절연, 확장, 및 Adipogenic CD34 + CD31 + 인간의 Omental 및 피하 지방 조직에서 내 피 세포의 유도

Summary

지방 조직 혈관 창시자에서 흰색과 베이지색 adipocytes의 차별화는 비만에 대사 개선 위한 잠재력을 맺는 다. 우리는 CD34 + CD31 + 인간의 지방에서 내 피 세포 격리 및 후속 시험관에 확장 및 차별화 흰색과 베이지색 adipocytes에 프로토콜을 설명합니다. 여러 다운스트림 응용 프로그램을 설명 합니다.

Abstract

비만 체형 비 통해 주로 지방 조직에의 개장 하는 광범위 한 함께 제공 됩니다. 극단적인 체형 성장 인슐린, 로컬 hypoxia, 그리고 염증에 빈약한 응답에 결과. 창시자에서 기능 흰색 adipocytes의 분화를 자극 하 여 체형 인구의 급진적인 비를 막을 수 있다, 따라서, 지방 조직의 대사 건강의 감소와 함께 향상 시킬 수 있습니다. 염증입니다. 또한, 베이 지/브라운 adipocytes의 분화를 자극 하 여 몸 전체 에너지 지출을 늘릴 수 있습니다, 체중 감소의 결과로. 이 이렇게 비만 공동 morbidities 2 형 당뇨병 및 심혈 관 질환 등의 개발을 방지할 수 있습니다.

이 종이 절연, 확장, 및 공동 CD31와 CD34 마커를 표현 하는 인간 지방 조직 내 피 세포의 부분 집합에서 흰색과 베이지색 adipocytes의 차별화에 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 상대적으로 저렴 하 고 노동 집약 되지 않습니다. 그것은 인간의 지방 조직에 대 한 액세스를 요구 한다 고 피하 디포 샘플링에 대 한 적합 합니다. 이 프로토콜에 대 한 병 적으로 뚱뚱한 주제에서 신선한 지방 조직 샘플 [신체 질량 지 수 (BMI) > 35] bariatric 수술 절차 동안 수집 됩니다. Stromal 혈관 분수에서 순차적 immunoseparation를 사용 하 여, 충분 한 셀에서 작은 지방의 2-3 g로 생산 됩니다. 이러한 세포 문화에 10-14 일 동안 확장 될 수 있다, cryopreserved 수 그리고 통로 5-6까지 뿌리고 그들의 adipogenic 속성을 유지 합니다. 세포는 adipogenic 칵테일 인간 인슐린의 조합과 가진 주 작동 근 rosiglitazone을 사용 하 여 14 일에 대 한 처리 됩니다.

이 방법론 지방 내 피 세포에서 adipogenic 응답을 드라이브 하는 분자 메커니즘에 대 한 개념 실험의 증거를 얻기 위해 사용할 수 있습니다 또는 심사는 adipogenic을 향상 시킬 수 있는 새로운 약물에 대 한 응답도 흰색으로 감독 또는 베이 지/브라운 체형 차별화입니다. 작은 피하 biopsies을 사용 하 여,이 방법론을 화면 베이 지/브라운과 흰색 adipocytes 비만 공동 morbidities의 치료에 대 한 자극을 목적으로 하는 임상 시험에 대 한 응답자 비 과목으로 사용할 수 있습니다.

Introduction

최근의 증거는 쥐와 인간에서 지방 조직 맥 관 구조에 있는 셀의 하위 집합 분화 될 수 있다 중 흰색 또는 베이지색/브라운 adipocytes^1,2,3으로 보여줍니다. 이러한 세포의 표현 형은 내 피 세포, 평활 근/pericyte, 또는 중간 고기^4,5,,67의 스펙트럼을 지 원하는 증거와 함께 논쟁의 주제 이다. 이 방법론을 개발의 범위 CD34 + CD31 + 비만 인간에서 다른 지방 저장소에서 분리 된 내 피 세포의 adipogenic 잠재력을 테스트 했다. 문학에서 다른 연구는 잠재적인 또는 알려진된 체형 창시자^2,,89의 총 stromal 혈관 분수의 adipogenic에 초점을 맞추고. 현재 기존 기술 마약 배달¹⁰에 대 한 내 피 세포를 지방 조직 구체적으로 타겟팅 할 수 있습니다, adipogenic을 같은 세포의 잠재력을 이해 흰색 또는 베이지색 adipocytes 향해 유도 이므로 중요 한 미래 치료 대상.

다른 그룹 보고 인간 지방 조직^11,,1213에서 내 피 세포를 분리 하는 대리 모 알선으로 CD31와 CD34 마커의 조합. 일반적으로, 고립 2 개의 일련의 단계와 긍정적인 선택 마그네틱 비즈를 사용 하 여 사용 하 여 수행 됩니다. 이 보고서에서 immunoseparation CD34 + 자석 구슬 CD31 플라스틱 구슬과 결합을 사용 하 여 이용 되었다. 우리는이 기술은 전형적인 조약돌 내 피 형태학의 보존에 관하여 순차적 자석 immunoseparation에 우수한 발견. 또한, 확장 및 adipogenic 유도에서 작은 지방 1-2 g로 시작에 필요한 충분 한 세포를 생성할 수 있었습니다. 피하 지방의 작은 샘플 생 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 셀의 필요한 수량을 생산 하기 위해 충분 하다. 이 점은 잠재적으로 중요 한 경우에 특히이 방법은 인체에 adipogenic 유도에 응답에 대 한 심사에 활용 됩니다.

다른 시스템과 달리 문학에서 보고,이 방법 활용 CD34 + CD31 + 세포의 adipogenic 유도 대 한만 두 재료: 가진 주 작동 근-rosiglitazone-및 인간의 인슐린. 중요 한 것은, 사용 하는 인슐린의 양을 순환 인간¹⁴post-absorptive 인슐린의 정상/높은 범위 내에서 넘어진다. 세포에는 생체 외에서Akt 인 산화에 의해 측정의 인슐린 응답의 정도 칵테일 유도에 대응 하는 능력 연결 되지 않습니다. 흥미롭게도,이 유도 칵테일 및 실험 조건을 사용 하 여, 흰색과 베이 지/브라운 셀의 혼합 얻은 했다 크기와 세포내 지질 방울과 분자 마커의 식의 숫자에 의해 결정 된 대로. 잠재적으로 차별화 된 베이지색의 균형을 변경할 수 있는 에이전트의 심사에 대 한 응답자 셀 (베이 지 화이트 대 )의 표현 형의 양적 평가 함께이 간단 하 고 비용 효율적인 유도 프로토콜 허용 : 화이트 adipocytes.

이 메서드는 또한 인간 지방 조직에서 혈관 내 피 창시자의 지질의 근본적인 메커니즘을 이해 하기 위한 변환 방법을 제공 합니다. 이 특정 격리/차별화 기술을 사용 하 여, 조사 야 위 고 뚱뚱한 인간의 다양 한 지방 창 고에서 책임 지질 혈관 내 피 세포의 하위 집합에 대 한 다양 한 경로 심문 수 있습니다.

Protocol

동부 버지니아에서 제도적 검토 보드 위원회 연구 및 연구에 사용 하는 인간 지방 조직 샘플의 수집을 승인 했다. 정보 서 면된 동의 환자에서 수집 되었다. 1. 버퍼, 미디어, 악기의 준비 Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered 솔루션 (KRBBS) 준비: 135 m m 염화 나트륨, 5 m m 염화 칼륨, 황산 마그네슘 1 m m, 0.4 m m 칼륨 인산 염 염기, 5.5 m m 포도 당, 1mm 아데노신, 0.01% 항생제/antimycotic 혼합 (…

Representative Results

우리의 프로토콜 CD34 + CD31 + 다른 플랫폼의 인간 지방 조직에서 혈관 세포의 adipogenic 잠재력을 결정 하기 위해 생체 외에서 접근을 제공 하는 것을 목표로. 간단한 순서도 다이어그램 그림 1A에 표시 됩니다. 셀을 표현 CD34의 긍정적인 선택을 사용 하 여 첫 번째 단계 갓 고립 된 세포 (그림 1A)의 인구에서 CD34 + 세포 > 95%에?…

Discussion

이 종이의 초점 절연, 확장 및 adipogenic CD34 + CD31 + 인간 지방 조직의 내장과 피하 창 고에서 내 피 세포의 유도 대 한 방법론을 제공 하는 것입니다.

설치류 또는 인간 CD31 항 체 붙일 표시 또는 자석 구슬^18, 결합을 사용 하 여 주로 기법을 포함 하는 다양 한 혈관 침대에서 내 피 세포의 고립에 대 한 보고 된 방법론 ^{19 ,} <sup class…

Materials

Large Equipment
Biosafety Cabinet	Nuaire	nu-425-400
Cell Culture Incubator	Thermo-Fisher Scientific	800 DH
Water Bath	Forma Scientific	2568	Reciprocal Shaker
RT-PCR Machine	BIO-RAD	CFX96-C1000
Electrophoresis Box	BIO-RAD	Mini PROTEAN 3 Cell
Transblot Box	BIO-RAD	Mini Trans-Blot Cell
Electrophoresis Power Supply	BIO-RAD	PowerPac Basic
ELISA Reader	Molecular Devices	SpectraMax M5
Blot Reader	LI-COR	Odyssey	Near Infrared
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Tabletop Centrifuge	Eppendorf	MiniSpin Plus
Fluorescent Microscope	Olympus	BX50
Inverted Microscope	Nikon	TMS
KRBSS Buffer
HEPES	Research Products International	H75030
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	792519
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	746398
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Glucose	Acros Organics	410950010
Adenosine	Acros Organics	164040250
Bovine Serum Albumin	GE Healthcare Bio-Sciences	SH30574.02
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher Scientific	15070063
Tissue Digestion
20 mL Syringe	Global Medical	67-2020
Nylon Mesh, 250 µm	Sefar	03-250/50
Pipetting Needles	Popper	7934
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Tissue Forceps	George Tiemann & Co	160-20
Collagenase, Type I	Worthington Biochemical	LS004196
Petri Dishes, 100 mm	USA Scientific	5666-4160	TC Treated
Eppendorf Tubes, 1.5 mL	USA Scientific	1615-5500
Conical Tubes, 15 mL	Nest Scientific	601052
Conical Tubes, 50 mL	Nalgene	3119-0050
Scintillation Vials	Kimble	74505-20	Tissue Dicing
Cell Isolation
Cellometer	Nexcelom	Auto 2000
Cellometer Slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002
Cellometer Viability Stain	Nexcelom	CS2-0106-5mL	Acridine Orange/Propidium Iodine
Anti-CD34 Magnetic Beads	StemCell Technologies	18056	Kit
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
Anti-CD31 Plastic Beads	pluriSelect USA	19-03100-10
pluriSelect 10x Wash Buffer	pluriSelect USA	60-00080-10
pluriSelect Connector Ring	pluriSelect USA	41-50000-03
pluriSelect Detachment Buffer	pluriSelect USA	60-00046-12
pluriSelect Incubation Buffer	pluriSelect USA	60-00060-12
pluriSelect S Cell Strainer	pluriSelect USA	43-50030-03
Cell Culture
6-well Plates	USA Scientific	CC7682-7506	TC Treated
4-well chambered slides	Corning Life Sciences	354559	Fibronectin coated
4-well chambered slides	Thermo-Fisher Scientific	154526PK	Uncoated glass
Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC)	Sciencell Research Laboratories	7200	Primary cell line
Endothelial Cell Media (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Complete Kit
DMEM/F12 Basal Media	Thermo-Fisher Scientific	11320082
Fetal Bovine Serum (FBS)	Rocky Mountain Biologicals	FBS-BBT
Insulin	Lilly	U-100	Humalog
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Cell Analysis
Oil Red O Dye	Sigma-Aldrich	O0625	Prepared in isopropanol
96 well plates	USA Scientific	1837-9600
96 well PCR plates	Genesee Scientific	24-300
RNA Extraction	Zymo Research	R2072	Kit
cDNA Synthesis	BIO-RAD	1708841	Supermix
JumpStart PCR Polymerase	Sigma-Aldrich	D9307-250UN	Hot start, with PCR Buffer N
Magnesium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	M8787-5ML	3 mM final in PCR reaction
dNTPs	Promega	U1515
TaqMan AdipoQ	Thermo-Fisher Scientific	Hs00605917_m1
TaqMan CIDEA	Thermo-Fisher Scientific	Hs00154455_m1
TaqMan RPL27	Thermo-Fisher Scientific	Hs03044961_g1
TaqMan UCP1	Thermo-Fisher Scientific	Hs00222453_m1
BCA Assay	Sigma-Aldrich	QPBCA-1KT	Kit
Bis-acrylamide	BIO-RAD	1610146	40% stock solution
Ammonium Persulfate	BIO-RAD	1610700
TEMED	BIO-RAD	1610800
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
Glycine	BIO-RAD	1610718
Sodium Dodecal Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
EDTA	Fisher Scientific	S311-100
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B8026
Blot Membrane	EMD Millipore	IPFL00010
Methanol	Fisher Scientific	A452-SK4
Odyssey Blocking Buffer, Tris	LI-COR	927-50000
Anti-AKT antibody	Cell Signaling Technology	2920S	Mouse monoclonal
Anti-pAKT antibody	Cell Signaling Technology	9271S	Rabbit polyclonal
Anti-UCP1 antibody	Abcam	ab10983	Rabbit polyclonal
Anti-Mouse IgG antibody	LI-COR	926-68070	Goat Polyclonal, IRDye 680RD
Anti-Rabbit IgG antibody	LI-COR	926-32211	Goat Polyclonal, IRDye 800CW
Anti-Rabbit IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	111-025-003	Goat Polyclonal, TRITC
Phosphate Buffer Saline	Thermo-Fisher Scientific	10010049
37% Formaldehyde Solution	Electron Microscopy Sciences	15686	4% solution for cell fixation
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000	10% blocking solution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100	0.1% permeabilization solution
DAPI	Thermo-Fisher Scientific	D1306
Calcein AM	Thermo-Fisher Scientific	65-0853-39	Cell fluorescent visualization
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning Life Sciences	356231	Growth factor reduced
DiI labeled Acetylated LDL	Thermo-Fisher Scientific	L3484