Summary

Isolasjon, utvidelse og Adipogenic induksjon av CD34 + CD31 + endotelceller fra menneskelig Omental og underhud fettvev

Published: July 17, 2018
doi:

Summary

Differensiering av hvitt og beige adipocytter fra fettvev vaskulær progenitors bærer metabolske forbedringspotensial i fedme. Vi beskriver protokoller for en CD34 + CD31 + endothelial celle isolasjon fra menneskelige fat og en senere i vitro ekspansjon og differensiering i hvitt og beige adipocytter. Flere nedstrøms programmer diskuteres.

Abstract

Fedme er ledsaget av en omfattende ombygging av fettvev hovedsakelig via adipocyte hypertrofi. Ekstrem adipocyte vekst resulterer i en dårlig respons på insulin, lokale hypoksi og betennelser. Ved å stimulere differensiering av funksjonelle hvite adipocytter fra progenitors, radikale hypertrofi av befolkningen adipocyte kan forebygges og følgelig fettvev metabolske helse kan forbedres med en reduksjon av betennelse. Også ved å stimulere en differensiering av beige/brun adipocytter, kan av hele kroppen energi utgiftene økes resulterer i vekttap. Denne tilnærmingen kan hindre utvikling av fedme Co-morbidities som type 2 diabetes og hjerte-og karsykdommer.

Dette dokumentet beskriver isolasjon, utvidelse og differensiering av hvitt og beige adipocytter fra et delsett av menneskelig fettvev endotelceller som co uttrykker markørene CD31 og CD34. Metoden er relativt billig og er ikke arbeidskrevende. Det krever tilgang til menneskelig fettvev og underhud depot er egnet for prøvetaking. For denne protokollen, frisk fettvev prøver sykelig overvektige fag [kroppsmasseindeks (BMI) > 35] er samlet under bariatric kirurgi prosedyrer. Bruker en sekvensiell immunoseparation fra pancreatic, produseres nok celler fra så lite som 2-3 g av fett. Disse cellene kan utvides i kultur over 10-14 dager, kan være cryopreserved og beholde sine adipogenic egenskaper med passaging opp til passasjen 5-6. Cellene behandles i 14 dager med en adipogenic cocktail ved hjelp av en kombinasjon av menneskelig insulin og PPARγ agonist-rosiglitazon.

Denne metoden kan brukes for å få bevis på konseptet eksperimenter på molekylære mekanismer som driver adipogenic svar i adipose endotelceller eller screening nye stoffer som kan forbedre adipogenic svar gjorde enten mot hvit eller beige/brun adipocyte differensiering. Bruker små subkutan biopsier, kan denne metoden brukes til å sile ut ikke-responder fag for kliniske forsøk å stimulere beige/brun og hvit adipocytter for behandling av fedme og Co-morbidities.

Introduction

Nyere bevis viser at både i mus og hos mennesker, et delsett av cellene er bosatt i fettvev blodkar kan differensieres til enten hvitt eller beige/brun adipocytter1,2,3. Fenotypen av slike celler er omstridt, med bevis som støtter endotelceller, glatt muskel/pericyte eller et spekter av mellomliggende fenotyper4,5,6,7. Omfanget av utvikle denne metoden var å teste adipogenic potensialet i CD34 + CD31 + endotelceller isolert fra ulike fett depoter fra overvektige mennesker. Andre studier i litteraturen fokuserer på adipogenic potensielle av den totale pancreatic eller kjente adipocyte progenitors2,8,9. Siden eksisterende teknologier kan målrette spesielt fettvev endotelceller for stoffet levering10, er forstå potensialet i slike celler gjennomgå adipogenic induksjon mot hvit eller beige adipocytter viktig for fremtidige målrettet terapi.

Ulike grupper rapportert kombinasjonen av CD31 og CD34 markører som surrogater isolere endotelceller menneskelige fettvev11,12,13. Vanligvis utføres isolasjon med to sammenhengende trinn og en positiv utvalg med magnetiske perler. I denne rapporten, ble immunoseparation med CD34 + magnetiske perler kombinert med CD31 plast perler benyttet. Vi fant denne teknikken bedre enn den sekvensielle magnetiske immunoseparation med hensyn til bevaring av typiske brosteinsbelagte endothelial morfologi. Også var vi kunne generere nok celler kreves for ekspansjon og adipogenic induksjon starter fra så lite som 1-2 g av fett. En liten prøve biopsy av subkutant fett er nok til å produsere det nødvendige antallet celler for nedstrøms programmer. Dette aspektet er potensielt viktig, spesielt hvis denne metoden vil bli benyttet for screening for en respons til adipogenic induksjon i mennesker.

I motsetning til andre systemer rapportert i litteraturen, benytter denne metoden bare to ingredienser for adipogenic induksjon av CD34 + CD31 + celler: en PPARγ agonist-rosiglitazon- og menneskelige insulin. Viktigere, ligger hvor mye insulin brukes innenfor normal/høy av sirkulerende post-absorptive insulin i mennesker14. Graden av respons på insulin på celler i vitro, målt ved Akt fosforylering, samsvarer ikke med deres evne til å svare på induksjon cocktail. Interessant, bruker denne induksjon cocktail og eksperimentelle forhold, en blanding av hvite og beige/brun celler ble innhentet etter størrelse og antall intracellulær lipid dråper og uttrykket av molekylære markører. Denne enkel og kostnadseffektiv induksjon protokollen sammen med kvantitative evalueringen av fenotypen av responder cellene (hvitt og beige) gir en screening av agenter som potensielt kan endre balansen av differensiert beige : hvit adipocytter.

Denne metoden gir også en translational tilnærming for å forstå de underliggende mekanismene adipogenesis av vaskulær endotelial progenitors i menneskelig fettvev. Bruker denne bestemte isolasjon/differensiering teknikken, kan etterforskere forhøre ulike veier ansvarlig for adipogenesis i et delsett av vaskulær endotelceller fra ulike fett depoter i mager og overvektige mennesker.

Protocol

Institusjonelle gjennomgang styret komiteen i øst Virginia Medical School godkjent forskning og samling av menneskelig fettvev prøver som brukes i studien. Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra pasienter. 1. forberedelse buffere, Media og instrumenter Forberede en Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered løsning (KRBBS): 135 mM natriumklorid, 5 mM kalium klorid, 1 mM Magnesiumsulfat, 0.4 mM kalium fosfat dibasic, 5,5 glukose, 1 mM adenosin, 0,01% antibiotika/antimycotic blanding…

Representative Results

Våre protokollen mål å gi i vitro tilnærming adipogenic potensialet av CD34 + CD31 + vaskulære celler fra ulike depoter av menneskelig fettvev. En forenklet flytskjema diagrammet vises i figur 1A. Det første trinnet bruker en positiv utvalg av CD34 uttrykke celler fører > 95% CD34 + celler i befolkningen av fersk isolert cellene (figur 1A). Viktigere, er denne indikatoren tapt når cellene er kultivert for et par …

Discussion

Fokus for denne utredningen er å gi en metodikk for isolasjon, utvidelse og adipogenic induksjon av CD34 + CD31 + endotelceller fra visceral og underhud depoter av menneskelig fettvev.

Metoder er rapportert for isolering av endotelceller fra ulike vaskulær senger til mus eller mennesker som involverer primært teknikker med CD31 antistoffer fluorescently merket eller koblet til magnetiske perler18, 19 , 2…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne ønsker å erkjenne Becky Marquez, klinisk koordinator på Sentara Bariatric Center, for henne hjelp med prosessen med pasienten screening og samtykke. Denne forskningen ble støttet av R15HL114062 til Anca D. Dobrian.

Materials

Large Equipment

Biosafety Cabinet

Nuaire

nu-425-400

Cell Culture Incubator

Thermo-Fisher Scientific

800 DH

Water Bath

Forma Scientific

2568

Reciprocal Shaker

RT-PCR Machine

BIO-RAD

CFX96-C1000

Electrophoresis Box

BIO-RAD

Mini PROTEAN 3 Cell

Transblot Box

BIO-RAD

Mini Trans-Blot Cell

Electrophoresis Power Supply

BIO-RAD

PowerPac Basic

ELISA Reader

Molecular Devices

SpectraMax M5

Blot Reader

LI-COR

Odyssey

Near Infrared

Refrigerated Centrifuge

Eppendorf

5810 R

Tabletop Centrifuge

Eppendorf

MiniSpin Plus

Fluorescent Microscope

Olympus

BX50

Inverted Microscope

Nikon

TMS

KRBSS Buffer

HEPES

Research Products International

H75030

Sodium bicarbonate

Sigma-Aldrich

792519

Calcium chloride dihydrate

Sigma-Aldrich

C7902

Potassium phosphate monobasic

Sigma-Aldrich

P5655

Magnesium sulfate

Sigma-Aldrich

M2643

Sodium chloride

Sigma-Aldrich

746398

Sodium phosphate monobasic monohydrate

Sigma-Aldrich

S9638

Potassium chloride

Sigma-Aldrich

P9333

Glucose

Acros Organics

410950010

Adenosine

Acros Organics

164040250

Bovine Serum Albumin

GE Healthcare Bio-Sciences

SH30574.02

Penicillin/Streptomycin

Thermo-Fisher Scientific

15070063

Tissue Digestion

20 mL Syringe

Global Medical

67-2020

Nylon Mesh, 250 µm

Sefar

03-250/50

Pipetting Needles

Popper

7934

Fine Scissors

Fine Science Tools

14058-11

Tissue Forceps

George Tiemann & Co

160-20

Collagenase, Type I

Worthington Biochemical

LS004196

Petri Dishes, 100 mm

USA Scientific

5666-4160

TC Treated

Eppendorf Tubes, 1.5 mL

USA Scientific

1615-5500

Conical Tubes, 15 mL

Nest Scientific

601052

Conical Tubes, 50 mL

Nalgene

3119-0050

Scintillation Vials

Kimble

74505-20

Tissue Dicing

Cell Isolation

Cellometer

Nexcelom

Auto 2000

Cellometer Slides

Nexcelom

CHT4-SD100-002

Cellometer Viability Stain

Nexcelom

CS2-0106-5mL

Acridine Orange/Propidium Iodine

Anti-CD34 Magnetic Beads

StemCell Technologies

18056

Kit

EasySep Magnet

StemCell Technologies

18000

Anti-CD31 Plastic Beads

pluriSelect USA

19-03100-10

pluriSelect 10x Wash Buffer

pluriSelect USA

60-00080-10

pluriSelect Connector Ring

pluriSelect USA

41-50000-03

pluriSelect Detachment Buffer

pluriSelect USA

60-00046-12

pluriSelect Incubation Buffer

pluriSelect USA

60-00060-12

pluriSelect S Cell Strainer

pluriSelect USA

43-50030-03

Cell Culture

6-well Plates

USA Scientific

CC7682-7506

TC Treated

4-well chambered slides

Corning Life Sciences

354559

Fibronectin coated

4-well chambered slides

Thermo-Fisher Scientific

154526PK

Uncoated glass

Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC)

Sciencell Research Laboratories

7200

Primary cell line

Endothelial Cell Media (ECM)

ScienCell Research Laboratories

1001

Complete Kit

DMEM/F12 Basal Media

Thermo-Fisher Scientific

11320082

Fetal Bovine Serum (FBS)

Rocky Mountain Biologicals

FBS-BBT

Insulin

Lilly

U-100

Humalog

Rosiglitazone

Sigma-Aldrich

R2408

Cell Analysis

Oil Red O Dye

Sigma-Aldrich

O0625

Prepared in isopropanol

96 well plates

USA Scientific

1837-9600

96 well PCR plates

Genesee Scientific

24-300

RNA Extraction

Zymo Research

R2072

Kit

cDNA Synthesis

BIO-RAD

1708841

Supermix

JumpStart PCR Polymerase

Sigma-Aldrich

D9307-250UN

Hot start, with PCR Buffer N

Magnesium Chloride Solution

Sigma-Aldrich

M8787-5ML

3 mM final in PCR reaction

dNTPs

Promega

U1515

TaqMan AdipoQ

Thermo-Fisher Scientific

Hs00605917_m1

TaqMan CIDEA

Thermo-Fisher Scientific

Hs00154455_m1

TaqMan RPL27

Thermo-Fisher Scientific

Hs03044961_g1

TaqMan UCP1

Thermo-Fisher Scientific

Hs00222453_m1

BCA Assay

Sigma-Aldrich

QPBCA-1KT

Kit

Bis-acrylamide

BIO-RAD

1610146

40% stock solution

Ammonium Persulfate

BIO-RAD

1610700

TEMED

BIO-RAD

1610800

Tris

Sigma-Aldrich

T1503

Glycine

BIO-RAD

1610718

Sodium Dodecal Sulfate

Sigma-Aldrich

L3771

EDTA

Fisher Scientific

S311-100

Bromophenol Blue

Sigma-Aldrich

B8026

Blot Membrane

EMD Millipore

IPFL00010

Methanol

Fisher Scientific

A452-SK4

Odyssey Blocking Buffer, Tris

LI-COR

927-50000

Anti-AKT antibody

Cell Signaling Technology

2920S

Mouse monoclonal

Anti-pAKT antibody

Cell Signaling Technology

9271S

Rabbit polyclonal

Anti-UCP1 antibody

Abcam

ab10983

Rabbit polyclonal

Anti-Mouse IgG antibody

LI-COR

926-68070

Goat Polyclonal, IRDye 680RD

Anti-Rabbit IgG antibody

LI-COR

926-32211

Goat Polyclonal, IRDye 800CW

Anti-Rabbit IgG antibody

Jackson ImmunoResearch

111-025-003

Goat Polyclonal, TRITC

Phosphate Buffer Saline

Thermo-Fisher Scientific

10010049

37% Formaldehyde Solution

Electron Microscopy Sciences

15686

4% solution for cell fixation

Normal Goat Serum

Vector Laboratories

S-1000

10% blocking solution

Triton X-100

Sigma-Aldrich

X-100

0.1% permeabilization solution

DAPI

Thermo-Fisher Scientific

D1306

Calcein AM

Thermo-Fisher Scientific

65-0853-39

Cell fluorescent visualization

Matrigel Basement Membrane Matrix

Corning Life Sciences

356231

Growth factor reduced

DiI labeled Acetylated LDL

Thermo-Fisher Scientific

L3484

References

  1. Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322 (5901), 583-586 (2008).
  2. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).
  3. Min, S. Y., et al. Human ‘brite/beige’ adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice. Nature Medicine. 22 (3), 312-318 (2016).
  4. Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
  5. Tran, K. V., et al. The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells. Cell Metabolism. 15 (2), 222-229 (2012).
  6. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  7. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  8. Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
  9. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15 (4), 480-491 (2012).
  10. Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5552-5557 (2016).
  11. Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
  12. Miranville, A., et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation. 110 (3), 349-355 (2004).
  13. Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 205 (1), 114-122 (2005).
  14. Moller, D. E., Flier, J. S. Insulin resistance–mechanisms, syndromes, and implications. The New England Journal of Medicine. 325 (13), 938-948 (1991).
  15. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  16. Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes. The Journal of Cell Biology. 87 (1), 180-196 (1980).
  17. Satish, L., et al. Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage. BMC Medical Genomics. 8 (41), (2015).
  18. Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. The Journal of Cell Biology. 60 (3), 673-684 (1974).
  19. Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (3), H837-H846 (2010).
  20. Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circulation Research. 99 (8), 861-869 (2006).
  21. Hewett, P. W., Murray, J. C. Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (11), 823-830 (1993).
  22. Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization. Microvascular Research. 46 (1), 89-102 (1993).
  23. Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (4), 325-331 (1993).
  24. Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (105), e53072 (2015).
  25. Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC). Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 101-109 (2015).
  26. Zhou, L., et al. In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis. PLoS One. 10 (2), e0117644 (2015).
  27. Curat, C. A., et al. From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes. Diabetes. 53 (5), 1285-1292 (2004).
  28. Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).
  29. Traktuev, D. O., et al. A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks. Circulation Research. 102 (1), 77-85 (2008).
  30. Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis. Cell Cycle. 11 (15), 2765-2766 (2012).
  31. Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue. Journal of Internal Medicine. 262 (4), 415-421 (2007).
  32. Ong, W. K., et al. Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
  33. Ong, W. K., Sugii, S. Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).
  34. Tchkonia, T., et al. Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots. American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).
  35. van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation. Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).

Play Video

Cite This Article
Haynes, B. A., Huyck, R. W., James, A. J., Carter, M. E., Gaafar, O. U., Day, M., Pinto, A., Dobrian, A. D. Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (137), e57804, doi:10.3791/57804 (2018).

View Video