Summary

العزلة والتوسع وتحريض أديبوجينيك CD34 + CD31 + خلايا بطانية من الأنسجة الدهنية تحت الجلد وأومينتال البشرية

Published: July 17, 2018
doi:

Summary

التفريق بين adipocytes أبيض وبيج من الأنسجة الدهنية والأوعية الدموية موروث يحمل إمكانات لتحسين التمثيل الغذائي في السمنة. يصف لنا البروتوكولات CD34 + CD31 + عزل الخلية البطانية من الدهون البشرية والتوسع اللاحق في المختبر ، والتمايز في adipocytes بيج وأبيض. وتناقش عدة تطبيقات المتلقين للمعلومات.

Abstract

ويرافق البدانة إعادة عرض واسعة من الأنسجة الدهنية في المقام الأول عن طريق تضخم adipocyte. نتائج النمو adipocyte المتطرفة في ضعف استجابة للأنسولين، ونقص المحلية، والتهاب. بحفز التفريق بين adipocytes البيضاء الفنية من فروعه، يمكن منع تضخم جذرية للسكان adipocyte، ونتيجة لذلك، يمكن تحسين صحة التمثيل الغذائي للأنسجة الدهنية جنبا إلى جنب مع تخفيض التهاب. أيضا، عن طريق تنشيط ريق adipocytes بيج/براون، نفقات الطاقة الجسم الكلي يمكن زيادة، مما يؤدي إلى فقدان الوزن. هذا النهج يمكن أن تحول دون تطور المراضات المشارك السمنة مثل داء السكري من النوع 2، وأمراض القلب والأوعية الدموية.

وتصف هذه الورقة العزلة والتوسع، والتفريق في adipocytes أبيض وبيج من مجموعة فرعية خلايا الأنسجة الدهنية البشرية بطانية المشترك تعبر عن علامات CD31 و CD34. الطريقة رخيصة نسبيا وليست كثيفة العمالة. يتطلب الوصول إلى الأنسجة الدهنية البشرية ومستودع تحت الجلد ومناسبة لأخذ العينات. لهذا البروتوكول، عينات الأنسجة الدهنية الطازجة من مواضيع السمنة سقيم [مؤشر كتلة الجسم (BMI) > 35] يتم جمعها خلال إجراءات جراحات. باستخدام إيمونوسيباريشن متسلسلة من الكسر الأوعية الدموية stromal، يتم إنتاج ما يكفي من خلايا من أقل من 2-3 غرام الدهون. هذه الخلايا يمكن توسيعها في ثقافة أكثر من 10-14 يوما، ويمكن cryopreserved، والاحتفاظ بممتلكاتهم أديبوجينيك مع باساجينج حتى سن 5-6. وتعامل الخلايا لمدة 14 يوما مع أديبوجينيك كوكتيل باستخدام مزيج من الأنسولين البشري ومؤثر-روزيغليتازون PPARγ.

يمكن أن تستخدم هذه المنهجية للحصول على دليل على مفهوم التجارب على الآليات الجزيئية التي تدفع ردود أديبوجينيك في الخلايا الدهنية بطانية، أو لفحص العقاقير الجديدة التي يمكن أن تعزز أديبوجينيك الرد موجها أما نحو الأبيض أو التفريق بين adipocyte بيج/براون. باستخدام عينة صغيرة تحت الجلد، يمكن استخدام هذه المنهجية لحجب المواضيع غير المستجيب للتجارب السريرية ويهدف إلى حفز adipocytes بيج/البنى والأبيض لعلاج السمنة والمراضات المشارك.

Introduction

وتبين الأدلة الأخيرة أن الفئران والبشر، يمكن أن تكون متباينة مجموعة فرعية خلايا يقطنون المفرج الأنسجة الدهنية إلى أما أبيض أو بيج/بني adipocytes1،2،3. النمط الظاهري لهذه الخلايا موضوع الخلاف، مع الأدلة المؤيدة لخلايا بطانية أو العضلات الملساء/بيريسيتي، أو طائفة من وسيطة تعمل4،5،،من67. وكان نطاق تطوير هذه المنهجية لاختبار إمكانات أديبوجينيك CD34 + CD31 + غشائي الخلايا المعزولة من مستودعات الدهون المختلفة من البشر يعانون من السمنة المفرطة. وتركز دراسات أخرى في الأدب على أديبوجينيك المحتملة في كسر الأوعية الدموية stromal مجموع أو adipocyte المعروفة المتكفل2،،من89. منذ التكنولوجيات الموجودة حاليا يمكن أن تستهدف على وجه التحديد خلايا الأنسجة الدهنية بطانية للمخدرات تسليم10، فهم إمكانات هذه الخلايا للخضوع أديبوجينيك توجيهي نحو adipocytes أبيض أو بيج من المهم العلاجات المستهدفة مستقبلا.

وذكرت مجموعات مختلفة مزيج علامات CD31 و CD34 كالأمهات البديلات عزل خلايا بطانية من الأنسجة الدهنية البشرية11،،من1213. عادة، يتم العزل استخدام اثنين من الخطوات المتسلسلة وتشكيله إيجابية باستخدام الخرز المغناطيسي. واستخدمت في هذا التقرير، إيمونوسيباريشن استخدام CD34 + الخرز المغناطيسي جنبا إلى جنب مع الخرز البلاستيك CD31. وجدنا هذا الأسلوب متفوقة على إيمونوسيباريشن المغناطيسي متسلسلة فيما يتعلق بالحفاظ على مورفولوجيا غشائي حصاة كبيرة نموذجية. أيضا، كنا قادرين على توليد ما يكفي من خلايا المطلوبة لتحريض التوسع وأديبوجينيك بدءاً من أقل من 1-2 غرام الدهون. خزعة عينة صغيرة من الدهون تحت الجلد ما يكفي لإنتاج الكمية المطلوبة من الخلايا للتطبيقات المتلقين للمعلومات. هذا الجانب يحتمل أن تكون هامة، لا سيما إذا كان هذا الأسلوب سوف تستخدم للكشف عن استجابة لتحريض أديبوجينيك في البشر.

خلافا لأنظمة أخرى ذكرت في الأدبيات، يستخدم هذا الأسلوب فقط هما مكونان لتحريض أديبوجينيك CD34 + CD31 + الخلايا: مؤثر PPARγ – روزيغليتازون – والإنسولين البشري. الأهم من ذلك، كمية الأنسولين المستخدمة يقع ضمن النطاق العادي/عالية لتعميم بوستابسوربتيفي الأنسولين في البشر14. درجة القدرة على الاستجابة للأنسولين من الخلايا في المختبر، تقاس الفسفرة Akt، ترتبط بمدى قدرتها على الاستجابة لتحريض كوكتيل. من المثير للاهتمام، استخدام هذه الشروط التعريفي كوكتيل والتجريبية، مزيج خلايا البيضاء والبيج/براون تم الحصول عليها كما تحدد حجم وعدد قطرات داخل الخلايا الدهنية والتعبير عن المؤشرات الجزيئية. يسمح هذا البروتوكول تعريفية بسيطة وفعالة من حيث التكلفة إلى جانب التقييم الكمي للنمط الظاهري لخلايا المستجيب (الأبيض مقابل بيج) لفحص العوامل التي يمكن أن يحتمل أن يغير موازين متباينة بيج : الأبيض adipocytes.

كما يوفر هذا الأسلوب نهجاً متعدية لفهم الآليات الكامنة أديبوجينيسيس فروعه غشائي الأوعية الدموية في الأنسجة الدهنية للإنسان. باستخدام هذه التقنية المحددة العزلة/التمايز، يمكن استجواب المحققين المسارات المختلفة المسؤولة عن أديبوجينيسيس في مجموعة فرعية خلايا البطانية الوعائية من شتى مخازن الدهون في البشر الهزيل والسمنة المفرطة.

Protocol

وافقت “لجنة استعراض المجلس المؤسسية” في مدرسة الطب في فيرجينيا الشرقية بالأبحاث وجمع عينات الأنسجة الدهنية البشرية المستخدمة في هذه الدراسة. وجمعت من المرضى موافقة خطية مستنيرة. 1-إعداد المخازن المؤقتة، ووسائط الإعلام، والصكوك إعداد حل Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (كربس): 135 ملم …

Representative Results

لدينا بروتوكول يهدف إلى توفير نهج في المختبر لتحديد إمكانات أديبوجينيك CD34 + CD31 + خلايا الأوعية الدموية من مستودعات مختلفة من الأنسجة الدهنية البشرية. ويبين الشكل 1Aرسم تخطيطي انسيابي مبسطة. الخطوة الأولى استخدام تحديد إيجابي CD34 معربا عن الخلايا يؤدي >…

Discussion

تركز هذه الورقة تقديم منهجية للعزل والتوسع وتحريض أديبوجينيك CD34 + CD31 + خلايا بطانية من مستودعات الحشوي وتحت الجلد من الأنسجة الدهنية البشرية.

وقد تم الإبلاغ عن المنهجيات لعزل خلايا بطانية من أسرة الأوعية الدموية المختلفة من القوارض أو البشر التي تنطوي أساسا على تقنيات استخ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

المؤلفون أن نشيد ماركيز بيكي، منسق السريرية في مركز بارياتريك سينترا، لمساعدتها في عملية للمريض الفحص والموافقة. وأيد R15HL114062 إلى Anca دال دوبريان هذا البحث.

Materials

Large Equipment

Biosafety Cabinet

Nuaire

nu-425-400

Cell Culture Incubator

Thermo-Fisher Scientific

800 DH

Water Bath

Forma Scientific

2568

Reciprocal Shaker

RT-PCR Machine

BIO-RAD

CFX96-C1000

Electrophoresis Box

BIO-RAD

Mini PROTEAN 3 Cell

Transblot Box

BIO-RAD

Mini Trans-Blot Cell

Electrophoresis Power Supply

BIO-RAD

PowerPac Basic

ELISA Reader

Molecular Devices

SpectraMax M5

Blot Reader

LI-COR

Odyssey

Near Infrared

Refrigerated Centrifuge

Eppendorf

5810 R

Tabletop Centrifuge

Eppendorf

MiniSpin Plus

Fluorescent Microscope

Olympus

BX50

Inverted Microscope

Nikon

TMS

KRBSS Buffer

HEPES

Research Products International

H75030

Sodium bicarbonate

Sigma-Aldrich

792519

Calcium chloride dihydrate

Sigma-Aldrich

C7902

Potassium phosphate monobasic

Sigma-Aldrich

P5655

Magnesium sulfate

Sigma-Aldrich

M2643

Sodium chloride

Sigma-Aldrich

746398

Sodium phosphate monobasic monohydrate

Sigma-Aldrich

S9638

Potassium chloride

Sigma-Aldrich

P9333

Glucose

Acros Organics

410950010

Adenosine

Acros Organics

164040250

Bovine Serum Albumin

GE Healthcare Bio-Sciences

SH30574.02

Penicillin/Streptomycin

Thermo-Fisher Scientific

15070063

Tissue Digestion

20 mL Syringe

Global Medical

67-2020

Nylon Mesh, 250 µm

Sefar

03-250/50

Pipetting Needles

Popper

7934

Fine Scissors

Fine Science Tools

14058-11

Tissue Forceps

George Tiemann & Co

160-20

Collagenase, Type I

Worthington Biochemical

LS004196

Petri Dishes, 100 mm

USA Scientific

5666-4160

TC Treated

Eppendorf Tubes, 1.5 mL

USA Scientific

1615-5500

Conical Tubes, 15 mL

Nest Scientific

601052

Conical Tubes, 50 mL

Nalgene

3119-0050

Scintillation Vials

Kimble

74505-20

Tissue Dicing

Cell Isolation

Cellometer

Nexcelom

Auto 2000

Cellometer Slides

Nexcelom

CHT4-SD100-002

Cellometer Viability Stain

Nexcelom

CS2-0106-5mL

Acridine Orange/Propidium Iodine

Anti-CD34 Magnetic Beads

StemCell Technologies

18056

Kit

EasySep Magnet

StemCell Technologies

18000

Anti-CD31 Plastic Beads

pluriSelect USA

19-03100-10

pluriSelect 10x Wash Buffer

pluriSelect USA

60-00080-10

pluriSelect Connector Ring

pluriSelect USA

41-50000-03

pluriSelect Detachment Buffer

pluriSelect USA

60-00046-12

pluriSelect Incubation Buffer

pluriSelect USA

60-00060-12

pluriSelect S Cell Strainer

pluriSelect USA

43-50030-03

Cell Culture

6-well Plates

USA Scientific

CC7682-7506

TC Treated

4-well chambered slides

Corning Life Sciences

354559

Fibronectin coated

4-well chambered slides

Thermo-Fisher Scientific

154526PK

Uncoated glass

Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC)

Sciencell Research Laboratories

7200

Primary cell line

Endothelial Cell Media (ECM)

ScienCell Research Laboratories

1001

Complete Kit

DMEM/F12 Basal Media

Thermo-Fisher Scientific

11320082

Fetal Bovine Serum (FBS)

Rocky Mountain Biologicals

FBS-BBT

Insulin

Lilly

U-100

Humalog

Rosiglitazone

Sigma-Aldrich

R2408

Cell Analysis

Oil Red O Dye

Sigma-Aldrich

O0625

Prepared in isopropanol

96 well plates

USA Scientific

1837-9600

96 well PCR plates

Genesee Scientific

24-300

RNA Extraction

Zymo Research

R2072

Kit

cDNA Synthesis

BIO-RAD

1708841

Supermix

JumpStart PCR Polymerase

Sigma-Aldrich

D9307-250UN

Hot start, with PCR Buffer N

Magnesium Chloride Solution

Sigma-Aldrich

M8787-5ML

3 mM final in PCR reaction

dNTPs

Promega

U1515

TaqMan AdipoQ

Thermo-Fisher Scientific

Hs00605917_m1

TaqMan CIDEA

Thermo-Fisher Scientific

Hs00154455_m1

TaqMan RPL27

Thermo-Fisher Scientific

Hs03044961_g1

TaqMan UCP1

Thermo-Fisher Scientific

Hs00222453_m1

BCA Assay

Sigma-Aldrich

QPBCA-1KT

Kit

Bis-acrylamide

BIO-RAD

1610146

40% stock solution

Ammonium Persulfate

BIO-RAD

1610700

TEMED

BIO-RAD

1610800

Tris

Sigma-Aldrich

T1503

Glycine

BIO-RAD

1610718

Sodium Dodecal Sulfate

Sigma-Aldrich

L3771

EDTA

Fisher Scientific

S311-100

Bromophenol Blue

Sigma-Aldrich

B8026

Blot Membrane

EMD Millipore

IPFL00010

Methanol

Fisher Scientific

A452-SK4

Odyssey Blocking Buffer, Tris

LI-COR

927-50000

Anti-AKT antibody

Cell Signaling Technology

2920S

Mouse monoclonal

Anti-pAKT antibody

Cell Signaling Technology

9271S

Rabbit polyclonal

Anti-UCP1 antibody

Abcam

ab10983

Rabbit polyclonal

Anti-Mouse IgG antibody

LI-COR

926-68070

Goat Polyclonal, IRDye 680RD

Anti-Rabbit IgG antibody

LI-COR

926-32211

Goat Polyclonal, IRDye 800CW

Anti-Rabbit IgG antibody

Jackson ImmunoResearch

111-025-003

Goat Polyclonal, TRITC

Phosphate Buffer Saline

Thermo-Fisher Scientific

10010049

37% Formaldehyde Solution

Electron Microscopy Sciences

15686

4% solution for cell fixation

Normal Goat Serum

Vector Laboratories

S-1000

10% blocking solution

Triton X-100

Sigma-Aldrich

X-100

0.1% permeabilization solution

DAPI

Thermo-Fisher Scientific

D1306

Calcein AM

Thermo-Fisher Scientific

65-0853-39

Cell fluorescent visualization

Matrigel Basement Membrane Matrix

Corning Life Sciences

356231

Growth factor reduced

DiI labeled Acetylated LDL

Thermo-Fisher Scientific

L3484

References

  1. Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322 (5901), 583-586 (2008).
  2. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).
  3. Min, S. Y., et al. Human ‘brite/beige’ adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice. Nature Medicine. 22 (3), 312-318 (2016).
  4. Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
  5. Tran, K. V., et al. The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells. Cell Metabolism. 15 (2), 222-229 (2012).
  6. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  7. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  8. Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
  9. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15 (4), 480-491 (2012).
  10. Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5552-5557 (2016).
  11. Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
  12. Miranville, A., et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation. 110 (3), 349-355 (2004).
  13. Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 205 (1), 114-122 (2005).
  14. Moller, D. E., Flier, J. S. Insulin resistance–mechanisms, syndromes, and implications. The New England Journal of Medicine. 325 (13), 938-948 (1991).
  15. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  16. Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes. The Journal of Cell Biology. 87 (1), 180-196 (1980).
  17. Satish, L., et al. Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage. BMC Medical Genomics. 8 (41), (2015).
  18. Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. The Journal of Cell Biology. 60 (3), 673-684 (1974).
  19. Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (3), H837-H846 (2010).
  20. Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circulation Research. 99 (8), 861-869 (2006).
  21. Hewett, P. W., Murray, J. C. Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (11), 823-830 (1993).
  22. Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization. Microvascular Research. 46 (1), 89-102 (1993).
  23. Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (4), 325-331 (1993).
  24. Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (105), e53072 (2015).
  25. Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC). Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 101-109 (2015).
  26. Zhou, L., et al. In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis. PLoS One. 10 (2), e0117644 (2015).
  27. Curat, C. A., et al. From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes. Diabetes. 53 (5), 1285-1292 (2004).
  28. Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).
  29. Traktuev, D. O., et al. A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks. Circulation Research. 102 (1), 77-85 (2008).
  30. Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis. Cell Cycle. 11 (15), 2765-2766 (2012).
  31. Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue. Journal of Internal Medicine. 262 (4), 415-421 (2007).
  32. Ong, W. K., et al. Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
  33. Ong, W. K., Sugii, S. Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).
  34. Tchkonia, T., et al. Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots. American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).
  35. van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation. Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).

Play Video

Cite This Article
Haynes, B. A., Huyck, R. W., James, A. J., Carter, M. E., Gaafar, O. U., Day, M., Pinto, A., Dobrian, A. D. Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (137), e57804, doi:10.3791/57804 (2018).

View Video