Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Количественное измерение реактивнооксигенных видов и старение связанные секреторной фенотип в нормальной фибробластов во время онкогена индуцированного старения

Published: August 12, 2018 doi: 10.3791/57890
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2
1Department of Biochemistry, College of Medicine, Dong-A University, 2Peripheral Neuropathy Research Center, College of Medicine, Dong-A University
* These authors contributed equally

Summary

Внутриклеточная ROS было показано, чтобы играть важную роль в индукции клеточного старения. Здесь мы описываем чувствительных assay для количественной оценки уровня рос во время клеточного старения. Мы также предоставляем протоколы для оценки старения связанные секреторной фенотип, который якобы способствует различных расстройств, связанных с возрастом.

Abstract

Клеточного старения рассмотрел состояние необратимых роста ареста после исчерпания пролиферативный потенциал или воздействия различных стрессов. Недавние исследования расширили роль клеточного старения в различных физиологических процессов, включая развитие, заживление ран, иммунной наблюдения и связанных с возрастом ткани дисфункции. Хотя арест клеточного цикла является критическим отличительной чертой сотовой старение, увеличению внутриклеточных реактивнооксигенных видов (ров) производства была продемонстрирована также играть важную роль в индукции клеточного старения. Кроме того недавние исследования показали, что стареющий клетки exhibit мощным паракринными деятельности на соседних клеток и тканей через связанные старение секреторной фенотип (SASP). Резкое увеличение интереса относительно терапевтических стратегий борьбы против клеточного старения подчеркивается необходимость четкого понимания механизмов старения, в том числе внутриклеточная ROS и SASP. Здесь мы описываем протоколы для количественной оценки внутриклеточная ROS уровней во время H-Ras индуцированной клеточного старения с помощью ROS-чувствительных Люминесцентную краску и проточной цитометрии. Кроме того мы представляем чувствительных методов для анализа индукции выражение mRNA и секрецию SASP факторов. Эти протоколы могут применяться к различным моделям клеточного старения.

Introduction

Более чем 50 лет назад, Хейфлик и Moorhead показали, что нормальные клетки введите необратимым роста арест после исчерпания их пролиферативный потенциал после определенного числа клеточных делений1. Это явление теперь известен как репликативной старение и считается, что сильно коррелируют с научные старения2. Хотя постепенной эрозией теломеры считается одной из основных причин репликативной старение, различных клеточных подчеркивает, как повреждение ДНК, онкогенные активации и окислительного стресса, были зарегистрированы чтобы заставить другой тип клеточного старения под названием «преждевременной» или «стресс индуцированного старения». Интересно, что преждевременной роль мощным подавляющих опухоли после активации онкогенов как H-Ras и BRAF. Исследования модели мыши и тканях человека дали сильный доказательства того, что биомаркеров старения клеток были преимущественно в предраковых поражений где онкогенных ран и BRAF активируются, но были умалены злокачественных раковых заболеваний, которые превратились от Эти поражения3,4,5. Помимо своей роли в старения и подавления опухоли сотовой старение было показано в предыдущих исследованиях играть определенную роль в различных физиологических процессах, включая заживление ран, репарации тканей, иммунной наблюдения и эмбрионального развития6.

Хотя рост арест широко изучены как отличительной чертой сотовой старение7, значительный объем доказательств свидетельствует о том, что что внутриклеточные реактивнооксигенных видов (ров) также способствует сотовой старение8. Высота уровня рос во время различных типов клеточного старения, включая репликативной старение и онкогена индуцированного старения (ОИ), первоначально сообщили несколько десятилетий назад9,10. Более непосредственно, экзогенных лечения с сублетальных доз H2O2 индуцирует старение11,12. Ингибирование ROS-очистки ферментов, таких как SOD1, также приводит к преждевременной13. Напротив, низкие условия атмосферного кислорода и увеличения ROS очистки задержки начала старение10,14,15. Несомненно, эти результаты показывают, что ROS являются важными посредниками или детерминанты клеточного старения индукции. Однако как рос вклад индукции сотовой старение и как рос уровни повышаются в течение клеточного старения требуют дальнейшего расследования.

Недавние исследования показали, что стареющей клетки имеют мощный паракринными деятельности на соседних клеток и тканей через SASP16,17. В возрасте ткани стареющей клетки способствуют возрастных ткани дисфункции через много путей в дополнение к автономной истощение пролиферативной клеток через SASP. Различные провоспалительных факторов, таких как ИЛ-6, IL-8, TGFβ и матрицы металлопротеиназ (MMPs), выделяемый стареющей клетки, вызвать дисфункции возрастных ткани через обесценения ткани гомеостаза, разрушение тканей архитектуры, старение соседних клеток, и стерильные воспаление18,19. Однако SASPs может иметь благоприятное воздействие в зависимости от биологических контекста. Кроме того heterogenetic характер SASPs зависит от типа стареющей клетки и клетки стадии, подчеркивая необходимость дальнейших исследований19.

Здесь мы описываем быстрое и чувствительных методов цитометрии для оценки внутриклеточная ROS уровней во время OIS. Кроме того внедряются методы для анализа факторов SASP, с использованием количественных реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ELISA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. склонение онкогена индуцированного старения

  1. Подготовка H-RasV12 ретровируса
    1. Герб 100 мм культуры блюдо, добавив 2 мл физраствора буферизации (PBS) поли L-лизин фосфатные 0,001% за 5 мин при комнатной температуре.
    2. Удаление поли L-лизин решения с помощью стеклянной пипетки, подключенных к вакуум и мыть культуры блюдо, добавив 2 мл ПБС.
    3. Пластина 3 x 106 ecotropic БОСК-23 упаковка клетки на покрытые культуры блюдо с Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) содержащий 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% пенициллина/стрептомицина и культура их при 37 ° C в культуре ткани CO2 Инкубатор для 1 d.
    4. Следующий день, transfect 2 мкг ДНК puro-H-RasV12 pBabe вместе с ретровирусной упаковки ДНК (2 мкг ПНВГ/ГСМ и 0,25 мкг pVSVG) с помощью трансфекции реагент для 8 h согласно инструкциям производителя.
    5. Извлеките носитель transfection и добавить 8 мл свежего средств массовой информации.
    6. После 48 ч собирать средства массовой информации, содержащие вирусных частиц и удалить любой сотовой мусора центрифугированием на 500 x g за 5 мин.
    7. Фильтр H-Ras вирус содержащих СМИ с 0,45 мкм фильтром шприца.
      Примечание: Избегайте любых замораживания и оттаивания supernatants вирус для эффективной вирусной инфекции. Чтобы получить лучшую эффективность, используйте вирус, который был собран в тот же день, как инфекция.
  2. Заражать нормальный фибробластов WI-38 с ретровируса H-RasV12
    1. Клемная 5 x 104 WI-38 клетки в культуре 60 мм блюдо с DMEM, содержащие 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина 1 d до уборки ретровируса H-RasV12 и их культура на 1 день в 37 ° C.
    2. Удалите средство роста следующий день и добавьте 1 mL H-RasV12 ретровируса средств массовой информации. Добавьте еще 1 мл среднего роста, содержащий 2 мкл раствора Полибрен акций (8 мг/мл в дистиллированной воде). Инкубируйте образца на 1 день в увлажненные 37 ° C, 5% CO2 культуры ткани инкубатора.
    3. Снимите смесь ретровируса H-RasV12 24 h позже и вымыть клетки 2 x с ПБС. Добавьте средство роста и лечить клетки с 2 мкг/мл puromycin за 2 дня в увлажненные 37 ° C, 5% CO2 культуры ткани инкубатора.
    4. После 2 d puromycin выбор, удалить среднего роста и вымыть клетки 2 x с ПБС. Добавьте средство роста и культуры клеток в увлажненные 37 ° C, 5% CO2 инкубатора до тех пор, пока указанное время точки (см. Рисунок 1A для схематического представления).

2. Мониторинг старение через пятнать связанные старения β-галактозидазы

  1. Подготовьте следующие акции решения.
    1. Подготовка 20 мг/мл 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-галактопиранозид (X-gal) в диметилформамид (DMF). Хранят раствор при температуре-20 ° C.
    2. Подготовка буфера фосфат натрия лимонной кислоты растворяют 3.377 g Na2HPO4.7H2O (126 мм) и 0,708 г лимонной кислоты (36,8 мм) в 100 мл дистиллированной воды. При необходимости отрегулируйте pH 6.0.
    3. Подготовьте Ферроцианид калия 0,5 М. Хранят раствор в темноте при 4 ° C.
    4. Подготовьте Гексацианоферрат калия 0,5 М. Хранят раствор в темноте при 4 ° C.
      Примечание: pH окрашивание раствора связанные старения β-галактозидазы (SA β-gal) имеет решающее значение для получения точных результатов.
  2. Сделайте свежий раствор окрашивание β-Гал SA путем разбавления Стоковый раствор, содержащий 150 мм NaCl, 2 мм MgCl2, Ферроцианид калия 5 мм, 5 мм калия Гексацианоферрат, 20% (v/v) лимонной кислоты/натрия фосфат буфер и 1 мг/мл X-Гал.
  3. Извлеките носитель культуры и вымыть клетки 1 x с ПБС. Исправьте клетки с 3% формальдегида для 5 мин при комнатной температуре.
    Примечание: Клетки, которые не заражены ретровируса должен использоваться как отрицательный контроль. Клетки неинфицированных управления следует продолжать пассированной сохранить их пролиферирующих статус.
  4. Удаление решения фиксации из клеток и мыть их с ПБС. Добавьте, свежеприготовленные 1 x SA β-Гал окрашивание раствора (1,5 мл в 60 мм культуры блюдо). Уплотнение блюдо с парафином пленкой для предотвращения высыхания и проинкубируйте 24 ч при 37 ° C. Кроме того Инкубируйте блюда вместе в камере влажности.
    Примечание: Фиксирующие раствор, содержащий 3% формальдегида должны утилизироваться как опасные отходы. Инкубатор без CO2 является желательным, чтобы предотвратить изменения pH во время инкубации.
  5. Проверить состояние пятная клетки под микроскопом на следующий день; SA β-Гал положительных клеток появляются синие в регионе perinuclear.
    Примечание: Пролиферирующих клеток контроля показывают низкой частоты SA β-Гал положительных клеток. Если окрашивание слишком светлый, по-прежнему инкубации немного дольше (см Рисунок 1B показательные примеры).
  6. Приобрести SA β-Гал окрашивание изображения с ПЗС-камеры с помощью 10 X или более объектива. Захват достаточное количество изображений, чтобы вычислить процент окрашивание (> 200 клеток).
  7. Рассчитайте процент SA β-Гал окрашенных клеток, количественной количество SA β-Гал положительных клеток относительно общего числа клеток.
    Примечание: SA β-Гал окрашивания следует повторить самостоятельно, по крайней мере 3 x и средние значения следует рассчитываются по результатам повторных экспериментов (рис. 1 C). Соответствующие ячейки плотность имеет решающее значение для окрашивания эксперимент SA β-Гал. Высокая confluency может вмешиваться с изменением морфологии, старение связанные и побудить ложного сигнала в ячейках элемента управления.

3. Количественная оценка реактивнооксигенных видов индукции во время H-Ras индуцированного старения

  1. Пластина 2 x 105 WI-38 клеток на 60 мм культуры блюдо и провоцировать H-Ras индуцированного старения, как описано в шаге 1.
    Примечание: Этот протокол может применяться для других типов моделей клеточного старения.
  2. Удалите средство роста в назначенное время точке (2, 4 или 6 дней) и вымыть клетки с ПБС. Отсоединить клетки, рассматривая их с 1 мл 0,05% раствора трипсина/ЭДТА и инактивировать трипсина, добавив 1 мл среднего роста, содержащие 10% FBS. Определите количество клеток.
  3. 1 х 105 клетки перехода в коническую пробирку 15 мл и собирать клетки центрифугированием на 500 x g за 5 мин.
  4. Подготовьте свежие 2', 7'-dichlorofluorescin диацетата (DCF-DA) пятная СМИ, добавляя 50 мкл 10 мм DCF-Да до 10 мл культуры среды (Рабочая концентрация DCF-DA 50 мкм).
    Примечание: DCF-да это светочувствительный. Следует избегать воздействия света. Концентрация DCF-да и окрашивания время может быть скорректирована в зависимости от типа ячейки.
  5. Осторожно извлеките средство роста из 15 мл Конические трубки и добавьте 1 mL свежеприготовленные DCF-DA окрашивание среды. Тщательно Ресуспензируйте клетки Пелле и Инкубируйте при 37 ° C на 30 мин в темноте. Включить-окрашенных образец как отрицательный контроль окрашивание.
    Примечание: Как отрицательный контроль должен быть подготовлен пролиферирующих клеток, не окрашенные DCF-да.
  6. Собирать клетки центрифугированием на 500 x g 5 минут и промыть их 1 x с 2 мл ПБС. Ресуспензируйте клетки с 1 мл раствора 1 x PBS и передавать соответствующую флуоресценции активированный ячейку Сортировка труб (FACS) образца.
  7. Измерьте 2′, диацетата (DCF-DA) 7′-Dichlorodihydrofluorescein флуоресценции сигнала с использованием проточный цитометр, соответствующий лазерный источник. Возбуждают образцы с голубой лазер (488 нм) и обнаружения излучаемых флуоресценции с детектором 530 ± 30 Нм (FITC) с помощью логарифмической шкалы.
    1. Анализ-окрашенных отрицательный контроль клетки сначала. В участке точка вперед точечной (FSC) против стороны точечной (SSC) выберите живые клетки, с помощью инструмента стробирования и устранить омертвевшие клетки и сотовой мусора.
      Примечание: Изменение размера ячейки должно тщательно контролироваться на участке точка FSC по сравнению SSC. Если величины стареющей клетки значительно увеличивается, DCF-да интенсивность следует сравнить в клеточных популяций того же размера после стробирования в сюжет точка FSC по сравнению SSC.
    2. В гистограмме один параметр отображения DCF-DA (488 нм) флуоресцирования на логарифмической шкале x-оси и количество событий (мобильный номер) на линейной шкале y-ось, отрегулировать напряжение 488 нм лазер поставить пик от окрашенные клетки на левом краю.
    3. Анализируйте DCF-DA Витражи образцов и записи по крайней мере 10 000 событий для каждого образца. Приобретать среднее флуоресценции значение каждого образца с помощью программного обеспечения для анализа, специфичные для проточный цитометр.
      Примечание: ROS измерения должен повторяться, независимо, что по крайней мере 3 x и средние значения должны быть рассчитаны от этих результатов. Представитель H-Ras индуцированного старения результаты показаны на рисунке 2.

4. Quantifying ИЛ-6 и IL-8 мРНК выражение для старения связанные секреторной фенотип анализ с помощью реального времени полимеразной цепной реакции

  1. Общая подготовка РНК
    1. Пластина 3 x 105 WI-38 клетки на 100 мм культуры блюдо в среде DMEM, содержащие 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина и культура их при 37 ° C в инкубатор культуры ткани за 1 день. Подготовьте дубликаты культур для каждой точки время.
    2. Вызвать старение, заражение клетки с H-RasV12 ретровируса, как описано в шаге 1.
    3. На 1 день до сбора урожая, вымыть клетки 2 x с ПБС и добавить 3 мл DMEM без FBS.
      Примечание: Этот шаг проводится производить кондиционером средство, используемое для ELISA, как описано в шаге 5. Сыворотка голода может вызвать проявление ИЛ-6 и IL-8 mRNAs в некоторых чувствительных клеток. Таким образом ИЛ-6 и IL-8 мРНК выражение в клетках, культивируемых с и без голода сыворотки следует сравнить первоначально. Если сыворотка голода вызывает значительные изменения в проявление ИЛ-6 и IL-8 мРНК, всего РНК для ПЦР и кондиционером среднего для ELISA должны подготавливаться отдельно.
    4. Собирать с кондиционерами среднего от каждого образца 24 h позже и хранить средне-80 ° c для ИФА-диагностики.
    5. Отсоединить клетки, рассматривая их с 1 мл 0,05% раствора трипсина/ЭДТА и инактивировать трипсина, добавив 1 мл среднего роста, содержащие 10% FBS. Определите количество клеток для нормализации ELISA результатов, как описано в шаге 5. Урожай клетки в 1,5 мл microcentrifuge центрифугированием на 500 x g за 5 мин.
    6. Удалите носитель, нежный всасывания и добавить 1 мл раствора РНК добыча. Затем, вихревой пробки microcentrifuge энергично для 15 s. Впоследствии, 200 мкл хлороформе и энергично вихревой смесь снова для еще 15 s.
    7. Центрифуга пробоотборные трубки на 17.000 x g 10 мин при 4 ° C. Затем тщательно перенесите Верхний этап новой пробки microcentrifuge 1,5 мл.
      Примечание: Интерфаза и Нижняя органические фазы должно не нарушается во время передачи верхнего этапа новой трубки.
    8. 400 мкл изопропанола осадок РНК и смешивать их хорошо, нежный инверсии. Затем Инкубируйте трубки при комнатной температуре в течение 10 мин.
    9. Центрифуга для трубки на 17.000 x g 10 мин при 4 ° C. Затем отбросить супернатанта, заботясь, чтобы сохранить Пелле РНК. Мыть РНК, добавив 1 мл 75% этанола и перевернуть трубку 2 – 3 x. Центрифуга для трубки для 5 мин на 17.000 x g при 4 ° C и удалить супернатант.
    10. Сухие гранулы РНК при комнатной температуре и распустить РНК в 50 мкл диэтиловым pyrocarbonate (DEPC)-очищенной дистиллированной воды. С помощью 1 мкл раствора РНК, количественно общая концентрация РНК с спектрофотометром.
      Примечание: Пересушивание уменьшит растворимость РНК; Поэтому избегайте Пересушивание РНК.
  2. подготовка cDNA
    1. Подготовьте смесь реакции реверс транскрипция для каждого образца, добавив следующее в тонкостенных ПЦР-пробирку: 2 мкг всего РНК (Отpегулиpуйте уpовень до 10 мкл РНКазы свободной водой), 2 мкл 10 x буфер RT, 1 мкл случайного праймера (50 пмоль), 0,8 мкл 25 x dNTP смеси (100 Мм) 1 мкл MMLV обратной транскриптазы (50 U/мкл) и 5.2 мкл РНКазы свободной воды.
    2. Настройка обратной транскрипции реакции программы на тепловая велосипедист с соблюдением следующих условий: 42 ° C 60 мин и 95 ° C за 5 минут место ПЦР пробирок тепловая велосипедист и запустить программу.
  3. Реальном времени полимеразная цепная реакция
    1. Готовить в режиме реального времени PCR мастер смесь для всех реакций. Реакционную смесь для каждого образца является следующим: 25 мкл 2 x реальном масштабе времени PCR Мастер микс, 1 мкл прямого и обратного праймеров для Ил-6 и IL-8 и 21 мкл ультра-чистой дистиллированной воды (DNase - и РНКазы бесплатно). Приведены в таблице 1.
      Примечание: Подготовьте реальном масштабе времени PCR реакционную смесь для каждого образца, содержащий праймеры RNA актина как внутреннего контроля. GAPDH также может использоваться в качестве внутреннего контроля для нормализации.
    2. Добавьте 48 мкл мастер смеси и 2 мкл вывозимому cDNA разбавленного продукта с водой в каждой скважине в плиту 96-луночных оптических ПЦР. Выполнение каждой реакции в трех экземплярах. Подготовьте хорошо элемент управления, который не содержит шаблон cDNA как элемент ПЦР.
    3. Настроить программу в реальном времени реакции PCR на тепловая велосипедист с соблюдением следующих условий: 10 мин при 95 ° C, s of15 40 циклов при 95 ° C (денатурация) и 1 мин при 60 ° C (отжига и расширение).
    4. Выполнять ПЦР в реальном времени и запись цикла (TC) пороговое значение после завершения цикла PCR. Рассчитайте уровни mRNA для Ил-6 и IL-8 с использованием 2- ΔΔCΤ метод20.
      Примечание: Изменения относительной раза в выражении определяется после нормализации уровня актина с использованием следующей формулы:
      Сбросить изменения = 2-Δ (ΔCТ)
      Здесь,
      ΔCT = CT, IL-6 и IL-8- CT, актина; и
      Δ (ΔCТ) = ΔCT, стимулировали- ΔCТ, управления.
    5. Вычислите среднее значение для каждого дубликата образца.
      Примечание: ПЦР следует самостоятельно повторить, что по крайней мере 3 x и средние значения следует быть рассчитаны на эти результаты. Представитель H-Ras индуцированного старения результаты показаны на рисунке 3. Сыворотка голода может вызвать проявление ИЛ-6 и IL-8 mRNAs в некоторых чувствительных клеток. Таким образом ИЛ-6 и IL-8 мРНК выражение в клетках, культивируемых с и без голода сыворотки следует сравнить первоначально. Если сыворотка голода вызывает значительные изменения в проявление ИЛ-6 и IL-8 мРНК, всего РНК для ПЦР и кондиционером среднего для ELISA должны подготавливаться отдельно.

5. Количественная оценка уровня секретируемые белки ИЛ-6 и IL-8 для старения связанные секреторной фенотип анализа с помощью ИФА

  1. Оттепель 3 мл с кондиционерами среднего заготавливаемым от стареющей клетки WI-38, как описано в шаге 4. Удалите мусор клетки центрифугированием на 500 x g за 5 мин.
  2. Концентрат с кондиционерами среднего 10 раз центрифугированием в 3000 x g 20 мин с помощью центробежного фильтра.
    Примечание: Концентрация кондиционером среднего может не зависеть от обязательно образец типа.
  3. Выполняют ELISA, используя 50 мкл каждого концентрированного образца обусловлено среды с соответствующие наборы ИЛ-6 и IL-8 ELISA.
    Примечание: Проверьте каждый образец на двух скважинах ELISA. Потому что каждый момент дублируется в шаге 4, этот анализ позволяет нам отслеживать изменения в ELISA assay и метода подготовки образца.
    1. Для ELISA плиты покрытия, разбавляют ИЛ-6 и IL-8 антитела с ПБС в концентрации 0,5 мкг/мл для Ил-6 или 0,125 мкг/мл для Ил-8. Добавьте 100 мкл разбавленного антител в каждой скважине ELISA пластины. Печать пластину с пластиной ELISA пленки для запайки и инкубировать без встряхивания на ночь при комнатной температуре.
    2. Удалите раствор антител, аспирации. Мыть каждый хорошо 4 x 300 мкл 1 x мыть буфера (0,05% Tween-20 в PBS). Добавьте 300 мкл блокировки буфера (1% BSA в PBS) в каждой скважине. Инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч.
    3. Удаление блокирования решения путем аспирации. Мыть каждый хорошо 4 x 300 мкл 1 x мыть буфера. Подготовьте серийно разреженных ELISA стандартов в буфером для разбавления проб (0,05% Tween-20 и 0,1% BSA в PBS) для создания стандартной кривой.
      Примечание: Серийный разрежения для Ил-6 является 31,25, 62,5, 125, 250, 500, 1000 и 2000 пг/мл. Серийный разрежения для Ил-8 — 2,34, 4,69, 9.38, 18,75, 37,5, 75 и 150 пг/мл.
    4. Добавьте 100 мкл раствора стандартного или 100 мкл пример решения (50 мкл концентрированного средства с 50 мкл буфера для разведения) в каждой скважине. Инкубируйте скважин при комнатной температуре в течение 2 ч.
    5. Удалите стандартные или образец решения путем аспирации. Мыть каждый хорошо 4 x 300 мкл 1 x мыть буфера. Разбавьте обнаружения антител с буфером для разбавления проб к концентрации 0,1 мкг/мл для Ил-6 или 0,25 мкг/мл для Ил-8. 100 мкл разбавленного антитела на хорошо. Инкубируйте скважин при комнатной температуре в течение 2 ч.
    6. Удалите раствор антител, аспирации. Мыть каждый хорошо 4 x 300 мкл 1 x мыть буфера. Разбавьте стрептавидина-пероксидаза (ПХ) в буфером для разбавления проб к концентрации 0,05 мкг/мл. 100 мкл решения стрептавидина ПХ на хорошо. Инкубируйте скважин при комнатной температуре за 30 мин.
    7. Удалите раствор антител, аспирации. Мыть каждый хорошо 4 x 300 мкл 1 x мыть буфера. 100 мкл 3, 3 ', 5, 5 ′ тетраметилбензидина (ТМБ) раствора субстрата в каждой скважине. Инкубируйте скважин при комнатной температуре 20 мин для разработки цвет. Остановите реакции, добавив 100 мкл стоп раствора HCl 1 M.
    8. Читайте поглощения каждой скважины с ELISA чтения на 450 Нм.
    9. Участок кривой стандартного для созданного стандартов. Рассчитайте концентрации ИЛ-6 и IL-8 в кондиционерами среднего согласно стандартных кривых. Печать результатов после нормализации числа клеток. Вычисление среднего значения для дубликатов образцов.
      Примечание: ELISAs следует самостоятельно повторить, что по крайней мере 3 x и средние значения следует рассчитаны на эти результаты (рис. 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1показан пример H-Ras индуцированного старения. Инфекция WI-38 нормальной фибробластов с H-RasV12 ретровируса индуцированной драматические морфологические изменения (рис. 1B). Кроме того как показано на рисунке 1 c, окрашивание активность β-Гал SA удивительно была увеличена на H-RasV12 выражение. Более 70% клеток показали SA β-Гал пятнать деятельности 6 d после инфекции ретровируса H-RasV12, указывающее, что выражение H-RasV12 успешно индуцирует сотовой старение клеток WI-38, как мы и другие группы сообщалось ранее21 ,22.

Рисунок 2 показывает представитель результаты DCF-DA окрашивание анализа для контроля уровня рос во время H-Ras индуцированной клеточного старения. Повышение уровня внутриклеточного ROS наблюдаются уже 2 дня после выражения H-Ras и поддерживаются до точки 6-дневное время. Между тем индукции SASP показывает различные кинетики. Увеличение в мРНК уровни IL-6 и IL-8, представитель SASP факторов, наблюдаются от 4 дней после выражения H-Ras и пик в 8-дневное время точке (рис. 3). Как показано на рисунке 4, секретируемые уровни IL-6 и IL-8 показывают аналогичные увеличивается, в соответствии с результатами ПЦР в реальном времени. Эти результаты предлагают разные роли в индукции сотовой старение рос и SASP.

Figure 1
Рисунок 1 : Морфологические изменения и увеличение SA β-Гал пятнать во время старения H-Ras индуцированной. (A) Эта группа показывает экспериментальной процедуры для индукции H-Ras индуцированного старения в клетках WI-38. (B) SA β-Гал пятнать была выполнена в точке указано время после заражения клеток WI-38 с ретровируса H-RasV12; Здесь показаны представителя изображения SA β-Гал окрашивания. (C) SA β-Гал положительных клеток были подсчитаны в трех независимых экспериментах. Результаты представлены как средние значения, а погрешностей представляют стандартных отклонений (SD). P < 0.01, студента t-теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 2
Рисунок 2 : Увеличение уровня внутриклеточная ROS во время старения H-Ras индуцированной. (A) WI-38 клетки были заражены ретровируса H-Ras и витражи с DCF-DA (50 мкм) в точках указанного времени. Интенсивности флуоресценции DCF-да были количественно с помощью проточный цитометр. Представитель гистограммы интенсивности флуоресценции DCF-Да в точках 0 - и 6-d время показываются. (B) представитель гистограммы интенсивности флуоресценции DCF-Да в точках 0 - и 6-день время выводятся вместе для удобства сравнения. (C) DCF-да интенсивности флуоресценции в H-Ras индуцированного старения была измерена в назначенное время очка 3 x. Результаты представлены как средние значения, а погрешностей представляют стандартных отклонений (SD). P < 0,05 и ** P < 0.01, студента t-теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Связанные с количественной оценки SASP mRNAs в H-Ras индуцированного старения. РНК был подготовлен WI-38 ячеек в указанное время точках после инфекции ретровируса H-RasV12. Эти панели показывают индукции ИЛ-6 (A) и (B) ИЛ-8 выражение анализируется ПЦР с использованием конкретных грунты, перечисленных в таблице 1. Уровни mRNA актина были использованы для нормализации. Нормализованное ИЛ-6 или уровни mRNA ИЛ-8 в пробе 0-день были равным 1 и изменения относительной раза были рассчитаны. Эксперименты были независимо неоднократные 3 x. Результаты представлены как средние значения, и погрешностей указывают стандартных отклонений (SD). P < 0,05 и ** P < 0.01, студента t-теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 4
Рисунок 4 : Количественная оценка секретируемые SASP факторы во время старения H-Ras индуцированной. Эти панели показывают стандартные кривые, созданные с ИЛ-6 (A) и ИЛ-8 (C) стандартами. Кондиционерами СМИ были собраны из WI-38 ячеек в указанное время точках после инфекции ретровируса H-RasV12. Выделяется ИЛ-6 (B) и ИЛ-8 уровней (D) были проанализированы с ИЛ-6 и IL-8 ELISA kit, соответственно. Эксперименты были независимо неоднократные 3 x. Результаты представлены как средние значения, и погрешностей указывают стандартных отклонений (SD). P < 0,05 и ** P < 0.01, студента t-теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Имя Джин Форвард грунтовка Обратный грунтовка
IL-6 5'-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3' 5'-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3'
ИЛ-8 5'-ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3' 5'-AACCCTCTGCACCCAGTTTTC-3'
актина 5'-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3' 5'-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3'

Таблица 1: Реальном масштабе времени PCR праймеры для SASP факторов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы представили методы мониторинга внутриклеточная ROS уровней во время H-Ras индуцированного старения в нормальной фибробластов WI-38. Внутриклеточные уровни рос в живых клеток можно измерить количественно клетки проницаемой реагент DCF-да и проточная цитометрия. После клеточного поглощения DCF-DA deacetylated, внутриклеточный эстераз и, впоследствии, окисленные ROS сформировать высоко флуоресцентные 2', 7'-dichlorofluorescein (DCF). Флуоресценции DCF могут быть обнаружены проточной цитометрии, используя значения параметров FL1 детектор (зеленая Флуоресценция). С помощью метода окрашивания DCF-Да, мы успешно обнаружено увеличение уровня рос во время H-Ras индуцированной сотовой старение в нормальной фибробластов WI-38. Этот метод может использоваться в различных моделях клеточного старения для мониторинга изменений в уровнях рос. В дополнение к ФСР-DA окрашивание, дополнительные методы, используемые для измерения индукции ROS включают в себя мониторинг уровня окисленного белки23 и confocal микроскопии анализа с использованием флуоресцентных красителей ROS-зависимых от24. Таким образом дальнейшее подтверждение изменений в уровнях ROS, с использованием дополнительных методов является желательным.

Недавно мы показали, что рос уровней увеличилась в раковых клетках во время p53-индуцированного старения, а также21H-Ras индуцированного старения. Повышенный уровень внутриклеточного ROS наблюдаются до увеличения SA β-Гал пятнать деятельность, предлагая причинный роль рос в индукции клеточного старения. Интересно, что увеличение уровней рос отдельно контролируется с Akt-NF-κB-NOX4 путь, а арест клеточного цикла при посредничестве p2121. Ли акт регулирует также увеличение рос в других типах клеточного старения бы интересно исследовать.

Мы также внедрены методы для анализа мРНК и выделяется уровни белка SASP факторов IL-6 и IL-8 во время H-Ras индуцированного старения. С помощью ПЦР, мы количественно индукции ИЛ-6 и IL-8 мРНК в стареющей клетки WI-38. Мы изучили уровни mRNA актина как внутреннего контроля для нормализации, но GAPDH мРНК также может использоваться в качестве внутреннего контроля. 18S рибосомной РНК (рРНК) является другой ген уборки, которая обычно используется в качестве внутреннего контроля в экспериментах ПЦР. Однако потому что рРНК транскрипции и рибосома созревания регулируются во время ареста клеточного цикла и клеточного старения25,26, 18S рРНК не может быть хорошим внутреннего контроля для исследования клеточного старения. ELISA, используя средство кондиционером от стареющей клетки WI-38, показали аналогичные увеличивается в секретируемые ИЛ-6 и IL-8 уровней. В соответствии с понятием, что SASP разрабатывается на стадии «зрелых» старение19, увеличение в IL-6 и IL-8 секреции обнаруживаются в более поздний момент времени, чем увеличение уровней рос. Примечательно SASP факторы различаются в зависимости от типов клеток и старение индукции условия27. Таким образом соответствующие факторы SASP должен быть выбран согласно модели клеточного старения.

Хотя мы подтвердили H-Ras индуцированного старения путем мониторинга морфологических изменений и индукции SA β-Гал окрашивание активности, клеточного старения должен быть проверен путем наблюдения за старение дополнительные характеристики, включая необратимой потере потенциал распространения, старение связанные гетерохроматин очагов (SAHF), факторы SASP, активации супрессоров опухолевого роста, p53 и p16INK4a, более сигналов повреждения ДНК и стойких ядерных очагов, определяется как сегменты ДНК с изменениями chromatin, армирующие старение (ДНК-ШРАМЫ). Однако важно помнить, что неоднородность характеристик старение старения разных типов. Некоторых биомаркеров старения можно наблюдать только в некоторых конкретных типов клеточного старения. К примеру SAHF обычно проявляются в OIS28,29.

Представлять автономной роста арест, вызванные условиями искусственные культуры первоначально считался клеточного старения. Однако исследования в последние полвека продемонстрировали важность клеточного старения в различных условиях патофизиологические, включая старение и рак. Ранее было доказано причинно-следственной связи между сотовой старение и ткани, связанные с возрастом ухудшение в BubR1 progeroid мыши модели30,31. Таким образом Управление старение клеток через либо ликвидации стареющей клетки или модуляции SASP в настоящее время рассматривается как перспективной стратегией для заболеваний, связанных с возрастом. Действительно, недавние исследования продемонстрировали, что ликвидация стареющей клетки будет перспективным лечения возрастных патологий, включая истощения стволовых клеток, потеря костной массы, выпадение волос и остеоартрит32,33, 34,35,36. Более глубокое понимание молекулярных механизмов старения индукции и старение фенотипов, включая SASPs, обеспечит улучшенные стратегии для ориентации старение путем уменьшения возможных недостатков и выборочно таргетинг только вредное функции стареющей клетки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грант от Национальный исследовательский фонд Кореи (2015R1D1A1A01060839) (для Юнг Ким Ен) и Национальный фонд исследований Кореи (NRF) Грант, финансируемых правительством Кореи (MSIT) (нет 2016R1A2B2008887, № 2016R1A5A2007009) (для Jeanho Yun).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
poly-L-lysine Sigma-Aldrich P2636
BOSC 23 ATCC CRL-11269
FBS GIBCO 16000-044
penicillin/streptomycin wellgene LS202-02
PBS Hyclone SH30013.02
DMEM GIBCO 12800-082
OPTI-MEM  GIBCO 31985-070
pBabe puro-H-RasV12  Addgene 1768
pGAG/pol Addgene 14887
pVSVG Addgene 1733
Turbofect Thermo Fisher Scientific R0531
polybrene Sigma-Aldrich H9268 8 mg/mL
puromycin Sigma-Aldrich P8833 2 mg/mL 
formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) Sigma-Aldrich B4252
potassium ferrocyanide Sigma-Aldrich B4252
potassium ferricyanide Sigma-Aldrich P9387
trypsin-EDTA wellgene LS015-01
DCF-DA Sigma-Aldrich  D6883 10 mM 
Trizol Thermo Fisher Scientific 15596026
MMLV Reverse transcriptase Promega M1701
SYBR Green PCR master 2x mix Takara PR820A
Random Primer Promega C118A
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
Ultra-pure distilled water Invitrogen 10977015
Human IL-6 ELISA assay PeproTech #900-TM16
Human IL-8 ELISA assay PeproTech #900_TM18
EQUIPMENTS
0.45 μm syringe filter sartorius 16555
Parafilm BEMIS  PM-996
Microscope NIKON TS100
Flow cytometer BD Bioscience LSR Fortessa
Amicon Ultra-4ml Merk Millipore UFC800324
NanoDrop spectrophotometer BioDrop 80-3006-61
Real-time PCR System Applied Biosystems ABI Prism 7500
ELISA Reader Molecular Devices EMax microplate reader

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
  3. Braig, M., et al. Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development. Nature. 436 (7051), 660-665 (2005).
  4. Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
  5. Collado, M., et al. Tumour biology: senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642 (2005).
  6. Malaquin, N., Martinez, A., Rodier, F. Keeping the senescence secretome under control: Molecular reins on the senescence-associated secretory phenotype. Experimental Gerontology. 82, 39-49 (2016).
  7. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes & Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  8. Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Experimental Cell Research. 314 (9), 1918-1922 (2008).
  9. Furumoto, K., Inoue, E., Nagao, N., Hiyama, E., Miwa, N. Age-dependent telomere shortening is slowed down by enrichment of intracellular vitamin C via suppression of oxidative stress. Life Sciences. 63 (11), 935-948 (1998).
  10. Lee, A. C., et al. Ras proteins induce senescence by altering the intracellular levels of reactive oxygen species. The Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 7936-7940 (1999).
  11. Chen, Q., Ames, B. N. Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).
  12. Dumont, P., et al. Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast. Free Radical Biology & Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).
  13. Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).
  14. Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
  15. Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).
  16. Rodier, F., Campisi, J. Four faces of cellular senescence. The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).
  17. Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).
  18. Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).
  19. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Kim, Y. Y., et al. Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence. Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).
  22. Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a. Cell. 88 (5), 593-602 (1997).
  23. Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).
  24. Wojtala, A., et al. Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).
  25. Duncan, F. E., et al. Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte. Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).
  26. Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence. Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).
  27. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  28. Kosar, M., et al. Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a). Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).
  29. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  30. Baker, D. J., et al. Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency. Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).
  31. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  32. Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
  33. Farr, J. N., et al. Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice. Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).
  34. Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
  35. Yosef, R., et al. Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL. Nature Communications. 7, 11190 (2016).
  36. Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).

Tags

Биология развития проблема 138 сотовой старение H-Ras Рось SASP IL-6 IL-8 старение
Количественное измерение реактивнооксигенных видов и старение связанные секреторной фенотип в нормальной фибробластов во время онкогена индуцированного старения
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, Y. Y., Um, J. H., Yun, J. A… More

Kim, Y. Y., Um, J. H., Yun, J. A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence. J. Vis. Exp. (138), e57890, doi:10.3791/57890 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter