volumetriske kolbe med ultrapure H2O til 500 mL.
    4. Bland løsningen godt før måling av osmolality. Justere 290-300 mOsm med mannitol. Filteret sterilisere løsningen bruker vann vakuum system og 0,2 µm filter.
  3. Gjøre 500 mL ekstra-mobile løsning med 0,1% bovin serum albumin (EC med BSA): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, 4 mM glukose, 10 mM Hepes.
    1. Oppløse 4,38 g NaCl, 186.37 mg av KCl, 147.01 mg av CaCl2, 61.89 mg av MgCl2, 360.32 mg av glukose og 1,19 g HEPES i 450 mL av ultrapure H2O i et glass beaker med en magnetisk agitator.
    2. Justere pH til 7,75 med NaOH.
    3. Overføre løsningen til en 500 mL volumetriske kolbe. Fyll volumetriske kolbe med ultrapure H2O til 500 mL.
    4. Bland løsningen godt før måling av osmolality. Justere 290-300 mOsm med mannitol. Filteret sterilisere løsningen bruker vann vakuum system og 0,2 µm filter. Legge til 50 mg BSA.
  4. Ta 250 mL intracellulær løsning (IC): 110 mM KOH, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, 20 mM sukrose.
    1. Oppløse 1,54 g KOH, 327.75 mg av KCl, 595.75 mg av HEPES og 1.712 g av sukrose i 450 mL ultrapure H2O i et glass beaker med en magnetisk agitator.
    2. Justere pH til 7.2 med (N-morpholino) etan sulfonic (MES) syre.
    3. Overføre løsningen i en 250 mL volumetriske kolbe. Fyll volumetriske kolbe med ultrapure H2O til 250 mL.
    4. Bland løsningen godt før måling av osmolality. Justere 280-290 mOsm (10 mOsm lavere enn EC) med sukker. Filteret sterilisere løsningen bruker vann vakuum system og 0,2 µm filter.
  5. Gjøre 100 mL 2% lavt Smeltepunkt agarose løsning i Ca2 + og BSA gratis EC (2 g lavt Smeltepunkt agarose i 100 mL Ca2 + gratis EC). Oppløse bruker mikrobølgeovn og sett den smeltet agarose i et vannbad på 40 ° C. La det avkjøles før den når 40 ° C før bruk på vev.
    Merk: EC, Ca2 + gratis EC kan lagres på 4 ° C i flere uker om sterile og IC løsninger på 20 ° C, i flere måneder. Agarose kan lagres i en uke på 4 ° C og kan gjenbrukes 3-5 ganger av kort mikrobølgeovnen. Overdreven gjenbruk vil føre til fordampning og endring av agarose og saltkonsentrasjon og kvalitet.
  6. Lage agar bro:
    1. Varme 7,5 mm lang Borosilikatglass kapillærene med utvendig diameter (OD) 2 mm og innvendig diameter (ID) 1.16 mm bruker en Bunsen brenner på et brennpunkt ca 1/3 fra den ene enden til glasset begynner å bøye. Fjerne glass fra flammen og la glasset for å bøye med en vinkel på ca 120 grader (figur 2A).
    2. Smelt 2% agar i normal EC uten ved bruk av mikrobølgeovn, og mens agarose er flytende fylle forhåndslagde glasset kapillær bruker capillarity styrker ved å sette en av endene av glasset i væsken og vente i noen minutter. Lagre broer til bruk på 4 ° C i Egenkapitalbevis uten glukose.
  7. Klargjør Borosilikatglass med filament oppdateringen Pipetter bruker en egnet pipette avtrekker. Se håndboken til pipette-avtrekker å få ønsket elektrode motstanden.
    Merk: Taper av pipette bør være så kort som mulig. Kort pipette taper oppnås ved å bruke 4-6 trekke trinnene. Elektroden motstanden bør være mellom 2 og 6 MΩ avhengig av cellestørrelsen på.
  8. For å unngå bevegelse av vev under oppdateringen-klemme eksperimenter coat overflaten av opptak kammer med 0,1% av polyethylenimine (PEI) borate buffer.
    1. Forbered 500 mL borate buffer (25 mM):
      1. Oppløse 4.768 g Na2B4O710t2O i 450 mL av ultrapure H2O i et glass beaker med en magnetisk agitator.
      2. Justere pH til 8.4 med HCl.
      3. Overføre løsningen til en 500 mL volumetriske kolbe. Fyll volumetriske kolbe med ultrapure H2O til 500 mL og 0,2 µm filter sterilisere løsningen bruker vann vakuumsystem.
    2. Forbered en 1% lagerløsning PEI (1 mL 50% PEI til 49 mL 25 mM borate bufferen) og en 0,1% PEI fortynning ved utvannende 10 µL av 1% lagerløsning i 100 µL borate bufferen for endelig bruk.
    3. Legg 2 mL 0,1% PEI på glass stykke holderen og la belegget ruge i 1 minutt. Deretter kort vaske glass to ganger med 5 mL ultrapure H2O og la luften tørr før bruk.
  9. Forberede amfotericin B løsninger.
    1. Gjør 60 mg/mL lager løsning ved å løse opp 3 mg av amfotericin B pulver i 50 µL dimethyl sulfoxide (DMSO), i en 1 mL tube beskyttet mot lyset. Vortex på maksimumshastigheten for 30 s og sonicate i 15 min til homogenize. Lagre dele inn i 3-5 rør på 20 ° C og bruke en aliquot per dag.
      Merk: Hvis amfotericin B lager løsningen ikke er klart og gul farge men melkeaktig (fortsatt gul) etter 15-20 min sonication gjør en ny lagerløsning.
    2. Gjøre IC løsning med amfotericin B av pipettering 2 mL av IC til et rent glass beaker med mer enn 10 mL kapasitet. Legg 8 µL av amfotericin B lagerløsning pipette-løsning og bland av pipettering. Pakk kanne med aluminiumsfolie og sted på is til bruk og fornye den hver 3t.

2. disseksjon og Slicing med Vibratome

  1. Forberede disseksjon verktøy før dissekere, inkludert en skarp og en sterk tang med saks. Rengjøre verktøy (vev holderen, børste, pinsett) med etanol og sørge for at de brukes bare til disseksjon formål og aldri i kontakt med fast vev. Oppbevar dem i en egen boks å unngå forurensning.
  2. Euthanize fisken i kaldt vann i 1 min.
  3. Følg fremgangsmåten for å raskt dissekere medaka hjernen og hypofysen med skarpe tang (bruker ikke mer enn 3 minutter).
    1. Mens holde fisken med sterk tang alvorlig to optiske nervene bak øynene med saks eller skarpe tang.
    2. Åpne den dorsal delen av skallen fra bakre til fremre side ved å bryte hodeskallen bein trinn med sterk tang.
    3. Løsner skallen på én side med sterk tang.
    4. Alvorlig ryggmargen med saks eller skarpe tang.
    5. Forsiktig ta ryggmargen med tang, Vend hjernen fra bakenfor fremre og plasser den i et fat med iskald Ca2 + gratis EF
  4. Fylle en 1,5 til 2 cm3 metall mold med flytende agarose og plasser den på isen.
  5. Like før agarose stivner (på rundt 25-30 ° C), forsiktig ta hjernen av ryggmargen med tang, tørr tang med fint papir og vevet inn i agarose. Raskt blande agarose å fortynne spor av EC venstre rundt vevet og orientere vevet og la mold på is i noen sekunder til agarose stivner.
    Merk: Det er viktig for dette trinnet å være rask. Agarose stivner raskt som metall mold er avkjølt av isen.
  6. Trim en firkantet blokk av agarose som inneholder vevet med skalpell blad og lim den på vibratome på prøveholderen ved hjelp av kirurgi (ikke giftig) lim.
  7. Fylle cuvette av vibratome mottar (hjernen-hypofysen) prøveholderen med iskald Ca2 + gratis EC.
  8. Plasser prøveholderen i vibratome og skjær agarose blokken for å gjøre parasagittal deler av 150 µm, med høy og lav hastighet for inndelingen. Samle de merkede inndelingene og plassere dem i oppdateringen-klemme opptak kammeret med 3 mL iskald Ca2 + gratis EC.
  9. Plass rutenettet harpe (figur 2B) på delen vev.
    Merk: Harpe vil sammen med belegget stabilisere vevet og hindre den fra å bevege seg under oppdateringen-klemme opptakene.
  10. Når harpe er på plass, kan du endre Ca2 + gratis EC medium normal EF med Ca2 + og BSA. La vev hvile i 10 min.

3. perforert Patch-klemme og elektrofysiologiske opptak

  1. Før du starter eksperimentet, klorid sølv wire elektroder ved følgende: Bruk først en fin sandpapir (p180) for å rense sølv wire elektrodene. Andre, skyll med 2 mL, 70% etanol. Tredje, dypp ledningene inne 2 mL, 2 – 5% klor i 10 min. Til slutt, skyll med 2 mL, ultrapure H2O.
  2. Plasser til opptak kammeret hjernen-hypofysen sektoren i mikroskopet scenen og Finn målområdet (hypofysen) med 10 X mål og inspisere cellene med 40 X mål.
    Merk: Hvis forberedelsene er vellykket, svært få runde celler skal vises. Disse runde cellene er vanligvis skadede celler som er frakobling fra vevet.
  3. Plass jordelektroden gjennom 2% agar broen i EC badekaret.
  4. Finn en sunn celle bruker 40 X målet.
    Merk: En sunn celle bør være fast knyttet til vev slice og ikke rundet opp og løsrevet fra sektoren.
  5. Angi forsterkeren i spenning-klemme (VC; Figur 4A punkt 1) modus. Åpne segl teste vinduet og trykk badekaret konfigurasjon (figur 4B punkt 1 og 2. Bruk en 5-FV puls for å dataskjerm pipette motstanden (figur 4B punkt 3).
  6. Etterfylle spissen av oppdateringen pipette med soppdrepende gratis IC løsning før du legger til IC løsningen med amfotericin B bruker en mikro-fyllstoff sprøyte (se fig. 3).
  7. Legger til en litt positive lufttrykket i oppdateringen pipette bruker 1 mL sprøyte.
    Merk: Dette gjør en liten flytende flyt fra oppdateringen pipette unngår forurensning tips.
  8. En gang i badekaret, vurdere oppdateringen pipette motstand og kontroller at ingen partikler er knyttet til spissen av Pipetter (figur 4C).
    Merk: En liten bit av tape er festet til skjermen viser skjemaet videoopptak synsfelt. Dette gjør plasseringen av oppdateringen Pipetter i forhold til cellen enklere når målet ikke er å fokusere på cellen.
  9. Guide oppdateringen Pipetter til cellen med micromanipulators.
    Merk: Sørg for at pipette er ren etter små partikler som kan ha festet til spissen av pipette. Plutselige endringer i motstanden kan også være et resultat av partiklene stakk i pipette spissen.
  10. Justere pipette når noen mikron over cellen slik at spissen av pipette vil berøre cellen 1/3 fra midten av cellen, som vist i figur 5. Når berøre cellen, slipp trykket og bruke skånsom for å gjøre en forsegling.
    Merk: Tiden fra oppdateringen pipette inn badet til en vellykket segl bør holdes så kort som mulig. Ikke mer enn 1-1,5 min for å unngå amfotericin B nå spissen pipette og lekkasje i badekaret.
  11. Umiddelbart bytte til vinduet oppdateringen i oppdatering-klemme programvaren (Figur 4 D punkt 1) og har en holder mellom-50 og-60 mV (Figur 4 d punkt 2). Null ut den raske kapasitans består av glass Pipetter (Figur 4 d punkt 3).
  12. Bytt til vinduet celle i patch-klemme programvare (figur 4E punkt 1 og 2) og starte overvåking tilgang motstand, Ra, vises i vinduet. Null ut membran kapasitans i forsterker programvaren (figur 4E punkt 3) etter tilgang.
    Merk: Tilstrekkelig tilgang kan ta 10 til 30 min (figur 4E punkt 2). En god tilgang til gjeldende klemme opptak skal være under 20 M.
  13. Bytt til gjeldende klemme, IC, i forsterker vinduet (figur 4F punkt 1). Justere rask-kapasitiv strøm i vinduet - klemme forsterker programvaren (figur 4F punkt 2 og 3) til samme verdi som 3.12. Sjekk membran potensialet (figur 4F punkt 1).
    Merk: Viktigere, hvis membran potensial er grunne (typisk over-35 mV) cellen kan være skadet. Avbryte innspillingen og finne en ny celle.
  14. Etter å finne en sunn celle (godt festet til vev med membran potensial under-40 mV), starte eksperimentelle opptakene som beskrevet i produsentens protokollen 33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen viser protokollen steg for steg hvordan du kan oppnå pålitelig elektrofysiologiske opptak fra hypofysen (gonadotrope) celler, ved å bruke medaka transgene: [vs (lhb- hrGfpII)] hvor målet celler (Lh-produserende gonadotropes) er merket med grønne fluorescerende protein (GFP).

Først ble elektrofysiologiske undersøkelser gjennomført med hele celle-konfigurasjon. Spontan handling potensialer ble imidlertid ikke observert i noen av studerte cellene. I en gruppe celler, kan action potensialer utløses bruke små gjeldende injeksjoner (5-9 pA) fra en hvile potensial mellom-50 og-60 mV (figur 6). Disse handlingen potensialene hadde en rask oversikt, og etter ca 4-6 min utløsere handlingen potensialer var ikke lenger mulig. Spesielt rask trekk observert kan forklares med små cellestørrelsen. Hypofysen celler er generelt mindre enn neurons 30. For eksempel gjennomsnittlig membran kapasitans av gonadotrope celler varierer mellom 4 og 10 pF 3,30,35. Ligner disse funnene medaka gonadotrope cellene hadde en gjennomsnittlig membran kapasitans av (gjennomsnittlig ± SD) 3,4 ± 0,9 pF (n = 67).

Bytter til perforert oppdateringen konfigurasjonen bruker amfotericin B, spontane handling potensialer ble observert i ca 50% av de innspilte cellene (figur 7A, n = 63 celler fra 21 dyr). Videre kan handling potensialer utløses i 95% av disse cellene med ingen observerbare trekk selv etter lengre opptak (opptil 1 h). Viktigere, for å oppnå pålitelig og høy kvalitet, er det nødvendig å først fylle spissen med soppdrepende-free IC løsning. Hvis små mengder antifungals unnslippe pipette spissen før gigaseal, kan det skade målcellen som samt omliggende celler.

For å teste om cellene i perforert oppdateringen konfigurasjonen er kunne svare på deres viktigste slippe hormon, brukt vi 1 µM Gnrh1 puff ut på målcellene. Forsøkene ble utført i gjeldende klemmen å tillate oss å overvåke endringer i spenning. Disse eksperimentene avslørte bifasisk svar (figur 7B). Den første fasen er en hyperpolarization der utgivelsen av Ca2 + fra interne butikker aktivere Ca2 + aktivert K+ kanaler forårsaker hyperpolarization. Den første fasen er etterfulgt av en depolarization og økt handling potensial frekvens fra 1 – 2 Hz til rundt 3 Hz. I noen av opptakene hadde den andre fasen pseudo platå potensial der 2 eller 3 små toppene ble observert før repolarisasjon.

Figure 1
Figur 1 : Forskjellen mellom hele-cellen (A) og perforert oppdateringen (B) konfigurasjoner av oppdateringen-klemme teknikken. I hele celle konfigurasjonen (A), etter at gigaseal er på plass, gjøres hull i membranen ved å bruke en liten negative trykket i oppdateringen pipette. I denne konfigurasjonen kan viktig intracellulær molekyler som signalnettverk molekyler bli fortynnet til oppdateringen pipette løsningen dermed påvirker de elektriske og fysiologiske responser i cellen. Dette fenomenet er enda viktigere i små celler, for eksempel hypofysen celler. I kontrast i perforert-patch konfigurasjon (B), etter gigaseal, elektrisk kontakt mellom stoffer og patch består pipette av antifungals eller tensider. Det soppdrepende eller surfactant lastes inn oppdateringen pipette før patching og vil bli innarbeidet i plasma membranen under oppdateringen, og dermed sakte perforating membran, slik at bare små molekyler som monovalent ioner skjedde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Bilder av Agar broen (A) og harpe (B) brukes i protokollen. Skala i mm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Fylling av oppdateringen-pipette. (A) soppdrepende gratis IC løsning (blå væske) er fylt av kapillære krefter på grunn av filament i pipette. (B) etter fylle pipette spissen med soppdrepende gratis IC, den bakre delen av pipette er fylt med IC løsning som inneholder amfotericin B (gul væske) bruker en sprøyte nål (mikro filler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4A
Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4B
Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4C
Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4D
Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4E
Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4F
Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4 : Programvare skjermbilder. (A) viser forsterker vinduet. 1. høydepunkter (røde sirkelen) området modus som tillater veksling mellom spenning klemme (VC), gjeldende klemme uten noen aktuell sprøytebruk (jeg = 0) og gjeldende klemme med mulighet for gjeldende injeksjoner (IC). 2 høydepunkter (røde sirkelen) i området for å justere fort kapasitiv gjeldende spenning klemme som helhet-celle kapasitiv gjeldende justeringer. (B) viser patch-klemme programvaren med membran testvinduet åpent. 1. høydepunkter (røde sirkelen) membran test-knappen. 2. høydepunkter (røde sirkelen) forskjellige puls konfigurasjoner, bad, Patch og celle. 3. høydepunkter (røde sirkelen) puls konfigurasjon amplituden og frekvens. (C-F) viser en kombinert enke av oppdateringen-klemme programvare (venstre) og forsterker (høyre) programvare. (C) høydepunkter (røde sirkelen) motstand når Pipetter i badekaret og skikkelig jording bruker agar bro (i Bad modus). (D) 1. Høydepunkter (røde sirkelen) bytte til oppdateringen modus etter gigaseal. 2. høydepunkter (røde sirkelen) puls konfigurasjonen (10 mV puls) og holde potensial tilpasset-60 mV. 3. høydepunkter (røde sirkelen) vinduet for korrigere eller nullstilling rask-kapasitiv strøm etter et giga segl. (E) 1. Høydepunkter (røde sirkelen) cellemodus brukt til overvåking tilgang motstand. 2 highlights (røde sirkelen) cellen parametrene membran kapasitans (Cm), segl kvalitet (Rm), tilgang motstand (Ra), tiden konstant (Tau) og holder gjeldende (Hold). 3. høydepunkter (røde sirkelen) knappen for å korrigere membran kapasitiv strøm. (F) 1. Høydepunkter (røde sirkelen) IC modus for overvåking membran potensial. 2. høydepunkter (røde sirkelen) for å bytte til gjeldende klemme justeringer (I-klemme). 3. høydepunkter (røde sirkelen) i vinduet for å korrigere rask-kapasitiv strøm.

Figure 5
Figur 5 : Mikroskop-bilde fra en patch-klemme opptak på en hypofysen cellen med perforert oppdateringen konfigurasjonen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Gjeldende klemme opptak fra en GFP-merket Lh-produserende celle etter gjeldende injeksjoner med normale hele celle konfigurasjonen. Cellene ble holdt mellom-50 og-60 mV. Typisk action potensialer kan utløses i et delsett av celler ved hjelp av 5-10 pA gjeldende injeksjoner umiddelbart etter å oppnå tilgang til cellen (svart trace). Etter 1-3 min begynte handling potensial amplituden å redusere, et typisk tegn på trekk (cyan trace). Etter 4-6 min forsvunnet handling potensial amplituden nesten helt (magenta trace). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 : Gjeldende klemme innspilling fra en GFP-merket Lh-produserende cellen med perforert oppdateringen konfigurasjonen, etter stimulering med Gonadotropin - lanserer hormone Gnrh1. (A) klemme stemmeopptaket demonstrere spontan handling potensialer fra en Lh produserende gonadotrope celle. (B) en bifasisk svar der Gnrh1 stimulering for 10 s indusert først en hyperpolarization i cellemembranen etterfulgt av en depolarization og økt avfyring frekvens (fra 1 – 2 Hz til 3 Hz) av handlingen potensialer i en celle som tidligere sparken spontan handling potensialer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Elektrofysiologiske opptak ved hjelp av patch-klemme teknikk på hjernen-hypofysen skiver krever forsiktig optimalisering. Godt optimalisert protokoller for gjennomføring av live-celle undersøkelser i teleoster er begrenset, med fleste publikasjoner bruke protokoller basert på pattedyr systemer. I denne forbindelse er det viktig å være klar over det faktum at flere fysiologiske parametere som pH og osmolality er ikke bare arter avhengig, men også mye avhengig om organismen i spørsmålet bor på land eller i vann. På fisk er det også nødvendig for å ta hensyn til, hvis de bor i et marine eller ferskvann. For eksempel er CO2 delvis trykket mye lavere i forhold til pattedyr med nivåer, fra 1,7-3.4 mmHg pCO2 i fisk og 40-46 mmHg pCO2 i pattedyr 36fisk. Basert på dette, justere vi pH 7,75 37,38,39,40 i alle løsninger brukes i gjeldende protokollen. Vi bruker også HEPES buffer som det har vist å ha utmerket bufring kapasitet i regionen pH i 7,4-7,8 41. Osmolality bruker vi 290-300 mOsm som er hva er målt i ekstracellulære miljøet i medaka 42. Temperaturen under elektrofysiologiske opptakene er valgt i henhold til miljøet i fisken. Faktisk bor medaka i vannet med et bredt temperaturområde (fra 4 til 40 ° C), mens i vårt laboratorium de er oppvokst i et kontrollert miljø på 26-28 ° C. Basert på dette, spilte vi vår opptak ved romtemperatur (rundt 25 ° C), forskjellig fra hva brukes for pattedyr vev (37 ° C) eller for kaldt vann fiskearter som torsk (12 ° C) 18.

For å kunne patch hypofysen celler, er det avgjørende å generere sunt vev skiver. Det er viktig å bruke rene verktøy (vev holderen, børste, pinsett, etc) som er kun i kontakt med levende vev (uten fiksativene). En rask Disseksjon av hjernen og hypofysen og holde vev ved lav temperatur (4 ° C) mens dissekere og slicing er andre viktige faktorer å gi levedyktige deler. Spesiell oppmerksomhet bør også gis til temperaturen på agarose på vev innebygging. For varmt agarose kan skade vev mens for kaldt agarose ikke vil forlate deg tid til å orientere vevet riktig snitting. I tillegg kutting bør gjøres med EF løsning uten Ca2 + å unngå skadede celler etter skjæring å inngå apoptose. Bobler er ikke nødvendig, men vev skiver skal samles umiddelbart etter snitting. La stykket ca 15 min etter skjæring slik at cellene hvile litt før patching.

Teleost fisk er gode modeller å undersøke elektrofysiologiske egenskaper av hypofysen celler. Faktisk, i motsetning til pattedyr og fugler, fisk ikke har en median anseelse, betyr at de hypothalamus nevroner kontrollere hypofysen direkte prosjektet deres axons på deres målet celler 32. Dermed i en hjerne-hypofysen skive, hypofysen cellene blir vedlikeholdt i et mer intakt miljø forhold til primære hypofysen cellekulturer hvor cellene er atskilt med kjemisk og mekanisk. Interessant, kunne bruker hjernen-hypofysen skiver av medaka, vi observere at handlingen potensialet avfyring frekvens på Lh celler, ved Gnrh1 aktivering, økt (figur 5). Disse observasjonene er med det har blitt rapportert i hypofysen celle kulturstudier fra vår egen lab 29 indikerer at bruke primære hypofysen cellekulturer er fortsatt relevant å karakterisere membran egenskapene til hypofysen celler. Men tillater hjernen-hypofysen skiver oss å studere også indirekte effekter av ulike forbindelser samt interaksjoner mellom celler, som den opprettholder strukturelle tilkoblinger som er tapt i primære hypofysen cellekulturer. I tillegg stykke forberedelse er raskere å forberede sammenlignet en dissociated primære cellekultur og elektrofysiologiske opptak kan bli gjennomført i følgende 30 min etter disseksjon. Dette betyr at, i motsetning til en primær cellekultur, kan døgnrytme rettes på en meningsfull måte ved hjelp av nylagde skiver.

På grunn av den lille størrelsen på hypofysen cellene i fisk (membran kapasitans rundt 3-10 pF), og våre egne observasjoner viser at gonadotrope cellene mister evnen til å skyte action potensialer (Figur 3) og dermed mister evnen til å svare på slippe hormoner registrere i hele celle konfigurasjon, besluttet vi å bruke og presentere perforert oppdateringen teknikken her. Faktisk har det vært vist at hele celle konfigurasjon kan føre til spredningen av viktige cytoplasmatiske molekyler dermed endre elektrofysiologiske celle egenskaper 13. Hjelp i stedet perforert oppdateringen konfigurasjoner med amfotericin B for å autoperforering cellemembranen i oppdateringen pipette, gjør bare små hull slik at bare liten ioner skjedde gjennom 15,16,43, 44, vi kunne unngå denne fortynning og post den elektriske aktiviteten i cellen for en lengre tid.

Et viktig poeng i perforert oppdateringen teknikken skal tilbake-fyll pipette med IC løsning uten antifungals for å unngå slippe antifungals til medium og ødelegge alle cellene i inndelingen mens nærmer med oppdateringen pipette. Faktisk på grunn av positive trykket på oppdateringen pipette mens nærmer vev, lekker noe væske gjennom oppdateringen pipette før oppdateringen blir gjort. Denne flyten bidrar til å holde spissen rene før du nå målrettet cellen men hvis soppdrepende slippes i medium før oppdateringen, kan det måte alle membraner av alle celler, endre seg dramatisk permeable kjennetegner cellemembraner og dermed elektriske egenskaper.

Presentert prosedyren er optimalisert og brukt til å studere den elektriske aktiviteten i medaka gonadotrope celler. Protokollen kan i tillegg brukes til å studere alle (endokrine) celletyper i hypofysen medaka og andre teleost fiskearter. Holde inne sinn bare at osmolality og pH av alle løsninger må justeres som i kroppsvæsker hos arter i spørsmålet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre

Acknowledgments

Vi takker Ms. LourdesCarreon G Tan for hennes hjelp opprettholde medaka anlegget og Anthony Peltier for illustrerende tallene. Dette arbeidet ble finansiert av NMBU og av Norges forskningsråd, gi tall 244461 (akvakultur program) og 248828 (Digital Livet Norge program).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000 S
Chirurgical glue WPI VETBOND 3M Vetbond Tissue Adhesive
Stainless steel blades Campden Instruments 752-1-SS
metal molds SAKURA 4122
steel harp Warner instruments 64-1417
PBS SIGMA D8537
Ultrapure LMP agarose invitrogen 166520-100
patch pipettes Sutter Instrument BF150-110-10HP Borosilicate with filament O.D.:1.5 mm, I.D.:1.10 mm
Microscope Slicescope Scientifica pro6000
P-Clamp10 Molecular Devices #1-2500-0180 sofware
Digitizer Digidata 1550A1 Molecular Devices DD1550
Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B Molecular Devices 1-CV-7B
GnRH Bachem 4108604 H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt 
pipette puller Sutter Instrument P-1000
amphotericin B SIGMA A9528 pore-forming antibiotic
polyethylenimine  SIGMA P3143 50% PEI solution
microfiler syringe WPI MF28/g67-5
glass for the agar bridge Sutter Instrument BF200-116-15 Borosilicate with filament O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm Fire polished
Micro-Manager software Open Source Microscopy Software
optiMOS sCMOS camera Qimaging  01-OPTIMOS-R-M-16-C
sonicator Elma D-7700 singen
NaCl SiGMA S3014
KCl SiGMA P9541
MgCl2 SiGMA M8266
D-Glucose SiGMA G5400
Hepes SiGMA H4034
CaCl2 SiGMA C8106
Sucrose SiGMA 84097
D-mannitol SiGMA 63565
MES-acid SIGMA M0895
BSA SIGMA A2153

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. Ion channels and signaling in the pituitary gland. Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).
  2. Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling. Trends Endocrinol Metab. 16 (4), 152-159 (2005).
  3. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Dopamine-D2 actions on voltage-dependent calcium current and gonadotropin-II secretion in cultured goldfish gonadotrophs. J Neuroendocrinol. 10 (3), 175-186 (1998).
  4. Chang, J. P., Pemberton, J. G. Comparative aspects of GnRH-Stimulated signal transduction in the vertebrate pituitary - Contributions from teleost model systems. Mol Cell Endocrinol. , (2017).
  5. Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. Inward membrane currents and electrophysiological responses to GnRH in ovine gonadotropes. Neuroendocrinology. 61 (6), 609-621 (1995).
  6. Ben-Jonathan, N., Hnasko, R. Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor. Endocrine Reviews. 22 (6), 724-763 (2001).
  7. Sanchez-Cardenas, C., Hernandez-Cruz, A. GnRH-Induced [Ca2+]i-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
  8. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  9. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  10. Neher, E. Techniques in cellular physiology. Baker, P. F. , Elsevier/North. Holland. 4-19 (1981).
  11. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  12. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).
  13. Marty, A., Neher, E. Single Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 113-114 (1983).
  14. Lindau, M., Fernandez, J. M. IgE-mediated degranulation of mast cells does not require opening of ion channels. Nature. 319 (6049), 150-153 (1986).
  15. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).
  16. Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B. J Neurosci Methods. 37 (1), 15-26 (1991).
  17. Fan, J. S., Palade, P. Perforated patch recording with beta-escin. Pflugers Arch. 436 (6), 1021-1023 (1998).
  18. Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO(2), and pH. Gen Comp Endocrinol. 178 (2), 206-215 (2012).
  19. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. US. 3-35 (1983).
  20. Andersen, P. Brain slices - a neurobiological tool of increasing usefulness. Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).
  21. Guerineau, N. C., Bonnefont, X., Stoeckel, L., Mollard, P. Synchronized spontaneous Ca2+ transients in acute anterior pituitary slices. J Biol Chem. 273 (17), 10389-10395 (1998).
  22. Levavi-Sivan, B., Bloch, C. L., Gutnick, M. J., Fleidervish, I. A. Electrotonic coupling in the anterior pituitary of a teleost fish. Endocrinology. 146 (3), 1048-1052 (2005).
  23. Guerineau, N. C., McKinney, R. A., Debanne, D., Mollard, P., Gahwiler, B. H. Organotypic cultures of the rat anterior pituitary: morphology, physiology and cell-to-cell communication. J Neurosci Methods. 73 (2), 169-176 (1997).
  24. Yu, Y., Ali, D. W., Chang, J. P. Characterization of ionic currents and electrophysiological properties of goldfish somatotropes in primary culture. Gen Comp Endocrinol. 169 (3), 231-243 (2010).
  25. Price, C. J., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Voltage-activated ionic currents in goldfish pituitary cells. Gen Comp Endocrinol. 92 (1), 16-30 (1993).
  26. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Electrical membrane properties and ionic currents in cultured goldfish gonadotrophs. Can J Physiol Pharmacol. 74 (6), 729-743 (1996).
  27. Xu, S., Shimahara, T., Cooke, I. M. Capacitance increases of dissociated tilapia prolactin cells in response to hyposmotic and depolarizing stimuli. Gen Comp Endocrinol. 173 (1), 38-47 (2011).
  28. Haug, T. M., Hodne, K., Weltzien, F. A., Sand, O. Electrophysiological properties of pituitary cells in primary culture from Atlantic cod (Gadus morhua). Neuroendocrinology. 86 (1), 38-47 (2007).
  29. Strandabo, R. A., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Mol Cell Endocrinol. 372 (1-2), 128-139 (2013).
  30. Hodne, K., et al. Electrophysiological differences between fshb- and lhb-expressing gonadotropes in primary culture. Endocrinology. 154 (9), 3319-3330 (2013).
  31. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka--a model organism from the far East. Nat Rev Genet. 3 (1), 53-64 (2002).
  32. Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. Gen Comp Endocrinol. 44 (2), 135-170 (1981).
  33. pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis For Comprehensive Electrophysiology User Guide. Molecular Devices Corporation. , (2006).
  34. MultiClamp 700B COMPUTER-CONTROLLED MICROELECTRODE AMPLIFIER Theory and Operation. Axon Instruments / Molecular Devices Corp. , (2005).
  35. Dominguez-Mancera, B., et al. Leptin regulation of inward membrane currents, electrical activity and LH release in isolated bovine gonadotropes. Biochem Biophys Res Commun. 491 (1), 53-58 (2017).
  36. Schmidt-Nielsen, K. Animal Physiology : adptation and environment fifth edition. , Cambridge university press. 613 (1997).
  37. Burton, R. F. Evolutionary determinants of normal arterial plasma pH in ectothermic vertebrates. J Exp Biol. 205, Pt 5 641-650 (2002).
  38. Burton, R. F. The dependence of normal arterial blood pH on sodium concentration in teleost fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 114 (2), 111-116 (1996).
  39. Heming, T. A., Blumhagen, K. A. Plasma acid-base and electrolyte states of rainbow trout exposed to alum (aluminum sulphate) in acidic and alkaline environments. Aquatic Toxicology. 12 (2), 125-139 (1988).
  40. Reeves, R. B. The interaction of body temperature and acid-base balance in ectothermic vertebrates. Annu Rev Physiol. 39, 559-586 (1977).
  41. Baicu, S. C., Taylor, M. J. Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency. Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).
  42. Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Lett. 2, 12 (2016).
  43. Cass, A., Finkelstein, A., Krespi, V. The ion permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 100-124 (1970).
  44. Holz, R., Finkelstein, A. The water and nonelectrolyte permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 125-145 (1970).

Tags

Nevrovitenskap problemet 138 hjerne-hypofysen vev-slice elektrofysiologi fisk patch-klemme endokrine celler
Sunn hjernen-hypofysen skiver for elektrofysiologiske undersøkelser av hypofysen celler i Teleost fisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien,… More

Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. J. Vis. Exp. (138), e57790, doi:10.3791/57790 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter