Summary
ROS intracelular foi mostrado para jogar um papel importante na indução da senescência celular. Aqui, descrevemos um ensaio sensível para quantificação dos níveis ROS durante a senescência celular. Nós também fornecemos protocolos para avaliar o fenótipo secretor associada a senescência, que alegadamente contribui para várias desordens relacionadas com a idade.
Abstract
Senescência celular tem sido considerada um estado de detenção do crescimento irreversível após o esgotamento da capacidade proliferativa ou exposição a várias tensões. Estudos recentes têm estendido o papel da senescência celular para vários processos fisiológicos, incluindo desenvolvimento, cicatrização de feridas, vigilância imunológica e disfunção do tecido relacionadas com a idade. Embora a detenção do ciclo celular é uma característica crítica da senescência celular, uma produção de (ROS) de espécies reativas de oxigênio intracelular aumento também foi demonstrada a desempenhar um papel importante na indução da senescência celular. Além disso, estudos recentes revelaram que células senescentes apresentam potente parácrina atividades em células e tecidos através de um fenótipo secretor associada a senescência (SASP) vizinhas. O acentuado aumento no interesse sobre estratégias terapêuticas contra senescência celular enfatiza a necessidade de uma compreensão precisa de mecanismos de senescência, incluindo ROS intracelular e a SASP. Aqui, descrevemos os protocolos para avaliar quantitativamente os níveis intracelulares de ROS durante a senescência celular H-Ras-induzido usando tintura fluorescente ROS-sensíveis e citometria de fluxo. Além disso, apresentamos técnicas sensíveis para a análise da indução da expressão de RNAm e secreção de fatores SASP. Esses protocolos podem ser aplicados a vários modelos de senescência celular.
Introduction
Mais de 50 anos atrás, Hayflick e Moorhead revelaram que as células normais entrem prisão de crescimento irreversível após o esgotamento do seu potencial proliferativa após um determinado número de divisões celulares1. Este fenómeno é agora conhecido como senescência replicative e acredita-se que correlaciona-se fortemente com o envelhecimento dos2. Embora a progressiva erosão dos telômeros é considerada das principais causas da senescência replicative, várias tensões celulares, tais como o DNA danos, ativação oncogênica e estresse oxidativo, têm sido relatados para induzir um outro tipo de senescência celular chamado de "senescência precoce" ou "senescência induzida por estresse". Curiosamente, senescência prematura desempenha um papel de tumor-supressora potente sobre a ativação de oncogenes, tais como H-Ras e BRAF. Estudos de modelos de rato e tecidos humanos produziram fortes evidências que biomarcadores de senescência celular eram predominantemente presentes em lesões pré-malignas onde oncogênica Ras e BRAF são ativados, mas foram diminuídos em cânceres malignos que desenvolveu a partir Estas lesões3,4,5. Além de seu papel no envelhecimento e supressão de tumor, senescência celular tem demonstrada em estudos anteriores para jogar um papel em vários processos fisiológicos, incluindo a cicatrização de feridas, reparação tecidual, vigilância imunológica e desenvolvimento embrionário6.
Embora a prisão de crescimento tem sido estudado extensivamente como uma marca registrada da senescência celular7, um significativo corpo de evidência sugere que espécies reativas de oxigênio intracelular (ROS) também contribuem para a senescência celular8. A elevação dos níveis ROS durante vários tipos de senescência celular, incluindo replicative senescência e senescência induzida pelo oncogene (OIS), foi originalmente relatada há décadas9,10. Mais diretamente, tratamento exógeno com uma dose subletais de H2O2 induz a senescência11,12. A inibição de enzimas ROS-eliminação, tais como a SOD1, também provoca senescência prematura13. Em contraste, baixas condições de oxigênio ambiente e aumentando o atraso de eliminação de ROS o início da senescência10,14,15. Estes resultados indicam, sem dúvida, que ROS são importantes mediadores ou determinantes da indução da senescência celular. No entanto, como ROS contribuem para a indução da senescência celular e como ROS níveis são elevados durante a senescência celular requerem mais investigação.
Estudos recentes têm revelado que células senescentes têm atividades parácrina potente em células e tecidos através de uma de16,de SASP17vizinhas. No tecido envelhecido, células senescentes promovem relacionadas com o envelhecimento do tecido disfunções através de muitos caminhos através de SASP além uma autónoma depleção de células proliferativas. Vários fatores proinflammatory, tais como IL-6, IL-8, TGFβ e metaloproteinases de matriz (MMPs), secretado pelas células senescentes, causam disfunções relacionadas com o envelhecimento do tecido através do comprometimento da homeostase do tecido, destruição da arquitetura do tecido, senescência das células vizinhas e inflamação estéril18,19. No entanto, SASPs pode ter efeitos benéficos, dependendo do contexto biológico. Além disso, a natureza heterogenetic do SASPs depende do tipo de células senescentes e o estágio de célula, enfatizando a necessidade de investigação mais19.
Aqui, descrevemos técnicas baseadas em citometria rápidas e sensíveis para avaliar os níveis intracelulares de ROS durante OIS. Além disso, métodos de análise dos fatores SASP usando a reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (qPCR) e ELISA são introduzidos.
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Protocol
1. induzindo Senescence Oncogene-induzido
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Preparando um H-RasV12 retrovírus
- Brasão da placa de cultura de 100mm, adicionando 2 mL de 0,001% poli-L-lisina/fosfato tampão salino (PBS) por 5 min à temperatura ambiente.
- Remover a solução de poli-L-lisina, usando uma pipeta de vidro ligada a um vácuo e lavar o prato de cultura, adicionando 2 mL de 1X PBS.
- Placa de 3 x 106 ecotropic BOSC-23 embalagem células na cultura revestida prato com de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina e cultura-los a 37 ° C numa cultura de tecido CO2 incubadora para 1 d.
- No dia seguinte, transfect 2 µ g de DNA de puro-H-RasV12 pBabe juntamente com DNA retroviral embalagens (2 µ g de pGAG/pol e 0,25 µ g de pVSVG) usando um reagente de Transfeccao para 8 h de acordo com as instruções do fabricante.
- Remova a mídia do transfection e adicionar 8 mL de mídia fresca.
- Após 48 h, recolher a mídia que contém as partículas virais e remover quaisquer restos celulares por centrifugação a 500 x g durante 5 min.
- Os H-Ras contendo vírus meios de filtro com um filtro de seringa de 0,45 µm.
Nota: Evite qualquer congelamento e descongelamento dos sobrenadantes de vírus por uma infecção viral eficiente. Para obter a melhor eficiência, use um vírus que foi colhido no mesmo dia como infecção.
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Infectando WI-38 fibroblastos humanos normais com o retrovírus H-RasV12
- Placa de 5 x 104 WI-38 células numa placa de cultura de 60 mm com DMEM contendo 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina 1 d antes da colheita o retrovírus H-RasV12 e cultura-los para o dia 1 a 37 ° C.
- Remover o meio de crescimento, no dia seguinte e adicione 1 mL de H-RasV12 mídia de retrovírus. Adicione um adicional 1 mL de meio de cultura contendo 2 µ l de uma solução estoque de polybrene (8 mg/mL em água destilada). Incube a amostra durante 1 dia em um umidificado e 37 ° C, 5% CO2 incubadora de cultura de tecidos.
- Retire a mistura do retrovírus H-RasV12 24 h depois e lave as células 2 x com PBS 1x. Adicionar o meio de crescimento e tratar as células com 2 µ g/mL de puromicina para 2 dias em um umidificado e 37 ° C, 5% CO2 incubadora de cultura de tecidos.
- Depois d 2 de puromicina, remover o meio de crescimento e lavar as células 2 x com PBS 1x. Adicionar o meio de crescimento e cultura de células em um umidificado e 37 ° C, 5% CO2 incubadora até a hora indicada (ver figura 1A para um diagrama esquemático).
2. monitoramento senescência através de coloração de senescência-associado β-galactosidase
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Prepare as seguintes soluções estoque.
- Prepare-se 20 mg/mL de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) em dimetil formamida (DMF). Armazenar a solução a-20 ° C.
- Preparar um tampão de fosfato de sódio/ácido cítrico dissolvendo 3,377 g de Na2HPO4.7h2O (126 mM) e 0,708 g de ácido cítrico (36,8 mM) em 100 mL de água destilada. Ajuste o pH a 6.0, se necessário.
- Prepare o ferrocianeto de potássio 0,5 M. Armazenar a solução no escuro a 4 ° C.
- Prepare o ferricianeto de potássio 0,5 M. Armazenar a solução no escuro a 4 ° C.
Nota: O pH da solução coloração associada a senescência β-galactosidase (SA β-gal) é essencial para obter resultados precisos.
- Fazer uma solução de coloração de β-gal fresca SA diluindo a solução estoque contendo 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, ferrocianeto de potássio 5 mM, ferricianeto de potássio 5 mM, 20% (v/v) tampão de fosfato de sódio/ácido cítrico e 1 mg/mL de X-gal.
- Remova a mídia de cultura e lavar as células 1 x com PBS 1x. Fixe as células com formaldeído 3% por 5 min à temperatura ambiente.
Nota: As células que não estão infectadas com o retrovírus devem ser usadas como um controle negativo. As células não infectadas controle devem continuar a ser passado para manter seu status de proliferação. - Remover a solução de fixação das células e lave-os com PBS 1x. Adicione 1 x SA solução coloração β-gal (1,5 mL em um prato de cultura 60mm) recém-preparada. Selar o prato com uma película de parafina para impedir a secagem e incube-lo por 24 h a 37 ° C. Alternativamente, incube os pratos juntos em uma câmara de umidade.
Nota: A fixador solução contendo 3% de formaldeído deve ser eliminada como resíduos perigosos. Uma incubadora sem CO2 é desejável, para evitar mudanças de pH durante a incubação. - Verificar o status de coloração das células com um microscópio no dia seguinte; Células β-gal-positivo de SA aparecem em azuis na região perinuclear.
Nota: As pilhas proliferating de controle mostram uma baixa frequência de células β-gal-positivo de SA. Se a coloração é muito leve, continuar a incubação por um período ligeiramente maior (ver figura 1B para exemplos representativos). - Adquirir uma imagem de coloração de β-gal SA com uma câmera CCD usando um 10 X ou maior lente objetiva. Capturar um número suficiente de imagens para calcular a porcentagem de coloração (> 200 células).
- Calcule a percentagem de células β-gal-manchado de SA quantificando o número das células β-gal-positivo SA em relação ao número total de células.
Nota: SA β-gal coloração deve ser repetido independentemente pelo menos 3 x e os valores médios devem ser calculado com base nos resultados de experimentos replicar (Figura 1 C). A densidade de célula apropriada é crítica para o experimento de coloração SA β-gal. Uma confluência de alta pode interferir com a mudança para uma morfologia associada a senescência e induzir um sinal falso-positivo nas células de controle.
3. quantificar uma indução de espécies reativas de oxigênio durante a senescência de H-Ras-induzido
- Placa de 2 x 105 WI-38 células em uma cultura de 60 mm prato e provocam a senescência H-Ras-induzida, conforme descrito na etapa 1.
Nota: Este protocolo pode ser aplicado a outros tipos de modelos de senescência celular. - Retire o meio de crescimento em ponto do tempo indicado (2, 4 ou 6 dias) e lave as células com PBS 1x. Separar as células, tratando-as com 1 mL de solução de tripsina/EDTA 0,05% e inativar a tripsina, adicionando 1 mL de meio de cultura contendo 10% FBS. Determine a contagem de células.
- Transferir 1 x 105 células para um tubo cônico de 15 mL e recolher as células por centrifugação a 500 x g durante 5 min.
- Prepare-se fresco 2', 7'-dichlorofluorescin diacetato (DCF-DA) mídia coloração pela adição de 50 µ l de 10mm DCF-DA 10 mL de meio de cultura (a concentração de trabalho de DCF-DA é 50 µM).
Nota: DCF-DA é sensível à luz. Exposição à luz deve ser evitada. A concentração do DCF-DA e o tempo de coloração pode ser ajustada dependendo do tipo de célula. - Retire cuidadosamente o meio de crescimento o tubo cônico de 15 mL e adicionar 1 mL de meio de coloração recentemente preparado DCF-DA. Cuidadosamente Ressuspender o celular e ele incubar a 37 ° C por 30 min no escuro. Inclua uma amostra não-manchado como um controle negativo de coloração.
Nota: As pilhas Proliferating não manchadas com DCF-DA devem ser preparadas como um controle negativo. - Coletar as células por centrifugação a 500 x g durante 5 min e lavá-los 1 x com 2 mL de 1X PBS. Ressuspender as células com 1 mL de 1X PBS e transferir a amostra para a cela de fluorescência-ativado apropriada classificação tubo (FACS).
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Medir a 2 ', 7 '-Dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCF-DA) sinal de fluorescência usando um citômetro de fluxo, equipado com uma fonte de laser apropriado. Excitar as amostras com um laser azul (488 nm) e detectar a fluorescência emitida com um detector de nm 530 ± 30 (FITC) usando uma escala logarítmica.
- Analise as células de controlo negativo não manchadas primeiro. Em um terreno de ponto de dispersão para a frente (FSC) versus lado dispersão (SSC), selecione as células vivas, usando uma ferramenta associada e eliminar as células mortas e restos celulares.
Nota: A alteração de tamanho de célula deve ser cuidadosamente monitorizada na trama do ponto do FSC contra SSC. Se o tamanho das células senescentes é aumentado significativamente, a DCF-DA intensidade deve ser comparada em populações de células do mesmo tamanho após retenção na trama do ponto do FSC contra SSC. - Em um histograma de single-parâmetro exibindo DCF-DA (488 nm) fluorescência na escala logarítmica do x-eixo e o número de eventos (número de telemóvel) na escala linear do y-axis, ajustar a tensão do laser 488 nm para colocar o pico de as células não-manchado na borda esquerda.
- Analise a DCF-DA vitrais amostras e registrar eventos de pelo menos 10.000 para cada amostra. Adquira o valor de média de fluorescência de cada amostra usando software de análise específico para o citômetro de fluxo.
Nota: As medições de ROS devem ser repetidas independentemente pelo menos 3 x e os valores médios devem ser calculado a partir destes resultados. Representante de H-Ras-induzido senescência resultados são mostrados na Figura 2.
- Analise as células de controlo negativo não manchadas primeiro. Em um terreno de ponto de dispersão para a frente (FSC) versus lado dispersão (SSC), selecione as células vivas, usando uma ferramenta associada e eliminar as células mortas e restos celulares.
4. quantificar a IL-6 e a expressão de RNAm de IL-8 para associada a senescência secretoras fenótipo análise usando uma reação em cadeia da polimerase em tempo real
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Preparação de RNA total
- Placa de 3 x 105 WI-38 células em uma cultura de 100 mm prato em DMEM contendo 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina e cultura-los a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecido para 1 dia. Prepare-se culturas duplicadas para cada ponto de tempo.
- Induzi a senescência por infectar as células com o retrovírus H-RasV12, conforme descrito na etapa 1.
- 1 dia antes da colheita, lavar as células 2 x com PBS 1x e adicionar 3 mL de DMEM sem FBS.
Nota: Este passo é realizado para produzir o meio condicionado utilizado para ELISA, conforme descrito na etapa 5. Fome de soro pode induzir a expressão de IL-6 e IL-8 mRNAs em algumas células sensíveis. Assim, a IL-6 e a expressão de RNAm de IL-8 em células cultivadas com e sem fome de soro devem ser comparadas inicialmente. Se a fome de soro induz mudanças significativas na expressão do mRNA de IL-8 ou IL-6, o RNA total para qPCR e o meio condicionado para ELISA devem ser preparadas separadamente. - Coletar o meio condicionado de cada amostra 24 horas mais tarde e armazenar o médio a-80 ° C para ELISA.
- Separar as células, tratando-as com 1 mL de solução de tripsina/EDTA 0,05% e inativar a tripsina, adicionando 1 mL de meio de cultura contendo 10% FBS. Determine a contagem de células para a normalização dos resultados ELISA conforme descrito na etapa 5. Recolher as células em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL por centrifugação a 500 x g durante 5 min.
- Remover o meio por sucção suave e adicione 1 mL de solução de extração de RNA. Então, o vórtice do tubo microcentrifuga vigorosamente durante 15 s. Posteriormente, adicionar 200 µ l de clorofórmio e vigorosamente vórtice a mistura novamente para um adicional de 15 s.
- Centrifugar os tubos de amostra a 17.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Em seguida, transferi com cuidado, a fase superior para um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL.
Nota: A interfase e a fase orgânica inferior não devem ser perturbados durante a transferência da fase superior para um novo tubo. - Adicione 400 µ l de isopropanol para precipitar o RNA e misturá-los bem gentilmente por inversão. Em seguida, incube o tubo em temperatura ambiente por 10 min.
- Centrifugar o tubo a 17.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Em seguida, descarte o sobrenadante, tendo o cuidado de manter a pelota do RNA. Lave o RNA adicionando 1 mL de etanol 75% e inverter o tubo 2 – 3 x. Centrifugar o tubo por 5 min a 17.000 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
- Secar a pelota do RNA em temperatura ambiente e dissolver o RNA em 50 µ l de pyrocarbonate de dietilo (DEPC)-tratados com água destilada. Usando 1 µ l de solução de RNA, quantificar a concentração de RNA total com um espectrofotômetro.
Nota: Excessos irão reduzir a solubilidade do RNA; Portanto, Evite excessos do RNA.
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preparação do cDNA
- Prepare a mistura de transcrição reversa reação para cada amostra, adicionando o seguinte em um tubo de parede fina de PCR: 2 µ g de RNA total (ajuste o volume para 10 µ l com água livre de RNase), 2 µ l de 10x buffer de RT, 1 µ l de um primer aleatório (50 pmol), 0,8 µ l do mix de x dNTP 25 (100 mM), 1 µ l de MMLV reverse transcriptase (50 U / µ l) e 5.2 µ l de RNase-livre da água.
- Configurar o programa de reação de transcrição reversa sobre o termociclador com as seguintes condições: tubos de 42 ° C por 60 min e 95 ° C por 5 min. lugar o PCR no termociclador e iniciar o programa.
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Reação em cadeia da polimerase em tempo real
- Prepare a mistura de mestre de PCR em tempo real para todas as reações. A mistura de reação para cada amostra é a seguinte: 25 µ l de 2 x real-time PCR Master Mix, 1 µ l cada dos primers para diante e reversos para IL-6 ou IL-8 e 21 µ l de água destilada ultra-pura (DNase e RNase-livre). Consulte a tabela 1.
Nota: Prepare a mistura de reação de PCR em tempo real para cada amostra contendo primers de RNA de actina como um controle interno. GAPDH também pode ser usado como um controle interno para normalização. - Adicione 48 µ l do mix master e 2 µ l de produto de 3 vezes do cDNA diluído com água a cada poço em uma placa de 96 poços óptico qPCR. Realize cada reação em triplicado. Prepare um controle bem que não contém o modelo de cDNA como um controle PCR.
- Configurar o programa de reação de PCR em tempo real sobre o termociclador com as seguintes condições: 10 min a 95 ° C, s de of15 40 ciclos a 95 ° C (desnaturação) e 1 min a 60 ° C (recozimento e extensão).
- Realizar o PCR em tempo real e gravar o valor limite de ciclo (CT) após a conclusão dos ciclos de PCR. Calcule os níveis de RNAm para IL-6 ou IL-8 usando o 2- ΔΔCΤ método20.
Nota: A dobra relativa mudança na expressão é determinada após a normalização dos níveis de actina, usando a seguinte fórmula:
Dobre a mudança = 2-Δ (ΔCT)
Aqui,
ΔCT = CT, IL-6 ou IL-8- CT, actina; e
Δ (ΔCT) =T, estimulado- ΔC da ΔCT, controle. - Calcule o valor médio para cada amostra duplicada.
Nota: qPCR deve ser repetido independentemente pelo menos 3 x e os valores médios devem ser calculado com base nestes resultados. Representante de H-Ras-induzido senescência resultados são mostrados na Figura 3. Fome de soro pode induzir a expressão dos mRNAs IL-6 e IL-8 em algumas células sensíveis. Assim, a IL-6 e a expressão de RNAm de IL-8 em células cultivadas com e sem fome de soro devem ser comparadas inicialmente. Se a fome de soro induz mudanças significativas na expressão de IL-6 ou mRNA de IL-8, o RNA total para qPCR e o meio condicionado para ELISA devem ser preparadas separadamente.
- Prepare a mistura de mestre de PCR em tempo real para todas as reações. A mistura de reação para cada amostra é a seguinte: 25 µ l de 2 x real-time PCR Master Mix, 1 µ l cada dos primers para diante e reversos para IL-6 ou IL-8 e 21 µ l de água destilada ultra-pura (DNase e RNase-livre). Consulte a tabela 1.
5. quantificação dos níveis de proteínas secretados de IL-6 e IL-8 para uma análise de fenótipo secretor senescência-associado usando ELISA
- Degelo a 3 mL de meio condicionado de células senescentes WI-38 colhidas conforme descrito na etapa 4. Retire os restos de células por centrifugação a 500 x g durante 5 min.
- Concentre-se o meio condicionado 10-fold por centrifugação a 3.000 x g por 20 min usando uma unidade de filtro centrífugo.
Nota: A concentração do meio condicionado pode não necessariamente depende do tipo de amostra. -
Execute o ELISA usando 50 µ l de cada amostra concentrada do meio condicionado com os kits de IL-6 e IL-8 ELISA apropriados.
Nota: Teste cada amostra em dois poços de ELISA. Porque cada ponto do tempo é duplicado na etapa 4, esta análise nos permite monitorar variações em ambos o ensaio de ELISA e a técnica de preparação de amostra.- Para o revestimento de chapa de ELISA, dilua a IL-6 ou anticorpo de IL-8, com uma concentração de 0,5 µ g/mL 1X PBS para IL-6 ou 0,125 µ g/mL para o IL-8. Adicione 100 µ l dos anticorpos diluídos a cada poço da placa de ELISA. A placa com uma placa de ELISA filme de vedação do selo e incubar sem tremer durante a noite em temperatura ambiente.
- Remova a solução de anticorpo por aspiração. Lavar cada bem 4x com 300 µ l de tampão de lavagem 1X (0,05% Tween-20 em PBS). Adicione 300 µ l de tampão de bloqueio (1% de BSA em PBS) para cada poço. Incube a temperatura ambiente durante 1 h.
- Remova a solução de bloqueio por aspiração. Lave cada bem 4x com 300 µ l de tampão de lavagem 1X. Prepare-se ELISA serialmente diluída padrões em um tampão de diluição (0,05% Tween-20 e 0,1% BSA em PBS) para gerar uma curva padrão.
Nota: A diluição serial para IL-6 é 31,25, 62,5, 125, 250, 500, 1.000 e 2.000 pg/mL. A diluição serial para IL-8 é 2.34 4.69, 9,38, 18.75, 37,5, 75 e 150 pg/mL. - Adicione 100 µ l de solução-padrão ou 100 µ l da solução da amostra (50 µ l de meio concentrado com 50 µ l de tampão de diluição) a cada poço. Incube os poços em temperatura ambiente por 2 h.
- Remova a solução padrão ou amostra por aspiração. Lave cada bem 4x com 300 µ l de tampão de lavagem 1X. Dilua o anticorpo da deteção com o tampão de diluição para uma concentração de 0,1 µ g/mL para IL-6 ou 0,25 µ g/mL para o IL-8. Adicione 100 µ l do anticorpo diluído por bem. Incube os poços em temperatura ambiente por 2 h.
- Remova a solução de anticorpo por aspiração. Lave cada bem 4x com 300 µ l de tampão de lavagem 1X. Dilua a peroxidase de streptavidin-rábano (HRP) no tampão de diluição para uma concentração de 0,05 µ g/mL. Adicione 100 µ l da solução de streptavidin HRP por bem. Incube os poços em temperatura ambiente por 30 min.
- Remova a solução de anticorpo por aspiração. Lave cada bem 4x com 300 µ l de tampão de lavagem 1X. Adicione 100 µ l de 3, 3 ', 5, 5 '-tetrametilbenzidina (TMB) de solução de substrato a cada poço. Incube os poços em temperatura ambiente por 20 min permitir o desenvolvimento de cor. Pare a reação adicionando-se 100 µ l de uma solução de paragem de HCl 1 M.
- Leia a absorvância de cada poço com um leitor de ELISA a 450 nm.
- Traça a curva de calibração para os padrões gerados. Calcule as concentrações de IL-6 e IL-8 na meio condicionado de acordo com as curvas padrão. Plotar os resultados após uma normalização para a contagem de células. Calcule os valores médios para as amostras duplicadas.
Nota: Elisa deve ser repetida independentemente pelo menos 3 x e os valores médios devem ser calculado com base nestes resultados (Figura 4).
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Representative Results
Um exemplo de H-Ras-induzido senescência é mostrado na Figura 1. Uma infecção de WI-38 fibroblastos humanos normais com o retrovírus H-RasV12 induzida por dramáticas mudanças morfológicas (figura 1B). Além disso, como mostrado na Figura 1, SA β-gal coloração atividade foi aumentou notavelmente sobre expressão de H-RasV12. Mais de 70% das células mostrou SA β-gal coloração atividade 6D após a infecção de retrovírus do H-RasV12, indicando que uma expressão de H-RasV12 com sucesso induz a senescência celular nas células WI-38, como nós e outros grupos anteriormente relataram21 ,22.
A Figura 2 mostra resultados representativos da análise DCF-DA coloração para monitorar níveis ROS durante a senescência celular H-Ras-induzida. Aumento dos níveis intracelular do ROS é observado logo em 2 dias após a expressão de H-Ras e é mantido até ao ponto em vez de 6 dias. Enquanto isso, a indução do SASP mostra diferente cinética. Aumenta os níveis de mRNA de IL-6 e IL-8, representante fatores SASP, observam-se de 4 dias, após a expressão de H-Ras e pico no ponto de tempo de 8 dias (Figura 3). Conforme ilustrado na Figura 4, os níveis de IL-6 e IL-8 secretados mostram aumentos semelhantes, consistentes com os resultados PCR em tempo real. Estes resultados sugerem diferentes papéis de ROS e SASP na indução da senescência celular.
Figura 1 : Mudanças morfológicas e aumento do SA β-gal coloração durante a senescência de H-Ras-induzido. (A), este painel mostra o procedimento experimental para a indução da senescência H-Ras-induzida em células WI-38. (B) SA β-gal coloração foi realizada no ponto de tempo indicado após a infecção de células WI-38 com o retrovírus H-RasV12; aqui, imagens representativas de coloração de β-gal o SA são mostradas. (C) SA β-gal-positivo células foram contadas em três experimentos independentes. Os resultados são apresentados como os valores médios e as barras de erro representam desvios padrão (SD). P < 0,01, t do estudante-teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Aumento nos níveis de ROS intracelulares durante a senescência de H-Ras-induzido. (A) células WI-38 foram infectadas com o retrovírus H-Ras e coradas com DCF-DA (50 µM) nos pontos de tempo indicado. DCF-DA intensidade de fluorescência foram quantificada usando um citômetro de fluxo. Histogramas representativas da DCF-DA intensidade da fluorescência nos pontos de tempo de 0 - e 6-d são mostradas. (B) representante histogramas da DCF-DA intensidade da fluorescência nos pontos de tempo de 0 e 6 dias são plotadas juntos para comparação mais fácil. (C) o DCF-DA intensidade de fluorescência durante a senescência de H-Ras-induzida foi medida no momento indicado pontos x 3. Os resultados são apresentados como os valores médios e as barras de erro representam desvios padrão (SD). P < 0,05 e * * P < 0,01, t do estudante-teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Relacionadas a quantificação de SASP mRNAs durante a senescência de H-Ras-induzido. RNA foi preparado a partir de células WI-38 nos pontos de tempo indicado após a infecção de retrovírus do H-RasV12. Estes painéis mostram a indução da expressão (A) IL-6 e IL-8. (B) analisada por qPCR utilizando os primers específicos listados na tabela 1. Os níveis de RNAm de actina foram usados para normalização. A IL-6 normalizado ou níveis de mRNA de IL-8, medidos na amostra 0-dia foram definidos como 1 e calcularam-se as alterações de dobra relativa. Os experimentos foram independentemente repetidos 3 x. Os resultados são apresentados como os valores médios e as barras de erro indicam desvios padrão (SD). P < 0,05 e * * P < 0,01, t do estudante-teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Fatores de quantificação de SASP secretado durante a senescência de H-Ras-induzido. Estes painéis mostram curvas padrão geradas com o (A) de IL-6 e IL-8 (C) padrões. Mídia condicionadas foram colhidas de células WI-38 nos pontos de tempo indicado após infecção retrovírus de H-RasV12. Os níveis de IL-8 (D) e secretada IL-6 (B) foram analisados com um IL-6 e IL-8 ELISA kit, respectivamente. Os experimentos foram independentemente repetidos 3 x. Os resultados são apresentados como os valores médios e as barras de erro indicam desvios padrão (SD). P < 0,05 e * * P < 0,01, t do estudante-teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome do gene | Cartilha para a frente | Primeira demão reversa |
| IL-6 | 5'-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3' | 5'-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3' |
| IL-8 | 5'-ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3' | 5'-AACCCTCTGCACCCAGTTTTC-3' |
| actina | 5'-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3' | 5'-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3' |
Tabela 1: Iniciadores de PCR em tempo real para fatores SASP.
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Discussion
Aqui, apresentamos métodos para monitorar níveis ROS intracelulares durante a senescência de H-Ras-induzida em WI-38 fibroblastos humanos normais. Níveis ROS intracelulares em células vivas podem ser medidos quantitativamente usando o reagente de célula-permeável DCF-DA e citometria de fluxo. Após absorção celular, DCF-DA é deacetilada por esterases intracelulares e, posteriormente, oxidada pela ROS para formar altamente fluorescente 2', 7'-diclorofluoresceína (DCF). Fluorescência de DCF pode ser detectada por citometria de fluxo, usando um detector de FL1 (fluorescência verde). Usando o método de coloração de DCF-DA, com êxito detectamos um aumento nos níveis de ROS durante a senescência celular H-Ras-induzida em WI-38 fibroblastos humanos normais. Esse método pode ser usado em vários modelos de senescência celular para monitorar as alterações nos níveis de ROS. Além de DCF-DA coloração métodos adicionais que foram usados para medir a indução de ROS incluem monitoramento dos níveis de proteínas oxidadas23 e uma análise de microscopia confocal usando ROS-dependente corantes fluorescentes24. Assim, ainda mais confirmação de alterações nos níveis ROS usando métodos adicionais é desejável.
Recentemente, mostramos que aumentam níveis ROS em células cancerosas durante a senescência induzida por p53, bem como a senescência induzida H-Ras21. Aumento dos níveis intracelular do ROS é observáveis antes do aumento SA β-gal coloração atividade, sugerindo o papel causal de ROS na indução da senescência celular. Curiosamente, o aumento nos níveis ROS separadamente é controlado pela via Akt-NF-κB-NOX4, enquanto a detenção do ciclo celular é mediada por p2121. Se Akt também regula o aumento ROS em outros tipos de senescência celular seria interessante para explorar.
Temos também introduziu métodos para analisar o mRNA e segregado dos fatores SASP IL-6 e IL-8, os níveis de proteína durante a senescência H-Ras-induzida. Estamos usando qPCR, quantificado a indução de IL-6 e IL-8 mRNA em células senescentes WI-38. Examinamos os níveis do mRNA de actina como um controle interno para normalização, mas GAPDH mRNA também pode ser usado como um controle interno. O RNA ribosomal 18S (rRNA) é um outro gene de limpeza que é comumente usado como um controle interno em experimentos de qPCR. No entanto, porque a maturação de transcrição e Ribossoma rRNA são regulados durante a detenção do ciclo celular e senescência celular25,26, 18S rRNA pode não ser um bom controle interno para estudos de senescência celular. ELISA, usando um meio condicionado de células senescentes WI-38, mostrou similares aumenta em secretada de IL-6 e IL-8 níveis. Consistente com a noção que o SASP é desenvolvido no palco a senescência "maduro"19, aumento da secreção de IL-8 e IL-6 é detectável em um momento posterior de tempo do que o aumento nos níveis ROS. Notavelmente, fatores SASP variam de acordo com os tipos de células e de condições de indução de senescência27. Portanto, os fatores SASP apropriados devem ser selecionados de acordo com o modelo de senescência celular.
Embora nós confirmamos senescência H-Ras-induzida pelo monitoramento de alterações morfológicas e a indução de atividade de coloração SA β-gal, senescência celular deve ser verificada mais monitorando as características adicionais da senescência, incluindo o perda irreversível de potencial de proliferação de focos de heterocromatina associada a senescência (SAHF), fatores SASP, a ativação de supressores de tumor como p53 e p16INK4a, reforçada sinais de dano do ADN e persistentes focos nucleares, definidos como segmentos de DNA com alterações de cromatina reforçando a senescência (DNA-cicatrizes). No entanto, é importante lembrar que há uma heterogeneidade de características de senescência em tipos diferentes de senescência. Determinados biomarcadores de senescência podem ser observável apenas em alguns tipos específicos de senescência celular. Por exemplo, SAHF são geralmente evidentes em OIS28,29.
Senescência celular considerou-se, inicialmente, para representar a prisão de crescimento autónomo causada por condições de cultura artificial. No entanto, estudos no passado meio século têm demonstrado a importância da senescência celular sob diferentes condições fisiopatológicas, incluindo envelhecimento e câncer. O nexo de causalidade entre a senescência celular e deterioração do tecido relacionadas com a idade mostrou-se anteriormente no BubR1 progeroid rato modelos30,31. Assim, controlando a senescência celular através de ou a eliminação de células senescentes ou a modulação da SASP atualmente é considerada como uma estratégia promissora para doenças relacionadas com a idade. De fato, estudos recentes demonstraram que a eliminação de células senescentes seria um tratamento promissor para patologias relacionadas com a idade, incluindo a depleção de células-tronco, perda óssea, perda de cabelo e osteoartrite32,33, 3435,de,36. Uma compreensão mais profunda dos mecanismos moleculares de indução da senescência e fenótipos de senescência, incluindo SASPs, proporcionará melhores estratégias para o direcionamento de senescência, reduzindo possíveis inconvenientes e seletivamente apenas direcionamento deletérios funções das células senescentes.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma concessão da Fundação de pesquisa nacional da Coreia (2015R1D1A1A01060839) (para Young Yeon Kim) e por uma bolsa de pesquisa nacional Fundação da Coreia (NRF), financiado pelo governo da Coreia (MSIT) (no. 2016R1A2B2008887, n. º 2016R1A5A2007009) (para Jeanho Yun).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| BOSC 23 | ATCC | CRL-11269 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| pBabe puro-H-RasV12 | Addgene | 1768 | |
| pGAG/pol | Addgene | 14887 | |
| pVSVG | Addgene | 1733 | |
| Turbofect | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/mL |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/mL |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| DCF-DA | Sigma-Aldrich | D6883 | 10 mM |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| MMLV Reverse transcriptase | Promega | M1701 | |
| SYBR Green PCR master 2x mix | Takara | PR820A | |
| Random Primer | Promega | C118A | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Human IL-6 ELISA assay | PeproTech | #900-TM16 | |
| Human IL-8 ELISA assay | PeproTech | #900_TM18 | |
| EQUIPMENTS | |||
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| Parafilm | BEMIS | PM-996 | |
| Microscope | NIKON | TS100 | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | LSR Fortessa | |
| Amicon Ultra-4ml | Merk Millipore | UFC800324 | |
| NanoDrop spectrophotometer | BioDrop | 80-3006-61 | |
| Real-time PCR System | Applied Biosystems | ABI Prism 7500 | |
| ELISA Reader | Molecular Devices | EMax microplate reader |
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