Summary
설명 하는 최적화 된 프로토콜을 electrophysiological 녹음으로 패치 클램프 기술을 사용 하 여 뇌 세포의 뒤에 가능한 뇌-뇌 하 수 체 조직을 조각, teleost 물고기 메 다카 (Oryzias latipes)를 사용 하 여 만들기는 구멍이 패치 구성입니다.
Abstract
뇌 세포의 electrophysiological 조사 다 척 추가 있는 종, 하지만 거의 teleost 물고기에 실시 되었습니다. 이 중, 분명 대다수 해리 1 차 셀에 수행 되었습니다. 어떻게 teleost 뇌 세포에 대 한 우리의 이해를 개선, 더 많은 생물학 관련 환경에서 작동,이 프로토콜에는 작은 민물고기 메 다카 (Oryzias latipes)를 사용 하 여 가능한 뇌-뇌 하 수 체 슬라이스를 준비 하는 방법을 보여 줍니다. 뇌-뇌 하 수 체 조각 만들기, pH 및 모든 솔루션의 osmolality 25 ~ 28 ° c.에 사는 민물 물고기의 체액에서 발견 하는 값을 조정 했다 조각 준비, 다음 프로토콜 electrophysiological 녹음 천공된 전체 셀 패치-클램프 기술을 사용 하 여 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 패치 클램프 기술 전례 없는 시간적 해상도와 감도, 단일 이온 채널 아래로 그대로 전체 세포에서 전기적 특성의 조사를 수 있도록 강력한 도구입니다. 세포내 환경 그대로에서 패치 피 펫 전극 솔루션에 의해 희석되는 cytosol에서 규제 요소를 방지를 유지에 구멍이 패치는 고유 합니다. 대조적으로, 전통적인 전체 셀 녹화를 수행할 때 메 다카 뇌 세포 신속 하 게 활동 전위를 발사 하는 그들의 기능을 잃고 관찰 되었다. 다양 한 기 공 기술을 사용할 수 있는, 중이 프로토콜 암포 B. 살 균 제를 사용 하 여 패치 막의 천공을 달성 하는 방법을 보여 줍니다.
Introduction
뇌 하 수 체는 척추 동물 시상 아래 위치 하 고 광학 chiasm에 후부 키 내 분 비 기관 이다. 그것은 생성 하 고 특정 세포 유형에서 6 ~ 8 호르몬을 secretes. 뇌 하 수 체 호르몬 두뇌와 주변 장기 사이의 중간을 구성 하며 다양 한 성장, 재생산, 그리고 항상성의 규칙을 포함 하 여 필수적인 생리 적 프로세스를 드라이브 합니다. 유사한 신경 세포는 뇌 하 수 체의 내 분 비 세포는 활동 전위를 자발적으로 발사 하는 기능으로 전기 고르기 1. 이 활동 전위의 역할은 종속 셀. 포유류의 뇌 하 수 체의 여러 세포 유형에서 활동 전위 수 상승 세포내 캘리포니아2 + 2호르몬 지속적인된 출시에 대 한 충분 합니다. 또한,는 뇌 세포 3,4,,56막 잠재력에 영향을 미치는 뇌에서 stimulatory와 금지 정보를 받습니다. 일반적으로, 물질로 입력은 흥분을 증가 하 고 자주 세포내 상점에서 캘리포니아2 + 의 출시를 포함 뿐만 아니라 발사 주파수 7증가. 셀 이온 채널 구성 활용 방법과 뇌에서 이러한 입력된 신호에 맞게 이해 이해 호르몬 합성 및 릴리스의 열쇠입니다.
패치 클램프 기술 Sakmann 및 정치학자 8,,910 에 의해 1970 년대 후반에 개발 되었고 더 해 밀 11, 개선 셀 electrophysiological 속성의 상세한 조사를 허용 하 고 단일 이온 채널 아래로 또한, 기술은 공부 하는 전류와 전압에 대 한 사용할 수 있습니다. 오늘, 패치 클램핑 셀의 electrophysiological 속성을 측정 하기 위한 황금 표준입니다. 단단한 물개 패치 클램프 기술의 4 개의 주요 구성 되어 개발된 11; 셀 연결 된 내부, 외부 아웃을 전체 셀 패치. 3 첫 번째 구성 단일 이온 채널 수사를 위해 일반적으로 사용 됩니다. 4, 다음 셀 연결 구성에 대 한 세포 막에 구멍 하위 대기 압력을 사용 하 여 이루어집니다. 이 구성에는 또한 12전체 세포 이온 채널 구성의 조사 수 있습니다. 그러나,이 기술의 한 가지 제한 세포질 분자는 패치 피 펫 솔루션 13 그림 1(A), 따라서 공부 셀의 전기 및 생리 적인 응답에 영향을 미치는 희석 하는. 사실, 그 분자의 일부 신호 변환 또는 다른 이온 채널의 규칙에서 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다. 이 방지 하려면 린다 우와 페르난데스 14 방법을 개발 기 공 형성 화합물 패치 피 펫에 추가 됩니다. 셀 연결 된 구성에 따라 화합물 패치 아래 플라즈마 막으로 통합 하 고 천천히 cytosol (그림 1B)와 전기 접촉을 만드는 막 구멍. Nystatin 15 와 암포 B 16, 같은 여러 다른 antifungals 또는 사포닌 베타-escin 17,18 같은 계면 활성 제를 사용할 수 있습니다. 이러한 화합물 생성 여러차례 양이온 및 Cl- 고분자 및 캘리포니아2 + 15와 같은 더 큰 이온의 cytosolic 레벨을 유지 하면서는 cytosol와 패치 피펫으로 사이 보급 수 있도록 충분히 큰 모 공 16.
구멍이 패치를 사용 하 여의 전에 잠재적으로 높은 직렬 저항입니다. 직렬 저항 (Rs) 또는 액세스 저항 결합 된 저항 지상 기준으로 패치 피 펫 이다. 패치 클램프 기록 하는 동안 Rs 막 저항 병행에서 될 것입니다 (Rm). Rm 그리고 Rs 전압 분배기로 병렬 작업에. 높은 Rs, 전압 기록에서 오류를 주는 Rs 이상 떨어질 것 이다. 오류 기록 큰 해류와 더 큰 될 것입니다. 또한, 전압 분배기 주파수 의존 따라서 시간적 해상도 영향을 미치는 로우-패스 필터 만들기 이기도 합니다. 사실상 구멍이 패치 항상 수 없습니다 크고 빠른 해류의 같은 전압 문이 나+ 전류 (에 대 한 자세한 읽기 참조 19참조). 또한, Rs 패치 클램프 기록, 다시 기록 된 전류에 변화를 선도 하는 동안 달라질 수 있습니다. 따라서, 가양성 Rs 약물 응용 프로그램 하는 동안 변경 하는 경우에 발생할 수 있습니다.
슬라이스 조직에 전기 생리학 20뇌 뉴런의 electrophysiological 특성 연구 앤더슨 연구소에 의해 처음 도입 되었다. 기술은 더 그대로 환경에서 세포-세포 통신 및 셀 회로 서 단일 셀의 상세한 수사에 대 한 방법을 포장. 뇌 조각을 만들기 위한 유사한 기술 Guérineau 그 외 여러분 에 의해 1998 년에 도입 되었다 그러나 21., 그것은 그의 뇌-뇌 하 수 체 슬라이스 준비 teleost 22패치 클램프 연구 성공적으로 사용 되었다 2005 년 전에. 이 연구에서 저자는 또한 구멍이 패치 클램프 기록의 사용을 보고 했다. 그러나, 지금까지, 대부분의 뇌 세포의 electrophysiological 조사 실시 되었습니다 포유류, 그리고 teleost 물고기 1,,222,23 포함 하 여 다른 척추 동물의 소수에서 . Teleosts에 거의 모든 연구에 수행 기본 해리 셀 24,25,26,,2728,29,30 .
현재 신문에서 우리 모델 물고기 메 다카에서 건강 한 뇌-뇌 하 수 체 조각의 준비를 위한 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 접근 기본 천연된 세포 배양에 비해 몇 가지 장점을 나타냅니다. 첫째, 세포 해리 세포 문화 조건에 비해 상대적으로 보존된 환경에 기록 됩니다. 둘째, 슬라이스 준비 공부는 해리 셀 문화 조건에 불가능-셀 통신 22, 중재 하는 간접 경로 수 있습니다. 또한, 기 공 형성 요원으로 암포 b 천공된 전체 셀 패치 클램프 기법을 사용 하 여 얻은 조직 조각에 electrophysiological 녹음을 수행 하는 방법을 보여 줍니다.
메 다카는 작은 민물고기 아시아, 주로 일본에서 발견 이다. 메 다카의 유전학, 발생 학, 생리학 광범위 하 게 연구 100 년 31, 그리고 그것은 많은 실험실에서 일반적으로 사용 되 연구 모델. 이 종이에 특별 한 중요성의 teleost 물고기에 시상 하 부-뇌 하 수 체 복합물의 독특한 형태학 조직 이다: 포유류와 조류 hypothalamic 뉴런 릴리스 그들의 신경-호르몬 뇌 하 수 체 내 분 비 세포를 조절 하는 반면 중간 예 하의 포털 시스템으로 hypothalamic 뉴런 teleost 물고기 32에서 뇌 하 수 체의 내 분 비 세포의 직접적인 긴장 투영이입니다. 따라서, 물고기, 잘 보존 된 뇌-뇌 하 수 체 네트워크에 뇌 세포와 특히 어떻게 뇌 세포의 electrophysiological 특성을 조사할 수 있는 특별 한 중요성의 이다 신중 하 게 실시 뇌-뇌 하 수 체 부 러 뜨 리 그들의 흥분을 제어 함으로써 캘리포니아2 + 항상성.
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Protocol
처리 하는 모든 동물 생명 과학의 고 승인된 수 사관의 감독 하에 간호와 노르웨이 대학에서 연구 동물의 복지에 대 한 권고에 따라 수행 되었다.
1입니다. 기기 및 솔루션의 준비
참고: 모든 솔루션 살 균 해야 합니다. 주의 산도를 신중 하 게 공부 종의 extracellular 환경에 적응 해야 합니다 모든 솔루션의 osmolality (osmol/kg 물) 주어져야 한다. pH와 osmolality 조정 되어야 한다 pH 미터, 어는 점 osmometer 등 정밀 전자 장비와 각각.
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확인 없이 캘리포니아2 + 여분-셀룰러 솔루션의 500 mL (Ca2 + 무료 EC): 150 mM NaCl, KCl, 1.3 m m MgCl2, 5mm 4mm 포도 당, 10 mM Hepes.
- 4.38 g의 NaCl, KCl, MgCl2, 360.32 mg의 포도 당 및 초순의 450 ml HEPES의 1.19 g 61.89 mg 186.37 mg 해산 (0.055 미국 / 25 ° C에서 cm, 18.2 MOhm 저항력) H2O 자석 교 반기를 사용 하 여 유리 비 커에.
- NaOH와 7.75에 pH를 조정 합니다.
- 500 mL 부피 플라스 크에 솔루션을 전송 합니다. 500 mL까지 초순 H2O로 부피 플라스 크를 채우십시오.
- osmolality 측정 하기 전에 솔루션을 믹스. 마 니 톨과 290-300 mOsm을 조정 합니다. 필터 물 진공 시스템 및 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 소독.
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여분-셀룰러 솔루션 (EC)의 500 mL 확인: 150 mM NaCl, 5 m m KCl, 2mm CaCl2, 1.3 m m MgCl2, 포도 당 4 mM, 10 mM Hepes.
- NaCl의 4.38 g, KCl의 186.37 mg, CaCl2의 147.01 mg, MgCl2의 61.89 mg, 360.32 밀리 그램의 포도 당 및 초순 H2O 자석 교 반기를 사용 하 여 유리 비 커에는 450 ml에서 HEPES의 1.19 g 용 해.
- NaOH와 7.75에 pH를 조정 합니다.
- 500 mL 부피 플라스 크에 솔루션을 전송 합니다. 500 mL까지 초순 H2O로 부피 플라스 크를 채우십시오.
- osmolality 측정 하기 전에 솔루션을 믹스. 마 니 톨과 290-300 mOsm을 조정 합니다. 필터 물 진공 시스템 및 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 소독.
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0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA와 EC)으로 여분-셀룰러 솔루션의 500 mL 확인: 150 mM NaCl, 5 m m KCl, 2mm CaCl2, 1.3 m m MgCl2, 포도 당 4 mM, 10 mM Hepes.
- NaCl의 4.38 g, KCl의 186.37 mg, CaCl2의 147.01 mg, MgCl2의 61.89 mg, 360.32 밀리 그램의 포도 당 및 초순 H2O 자석 교 반기를 사용 하 여 유리 비 커에는 450 ml에서 HEPES의 1.19 g 용 해.
- NaOH와 7.75에 pH를 조정 합니다.
- 500 mL 부피 플라스 크에 솔루션을 전송 합니다. 500 mL까지 초순 H2O로 부피 플라스 크를 채우십시오.
- osmolality 측정 하기 전에 솔루션을 믹스. 마 니 톨과 290-300 mOsm을 조정 합니다. 필터 물 진공 시스템 및 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 소독. 50 mg BSA를 추가 합니다.
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세포내 솔루션 (IC)의 250 mL 확인: 110mm 코, 20 m KCl, 10mm Hepes, m 20 m m 자당.
- 1.54 g 코, KCl의 327.75 mg, HEPES의 595.75 mg 및 초순 H2O 자석 교 반기를 사용 하 여 유리 비 커에 450 mL에 자당의 1.712 g 용 해.
- (N-morpholino) 탄 sulfonic (MES) 산 7.2에 pH를 조정 합니다.
- 250 mL 부피 플라스 크에 솔루션을 전송 합니다. 250 mL까지 초순 H2O로 부피 플라스 크를 채우십시오.
- osmolality 측정 하기 전에 솔루션을 믹스. 280-290 mOsm (EC 보다 낮은 10 mOsm) 자당으로 조정 됩니다. 필터 물 진공 시스템 및 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 소독.
- 캘리포니아2 + 및 BSA 무료 EC 2% 낮은 녹는 agarose 용액 100 mL를 만들기 (캘리포니아2 + 의 100 mL에 낮은 녹는 agarose의 2 세대 무료 EC). 전자 레인지를 사용 하 여 녹이 고 40 ° c.에 물 욕조에 녹아 agarose를 배치 그것은 진정 하자 조직에 사용 하기 전에 40 ° C를 도달할 때까지.
참고: EC, 캘리포니아2 + 무료 EC 저장 될 수 있습니다 4 ° C에서 몇 주 면 살 균 및 IC 솔루션-20 ° C에서 몇 달 동안. Agarose 4 ° C에서 1 주 동안 저장 될 수 있다 고 짧게 microwaving에 의해 3-5 시간을 다시 사용할 수 있습니다. 과도 한 재사용 agarose 및 소금 농도 품질의 증발 및 이어질 것입니다. -
한 다리를 만들:
- 열 (마약과) 2 m m 외부 직경 7.5 m m 긴 붕 규 산 유리 모 세관 그리고 안쪽 직경 (아이디) 1.16 m m는 초점에 분 젠 버너를 사용 하 여 지점 약 1/3 한쪽에서 유리 구 부를 시작할 때까지. 불꽃에서 유리를 제거 하 고 유리 (그림 2A) 약 120도의 각도 벤드를 허용.
- 포도 당, 전자 레인지를 사용 하 여 없이 하 고는 agarose는 액체 채우기 미리 만든된 유리 주입구를 사용 하 여 모 세관 액체 유리의 끝 중 하나를 삽입 하 고 몇 분 동안 대기에 의해 강제로 하는 동안 정상적인 ec 2 %agar 녹여. 포도 당 없이 EC에서 4 ° C에서 사용까지 다리를 저장 합니다.
- 적당 한 피 펫 끌어당기는 사람을 사용 하 여 필 라 멘 트 패치 펫으로 붕 규 산 유리를 준비 합니다. 원하는 전극 저항을 얻기 위해 피 펫 끌어당기는 설명서를 참조 하십시오.
참고: 피펫으로의 테이퍼 가능한 한 짧게 해야 합니다. 짧은 피 펫 테이퍼 당기 단계 4-6을 사용 하 여 이루어집니다. 전극 저항 셀 크기에 따라 2, 6 m ω 사이 이어야 한다. -
피하기 위해 패치 클램프 실험 동안 조직 운동의 borate 버퍼에서 polyethylenimine (페이)의 0.1%와 녹음 실의 표면 코트.
- Borate 버퍼 (25 m m)의 500 mL를 준비:
- 나2B4O710 H2O 450 ml에서의 초순 H2O 자석 교 반기를 사용 하 여 유리 비 커에 4.768 g을 분해.
- HCl와 8.4에 pH를 조정 합니다.
- 500 mL 부피 플라스 크에 솔루션을 전송 합니다. 500 mL과 0.2 µ m 필터 소독 물 진공 시스템을 사용 하 여 솔루션까지 초순 H2O로 부피 플라스 크를 채우십시오.
- 최종 사용을 위한 10 µ L borate 버퍼의 100 µ L에서 재고 솔루션 1%의 희석으로 페이 (49 mL 25mm borate 버퍼에 1 mL 50% 페이)와 0.1% 페이 희석 1% 재고 솔루션을 준비 합니다.
- 슬라이스 소유자의 유리에 0.1% 페이의 2 개 mL를 추가 하 고 1 분 동안 품 어 코팅을 하자. 짧게 초순 H2O의 5 mL로 두 번 유리 세척 그리고 사용까지 건조 공기.
- Borate 버퍼 (25 m m)의 500 mL를 준비:
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암포 B 솔루션을 준비 합니다.
- 빛 으로부터 보호 1 mL 튜브에 50 µ L 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 암포 B 가루 3 mg를 용 해 하 여 60 mg/mL 재고 솔루션을 확인 합니다. 30 최대 속도로 소용돌이 s와 15 분 균질 sonicate. -20 ° C에서 3-5 튜브에 aliquots를 저장 하 고 하루 한 약 수를 사용 합니다.
참고: 경우 암포 B 재고 솔루션은 명확 하 고 노란색 색 하지만 밀키 (여전히 노란색) 15-20 분 쥡니다 후 확인 새로운 재고 솔루션. - 10 mL 용량 보다 더 깨끗 한 유리 비 커에 IC의 2 개 mL를 pipetting으로 암포 b IC 솔루션을 확인 합니다. 피 펫 솔루션으로 암포 B 재고 솔루션의 8 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 혼합. 사용까지 얼음에 알루미늄 호 일 및 장소 비 커를 포장 하 고 그것에 게 모든 3 h를 갱신.
- 빛 으로부터 보호 1 mL 튜브에 50 µ L 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 암포 B 가루 3 mg를 용 해 하 여 60 mg/mL 재고 솔루션을 확인 합니다. 30 최대 속도로 소용돌이 s와 15 분 균질 sonicate. -20 ° C에서 3-5 튜브에 aliquots를 저장 하 고 하루 한 약 수를 사용 합니다.
2. 해 부 및 Vibratome와 슬라이스
- 해 부, 전에 해 부 도구 준비 등 날카로운 하나 하나의 강한 집게가 위. 에탄올 (조직 홀더, 브러시, 집게) 도구를 청소 하 고는 사용 해 부 목적 으로만 고정된 조직 접촉 결코 다는 것을 확인. 오염을 피하기 위하여 별도 상자에 그들을 유지.
- 1 분에 대 한 차가운 얼음 물에 물고기 안락사
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후속 단계에 따라 신속 하 게 날카로운 집게 (를 사용 하 여 더 이상 3 분)와 메 다카 뇌와 뇌를 해 부.
- 물고기와 함께 들고 강한 집게 심각한 눈 뒤에 2 개의 시 신경이 위로 while 또는 날카로운 집게.
- 강력한 집게로 단계적으로 두개골 뼈를 파괴 함으로써 뒷부분에서 앞쪽 측면 두개골의 등 쪽 부분을 엽니다.
- 강력한 집게로 한쪽에 두개골을 벗기다.
- 심한이 위 또는 날카로운 집게와 척수.
- 부드럽게, 척수는 집게로 잡아, 앞쪽에 후부에서 뇌를 플립 하 고 접시는 차가운 캘리포니아2 + 무료 적와 장소
- 액체 agarose와 1.5-2 cm3 금속 몰드를 얼음에 그것을 배치.
- 바로 전에 agarose 굳은 (약 25-30 ° C)에서 부드럽게 뇌 척수는 집게로 잡아, 괜 찮 아 요 종이의 조각으로 겸 건조와 agarose에 조직을 넣어. EC는 조직 주위 왼쪽의 흔적을 희석 하 고 조직 찾으시는 agarose 견고까지 몇 초 동안 얼음에 형을 하자 agarose는 신속 하 게 혼합.
참고: 그것은 빨리이 단계에 대 한 필수적입니다. agarose은 신속 하 게 얼음에 의해 금속 금형 냉각으로 굳은 것 이다. - 메스 칼 날 조직을 포함 하는 agarose의 정사각형 블록을 트림 하 고 수술 (무 독성) 접착제를 사용 하 여 vibratome 견본 홀더에 접착제.
- 얼음 처럼 차가운 캘리포니아2 + 무료 적으로 표본 (뇌-뇌 하 수 체) 홀더를 받는 vibratome의 베트를 채우기
- vibratome로 견본 홀더를 놓고는 단면에 대 한 높은 주파수와 낮은 속도 사용 하 여 150 µ m의 parasagittal 섹션을 agarose 블록을 잘라. 선택한 섹션을 수집 하 고 차가운 캘리포니아2 + 무료 적의 3 mL와 패치 클램프 기록 챔버에 배치
- 조직 섹션에 그리드 하프 (그림 2B)를 놓습니다.
참고: 하프 것 이다 코팅 함께 조직 안정화 및 패치 클램프 기록 하는 동안 이동에서 그것을 방지. - 거문고 자리에 후에, 캘리포니아2 + 일반 EC 및 BSA에 Ca2 + 무료 EC 매체를 변경 합니다. 10 분에 대 한 조직의 나머지를 보자.
3. 천공 패치 클램프 및 Electrophysiological 녹음
- 실험을 시작 하기 전에 다음 단계에 의해 전극 와이어 염화는: 첫째, 좋은 샌드 페이퍼 (p180)을 사용 하 여 실버 와이어 전극을 청소. 둘째, 2 mL, 70% 에탄올으로 씻어. 셋째, 2 mL, 10 분 동안 2-5% 염소에에서 와이어를 찍어. 마지막으로, 린스 2 mL, 초순 H2o.
- 10 X 목표를 사용 하 여 대상 영역 (뇌) 현미경 단계 뇌-뇌 하 수 체 조각으로 녹음 실 에서도 찾아서 40 X 목표를 사용 하 여 셀을 검사 합니다.
참고: 성공적으로 준비 되 면 거의 라운드 셀 표시 되어야 합니다. 이러한 둥근 세포는 조직에서 분리는 일반적으로 손상 된 세포입니다. - 2% 한 천의 다리를 통해 접지 전극을 EC 욕조에 놓습니다.
- 40 X 목표를 사용 하 여 건강 한 세포를 찾습니다.
참고: 건강 한 셀 해야 될 단단히 조직 조각에 연결 된 및 하지 고 조각에서 분리. - 전압 클램프 (VC;에 앰프를 설정 그림 4A 포인트 1) 모드. 오픈 인감 테스트 창과 언론 목욕 구성 (그림 4B 포인트 1과 2. 5 mV 펄스를 사용 하 여 피 펫 저항 (그림 4B 포인트 3) 모니터링.
- 백필 암포 b 마이크로 필러 주사기를 사용 하 여 IC 솔루션을 추가 하기 전에 항진균 무료 IC 솔루션 패치 피 펫의 끝 ( 그림 3참조).
- 1 mL 주사기를 사용 하 여 패치 피 펫에 약간 긍정적인 공기 압력을 추가 합니다.
참고: 이것은 팁의 오염을 방지 하는 패치 피 펫에서 작은 액체 흐름. - 일단 목욕, 패치 피펫은 저항을 평가 하 고 아무 입자 (그림 4C) 피 펫의 끝에 연결 된 ㄴ 다는 것을 확인 키를 누릅니다.
참고: 테이프의 작은 조각은 비디오 녹화 형태 보기의 필드를 표시 하는 모니터에 부착 되어. 이것은의 위치 셀 기준으로 패치 피펫으로 쉽게 때 목표 하지 셀에 초점을 맞추고 있습니다. - Micromanipulators를 사용 하 여 셀 아래로 패치 피 펫 가이드.
참고: 피펫으로 작은 입자는 피 펫의 끝에 연결 된 수를 찾아 깨끗 한는 다는 것을 확인 하십시오. 저항에 급격 한 변화는 피 펫 팁에 갇혀 입자의 결과 영향을 수도 있습니다. - 때 몇 가지 피 펫을 재조정 미크론 셀 위에 그림 5와 같이 피 펫의 끝 셀 셀의 중간에서 1/3를 터치 것입니다. 셀을 만질 때 압력을 놓고 인감을 만들기 위해 부드러운 흡입을 적용.
참고: 패치 피 펫에서 시간 성공적인 목욕을 입력 인감을 가능한 한 짧게 유지 되어야 한다. 1-1.5 분 이상 목욕으로 피 펫 누설의 끝을 도달 하는 암포 B를 피하기 위하여. - 즉시 패치 클램프 소프트웨어 (그림 4 D 포인트 1) 패치 창으로 전환 하 고-50,-60 mV (그림 4D 포인트 2) 사이의 지주 잠재력 합니다. 제로 아웃 빠른 정전 용량 유리 피 펫 (그림 4D 점 3)으로 구성.
- 패치 클램프 소프트웨어 (4E 그림 포인트 1과 2)에 셀 창으로 전환 하 고 액세스 저항, Ra, 창에 표시 됩니다 모니터링을 시작 합니다. 충분 한 액세스 후 앰프 소프트웨어 (4E 그림 포인트 3)에서 막 용량 밖으로 0.
참고: 충분 한 액세스 10 ~ 30 분 (4E 그림 포인트 2) 걸릴 수 있습니다. 현재 클램프 녹음에 대 한 좋은 액세스 20 M 미만 이어야 합니다. - 전류 클램프, IC, 앰프 소프트웨어 창 (그림 4 층 포인트 1)에서 전환 합니다. 3.12은 같은 값을 앰프 소프트웨어 (4 층 그림 포인트 2, 3) -클램프 창에서 빠른 용량 성 전류를 조정 합니다. 막 잠재력 (4 층 그림 포인트 1)를 확인 합니다.
참고: 중요 한 것은, 막 잠재력은 얕은 경우 (-35 위의 일반적인 mV) 세포를 손상 될 수 있습니다. 녹음/녹화를 취소 하 고 새 셀을 찾을. - 건강 한 세포를 찾는 후 (막-40 아래 잠재적으로 조직에 단단히 부착 된 mV), 제조 업체의 프로토콜 33,34에 설명된대로 실험 녹음을 시작.
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Representative Results
이 프로토콜 어디 대상 세포 (Lh 생산 gonadotropes) 한 메 다카 유전자 변형 라인 [Tg (lhb-hrGfpII)]를 사용 하 여 뇌 하 수 체 (gonadotrope) 셀에서 안정적인 electrophysiological 녹음을 달성 하는 방법의 단계 프로토콜을 보여 줍니다. 녹색 형광 단백질 (GFP)으로 표시 됩니다.
처음, electrophysiological 조사 전체 셀 구성을 사용 하 여 실시 했다. 그러나, 자발적인 활동 전위 되지 공부 셀에서 관찰 되었다. 셀의 하위 집합에서 활동 전위-50,-60 mV (그림 6) 사이 휴식 잠재력에서 작은 현재 주사 (5-9 pA)를 사용 하 여 발생 수 있습니다. 이 활동 전위를 빨리 마칠 수 있어 졌고 약 4-6 분 후 트리거 활동 전위는 더 이상 가능. 특히 빠른 감소 관찰 작은 셀 크기에 의해 설명 될 수 있습니다. 일반적으로, 뇌 세포는 뉴런 30보다 작습니다. 예를 들어, 4와 10 pF 3,,3035gonadotrope 셀 범위의 막 커패시턴스 평균. 이러한 연구 결과 메 다카와 비슷한 gonadotrope 셀 했다 (평균 ± S.D) 3.4 ± 0.9 pF의 평균 막 커패시턴스 (n = 67).
암포 B를 사용 하 여 천공된 패치 구성으로 전환, 자발적인 활동 전위 기록된 세포의 약 50%에서 관찰 되었다 (그림 7A, n = 21 동물에서 63 셀). 또한, 활동 전위 없이 관찰 요약 이러한 셀의 95%에서 (최대 1 h) 장시간된 녹음 후에 실행 수 있습니다. 중요 한 것은, 달성 하기 위하여 안정적이 고 높은-품질 레코딩, 그것이 먼저 IC 솔루션 항진균 무료 팁을 채우기 위해 필요 합니다. 적은 양의 antifungals는 gigaseal를 하기 전에 피 펫 팁을 탈출, 그것은 잘 주변 세포로 목표 셀을 손상 수 있습니다.
셀 구멍이 패치 구성에 그들의 주요 공개 호르몬에 응답할 수 있다면을 테스트 하려면 우리는 대상 세포에 배출 1 µ M Gnrh1 퍼프 적용. 실험 모니터링 전압 변화를 전류 클램프에 수행 했다. 이러한 실험 복 형 응답을 (그림 7B) 밝혔다. 첫 번째 단계는 내부 매장에서 캘리포니아2 + 의 방출 캘리포니아2 + 활성화 K+ 채널에서 hyperpolarization 일으키는 활성화는 hyperpolarization입니다. 첫 번째 단계 3 hz 약 1-2 Hz에서 도발 및 활동 전위 증가 주파수에 선행 된다. 일부 녹음, 두 번째 단계는 의사 고원 잠재력 2 또는 3 작은 스파이크 repolarization 전에 관찰 되었다 했다.
그림 1 : 전체 셀 (A)와 패치 클램프 기술의 구멍이 패치 (B) 구성 차이입니다. 전체 셀 구성 (A)에서 후 gigaseal, 구멍에서에서 이루어집니다 막 패치 피 펫에 작은 부정적인 압력을 적용 하 여. 이 구성에 따라서 셀의 전기 및 생리 적인 응답에 영향을 미치는 패치 피 펫 솔루션으로 신호 분자와 같은 중요 한 세포내 분자를 희석 수 있습니다. 이러한 현상은 뇌 세포와 같은 작은 세포에서 훨씬 더 중요 하다. 대조적으로, 천공 패치 구성 (B), gigaseal, 전기 접점은 cytosol와 패치 사이에서 피 펫은 이루어진 antifungals 또는 계면 활성 제. 계면 활성 제 또는 항진균 패치 전에 패치 피 펫에 로드 되 고 플라즈마 멤브레인 막, 여러차례 이온을 통과 같은 단지 작은 분자를 허용 함으로써 천천히 꿰뚫기 패치 아래에 통합 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 프로토콜에 사용 된 한 천 교량 (A)와 (B) 하프의 사진. M m. 규모 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 패치-피 펫의 작성. (A) 항진균 무료 IC 솔루션 (파란색 액체) 이다 피펫으로 내부의 필 라 멘 트 때문에 모 세관 힘에 의해 backfilled. (B) 암포 B (노란색 액체) 주사기 바늘 (마이크로 필러)를 사용 하 여 포함 된 IC 솔루션으로 가득 항진균 무료 IC, 피펫으로의 후부 부분으로 피 펫 팁을 작성 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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그림 4 : 소프트웨어 스크린샷. (A) 보여주는 앰프 소프트웨어 창. 1. 하이라이트 (빨간색 원) 전압 클램프 (VC), 모든 현재 주입 없이 전류 클램프 사이 전환할 수 있도록 하는 모드 영역 (I = 0)와 현재 주사 (IC)에 대 한 가능성과 전류 클램프. 2 전압 클램프 전체 셀 용량 성 전류 조정에 있는 빨리 용량 성 전류를 조정 하기 위한 지역 (빨간 원)을 강조 표시 합니다. (B) 오픈 막 테스트 창 패치 클램프 소프트웨어를 보여 줍니다. 1. 막 테스트 버튼 (빨간 원)을 강조 한다. 2. 다른 펄스 구성, 목욕, 패치, 그리고 셀 (빨간색 동그라미)를 강조 표시합니다. 3. 펄스 구성 진폭 및 주파수 (빨간색 동그라미)를 강조 표시합니다. (C F) 패치 클램프 소프트웨어 (왼쪽)와 증폭기 (오른쪽) 소프트웨어의 결합된 부를 보여줍니다. (C) 때 피펫으로 목욕에 적절 한 천 다리 (목욕 모드)을 사용 하 여 접지 저항 (빨간색 동그라미)를 강조 한다. (D) 1입니다. gigaseal 다음 패치 모드를 전환 (빨간색 동그라미)를 강조 표시 합니다. 2. 하이라이트 (빨간색 원) 펄스 구성 (10 mV 펄스) 및 지주 잠재력 조정-60 mV. 3. 수정 또는 기가 인감 다음 빠른 용량 성 전류를 비우기 위한 창 (빨간 원)을 강조 한다. (E) 1입니다. 액세스 저항 모니터링을 위해 사용 되는 셀 모드 (빨간색 동그라미)를 강조 표시 합니다. 2 강조 표시 (빨간색 원) 셀 매개 변수, 막 커패시턴스 (Cm), 품질 (Rm) 인감, 저항 (Ra), 시간 상수 (타우) 및 지주 전류 (보류) 액세스. 3. 막 용량 성 전류를 해결 하기 위한 버튼 (빨간 원)을 강조 한다. (F) 1입니다. 막 잠재적인 모니터링 IC 모드 (빨간색 동그라미)를 강조 표시 합니다. 2. 현재 클램프 조정 (난-클램프)로 전환 하는 버튼 (빨간 원)을 강조 한다. 3. 빠른 용량 성 전류를 해결 하기 위한 창 (빨간 원)을 강조 한다.
그림 5 : 패치 클램프 구멍이 패치 구성을 사용 하 여 뇌 세포에 기록에서 현미경 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : GFP 표시 된 Lh-생산에서 현재 클램프 녹음 셀 다음 일반 전체 셀 구성을 사용 하 여 현재 주사. 셀-50,-60 mV 사이 유지 했다. 전형적인 활동 전위 셀 (검은 추적)에 대 한 액세스를 달성 한 후 즉시 5-10 pA 현재 주사를 사용 하 여 셀의 하위 집합에서 실행 수 있습니다. 1-3 분 후에 활동 전위의 진폭 감소, 감소 (시안색 추적)의 전형적인 표시 하기 시작 했다. 4-6 분 후 활동 전위의 진폭 (마젠타 추적)를 거의 완전히 사라졌다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : 전류 클램프 생식 샘 자극 호르몬-방출 호르몬 Gnrh1와 자극에 따라 구멍이 패치 구성을 사용 하 여 GFP 표시 된 Lh 생성 세포에서 녹음. (A) 현재 클램프 녹화 Lh 생산 gonadotrope 셀에서 자발적인 활동 전위를 시연. (B) 복 형 응답 어디 10 Gnrh1 자극 s는 먼저 이전 발사 한 세포에 활동 전위의 세포 막 한 도발은 및 발사 (1-2 Hz 3 hz)에서 주파수 증가의 hyperpolarization 유도 자발적인 활동 전위입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
뇌-뇌 하 수 체 조각에 패치 클램프 기법을 사용 하 여 electrophysiological 녹음 주의 최적화가 필요 합니다. 특히 teleosts에서에서 라이브 셀 조사 수행을 위한 최적화 되 프로토콜 대부분 포유류 시스템 기반 프로토콜을 사용 하 여 발행물의 제한 됩니다. 이와 관련, 그것은 중요 한 사실을 pH 및 osmolality 같은 여러 생리 적 매개 변수 종류가 뿐만 아니라 종속, 하지만 또한 매우 여부 유기 체에 살고 땅에 또는 물에 의존. 물고기, 그것은 또한 필요한 계정, 바다 또는 민물 환경에서 사는 경우입니다. 예를 들어 CO2 부분 압력 물고기 포유류에 1.7-3.4 mmHg pCO2 물고기와 포유류 36에서 40-46 mmHg pCO2 레벨에 비해 훨씬 낮습니다. 이에 따라, 우리는 7.75 37,38,,3940 현재 프로토콜에 사용 되는 모든 솔루션에 pH를 조정. 우리는 또한으로 7.4-7.8 41의 pH 지역에서 우수한 완충 용량을 소유 하기 위하여 보였다 HEPES 버퍼 사용. Osmolality, 우리 290-300 mOsm 무슨 메 다카 42의 extracellular 환경에 측정 되었다는 사용 합니다. Electrophysiological 녹음 중에 사용 하는 온도 물고기의 환경에 따라 선정 되었습니다. 실제로,에 메 다카 26-28 ° c.에 통제 된 환경에서 발생 하는 우리의 실험실에서 동안 (에서 40 ° C에 4), 넓은 온도 범위와 바다에서 살으십시오 이에 따라, 우리는 실내 온도 (약 25 ° C), 포유류 조직 (37 ° C) 또는 냉 수 물고기 종 대서양 대구 (12 ° C) 18의 용도 다른 우리의 녹음 수행.
뇌 세포를 패치 수, 건강 한 조직을 조각 생성에 중대 하다. 그것은 살아있는 조직 (fixatives의 무료) 접촉만 하는 깨끗 한 도구 (조직 홀더, 브러시, 집게, 등)을 사용 하는 것이 필수적. 뇌 및 뇌 하 수 체 및 유지의 빠른 해 부 해 부하 고 자르는 동안 (4 ° C) 낮은 온도에서 조직 제공 가능한 섹션 다른 주요 요인이 있다. 특정 관심 또한 조직 포함 시 agarose의 온도에 주어져야 한다. 너무 추 워 agarose 당신을 떠나지 않을 것입니다 하는 동안 너무 따뜻한 agarose는 조직 손상 될 수 있습니다 적절 한 단면에 대 한 조직 찾으시는 시간. 또한, 슬라이스 할 수 없이 손상 된 세포를 피하기 위해 Ca2 + EC 솔루션 apoptosis에 입력 하 단면에 따라. 버블링, 필요 하지 않습니다 하지만 조직 조각 단면 후 즉시 수집 한다. 조각 패치 전에 조금 나머지 셀 수 있도록 단면 다음 약 15 분을 남겨 주세요.
Teleost 물고기 뇌 세포의 electrophysiological 속성을 조사 하기 위해 우수한 모델입니다. 실제로, 포유류와 조류를 반대로 물고기 할 소유 하지 hypothalamic 신경 세포는 뇌 하 수 체를 직접 제어 그들의 대상 셀 32에 그들의 축 삭을 프로젝트 의미 중간 예 하. 따라서, 뇌-뇌 하 수 체 조각에서 뇌 세포 기본 뇌 세포 배양에 비해 더 그대로 환경에서 유지는 세포 화학 및 기계적 치료를 사용 하 여 해리는 어디. 흥미롭게도, 메 다카의 뇌-뇌 하 수 체 분할 영역을 사용 하 여, 우리 수 관찰 Gnrh1 활성화 시 Lh 셀에 주파수를 발사 하는 활동 전위 (그림 5) 증가 합니다. 이러한 관찰은 우리 자신의 실험실 29 를 사용 하 여 나타내는에서 뇌 세포 문화 연구에서 보고 되었습니다 무엇 계약 기본 뇌 세포 배양은 여전히 뇌 세포의 막 속성 특성 관련. 그러나, 뇌-뇌 하 수 체 조각 수 공부 또한 셀 간의 상호 작용 뿐만 아니라 다른 화합물의 간접 효과 기본 뇌 세포 배양에서 분실 하는 구조적 연결을 유지. 또한, 슬라이스 준비 빨리 준비 하는 해리 기본 세포 배양에 비해 고 electrophysiological 녹음 해 부 후에 다음 30 분 수행할 수 있습니다. 즉, 1 차 셀 문화 반대 circadian 리듬 해결할 수 갓된 분할 영역을 사용 하 여 의미 있는 방식.
물고기에 있는 뇌 세포의 작은 크기 때문에 (주위 막 커패시턴스 pF 3-10), 및 gonadotrope 세포 활동 전위 (그림 3) 해 고에 대응 하는 능력을 잃게 따라서 그들의 능력을 잃고 보여주는 우리 자신의 관찰 전체 셀 구성에 기록할 때 호르몬을 방출, 우리는 사용 하 고 여기에 구멍이 패치 기법을 제시 하기로 결정. 실제로, 그것은 그 전체 셀 구성 따라서 13electrophysiological 셀 속성 변경 하는 중요 한 세포질 분자의 확산으로 이어질 수 표시 되었습니다. 구성을 사용 하 여 대신에 구멍이 패치 암포 b 15,,1643, 를 통과에 작은 이온 수만 작은 구멍을 만드는 패치 피 펫에 세포 막에 구멍을 44, 장기간 동안이 희석 및 기록 세포의 전기적 활동을 피할 수 있습니다 우리.
구멍이 패치 기법에서 중요 한 1 포인트는 첫 번째 다시-채우기 antifungals 매체에 antifungals를 방출 하지 않도록 하 고 패치 피 펫으로 접근 하는 동안 섹션의 모든 세포를 손상 없이 IC 솔루션으로 피 펫 이다. 사실, 조직에 접근 하는 동안 패치 피 펫에 적용 하는 긍정적인 압력 때문에 일부 액체는 새 패치 피 펫을 통해 패치 때까지. 이 흐름 대상된 셀에 도달할 때까지 경우 항진균은 매체에 패치 하기 전에, 그것은 모든 세포 막 세포 막의 투과 특성을 극적으로 변화 하는 모든 셀의 구멍 수 팁을 청결 한 유지 하는 데 도움이 및 따라서 그들의 전기 속성입니다.
제시 절차 최적화 되었고 성공적으로 메 다카 gonadotrope 세포의 전기적 활동을 연구 하는 데 사용. 또한, 메 다카와 다른 teleost 어류의 뇌 하 수 체에 있는 모든 (내 분 비) 셀 형식을 공부 하는 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 명심 단지 osmolality와 모든 솔루션의 pH는 종의 체액의 조정 해야 합니다 질문에.
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Disclosures
저자 공개할 게 없다
Acknowledgments
우리 양 LourdesCarreon G 탄 메 다카 시설을 유지 하는 그녀의 도움 및 안토니 Peltier 설명 그림에 대 한 감사 합니다. 이 작품은 노르웨이의 연구 위원회, 보조금 번호 244461 (양식 프로그램) 및 248828 (디지털 라이프 노르웨이 프로그램)와 NMBU에 의해 투자 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | |
| Chirurgical glue | WPI | VETBOND | 3M Vetbond Tissue Adhesive |
| Stainless steel blades | Campden Instruments | 752-1-SS | |
| metal molds | SAKURA | 4122 | |
| steel harp | Warner instruments | 64-1417 | |
| PBS | SIGMA | D8537 | |
| Ultrapure LMP agarose | invitrogen | 166520-100 | |
| patch pipettes | Sutter Instrument | BF150-110-10HP | Borosilicate with filament O.D.:1.5 mm, I.D.:1.10 mm |
| Microscope Slicescope | Scientifica | pro6000 | |
| P-Clamp10 | Molecular Devices | #1-2500-0180 | sofware |
| Digitizer Digidata 1550A1 | Molecular Devices | DD1550 | |
| Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | |
| GnRH | Bachem | 4108604 | H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt |
| pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| amphotericin B | SIGMA | A9528 | pore-forming antibiotic |
| polyethylenimine | SIGMA | P3143 | 50% PEI solution |
| microfiler syringe | WPI | MF28/g67-5 | |
| glass for the agar bridge | Sutter Instrument | BF200-116-15 | Borosilicate with filament O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm Fire polished |
| Micro-Manager software | Open Source Microscopy Software | ||
| optiMOS sCMOS camera | Qimaging | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | |
| sonicator | Elma | D-7700 singen | |
| NaCl | SiGMA | S3014 | |
| KCl | SiGMA | P9541 | |
| MgCl2 | SiGMA | M8266 | |
| D-Glucose | SiGMA | G5400 | |
| Hepes | SiGMA | H4034 | |
| CaCl2 | SiGMA | C8106 | |
| Sucrose | SiGMA | 84097 | |
| D-mannitol | SiGMA | 63565 | |
| MES-acid | SIGMA | M0895 | |
| BSA | SIGMA | A2153 |
References
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