वसा ऊतक संवहनी progenitors से सफेद और बेज रंग adipocytes के भेदभाव मोटापा में चयापचय सुधार के लिए संभावित भालू । हम एक CD34 के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन + CD31 + endothelial मानव वसा से सेल अलगाव और इन विट्रो विस्तार और सफेद और बेज रंग adipocytes में विभेद के लिए बाद में । कई बहाव आवेदन पर चर्चा कर रहे हैं ।
मोटापा मुख्य रूप से adipocyte अतिवृद्धि के माध्यम से वसा ऊतक के एक व्यापक remodeling के साथ है । अति adipocyte विकास इंसुलिन, स्थानीय हाइपोक्सिया, और सूजन के लिए एक गरीब प्रतिक्रिया में परिणाम । progenitors से कार्यात्मक सफेद adipocytes के भेदभाव उत्तेजक द्वारा, adipocyte जनसंख्या के कट्टरपंथी अतिवृद्धि और रोका जा सकता है, नतीजतन, वसा ऊतक के चयापचय स्वास्थ्य की कमी के साथ साथ सुधार किया जा सकता है सूजन. इसके अलावा, बेज रंग/ब्राउन adipocytes के एक भेदभाव उत्तेजक द्वारा, कुल शरीर ऊर्जा व्यय बढ़ सकता है, वजन घटाने में जिसके परिणामस्वरूप । इस दृष्टिकोण से मोटापा सह रुग्णता जैसे टाइप 2 मधुमेह और हृदय रोग के विकास को रोका जा सकता है ।
यह कागज मानव वसा ऊतक endothelial कोशिकाओं के एक सबसेट से अलगाव, विस्तार, और सफेद और बेज रंग adipocytes के भेदभाव का वर्णन है कि सह CD31 और CD34 मार्करों व्यक्त करते हैं । विधि अपेक्षाकृत सस्ता है और श्रम गहन नहीं है । यह मानव वसा ऊतक और चमड़े के नीचे डिपो के लिए उपयोग की आवश्यकता है नमूना के लिए उपयुक्त है । इस प्रोटोकॉल के लिए, रुग्ण मोटापे से ग्रस्त विषयों से ताजा वसा ऊतक नमूने [बॉडी मास इंडेक्स (बीएमआई) > 35] बैरिएट्रिक सर्जरी प्रक्रियाओं के दौरान एकत्र कर रहे हैं । stromal संवहनी अंश से एक अनुक्रमिक immunoseparation का उपयोग करना, पर्याप्त कोशिकाओं के रूप में छोटे से उत्पादित कर रहे हैं 2 – 3 वसा के जी. इन कोशिकाओं को संस्कृति में 10 से अधिक का विस्तार किया जा सकता है-14 दिन, cryopreserved जा सकता है, और passaging के साथ अपने adipogenic गुणों को बनाए रखने के लिए 5-6 । कोशिकाओं को एक adipogenic कॉकटेल के साथ 14 दिनों के लिए इलाज कर रहे है मानव इंसुलिन और PPARγ एगोनिस्ट-rosiglitazone का एक संयोजन का उपयोग कर ।
इस पद्धति आणविक तंत्र पर अवधारणा प्रयोगों का सबूत प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि वसा endothelial कोशिकाओं में adipogenic प्रतिक्रियाओं ड्राइव, या नई दवाओं है कि adipogenic प्रतिक्रिया में वृद्धि कर सकते है या तो सफेद की ओर निर्देशित या जांच के लिए बेज रंग/भूरा adipocyte विभेद. छोटे चमड़े के नीचे बायोप्सी का उपयोग करना, इस पद्धति बाहर स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है नैदानिक परीक्षण के लिए विषयों को बेज रंग को उत्तेजित करने के उद्देश्य से और मोटापा और सह रुग्णता के उपचार के लिए सफेद adipocytes ।
हाल के सबूत से पता चलता है कि दोनों चूहों में और मनुष्यों में, वसा ऊतक vasculature में रहने वाले कोशिकाओं का एक सबसेट या तो सफेद या बेज रंग में विभेदित किया जा सकता है/ब्राउन adipocytes1,2,3। ऐसी कोशिकाओं का phenotype विवाद का विषय है, endothelial कोशिकाओं के समर्थन सबूत के साथ, चिकनी मांसपेशी/pericyte, या मध्यवर्ती phenotypes4,5,6,7की एक स्पेक्ट्रम । इस कार्यप्रणाली को विकसित करने की गुंजाइश CD34 + CD31 + endothelial कोशिकाओं को मोटे इंसानों से अलग मोटे डिपो से पृथक करने की adipogenic क्षमता का परीक्षण करना था. साहित्य के अन्य अध्ययनों में कुल stromal संवहनी अंश या ज्ञात adipocyte progenitors2,8,9की adipogenic क्षमता पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं । चूंकि वर्तमान में मौजूदा प्रौद्योगिकियों विशेष रूप से दवा वितरण के लिए वसा ऊतक endothelial कोशिकाओं को लक्षित कर सकते हैं10, इस तरह की कोशिकाओं की क्षमता को समझने adipogenic प्रेरण से गुजरना करने के लिए सफेद या बेज रंग adipocytes के लिए महत्वपूर्ण है भविष्य लक्षित चिकित्सा ।
विभिंन समूहों CD31 और CD34 मार्करों के संयोजन के रूप में मानव वसा ऊतक11,12,13से endothelial कोशिकाओं को अलग करने की रिपोर्ट । आमतौर पर, अलगाव दो अनुक्रमिक चरणों और एक सकारात्मक चयन चुंबकीय मोतियों का उपयोग कर का उपयोग किया जाता है । इस रिपोर्ट में, CD31 प्लास्टिक मोतियों के साथ संयुक्त CD34 + चुंबकीय मोतियों का उपयोग immunoseparation इस्तेमाल किया गया था । हम इस तकनीक ठेठ cobblestone endothelial आकृति विज्ञान के संरक्षण के संबंध में अनुक्रमिक चुंबकीय immunoseparation से बेहतर पाया । इसके अलावा, हम पर्याप्त विस्तार और adipogenic प्रेरण के रूप में के रूप में छोटे से शुरू करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं उत्पंन करने में सक्षम थे 1-वसा के 2 जी । चमड़े के नीचे वसा का एक छोटा सा नमूना बायोप्सी बहाव अनुप्रयोगों के लिए कोशिकाओं की आवश्यक मात्रा का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त है । यह पहलू संभावित रूप से महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से अगर इस विधि एक जवाबदेही के लिए मानव विषयों में प्रेरण adipogenic के लिए उपयोग किया जाएगा ।
अंय साहित्य में रिपोर्ट प्रणालियों के विपरीत, इस विधि CD34 + CD31 + कोशिकाओं के adipogenic प्रेरण के लिए केवल दो अवयवों का इस्तेमाल: एक PPARγ एगोनिस्ट — rosiglitazone-और मानव इंसुलिन । महत्वपूर्ण बात, इस्तेमाल किया इंसुलिन की मात्रा में मानव14में घूम पोस्ट-अवशोषण इंसुलिन के सामान्य/ इन विट्रो मेंकोशिकाओं के इंसुलिन के लिए जवाबदेही की डिग्री, एकेटी फास्फारिलीकरण द्वारा मापा, प्रेरण कॉकटेल का जवाब देने की क्षमता के साथ सहसंबंधी नहीं है । दिलचस्प है, इस प्रेरण कॉकटेल और प्रयोगात्मक शर्तों का उपयोग कर, सफेद और बेज रंग/ब्राउन कोशिकाओं का मिश्रण आकार और intracellular लिपिड बूंदों की संख्या और आणविक मार्करों की अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित के रूप में प्राप्त किया गया । यह सरल और लागत प्रभावी उत्तरदाता कोशिकाओं के phenotype के मात्रात्मक मूल्यांकन के साथ प्रेरण प्रोटोकॉल (सफेद बनाम बेज रंग) एजेंटों कि संभवतः विभेदित बेज रंग का संतुलन बदल सकते हैं की एक स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है : white adipocytes.
यह विधि भी मानव वसा ऊतक में संवहनी endothelial progenitors के adipogenesis के अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए एक शोधों दृष्टिकोण प्रदान करता है । इस विशिष्ट अलगाव/भेदभाव तकनीक का प्रयोग, जांचकर्ताओं दुबला और मोटापे से ग्रस्त मनुष्यों में विभिंन वसा डिपो से संवहनी endothelial कोशिकाओं का एक सबसेट में adipogenesis के लिए जिंमेदार विभिंन रास्ते पूछताछ कर सकते हैं ।
इस कागज का ध्यान अलगाव, विस्तार और CD34 + CD31 के adipogenic प्रेरण के लिए एक पद्धति प्रदान करना है + endothelial कोशिकाओं आंत और मानव वसा ऊतक के चमड़े के नीचे डिपो से ।
तरीके से कुतर या मनुष्यों के विभिंन संवहनी बिस…
The authors have nothing to disclose.
लेखक बेकी Marquez, सेंट्रा बैरिएट्रिक केंद्र में नैदानिक समंवयक, रोगी स्क्रीनिंग और सहमति की प्रक्रिया के साथ उसकी सहायता के लिए स्वीकार करना चाहते हैं । इस शोध को R15HL114062 द्वारा ऐंका डी. Dobrian का समर्थन किया गया.
Large Equipment |
|||
Biosafety Cabinet |
Nuaire |
nu-425-400 |
|
Cell Culture Incubator |
Thermo-Fisher Scientific |
800 DH |
|
Water Bath |
Forma Scientific |
2568 |
Reciprocal Shaker |
RT-PCR Machine |
BIO-RAD |
CFX96-C1000 |
|
Electrophoresis Box |
BIO-RAD |
Mini PROTEAN 3 Cell |
|
Transblot Box |
BIO-RAD |
Mini Trans-Blot Cell |
|
Electrophoresis Power Supply |
BIO-RAD |
PowerPac Basic |
|
ELISA Reader |
Molecular Devices |
SpectraMax M5 |
|
Blot Reader |
LI-COR |
Odyssey |
Near Infrared |
Refrigerated Centrifuge |
Eppendorf |
5810 R |
|
Tabletop Centrifuge |
Eppendorf |
MiniSpin Plus |
|
Fluorescent Microscope |
Olympus |
BX50 |
|
Inverted Microscope |
Nikon |
TMS |
|
KRBSS Buffer |
|||
HEPES |
Research Products International |
H75030 |
|
Sodium bicarbonate |
Sigma-Aldrich |
792519 |
|
Calcium chloride dihydrate |
Sigma-Aldrich |
C7902 |
|
Potassium phosphate monobasic |
Sigma-Aldrich |
P5655 |
|
Magnesium sulfate |
Sigma-Aldrich |
M2643 |
|
Sodium chloride |
Sigma-Aldrich |
746398 |
|
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich |
S9638 |
|
Potassium chloride |
Sigma-Aldrich |
P9333 |
|
Glucose |
Acros Organics |
410950010 |
|
Adenosine |
Acros Organics |
164040250 |
|
Bovine Serum Albumin |
GE Healthcare Bio-Sciences |
SH30574.02 |
|
Penicillin/Streptomycin |
Thermo-Fisher Scientific |
15070063 |
|
Tissue Digestion |
|||
20 mL Syringe |
Global Medical |
67-2020 |
|
Nylon Mesh, 250 µm |
Sefar |
03-250/50 |
|
Pipetting Needles |
Popper |
7934 |
|
Fine Scissors |
Fine Science Tools |
14058-11 |
|
Tissue Forceps |
George Tiemann & Co |
160-20 |
|
Collagenase, Type I |
Worthington Biochemical |
LS004196 |
|
Petri Dishes, 100 mm |
USA Scientific |
5666-4160 |
TC Treated |
Eppendorf Tubes, 1.5 mL |
USA Scientific |
1615-5500 |
|
Conical Tubes, 15 mL |
Nest Scientific |
601052 |
|
Conical Tubes, 50 mL |
Nalgene |
3119-0050 |
|
Scintillation Vials |
Kimble |
74505-20 |
Tissue Dicing |
Cell Isolation |
|||
Cellometer |
Nexcelom |
Auto 2000 |
|
Cellometer Slides |
Nexcelom |
CHT4-SD100-002 |
|
Cellometer Viability Stain |
Nexcelom |
CS2-0106-5mL |
Acridine Orange/Propidium Iodine |
Anti-CD34 Magnetic Beads |
StemCell Technologies |
18056 |
Kit |
EasySep Magnet |
StemCell Technologies |
18000 |
|
Anti-CD31 Plastic Beads |
pluriSelect USA |
19-03100-10 |
|
pluriSelect 10x Wash Buffer |
pluriSelect USA |
60-00080-10 |
|
pluriSelect Connector Ring |
pluriSelect USA |
41-50000-03 |
|
pluriSelect Detachment Buffer |
pluriSelect USA |
60-00046-12 |
|
pluriSelect Incubation Buffer |
pluriSelect USA |
60-00060-12 |
|
pluriSelect S Cell Strainer |
pluriSelect USA |
43-50030-03 |
|
Cell Culture |
|||
6-well Plates |
USA Scientific |
CC7682-7506 |
TC Treated |
4-well chambered slides |
Corning Life Sciences |
354559 |
Fibronectin coated |
4-well chambered slides |
Thermo-Fisher Scientific |
154526PK |
Uncoated glass |
Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC) |
Sciencell Research Laboratories |
7200 |
Primary cell line |
Endothelial Cell Media (ECM) |
ScienCell Research Laboratories |
1001 |
Complete Kit |
DMEM/F12 Basal Media |
Thermo-Fisher Scientific |
11320082 |
|
Fetal Bovine Serum (FBS) |
Rocky Mountain Biologicals |
FBS-BBT |
|
Insulin |
Lilly |
U-100 |
Humalog |
Rosiglitazone |
Sigma-Aldrich |
R2408 |
|
Cell Analysis |
|||
Oil Red O Dye |
Sigma-Aldrich |
O0625 |
Prepared in isopropanol |
96 well plates |
USA Scientific |
1837-9600 |
|
96 well PCR plates |
Genesee Scientific |
24-300 |
|
RNA Extraction |
Zymo Research |
R2072 |
Kit |
cDNA Synthesis |
BIO-RAD |
1708841 |
Supermix |
JumpStart PCR Polymerase |
Sigma-Aldrich |
D9307-250UN |
Hot start, with PCR Buffer N |
Magnesium Chloride Solution |
Sigma-Aldrich |
M8787-5ML |
3 mM final in PCR reaction |
dNTPs |
Promega |
U1515 |
|
TaqMan AdipoQ |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00605917_m1 |
|
TaqMan CIDEA |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00154455_m1 |
|
TaqMan RPL27 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs03044961_g1 |
|
TaqMan UCP1 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00222453_m1 |
|
BCA Assay |
Sigma-Aldrich |
QPBCA-1KT |
Kit |
Bis-acrylamide |
BIO-RAD |
1610146 |
40% stock solution |
Ammonium Persulfate |
BIO-RAD |
1610700 |
|
TEMED |
BIO-RAD |
1610800 |
|
Tris |
Sigma-Aldrich |
T1503 |
|
Glycine |
BIO-RAD |
1610718 |
|
Sodium Dodecal Sulfate |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
EDTA |
Fisher Scientific |
S311-100 |
|
Bromophenol Blue |
Sigma-Aldrich |
B8026 |
|
Blot Membrane |
EMD Millipore |
IPFL00010 |
|
Methanol |
Fisher Scientific |
A452-SK4 |
|
Odyssey Blocking Buffer, Tris |
LI-COR |
927-50000 |
|
Anti-AKT antibody |
Cell Signaling Technology |
2920S |
Mouse monoclonal |
Anti-pAKT antibody |
Cell Signaling Technology |
9271S |
Rabbit polyclonal |
Anti-UCP1 antibody |
Abcam |
ab10983 |
Rabbit polyclonal |
Anti-Mouse IgG antibody |
LI-COR |
926-68070 |
Goat Polyclonal, IRDye 680RD |
Anti-Rabbit IgG antibody |
LI-COR |
926-32211 |
Goat Polyclonal, IRDye 800CW |
Anti-Rabbit IgG antibody |
Jackson ImmunoResearch |
111-025-003 |
Goat Polyclonal, TRITC |
Phosphate Buffer Saline |
Thermo-Fisher Scientific |
10010049 |
|
37% Formaldehyde Solution |
Electron Microscopy Sciences |
15686 |
4% solution for cell fixation |
Normal Goat Serum |
Vector Laboratories |
S-1000 |
10% blocking solution |
Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
X-100 |
0.1% permeabilization solution |
DAPI |
Thermo-Fisher Scientific |
D1306 |
|
Calcein AM |
Thermo-Fisher Scientific |
65-0853-39 |
Cell fluorescent visualization |
Matrigel Basement Membrane Matrix |
Corning Life Sciences |
356231 |
Growth factor reduced |
DiI labeled Acetylated LDL |
Thermo-Fisher Scientific |
L3484 |