Isolasjon, utvidelse og Adipogenic induksjon av CD34 + CD31 + endotelceller fra menneskelig Omental og underhud fettvev

Summary

Differensiering av hvitt og beige adipocytter fra fettvev vaskulær progenitors bærer metabolske forbedringspotensial i fedme. Vi beskriver protokoller for en CD34 + CD31 + endothelial celle isolasjon fra menneskelige fat og en senere i vitro ekspansjon og differensiering i hvitt og beige adipocytter. Flere nedstrøms programmer diskuteres.

Abstract

Fedme er ledsaget av en omfattende ombygging av fettvev hovedsakelig via adipocyte hypertrofi. Ekstrem adipocyte vekst resulterer i en dårlig respons på insulin, lokale hypoksi og betennelser. Ved å stimulere differensiering av funksjonelle hvite adipocytter fra progenitors, radikale hypertrofi av befolkningen adipocyte kan forebygges og følgelig fettvev metabolske helse kan forbedres med en reduksjon av betennelse. Også ved å stimulere en differensiering av beige/brun adipocytter, kan av hele kroppen energi utgiftene økes resulterer i vekttap. Denne tilnærmingen kan hindre utvikling av fedme Co-morbidities som type 2 diabetes og hjerte-og karsykdommer.

Dette dokumentet beskriver isolasjon, utvidelse og differensiering av hvitt og beige adipocytter fra et delsett av menneskelig fettvev endotelceller som co uttrykker markørene CD31 og CD34. Metoden er relativt billig og er ikke arbeidskrevende. Det krever tilgang til menneskelig fettvev og underhud depot er egnet for prøvetaking. For denne protokollen, frisk fettvev prøver sykelig overvektige fag [kroppsmasseindeks (BMI) > 35] er samlet under bariatric kirurgi prosedyrer. Bruker en sekvensiell immunoseparation fra pancreatic, produseres nok celler fra så lite som 2-3 g av fett. Disse cellene kan utvides i kultur over 10-14 dager, kan være cryopreserved og beholde sine adipogenic egenskaper med passaging opp til passasjen 5-6. Cellene behandles i 14 dager med en adipogenic cocktail ved hjelp av en kombinasjon av menneskelig insulin og PPARγ agonist-rosiglitazon.

Denne metoden kan brukes for å få bevis på konseptet eksperimenter på molekylære mekanismer som driver adipogenic svar i adipose endotelceller eller screening nye stoffer som kan forbedre adipogenic svar gjorde enten mot hvit eller beige/brun adipocyte differensiering. Bruker små subkutan biopsier, kan denne metoden brukes til å sile ut ikke-responder fag for kliniske forsøk å stimulere beige/brun og hvit adipocytter for behandling av fedme og Co-morbidities.

Introduction

Nyere bevis viser at både i mus og hos mennesker, et delsett av cellene er bosatt i fettvev blodkar kan differensieres til enten hvitt eller beige/brun adipocytter^1,2,3. Fenotypen av slike celler er omstridt, med bevis som støtter endotelceller, glatt muskel/pericyte eller et spekter av mellomliggende fenotyper^4,5,6,7. Omfanget av utvikle denne metoden var å teste adipogenic potensialet i CD34 + CD31 + endotelceller isolert fra ulike fett depoter fra overvektige mennesker. Andre studier i litteraturen fokuserer på adipogenic potensielle av den totale pancreatic eller kjente adipocyte progenitors^2,8,9. Siden eksisterende teknologier kan målrette spesielt fettvev endotelceller for stoffet levering¹⁰, er forstå potensialet i slike celler gjennomgå adipogenic induksjon mot hvit eller beige adipocytter viktig for fremtidige målrettet terapi.

Ulike grupper rapportert kombinasjonen av CD31 og CD34 markører som surrogater isolere endotelceller menneskelige fettvev^11,12,13. Vanligvis utføres isolasjon med to sammenhengende trinn og en positiv utvalg med magnetiske perler. I denne rapporten, ble immunoseparation med CD34 + magnetiske perler kombinert med CD31 plast perler benyttet. Vi fant denne teknikken bedre enn den sekvensielle magnetiske immunoseparation med hensyn til bevaring av typiske brosteinsbelagte endothelial morfologi. Også var vi kunne generere nok celler kreves for ekspansjon og adipogenic induksjon starter fra så lite som 1-2 g av fett. En liten prøve biopsy av subkutant fett er nok til å produsere det nødvendige antallet celler for nedstrøms programmer. Dette aspektet er potensielt viktig, spesielt hvis denne metoden vil bli benyttet for screening for en respons til adipogenic induksjon i mennesker.

I motsetning til andre systemer rapportert i litteraturen, benytter denne metoden bare to ingredienser for adipogenic induksjon av CD34 + CD31 + celler: en PPARγ agonist-rosiglitazon- og menneskelige insulin. Viktigere, ligger hvor mye insulin brukes innenfor normal/høy av sirkulerende post-absorptive insulin i mennesker¹⁴. Graden av respons på insulin på celler i vitro, målt ved Akt fosforylering, samsvarer ikke med deres evne til å svare på induksjon cocktail. Interessant, bruker denne induksjon cocktail og eksperimentelle forhold, en blanding av hvite og beige/brun celler ble innhentet etter størrelse og antall intracellulær lipid dråper og uttrykket av molekylære markører. Denne enkel og kostnadseffektiv induksjon protokollen sammen med kvantitative evalueringen av fenotypen av responder cellene (hvitt og beige) gir en screening av agenter som potensielt kan endre balansen av differensiert beige : hvit adipocytter.

Denne metoden gir også en translational tilnærming for å forstå de underliggende mekanismene adipogenesis av vaskulær endotelial progenitors i menneskelig fettvev. Bruker denne bestemte isolasjon/differensiering teknikken, kan etterforskere forhøre ulike veier ansvarlig for adipogenesis i et delsett av vaskulær endotelceller fra ulike fett depoter i mager og overvektige mennesker.

Protocol

Institusjonelle gjennomgang styret komiteen i øst Virginia Medical School godkjent forskning og samling av menneskelig fettvev prøver som brukes i studien. Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra pasienter. 1. forberedelse buffere, Media og instrumenter Forberede en Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered løsning (KRBBS): 135 mM natriumklorid, 5 mM kalium klorid, 1 mM Magnesiumsulfat, 0.4 mM kalium fosfat dibasic, 5,5 glukose, 1 mM adenosin, 0,01% antibiotika/antimycotic blanding…

Representative Results

Våre protokollen mål å gi i vitro tilnærming adipogenic potensialet av CD34 + CD31 + vaskulære celler fra ulike depoter av menneskelig fettvev. En forenklet flytskjema diagrammet vises i figur 1A. Det første trinnet bruker en positiv utvalg av CD34 uttrykke celler fører > 95% CD34 + celler i befolkningen av fersk isolert cellene (figur 1A). Viktigere, er denne indikatoren tapt når cellene er kultivert for et par …

Discussion

Fokus for denne utredningen er å gi en metodikk for isolasjon, utvidelse og adipogenic induksjon av CD34 + CD31 + endotelceller fra visceral og underhud depoter av menneskelig fettvev.

Metoder er rapportert for isolering av endotelceller fra ulike vaskulær senger til mus eller mennesker som involverer primært teknikker med CD31 antistoffer fluorescently merket eller koblet til magnetiske perler^{18, 19 , 2…}

Materials

Large Equipment
Biosafety Cabinet	Nuaire	nu-425-400
Cell Culture Incubator	Thermo-Fisher Scientific	800 DH
Water Bath	Forma Scientific	2568	Reciprocal Shaker
RT-PCR Machine	BIO-RAD	CFX96-C1000
Electrophoresis Box	BIO-RAD	Mini PROTEAN 3 Cell
Transblot Box	BIO-RAD	Mini Trans-Blot Cell
Electrophoresis Power Supply	BIO-RAD	PowerPac Basic
ELISA Reader	Molecular Devices	SpectraMax M5
Blot Reader	LI-COR	Odyssey	Near Infrared
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Tabletop Centrifuge	Eppendorf	MiniSpin Plus
Fluorescent Microscope	Olympus	BX50
Inverted Microscope	Nikon	TMS
KRBSS Buffer
HEPES	Research Products International	H75030
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	792519
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	746398
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Glucose	Acros Organics	410950010
Adenosine	Acros Organics	164040250
Bovine Serum Albumin	GE Healthcare Bio-Sciences	SH30574.02
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher Scientific	15070063
Tissue Digestion
20 mL Syringe	Global Medical	67-2020
Nylon Mesh, 250 µm	Sefar	03-250/50
Pipetting Needles	Popper	7934
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Tissue Forceps	George Tiemann & Co	160-20
Collagenase, Type I	Worthington Biochemical	LS004196
Petri Dishes, 100 mm	USA Scientific	5666-4160	TC Treated
Eppendorf Tubes, 1.5 mL	USA Scientific	1615-5500
Conical Tubes, 15 mL	Nest Scientific	601052
Conical Tubes, 50 mL	Nalgene	3119-0050
Scintillation Vials	Kimble	74505-20	Tissue Dicing
Cell Isolation
Cellometer	Nexcelom	Auto 2000
Cellometer Slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002
Cellometer Viability Stain	Nexcelom	CS2-0106-5mL	Acridine Orange/Propidium Iodine
Anti-CD34 Magnetic Beads	StemCell Technologies	18056	Kit
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
Anti-CD31 Plastic Beads	pluriSelect USA	19-03100-10
pluriSelect 10x Wash Buffer	pluriSelect USA	60-00080-10
pluriSelect Connector Ring	pluriSelect USA	41-50000-03
pluriSelect Detachment Buffer	pluriSelect USA	60-00046-12
pluriSelect Incubation Buffer	pluriSelect USA	60-00060-12
pluriSelect S Cell Strainer	pluriSelect USA	43-50030-03
Cell Culture
6-well Plates	USA Scientific	CC7682-7506	TC Treated
4-well chambered slides	Corning Life Sciences	354559	Fibronectin coated
4-well chambered slides	Thermo-Fisher Scientific	154526PK	Uncoated glass
Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC)	Sciencell Research Laboratories	7200	Primary cell line
Endothelial Cell Media (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Complete Kit
DMEM/F12 Basal Media	Thermo-Fisher Scientific	11320082
Fetal Bovine Serum (FBS)	Rocky Mountain Biologicals	FBS-BBT
Insulin	Lilly	U-100	Humalog
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Cell Analysis
Oil Red O Dye	Sigma-Aldrich	O0625	Prepared in isopropanol
96 well plates	USA Scientific	1837-9600
96 well PCR plates	Genesee Scientific	24-300
RNA Extraction	Zymo Research	R2072	Kit
cDNA Synthesis	BIO-RAD	1708841	Supermix
JumpStart PCR Polymerase	Sigma-Aldrich	D9307-250UN	Hot start, with PCR Buffer N
Magnesium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	M8787-5ML	3 mM final in PCR reaction
dNTPs	Promega	U1515
TaqMan AdipoQ	Thermo-Fisher Scientific	Hs00605917_m1
TaqMan CIDEA	Thermo-Fisher Scientific	Hs00154455_m1
TaqMan RPL27	Thermo-Fisher Scientific	Hs03044961_g1
TaqMan UCP1	Thermo-Fisher Scientific	Hs00222453_m1
BCA Assay	Sigma-Aldrich	QPBCA-1KT	Kit
Bis-acrylamide	BIO-RAD	1610146	40% stock solution
Ammonium Persulfate	BIO-RAD	1610700
TEMED	BIO-RAD	1610800
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
Glycine	BIO-RAD	1610718
Sodium Dodecal Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
EDTA	Fisher Scientific	S311-100
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B8026
Blot Membrane	EMD Millipore	IPFL00010
Methanol	Fisher Scientific	A452-SK4
Odyssey Blocking Buffer, Tris	LI-COR	927-50000
Anti-AKT antibody	Cell Signaling Technology	2920S	Mouse monoclonal
Anti-pAKT antibody	Cell Signaling Technology	9271S	Rabbit polyclonal
Anti-UCP1 antibody	Abcam	ab10983	Rabbit polyclonal
Anti-Mouse IgG antibody	LI-COR	926-68070	Goat Polyclonal, IRDye 680RD
Anti-Rabbit IgG antibody	LI-COR	926-32211	Goat Polyclonal, IRDye 800CW
Anti-Rabbit IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	111-025-003	Goat Polyclonal, TRITC
Phosphate Buffer Saline	Thermo-Fisher Scientific	10010049
37% Formaldehyde Solution	Electron Microscopy Sciences	15686	4% solution for cell fixation
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000	10% blocking solution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100	0.1% permeabilization solution
DAPI	Thermo-Fisher Scientific	D1306
Calcein AM	Thermo-Fisher Scientific	65-0853-39	Cell fluorescent visualization
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning Life Sciences	356231	Growth factor reduced
DiI labeled Acetylated LDL	Thermo-Fisher Scientific	L3484