Differensiering av hvitt og beige adipocytter fra fettvev vaskulær progenitors bærer metabolske forbedringspotensial i fedme. Vi beskriver protokoller for en CD34 + CD31 + endothelial celle isolasjon fra menneskelige fat og en senere i vitro ekspansjon og differensiering i hvitt og beige adipocytter. Flere nedstrøms programmer diskuteres.
Fedme er ledsaget av en omfattende ombygging av fettvev hovedsakelig via adipocyte hypertrofi. Ekstrem adipocyte vekst resulterer i en dårlig respons på insulin, lokale hypoksi og betennelser. Ved å stimulere differensiering av funksjonelle hvite adipocytter fra progenitors, radikale hypertrofi av befolkningen adipocyte kan forebygges og følgelig fettvev metabolske helse kan forbedres med en reduksjon av betennelse. Også ved å stimulere en differensiering av beige/brun adipocytter, kan av hele kroppen energi utgiftene økes resulterer i vekttap. Denne tilnærmingen kan hindre utvikling av fedme Co-morbidities som type 2 diabetes og hjerte-og karsykdommer.
Dette dokumentet beskriver isolasjon, utvidelse og differensiering av hvitt og beige adipocytter fra et delsett av menneskelig fettvev endotelceller som co uttrykker markørene CD31 og CD34. Metoden er relativt billig og er ikke arbeidskrevende. Det krever tilgang til menneskelig fettvev og underhud depot er egnet for prøvetaking. For denne protokollen, frisk fettvev prøver sykelig overvektige fag [kroppsmasseindeks (BMI) > 35] er samlet under bariatric kirurgi prosedyrer. Bruker en sekvensiell immunoseparation fra pancreatic, produseres nok celler fra så lite som 2-3 g av fett. Disse cellene kan utvides i kultur over 10-14 dager, kan være cryopreserved og beholde sine adipogenic egenskaper med passaging opp til passasjen 5-6. Cellene behandles i 14 dager med en adipogenic cocktail ved hjelp av en kombinasjon av menneskelig insulin og PPARγ agonist-rosiglitazon.
Denne metoden kan brukes for å få bevis på konseptet eksperimenter på molekylære mekanismer som driver adipogenic svar i adipose endotelceller eller screening nye stoffer som kan forbedre adipogenic svar gjorde enten mot hvit eller beige/brun adipocyte differensiering. Bruker små subkutan biopsier, kan denne metoden brukes til å sile ut ikke-responder fag for kliniske forsøk å stimulere beige/brun og hvit adipocytter for behandling av fedme og Co-morbidities.
Nyere bevis viser at både i mus og hos mennesker, et delsett av cellene er bosatt i fettvev blodkar kan differensieres til enten hvitt eller beige/brun adipocytter1,2,3. Fenotypen av slike celler er omstridt, med bevis som støtter endotelceller, glatt muskel/pericyte eller et spekter av mellomliggende fenotyper4,5,6,7. Omfanget av utvikle denne metoden var å teste adipogenic potensialet i CD34 + CD31 + endotelceller isolert fra ulike fett depoter fra overvektige mennesker. Andre studier i litteraturen fokuserer på adipogenic potensielle av den totale pancreatic eller kjente adipocyte progenitors2,8,9. Siden eksisterende teknologier kan målrette spesielt fettvev endotelceller for stoffet levering10, er forstå potensialet i slike celler gjennomgå adipogenic induksjon mot hvit eller beige adipocytter viktig for fremtidige målrettet terapi.
Ulike grupper rapportert kombinasjonen av CD31 og CD34 markører som surrogater isolere endotelceller menneskelige fettvev11,12,13. Vanligvis utføres isolasjon med to sammenhengende trinn og en positiv utvalg med magnetiske perler. I denne rapporten, ble immunoseparation med CD34 + magnetiske perler kombinert med CD31 plast perler benyttet. Vi fant denne teknikken bedre enn den sekvensielle magnetiske immunoseparation med hensyn til bevaring av typiske brosteinsbelagte endothelial morfologi. Også var vi kunne generere nok celler kreves for ekspansjon og adipogenic induksjon starter fra så lite som 1-2 g av fett. En liten prøve biopsy av subkutant fett er nok til å produsere det nødvendige antallet celler for nedstrøms programmer. Dette aspektet er potensielt viktig, spesielt hvis denne metoden vil bli benyttet for screening for en respons til adipogenic induksjon i mennesker.
I motsetning til andre systemer rapportert i litteraturen, benytter denne metoden bare to ingredienser for adipogenic induksjon av CD34 + CD31 + celler: en PPARγ agonist-rosiglitazon- og menneskelige insulin. Viktigere, ligger hvor mye insulin brukes innenfor normal/høy av sirkulerende post-absorptive insulin i mennesker14. Graden av respons på insulin på celler i vitro, målt ved Akt fosforylering, samsvarer ikke med deres evne til å svare på induksjon cocktail. Interessant, bruker denne induksjon cocktail og eksperimentelle forhold, en blanding av hvite og beige/brun celler ble innhentet etter størrelse og antall intracellulær lipid dråper og uttrykket av molekylære markører. Denne enkel og kostnadseffektiv induksjon protokollen sammen med kvantitative evalueringen av fenotypen av responder cellene (hvitt og beige) gir en screening av agenter som potensielt kan endre balansen av differensiert beige : hvit adipocytter.
Denne metoden gir også en translational tilnærming for å forstå de underliggende mekanismene adipogenesis av vaskulær endotelial progenitors i menneskelig fettvev. Bruker denne bestemte isolasjon/differensiering teknikken, kan etterforskere forhøre ulike veier ansvarlig for adipogenesis i et delsett av vaskulær endotelceller fra ulike fett depoter i mager og overvektige mennesker.
Fokus for denne utredningen er å gi en metodikk for isolasjon, utvidelse og adipogenic induksjon av CD34 + CD31 + endotelceller fra visceral og underhud depoter av menneskelig fettvev.
Metoder er rapportert for isolering av endotelceller fra ulike vaskulær senger til mus eller mennesker som involverer primært teknikker med CD31 antistoffer fluorescently merket eller koblet til magnetiske perler18, 19 , 2…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å erkjenne Becky Marquez, klinisk koordinator på Sentara Bariatric Center, for henne hjelp med prosessen med pasienten screening og samtykke. Denne forskningen ble støttet av R15HL114062 til Anca D. Dobrian.
Large Equipment |
|||
Biosafety Cabinet |
Nuaire |
nu-425-400 |
|
Cell Culture Incubator |
Thermo-Fisher Scientific |
800 DH |
|
Water Bath |
Forma Scientific |
2568 |
Reciprocal Shaker |
RT-PCR Machine |
BIO-RAD |
CFX96-C1000 |
|
Electrophoresis Box |
BIO-RAD |
Mini PROTEAN 3 Cell |
|
Transblot Box |
BIO-RAD |
Mini Trans-Blot Cell |
|
Electrophoresis Power Supply |
BIO-RAD |
PowerPac Basic |
|
ELISA Reader |
Molecular Devices |
SpectraMax M5 |
|
Blot Reader |
LI-COR |
Odyssey |
Near Infrared |
Refrigerated Centrifuge |
Eppendorf |
5810 R |
|
Tabletop Centrifuge |
Eppendorf |
MiniSpin Plus |
|
Fluorescent Microscope |
Olympus |
BX50 |
|
Inverted Microscope |
Nikon |
TMS |
|
KRBSS Buffer |
|||
HEPES |
Research Products International |
H75030 |
|
Sodium bicarbonate |
Sigma-Aldrich |
792519 |
|
Calcium chloride dihydrate |
Sigma-Aldrich |
C7902 |
|
Potassium phosphate monobasic |
Sigma-Aldrich |
P5655 |
|
Magnesium sulfate |
Sigma-Aldrich |
M2643 |
|
Sodium chloride |
Sigma-Aldrich |
746398 |
|
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich |
S9638 |
|
Potassium chloride |
Sigma-Aldrich |
P9333 |
|
Glucose |
Acros Organics |
410950010 |
|
Adenosine |
Acros Organics |
164040250 |
|
Bovine Serum Albumin |
GE Healthcare Bio-Sciences |
SH30574.02 |
|
Penicillin/Streptomycin |
Thermo-Fisher Scientific |
15070063 |
|
Tissue Digestion |
|||
20 mL Syringe |
Global Medical |
67-2020 |
|
Nylon Mesh, 250 µm |
Sefar |
03-250/50 |
|
Pipetting Needles |
Popper |
7934 |
|
Fine Scissors |
Fine Science Tools |
14058-11 |
|
Tissue Forceps |
George Tiemann & Co |
160-20 |
|
Collagenase, Type I |
Worthington Biochemical |
LS004196 |
|
Petri Dishes, 100 mm |
USA Scientific |
5666-4160 |
TC Treated |
Eppendorf Tubes, 1.5 mL |
USA Scientific |
1615-5500 |
|
Conical Tubes, 15 mL |
Nest Scientific |
601052 |
|
Conical Tubes, 50 mL |
Nalgene |
3119-0050 |
|
Scintillation Vials |
Kimble |
74505-20 |
Tissue Dicing |
Cell Isolation |
|||
Cellometer |
Nexcelom |
Auto 2000 |
|
Cellometer Slides |
Nexcelom |
CHT4-SD100-002 |
|
Cellometer Viability Stain |
Nexcelom |
CS2-0106-5mL |
Acridine Orange/Propidium Iodine |
Anti-CD34 Magnetic Beads |
StemCell Technologies |
18056 |
Kit |
EasySep Magnet |
StemCell Technologies |
18000 |
|
Anti-CD31 Plastic Beads |
pluriSelect USA |
19-03100-10 |
|
pluriSelect 10x Wash Buffer |
pluriSelect USA |
60-00080-10 |
|
pluriSelect Connector Ring |
pluriSelect USA |
41-50000-03 |
|
pluriSelect Detachment Buffer |
pluriSelect USA |
60-00046-12 |
|
pluriSelect Incubation Buffer |
pluriSelect USA |
60-00060-12 |
|
pluriSelect S Cell Strainer |
pluriSelect USA |
43-50030-03 |
|
Cell Culture |
|||
6-well Plates |
USA Scientific |
CC7682-7506 |
TC Treated |
4-well chambered slides |
Corning Life Sciences |
354559 |
Fibronectin coated |
4-well chambered slides |
Thermo-Fisher Scientific |
154526PK |
Uncoated glass |
Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC) |
Sciencell Research Laboratories |
7200 |
Primary cell line |
Endothelial Cell Media (ECM) |
ScienCell Research Laboratories |
1001 |
Complete Kit |
DMEM/F12 Basal Media |
Thermo-Fisher Scientific |
11320082 |
|
Fetal Bovine Serum (FBS) |
Rocky Mountain Biologicals |
FBS-BBT |
|
Insulin |
Lilly |
U-100 |
Humalog |
Rosiglitazone |
Sigma-Aldrich |
R2408 |
|
Cell Analysis |
|||
Oil Red O Dye |
Sigma-Aldrich |
O0625 |
Prepared in isopropanol |
96 well plates |
USA Scientific |
1837-9600 |
|
96 well PCR plates |
Genesee Scientific |
24-300 |
|
RNA Extraction |
Zymo Research |
R2072 |
Kit |
cDNA Synthesis |
BIO-RAD |
1708841 |
Supermix |
JumpStart PCR Polymerase |
Sigma-Aldrich |
D9307-250UN |
Hot start, with PCR Buffer N |
Magnesium Chloride Solution |
Sigma-Aldrich |
M8787-5ML |
3 mM final in PCR reaction |
dNTPs |
Promega |
U1515 |
|
TaqMan AdipoQ |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00605917_m1 |
|
TaqMan CIDEA |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00154455_m1 |
|
TaqMan RPL27 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs03044961_g1 |
|
TaqMan UCP1 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00222453_m1 |
|
BCA Assay |
Sigma-Aldrich |
QPBCA-1KT |
Kit |
Bis-acrylamide |
BIO-RAD |
1610146 |
40% stock solution |
Ammonium Persulfate |
BIO-RAD |
1610700 |
|
TEMED |
BIO-RAD |
1610800 |
|
Tris |
Sigma-Aldrich |
T1503 |
|
Glycine |
BIO-RAD |
1610718 |
|
Sodium Dodecal Sulfate |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
EDTA |
Fisher Scientific |
S311-100 |
|
Bromophenol Blue |
Sigma-Aldrich |
B8026 |
|
Blot Membrane |
EMD Millipore |
IPFL00010 |
|
Methanol |
Fisher Scientific |
A452-SK4 |
|
Odyssey Blocking Buffer, Tris |
LI-COR |
927-50000 |
|
Anti-AKT antibody |
Cell Signaling Technology |
2920S |
Mouse monoclonal |
Anti-pAKT antibody |
Cell Signaling Technology |
9271S |
Rabbit polyclonal |
Anti-UCP1 antibody |
Abcam |
ab10983 |
Rabbit polyclonal |
Anti-Mouse IgG antibody |
LI-COR |
926-68070 |
Goat Polyclonal, IRDye 680RD |
Anti-Rabbit IgG antibody |
LI-COR |
926-32211 |
Goat Polyclonal, IRDye 800CW |
Anti-Rabbit IgG antibody |
Jackson ImmunoResearch |
111-025-003 |
Goat Polyclonal, TRITC |
Phosphate Buffer Saline |
Thermo-Fisher Scientific |
10010049 |
|
37% Formaldehyde Solution |
Electron Microscopy Sciences |
15686 |
4% solution for cell fixation |
Normal Goat Serum |
Vector Laboratories |
S-1000 |
10% blocking solution |
Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
X-100 |
0.1% permeabilization solution |
DAPI |
Thermo-Fisher Scientific |
D1306 |
|
Calcein AM |
Thermo-Fisher Scientific |
65-0853-39 |
Cell fluorescent visualization |
Matrigel Basement Membrane Matrix |
Corning Life Sciences |
356231 |
Growth factor reduced |
DiI labeled Acetylated LDL |
Thermo-Fisher Scientific |
L3484 |