Summary

Isolation, Expansion und Adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelial Zellen aus menschlichen Omentalis und subkutanem Fettgewebe

Published: July 17, 2018
doi:

Summary

Die Unterscheidung von weiß und Beige Adipozyten aus Fettgewebe vaskulären Stammeltern trägt metabolische Verbesserungspotenzial bei Adipositas. Protokolle beschrieben für eine CD34 + CD31 + Endothelzellen losgelöst von menschlichen Fett und für eine spätere in-vitro- Erweiterung und Differenzierung in weiß und Beige Adipozyten. Mehrere downstream-Anwendungen werden diskutiert.

Abstract

Adipositas wird begleitet von einer umfangreichen Umbau des Fettgewebes in erster Linie über Adipocyte Hypertrophie. Extreme Adipocyte Wachstum führt ein schlechtes ansprechen auf Insulin, lokale Hypoxie und Entzündungen. Durch die Stimulierung der Differenzierung der funktionalen weiße Fettzellen aus Vorläuferzellen, radikale Hypertrophie der Adipocyte Bevölkerung verhindert werden kann und infolgedessen die metabolische Gesundheit des Fettgewebes verbessert werden kann, sowie eine Reduzierung der die Entzündung. Auch kann durch die Stimulierung einer Differenzierung der Adipozyten Beige/braun, der Ganzkörper-Energieaufwand erhöht werden, was zu Gewichtsverlust. Dieser Ansatz könnte die Entwicklung von Fettleibigkeit Komorbiditäten wie Diabetes Typ 2 und Herz-Kreislauf-Erkrankungen verhindern.

Dieses Papier beschreibt die Isolation, Erweiterung und Differenzierung der weiße und Beige Adipozyten aus einer Teilmenge von menschlichen Fettgewebe Endothelzellen, die die CD31 und CD34-Marker Co Ausdrücken. Die Methode ist relativ billig und nicht arbeitsintensiv. Es erfordert Zugang zu menschlichen Fettgewebe und das subkutane Depot eignet sich für die Probenahme. Für dieses Protokoll frisches Fettgewebe Proben aus krankhaft übergewichtigen Probanden [Body-mass-Index (BMI) > 35] werden während der bariatrischen Chirurgie Verfahren gesammelt. Mit einem sequentiellen Immunoseparation von den Stromazellen vaskulären Bruch, sind genügend Zellen von weniger als 2 – 3 g Fett hergestellt. Diese Zellen in Kultur über 10 – 14 Tage erweitert werden können, können kryokonserviert werden und behalten ihre Eigenschaften adipogenen mit bis zu 5 – 6 Durchgang passagierung. Die Zellen werden für 14 Tage mit einer adipogenen cocktail mit einer Kombination von Humaninsulin und PPARγ-Agonisten-Rosiglitazon behandelt.

Diese Methode kann verwendet werden, für den Erhalt der Nachweis der Konzept-Experimente an molekularen Mechanismen, die adipogenen Antworten in Endothelzellen Fettzellen zu fahren, oder für das screening von neuer Medikamenten, die die adipogenen verbessern können Antwort geleitet, entweder in Richtung weiß oder Beige/braun Adipocyte Unterscheidung. Mit kleinen subkutanen Biopsien, kann diese Methode zur Bildschirm aus non-Responder Probanden für klinische Studien zielte darauf ab, Beige/braun und weiße Fettzellen für die Behandlung von Adipositas und Komorbiditäten zu stimulieren.

Introduction

Aktuelle Belege dafür, dass sowohl beim Menschen als auch bei Mäusen eine Teilmenge von Zellen, die ihren Wohnsitz in das Fettgewebe Gefäßsystem in entweder weiß oder Beige/braunen Fettzellen1,2,3unterschieden werden kann. Der Phänotyp dieser Zellen ist ein Thema der Kontroverse, mit Nachweise für Endothelzellen, glatte Muskulatur/Pericyte oder ein Spektrum von intermediate Phänotypen4,5,6,7. Der Umfang der Ausarbeitung dieser Methode war, das adipogenen Potenzial von CD34 + CD31 + Endothelzellen aus verschiedenen Fettdepots von übergewichtigen Menschen isoliert zu testen. Andere Studien in der Literatur konzentrieren sich auf das Potenzial der gesamten Stromazellen vaskulären Fraktion oder der bekannten Adipocyte Stammväter2,8,9adipogenen. Da derzeit vorhandene Technologien speziell Fettgewebe Endothelzellen für Drug Delivery10ausrichten können, ist Verständnis das Potenzial solcher Zellen adipogenen unterziehen Induktion auf weißem oder beigem Adipozyten wichtig für zukünftige gezielte Therapien.

Verschiedene Gruppen berichteten die Kombination von CD31 und CD34-Marker als Surrogate, endotheliale Zellen aus menschlichen Fettgewebe11,12,13zu isolieren. In der Regel erfolgt die Isolierung mit zwei aufeinander folgenden Schritten und eine positive Selektion mit magnetischen Beads. In diesem Bericht wurde Immunoseparation mit CD34 + magnetische Beads mit Plastikperlen CD31 kombiniert eingesetzt. Wir fanden diese Technik besser als die sequentielle magnetische Immunoseparation in Bezug auf die Erhaltung der typischen Kopfsteinpflaster endotheliale Morphologie. Darüber hinaus konnten wir erzeugen genügend Zellen für die Expansion und adipogenen Induktion ab weniger als 1 – 2 g Fett benötigt. Eine kleine Probe-Biopsie des subkutanen Fettgewebes ist genug, um die benötigte Menge an Zellen für downstream-Anwendungen zu produzieren. Dieser Aspekt ist potentiell wichtig, insbesondere dann, wenn diese Methode für das Screening für eine Reaktion auf adipogenen Induktion an Probanden genutzt wird.

Im Gegensatz zu anderen Systemen, die in der Literatur beschrieben, nutzt diese Methode nur zwei Zutaten zur adipogenen Einarbeitung von CD34 + CD31 + Zellen: einem PPARγ-Agonisten — Rosiglitazon – und Humaninsulin. Wichtig ist, fällt die Menge an Insulin verwendet in Normal/Hochton des zirkulierenden post-absorptive Insulin in Menschen14. Der Grad der Ansprechbarkeit auf Insulin von den Zellen in Vitro, gemessen durch Phosphorylierung von Akt, korreliert nicht mit ihrer Fähigkeit zur Reaktion auf die Induktion cocktail. Interessanterweise mit diesem Induktion cocktail und experimentellen Bedingungen, eine Mischung aus weiß und Beige/braunen Zellen stammen wie von der Größe und Anzahl der intrazellulären Lipid Tröpfchen und den Ausdruck von molekularen Markern bestimmt. Dieses einfache und kostengünstige Induktion Protokoll zusammen mit der quantitativen Erfassung des Phänotyps der Responder Zellen (weiße vs. Beige) ermöglicht ein Screening der Agents, die potenziell das Gleichgewicht der differenzierten Beige verändern können : weiße Fettzellen.

Diese Methode bietet auch einen translationalen Ansatz für das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der angereizte des vaskulären endothelialen Vorläuferzellen im menschlichen Fettgewebe. Mit dieser speziellen Isolierung/Differenzierung Technik können Ermittler Verhören verantwortlich für angereizte in eine Teilmenge der vaskulären endothelialen Zellen aus verschiedenen Fettdepots in schlanke und übergewichtige Menschen verschiedene Wege.

Protocol

Das institutionelle Review Board Committee an der Eastern Virginia Medical School genehmigte Forschung und Sammlung von menschlichen Fettgewebe Proben in der Studie verwendet. Informierter Zustimmung wurde von den Patienten gesammelt. 1. Vorbereitung der Puffer, Medien und Instrumente Bereiten Sie eine Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered Lösung (KRBBS): 135 mM Natriumchlorid, Kaliumchlorid 5 mM, 1 mM-Magnesium-Sulfat, 0,4 mM Kalium Phosphat Diabas-, 5,5 mM Glukose, 1 mM Adenosin, 0,01…

Representative Results

Unser Protokoll bezweckt eine in-vitro- Ansatz zur adipogenen Potenzial von CD34 + CD31 + vaskuläre Zellen aus verschiedenen Depots von menschlichen Fettgewebe zu bestimmen. Abbildung 1Azeigt ein vereinfachtes Flussdiagramm-Diagramm. Der erste Schritt durch eine positive Selektion von CD34 Ausdruck Zellen führt zu > 95 % CD34 + Zellen in der Bevölkerung der frisch isolierten Zellen (Abbildung 1A). Wichtiger ist, ist d…

Discussion

Im Mittelpunkt dieses Papiers ist es, eine Methodik für die Isolierung, Expansion und adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelzellen von viszeralen und subkutanen Depots von menschlichen Fettgewebe zur Verfügung zu stellen.

Methoden sind berichtet worden, für die Isolierung von Endothelzellen aus verschiedenen vaskulären Betten von Nagetieren oder Menschen, bei denen in erster Linie Techniken mit CD31 Antikörper eindringmittel beschriftet oder gekoppelt mit magnetischen Beads<sup c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren wollen Becky Marquez, der klinischen Koordinator am Sentara Bariatrisch Zentrum, für ihre Hilfe mit dem Prozess der Patient screening und Zustimmung bestätigen. Diese Forschung wurde durch R15HL114062, Anca D. Dobrian unterstützt.

Materials

Large Equipment

Biosafety Cabinet

Nuaire

nu-425-400

Cell Culture Incubator

Thermo-Fisher Scientific

800 DH

Water Bath

Forma Scientific

2568

Reciprocal Shaker

RT-PCR Machine

BIO-RAD

CFX96-C1000

Electrophoresis Box

BIO-RAD

Mini PROTEAN 3 Cell

Transblot Box

BIO-RAD

Mini Trans-Blot Cell

Electrophoresis Power Supply

BIO-RAD

PowerPac Basic

ELISA Reader

Molecular Devices

SpectraMax M5

Blot Reader

LI-COR

Odyssey

Near Infrared

Refrigerated Centrifuge

Eppendorf

5810 R

Tabletop Centrifuge

Eppendorf

MiniSpin Plus

Fluorescent Microscope

Olympus

BX50

Inverted Microscope

Nikon

TMS

KRBSS Buffer

HEPES

Research Products International

H75030

Sodium bicarbonate

Sigma-Aldrich

792519

Calcium chloride dihydrate

Sigma-Aldrich

C7902

Potassium phosphate monobasic

Sigma-Aldrich

P5655

Magnesium sulfate

Sigma-Aldrich

M2643

Sodium chloride

Sigma-Aldrich

746398

Sodium phosphate monobasic monohydrate

Sigma-Aldrich

S9638

Potassium chloride

Sigma-Aldrich

P9333

Glucose

Acros Organics

410950010

Adenosine

Acros Organics

164040250

Bovine Serum Albumin

GE Healthcare Bio-Sciences

SH30574.02

Penicillin/Streptomycin

Thermo-Fisher Scientific

15070063

Tissue Digestion

20 mL Syringe

Global Medical

67-2020

Nylon Mesh, 250 µm

Sefar

03-250/50

Pipetting Needles

Popper

7934

Fine Scissors

Fine Science Tools

14058-11

Tissue Forceps

George Tiemann & Co

160-20

Collagenase, Type I

Worthington Biochemical

LS004196

Petri Dishes, 100 mm

USA Scientific

5666-4160

TC Treated

Eppendorf Tubes, 1.5 mL

USA Scientific

1615-5500

Conical Tubes, 15 mL

Nest Scientific

601052

Conical Tubes, 50 mL

Nalgene

3119-0050

Scintillation Vials

Kimble

74505-20

Tissue Dicing

Cell Isolation

Cellometer

Nexcelom

Auto 2000

Cellometer Slides

Nexcelom

CHT4-SD100-002

Cellometer Viability Stain

Nexcelom

CS2-0106-5mL

Acridine Orange/Propidium Iodine

Anti-CD34 Magnetic Beads

StemCell Technologies

18056

Kit

EasySep Magnet

StemCell Technologies

18000

Anti-CD31 Plastic Beads

pluriSelect USA

19-03100-10

pluriSelect 10x Wash Buffer

pluriSelect USA

60-00080-10

pluriSelect Connector Ring

pluriSelect USA

41-50000-03

pluriSelect Detachment Buffer

pluriSelect USA

60-00046-12

pluriSelect Incubation Buffer

pluriSelect USA

60-00060-12

pluriSelect S Cell Strainer

pluriSelect USA

43-50030-03

Cell Culture

6-well Plates

USA Scientific

CC7682-7506

TC Treated

4-well chambered slides

Corning Life Sciences

354559

Fibronectin coated

4-well chambered slides

Thermo-Fisher Scientific

154526PK

Uncoated glass

Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC)

Sciencell Research Laboratories

7200

Primary cell line

Endothelial Cell Media (ECM)

ScienCell Research Laboratories

1001

Complete Kit

DMEM/F12 Basal Media

Thermo-Fisher Scientific

11320082

Fetal Bovine Serum (FBS)

Rocky Mountain Biologicals

FBS-BBT

Insulin

Lilly

U-100

Humalog

Rosiglitazone

Sigma-Aldrich

R2408

Cell Analysis

Oil Red O Dye

Sigma-Aldrich

O0625

Prepared in isopropanol

96 well plates

USA Scientific

1837-9600

96 well PCR plates

Genesee Scientific

24-300

RNA Extraction

Zymo Research

R2072

Kit

cDNA Synthesis

BIO-RAD

1708841

Supermix

JumpStart PCR Polymerase

Sigma-Aldrich

D9307-250UN

Hot start, with PCR Buffer N

Magnesium Chloride Solution

Sigma-Aldrich

M8787-5ML

3 mM final in PCR reaction

dNTPs

Promega

U1515

TaqMan AdipoQ

Thermo-Fisher Scientific

Hs00605917_m1

TaqMan CIDEA

Thermo-Fisher Scientific

Hs00154455_m1

TaqMan RPL27

Thermo-Fisher Scientific

Hs03044961_g1

TaqMan UCP1

Thermo-Fisher Scientific

Hs00222453_m1

BCA Assay

Sigma-Aldrich

QPBCA-1KT

Kit

Bis-acrylamide

BIO-RAD

1610146

40% stock solution

Ammonium Persulfate

BIO-RAD

1610700

TEMED

BIO-RAD

1610800

Tris

Sigma-Aldrich

T1503

Glycine

BIO-RAD

1610718

Sodium Dodecal Sulfate

Sigma-Aldrich

L3771

EDTA

Fisher Scientific

S311-100

Bromophenol Blue

Sigma-Aldrich

B8026

Blot Membrane

EMD Millipore

IPFL00010

Methanol

Fisher Scientific

A452-SK4

Odyssey Blocking Buffer, Tris

LI-COR

927-50000

Anti-AKT antibody

Cell Signaling Technology

2920S

Mouse monoclonal

Anti-pAKT antibody

Cell Signaling Technology

9271S

Rabbit polyclonal

Anti-UCP1 antibody

Abcam

ab10983

Rabbit polyclonal

Anti-Mouse IgG antibody

LI-COR

926-68070

Goat Polyclonal, IRDye 680RD

Anti-Rabbit IgG antibody

LI-COR

926-32211

Goat Polyclonal, IRDye 800CW

Anti-Rabbit IgG antibody

Jackson ImmunoResearch

111-025-003

Goat Polyclonal, TRITC

Phosphate Buffer Saline

Thermo-Fisher Scientific

10010049

37% Formaldehyde Solution

Electron Microscopy Sciences

15686

4% solution for cell fixation

Normal Goat Serum

Vector Laboratories

S-1000

10% blocking solution

Triton X-100

Sigma-Aldrich

X-100

0.1% permeabilization solution

DAPI

Thermo-Fisher Scientific

D1306

Calcein AM

Thermo-Fisher Scientific

65-0853-39

Cell fluorescent visualization

Matrigel Basement Membrane Matrix

Corning Life Sciences

356231

Growth factor reduced

DiI labeled Acetylated LDL

Thermo-Fisher Scientific

L3484

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Haynes, B. A., Huyck, R. W., James, A. J., Carter, M. E., Gaafar, O. U., Day, M., Pinto, A., Dobrian, A. D. Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (137), e57804, doi:10.3791/57804 (2018).

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