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Developmental Biology

Eine Quantitative Messung von reaktiven Sauerstoffspezies und Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp in normalen menschlichen Fibroblasten während Onkogen-induzierte Seneszenz

Published: August 12, 2018 doi: 10.3791/57890
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2
1Department of Biochemistry, College of Medicine, Dong-A University, 2Peripheral Neuropathy Research Center, College of Medicine, Dong-A University
* These authors contributed equally

Summary

Intrazellulären ROS hat nachweislich eine wichtige Rolle in der Induktion der zellulären Seneszenz. Hier beschreiben wir einen sensible Assay zur Quantifizierung der ROS Ebenen während der zellulären Seneszenz. Wir bieten auch Protokolle für die Beurteilung des Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyps, was angeblich zu verschiedenen altersbedingte Funktionsstörungen beiträgt.

Abstract

Zelluläre Seneszenz wurde einen Zustand der irreversiblen Wachstum Festnahme nach Erschöpfung der proliferative Kapazität oder Exposition gegenüber verschiedenen Belastungen berücksichtigt. Jüngste Studien haben die Rolle der zellulären Seneszenz, verschiedene physiologische Prozesse, einschließlich Entwicklung, Wundheilung, immunüberwachung und altersbedingte Gewebe Dysfunktion erweitert. Zwar Zellzyklus Festnahme einer kritischen Markenzeichen der zellulären Seneszenz, wurde eine erhöhte intrazelluläre reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS)-Produktion auch eine wichtige Rolle in der Induktion der zellulären Seneszenz gezeigt. Neue Studien zufolge darüber hinaus seneszenten Zellen potente Parakrine Aktivitäten auf benachbarte Zellen und Gewebe durch einen Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP) ausstellen. Die starke gestiegene Interesse bezüglich Therapiestrategien gegen zelluläre Seneszenz betont die Notwendigkeit für ein genaues Verständnis der Seneszenz Mechanismen, einschließlich der intrazellulären ROS und der SASP. Hier beschreiben wir Protokolle für die Beurteilung der quantitativ intrazelluläre ROS Ebenen während H-Ras-induzierte zellulären Seneszenz mit ROS-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff und Durchflusszytometrie. Darüber hinaus stellen wir sensible Techniken für die Analyse der Induktion von mRNA Expression und Sekretion von SASP Faktoren. Diese Protokolle können auf verschiedenen zellulären Seneszenz Modelle angewendet werden.

Introduction

Mehr als 50 Jahren offenbarte Hayflick und Moorhead, dass normale Zellen irreversibel Wachstum Verhaftung auf die Erschöpfung der proliferativen entfalten nach einer bestimmten Anzahl von Zellteilungen1eingeben. Dieses Phänomen ist heute bekannt als replikative Seneszenz und wird geglaubt, um mit organismal Altern2stark korrelieren. Obwohl die fortschreitende Erosion der Telomere als eine der Hauptursachen für replikative Seneszenz gilt, worden verschiedenen zelluläre Belastungen, wie DNA-Schäden, Onkogene Aktivierung und oxidativen Stress, berichtet, eine andere Art der zellulären Seneszenz induzieren "vorzeitige Seneszenz" oder "Stress-induzierte Seneszenz" genannt. Interessanterweise spielt vorzeitige Seneszenz eine potente Tumor-suppressive Rolle bei der Aktivierung der Onkogene wie H-Ras und BRAF. Studien an Mäusen und menschlichen Geweben haben starke Beweise hergestellt, die Biomarker der Zelle Seneszenz überwiegend in prämaligne Läsionen vorhanden waren, wo Onkogenen Ras und BRAF sind aktiviert, aber wurden in bösartigen Tumoren, die von entwickelt vermindert Diese Läsionen3,4,5. Über seine Rolle als Altern und Tumor-Unterdrückung zelluläre Seneszenz in früheren Studien nachweislich eine Rolle in verschiedenen physiologischen Prozessen, einschließlich der Wundheilung, Gewebereparatur immunüberwachung und embryonale Entwicklung6.

Obwohl Wachstum Verhaftung als ein Markenzeichen der zellulären Seneszenz7ausgiebig untersucht wurde, schlägt eine erhebliche Zahl von beweisen, dass die intrazelluläre reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) auch einen Beitrag zur zellulären Seneszenz8. Die Höhe des ROS Ebenen während der verschiedenen Arten der zellulären Seneszenz, einschließlich replikative Seneszenz und Onkogen-induzierte Seneszenz (OIS), hieß ursprünglich vor Jahrzehnten9,10. Mehr induziert direkt, exogene Behandlung mit subletale Dosis von H2O2 Seneszenz11,12. Die Hemmung der ROS-Aufräumvorgang Enzyme wie SOD1, verursacht auch vorzeitige Seneszenz13. Im Gegensatz dazu niedrig ambient sauerstoffbedingungen und Erhöhung der ROS Aufräumvorgang verzögert das Auftreten von Seneszenz10,14,15. Diese Ergebnisse zeigen zweifellos, dass ROS wichtige Mediatoren oder Determinanten der zellulären Seneszenz Induktion sind. Jedoch wie ROS beitragen zur Induktion der zellulären Seneszenz und wie erhöhte ROS Niveaus während der zellulären Seneszenz sind weitere machen Sie Untersuchungen nötig.

Neuere Studien haben gezeigt, dass alternde Zellen potente Parakrine Aktivitäten auf benachbarte Zellen und Gewebe durch eine SASP16,17. Im Alter von Gewebe fördern seneszenten Zellen altersbedingte Gewebe Funktionsstörungen über viele Wege durch SASP neben einer autonomen Erschöpfung der proliferativen Zellen. Proinflammatorischen Faktoren, wie IL-6, IL-8, TGFβ und Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) sezerniert seneszenten Zellen verursachen altersbedingte Gewebe Funktionsstörungen durch Beeinträchtigung der Gewebe Homöostase, Zerstörung der Gewebearchitektur Seneszenz der benachbarten Zellen und sterile Entzündung18,19. Allerdings kann die SASPs je nach biologischen Kontext günstig auswirken. Heterogenetic Artder SASPs hängt darüber hinaus die alternde Zelltyp und Zell-Stadium, betonend, dass weitere Forschung19.

Hier beschreiben wir rasche und sensible zytometrie-basierte Techniken für die Beurteilung der intrazelluläre ROS Ebenen während OIS. Darüber hinaus werden Methoden zur Analyse der SASP Faktoren mit quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction (qPCR) und ELISA eingeführt.

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Protocol

1. Induktion Onkogen-induzierte Seneszenz

  1. Vorbereitung einer H-RasV12 Retrovirus
    1. Mantel der Kulturschale 100 mm durch Zugabe von 2 mL von 0,001 % Poly-L-Lysin/Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 5 min bei Raumtemperatur.
    2. Entfernen Sie die Poly-L-Lysin-Lösung mit einer Glaspipette verbunden mit einem Vakuum und waschen Sie der Kulturschale durch Zugabe von 2 mL 1 X PBS.
    3. Platte 3 x 106 Ecotropic BOSC-23 verpackungszellen auf die beschichtete Kultur Gericht mit Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin und Kultur sie bei 37 ° C in einer Gewebekultur CO2 Inkubator für 1D.
    4. Am nächsten Tag transfizieren 2 µg pBabe Puro-H-RasV12 DNA zusammen mit retroviralen Verpackung DNA (2 µg pGAG/Pol und 0,25 µg pVSVG) mit einem Transfection Reagens für 8 h entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
    5. Entfernen Sie die Transfektion Medium und 8 mL frische Medien.
    6. Nach 48 h sammeln Sie das Medium mit der Viruspartikel zu und entfernen Sie alle zelltrümmer durch Zentrifugation bei 500 X g für 5 min.
    7. Filtern Sie die H-Ras Virus-haltigen Medien mit einem 0,45 µm-Spritze-Filter.
      Hinweis: Vermeiden Sie jede Einfrieren und Auftauen des Virus Überstände für eine effiziente Virusinfektion. Um den besten Wirkungsgrad zu erhalten, verwenden Sie einen Virus, der am selben Tag als Infektion geerntet wurde.
  2. WI-38 normalen menschliche Fibroblasten mit der H-RasV12-Retroviren infizieren
    1. 5 x 104 WI-38 Zellen in der Kulturschale 60 mm-Platte mit DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin 1D vor der Ernte die H-RasV12 Retrovirus und Kultur sie für 1 Tag bei 37 ° C.
    2. Entfernen Sie am nächsten Tag das Wachstumsmedium zu und fügen Sie 1 mL H-RasV12 Retrovirus Medien. Fügen Sie eine zusätzliche 1 mL des Kulturmediums mit 2 µL Polybrene-Stammlösung (8 mg/mL in destilliertem Wasser). Inkubieren Sie die Probe für 1 Tag in einem befeuchteten 37 ° C, 5 % CO2 Gewebekultur Inkubator.
    3. Die H-RasV12 Retrovirus Mischung 24 h später zu entfernen und waschen Sie die Zellen 2 X mit 1 X PBS. Wachstumsmedium hinzufügen und die Zellen mit 2 µg/mL von Puromycin für 2 Tage in einem befeuchteten 37 ° C, 5 % CO2 Gewebekultur Inkubator zu behandeln.
    4. Nach 2 d Puromycin Auswahl, das Wachstumsmedium zu entfernen und waschen Sie die Zellen 2 X mit 1 X PBS. Fügen Sie Wachstumsmedium und Kultur der Zellen in einer befeuchteten 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator bis zu die angegebene Zeit Punkt (siehe Abbildung 1A für eine schematische Darstellung).

2. Überwachung der Seneszenz über Seneszenz-assoziierten β-Galaktosidase Färbung

  1. Die folgenden Stammlösungen vorzubereiten.
    1. 20 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-Galactopyranoside (X-gal) in Dimethyl Formamid (DMF) vorzubereiten. Speichern Sie die Lösung bei-20 ° C.
    2. Bereiten Sie einen Zitronensäure/Natrium-Phosphat-Puffer durch 3,377 g Na2HPO4.7H2O (126 mM) auflösen und 0,708 g Zitronensäure (36,8 mM) in 100 mL destilliertem Wasser. Nachstellen Sie den pH-Wert 6,0, ggf..
    3. 0,5 M Kaliumferrocyanid vorzubereiten. Speichern Sie die Lösung im Dunkeln bei 4 ° C.
    4. 0,5 M Kalium ferricyanid vorzubereiten. Speichern Sie die Lösung im Dunkeln bei 4 ° C.
      Hinweis: Der pH-Wert der Färbelösung Seneszenz-assoziierten β-Galaktosidase (SA β-gal) ist wichtig für genaue Ergebnisse.
  2. Machen Sie einen frischen SA β-gal-Färbelösung durch Verdünnung der Stammlösung mit 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM Kaliumferrocyanid, 5 mM Kalium ferricyanid, 20 % (V/V) Zitronensäure/Natrium-Phosphat-Puffer und 1 mg/mL X-gal.
  3. Die Nährmedien zu entfernen und waschen Sie die Zellen 1 X mit 1 X PBS. Befestigen Sie die Zellen mit 3 % Formaldehyd für 5 min bei Raumtemperatur.
    Hinweis: Zellen, die nicht mit den Retrovirus infiziert werden sollte als Negativkontrolle verwendet werden. Die nicht infizierten Kontrollzellen sollten weiterhin passagiert werden, um ihre wuchernden Status beizubehalten.
  4. Entfernen Sie die Fixierung-Lösung aus den Zellen und waschen Sie sie mit 1 X PBS. Fügen Sie frisch zubereitet, 1 X SA β-gal Färbelösung (1,5 mL in der Kulturschale 60 mm). Verschließen Sie die Schüssel mit einem Paraffin-Film zu verhindern, Trocknung und 24 h bei 37 ° c inkubieren Alternativ inkubieren Sie die Gerichte zusammen in eine Feuchte Kammer.
    Hinweis: Die Fixativ Lösung enthält 3 % Formaldehyd sollte als Sondermüll entsorgt werden. Inkubator ohne CO2 ist wünschenswert, um pH-Wert-Änderungen während der Inkubation zu verhindern.
  5. Statusprüfung Färbung der Zellen unter dem Mikroskop am nächsten Tag; SA β-gal-positiven Zellen erscheinen in der perinukleären Region blau.
    Hinweis: Die wuchernden Kontrollzellen zeigen eine geringe Häufigkeit von SA β-gal-positiven Zellen. Wenn die Färbung zu hell ist, weiterhin die Inkubation für einen etwas längeren Zeitraum (siehe Abbildung 1 b für repräsentative Beispiele).
  6. Erwerben Sie ein SA-β-gal-Färbung-Bild mit einer CCD-Kamera mit 10 X oder mehr Objektiv. Erfassen Sie eine ausreichende Anzahl von Bildern zu den befleckenden Prozentsatz zu berechnen (> 200 Zellen).
  7. Berechnen Sie den Prozentsatz der SA β-gal-gefärbten Zellen durch die Anzahl der SA β-gal-positiven Zellen bezogen auf die Gesamtzahl der Zellen zu quantifizieren.
    Hinweis: SA β-gal-Färbung sollte selbstständig wiederholt werden, dass mindestens 3 X und die Mittelwerte über die Ergebnisse der wiederholte Experimente (Abbildung 1 C) auf der Grundlage berechnet werden soll. Die entsprechenden Zelldichte ist entscheidend für das SA-β-gal-Färbung-Experiment. Eine hohe Konfluenz kann stören mit der Umstellung auf eine Seneszenz-assoziierten Morphologie und induzieren eine falsch-positives Signal in der Kontrollzellen.

3. Quantifizierung eine reaktive Sauerstoff Spezies Induktion während H-Ras-induzierte Seneszenz

  1. Platte 2 x 105 WI-38 Zellen auf einer 60 mm-Kultur-Speise- und H-Ras-induzierte Seneszenz zu provozieren, wie in Schritt 1 beschrieben.
    Hinweis: Dieses Protokoll kann auf andere Arten der zellulären Seneszenz Modelle angewendet werden.
  2. Entfernen Sie das Wachstumsmedium zum angegebenen Zeitpunkt (2, 4 oder 6 Tage), und waschen Sie die Zellen mit 1 X PBS. Die Zellen zu lösen, indem man sie mit 1 mL Trypsin/EDTA-Lösung 0,05 % und inaktivieren die Trypsin durch Zugabe von 1 mL des Kulturmediums mit 10 % FBS. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen.
  3. Übertragen Sie 1 x 105 Zellen in einer 15 mL konische Röhrchen zu, und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 500 X g für 5 Minuten.
  4. Bereiten Sie frische 2', 7'-Dichlorofluorescin Diacetat (DCF-DA) Färbung Medien durch Zugabe von 50 µL 10 mM DCF-DA bis 10 mL Kulturmedium (die Arbeit Konzentration der DCF-DA ist 50 µM).
    Hinweis: DCF-DA ist lichtempfindlich. Lichteinwirkung sollte vermieden werden. Die Konzentration der DCF-DA und die Färbung ist je nach Zelltyp einstellbar.
  5. Entfernen Sie das Wachstumsmedium aus dem 15 mL konische Röhrchen vorsichtig, und fügen Sie 1 mL frisch zubereitete DCF-DA Färbung Medium. Vorsichtig die Zelle Pellet aufschwemmen und bei 37 ° C für 30 Minuten im Dunkeln inkubieren. Umfassen Sie eine Probe nicht gebeizt als Negativkontrolle Färbung.
    Hinweis: Proliferierende Zellen nicht befleckt mit DCF-DA sollte als Negativkontrolle vorbereitet werden.
  6. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 500 X g für 5 min und waschen Sie sie 1 X mit 2 mL 1 X PBS. Die Zellen mit 1 mL 1 X PBS aufschwemmen und die Probe auf die entsprechende Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS) Rohr übertragen.
  7. Messen Sie die 2′, 7-Dichlorodihydrofluorescein Diacetat (DCF-DA) Fluoreszenz-Signal mit einem Durchflusszytometer, ausgestattet mit einem geeigneten Laser-Quelle. Begeistern Sie die Proben mit einem blauen Laser (488 nm) und die emittierte Fluoreszenz mit einem 530 ± 30 nm-Detektor (FITC) mit Hilfe einer logarithmischen Skala zu erkennen.
    1. Analysieren Sie zunächst die Negativkontrolle nicht gefärbten Zellen. Wählen Sie in einem Punkt Grundstück von forward Scatter (FSC) im Vergleich zu Side Scatter (SSC) lebende Zellen mit einem gating-Tool und beseitigen Sie abgestorbene Zellen und zelltrümmer.
      Hinweis: Die Änderung der Größe der Zelle in der Dot-Plot des FSC gegen SSC überwacht werden. Wenn die Größe der alternde Zellen deutlich erhöht wird, sollte die DCF-DA Intensität nach Anspritzung in der Dot-Plot des FSC gegen SSC in Zell-Populationen der gleichen Größe verglichen werden.
    2. In einem einzigen Parameter Histogramm anzeigen DCF-DA (488 nm) Fluoreszenz auf der logarithmischen Skala der X-Achse und die Anzahl der Ereignisse (Handynummer) auf der linearen Skala der y-Achse, passen Sie die Spannung der 488 nm Laser, platzieren Sie den Gipfel von die nicht-gefärbten Zellen am linken Rand.
    3. Analysieren Sie die DCF-DA gefärbten Proben und mindestens 10.000 Ereignisse für jede Probe aufzeichnen. Den mittlere Fluoreszenz-Wert jeder einzelnen Probe mit Analysesoftware speziell für das Durchflusszytometer zu erwerben.
      Hinweis: Die ROS-Messungen sollten unabhängig voneinander wiederholt werden mindestens 3 X und die Mittelwerte aus diesen Ergebnissen berechnet werden soll. Vertreter H-Ras-induzierte Seneszenz Ergebnisse sind in Abbildung 2dargestellt.

(4) Quantifizierung IL-6 und IL-8 mRNA Ausdruck für Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp Analyse mithilfe einer Real-Time Polymerase-Kettenreaktion

  1. Insgesamt RNA-Vorbereitung
    1. Platte 3 x 105 WI-38 Zellen auf einem 100 mm-Kultur Gericht in DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin und Kultur sie bei 37 ° C in einer Gewebekultur-Inkubator für 1 Tag. Doppelte Kulturen für jeden Zeitpunkt vorzubereiten.
    2. Induzieren Sie Seneszenz durch Infektion der Zellen mit der H-RasV12-Retroviren wie in Schritt 1 beschrieben.
    3. 1 Tag vor der Ernte, waschen Sie die Zellen 2 X mit 1 X PBS und 3 mL DMEM ohne FBS.
      Hinweis: Dieser Schritt wird durchgeführt, um die konditionierten Medium für ELISA wie in Schritt 5 beschrieben verwendet zu produzieren. Serum-Hunger kann einen Ausdruck von IL-6 und IL-8 mRNAs in einigen empfindlichen Zellen induzieren. Daher sollte die IL-6 und IL-8 mRNA Expression in Zellen kultiviert mit und ohne Serum Hunger zunächst verglichen werden. Wenn Serum Hunger erhebliche Veränderungen in der Expression des IL-6 oder IL-8 mRNA induziert, sollte die Gesamt-RNS für qPCR und dem konditionierten Medium für ELISA separat vorbereitet werden.
    4. Die konditionierte Medium von jeder Probe 24 h später abholen und das Medium bei-80 ° C für ELISA aufbewahren.
    5. Die Zellen zu lösen, indem man sie mit 1 mL Trypsin/EDTA-Lösung 0,05 % und inaktivieren die Trypsin durch Zugabe von 1 mL des Kulturmediums mit 10 % FBS. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen für die Normalisierung der ELISA Ergebnisse wie in Schritt 5 beschrieben. Ernten Sie die Zellen in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch durch Zentrifugation bei 500 X g für 5 Minuten.
    6. Entfernen Sie das Medium durch sanfte Saugwirkung und 1 mL Extraktionslösung RNA. Dann Wirbel Microcentrifuge Schlauch kräftig für 15 s. Anschließend fügen Sie 200 µL Chloroform und kräftig Vortex die Mischung erneut für eine zusätzliche 15 s.
    7. Zentrifugieren Sie die Probenröhrchen bei 17.000 X g für 10 min bei 4 ° C. Übertragen Sie dann vorsichtig die obere Phase zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
      Hinweis: Die Interphase und die untere organische Phase sollte nicht während der Übertragung der oberen Phase zu einem neuen Schlauch gestört werden.
    8. Fügen Sie 400 µL Isopropanol, überstürzen sich die RNA und mischen sie gut durch sanfte Umkehrung hinzu. Dann inkubieren Sie das Rohr bei Raumtemperatur für 10 min.
    9. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 17.000 X g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand, kümmert sich um die RNA-Pellet zu behalten. Waschen der RNS durch Zugabe von 1 mL 75 % Ethanol und invertieren der Röhre 2 – 3 X. Zentrifugieren Sie das Rohr für 5 min bei 17.000 X g bei 4 ° C und verwerfen Sie den überstand.
    10. Die RNA-Pellet bei Raumtemperatur trocknen und auflösen die RNA in 50 µL Diethyl-Pyrocarbonate (DEPC)-destilliertes Wasser behandelt. Mit 1 µL RNA-Lösung, quantifizieren Sie die Gesamtkonzentration der RNA mit einem Spektrophotometer.
      Hinweis: Übertrocknetes verringert sich die Löslichkeit der RNA; vermeiden Sie daher die RNA übertrocknetes.
  2. cDNA-Vorbereitung
    1. Jede Probe Reverse Transkription Reaktionsgemisch vorbereiten, indem man folgendes in ein dünnwandiger PCR-Röhrchen: 2 µg Gesamt-RNA (stellen Sie die Lautstärke auf 10 µL mit RNase-freies Wasser), 2 µL 10 x RT Puffer, 1 µL eine zufällige Grundierung (50 Pmol) 0,8 µL 25 X dNTP-Mix (100 mM), Wasser 1 µL MMLV Reverse-Transkriptase (50 U/µL) und 5.2 µL RNase-freies.
    2. Einrichten der reversen Transkription Reaktion Programm auf den Thermocycler mit den folgenden Bedingungen: 42 ° C für 60 min und 95 ° C für 5 min. Ort der PCR-Röhren in den Thermocycler und starten Sie das Programm.
  3. Real-Time Polymerase-Kettenreaktion
    1. Bereiten Sie die Real-Time PCR-master-Mix für alle Reaktionen. Das Reaktionsgemisch für jede Probe ist wie folgt: 25 µL 2 x Echtzeit-PCR Master Mix, 1 µL der vorwärts- und Primer für IL-6 oder IL-8 und 21 µL destilliertes Reinstwasser (DNase und RNase-frei). Siehe Tabelle 1.
      Hinweis: Bereiten Sie die Echtzeit-PCR Reaktionsmischung für jede Probe mit Actin-RNA-Primer als interne Kontrolle. GAPDH kann auch als interne Kontrolle für die Normalisierung verwendet werden.
    2. Jede Vertiefung in einer 96-Well Optische qPCR-Platte 48 µL des master-Mix und 2 µL 3-fold verdünnte cDNA Produkt mit Wasser hinzufügen. Führen Sie jede Reaktion in dreifacher Ausfertigung. Bereiten Sie ein Steuerelement gut, das nicht die cDNA-Vorlage als PCR-Steuerelement enthält.
    3. Richten Sie die Echtzeit-PCR Reaktion Programm auf den Thermocycler mit den folgenden Bedingungen: 10 min bei 95 ° C, 40 Zyklen of15 s bei 95 ° C (Denaturierung) und 1 min bei 60 ° C (glühen und Verlängerung).
    4. Durchführen Sie Real-Time PCR und notieren Sie den Schwellenwert-Zyklus (C-T) nach Abschluss der PCR-Zyklen. Berechnen Sie die mRNA-Niveaus für IL-6 oder IL-8 mit der 2- ΔΔCΤ Methode20.
      Hinweis: Die relative Falte Ausdruck ist nach der Normalisierung der Aktin-Niveau bestimmt mithilfe der folgenden Formel:
      Falten Sie Änderung = 2-Δ (ΔCT)
      Hier,
      ΔCT = CT, IL-6 oder IL-8- CT, Aktin; und
      Δ (ΔCT) = ΔCT, stimuliert- ΔCT, Kontrolle.
    5. Berechnen Sie den Mittelwert für jede doppelte Probe.
      Hinweis: qPCR sollten unabhängig voneinander wiederholt werden mindestens 3 X und die Durchschnittswerte basierend auf diese Ergebnisse berechnet werden sollte. Vertreter H-Ras-induzierte Seneszenz Ergebnisse sind in Abbildung 3dargestellt. Serum-Hunger kann die Expression von IL-6 und IL-8 mRNAs in einigen empfindlichen Zellen induzieren. Daher sollte die IL-6 und IL-8 mRNA Expression in Zellen kultiviert mit und ohne Serum Hunger zunächst verglichen werden. Wenn Serum Hunger erhebliche Veränderungen in der Expression von IL-6 oder IL-8 mRNA induziert, sollte die Gesamt-RNS für qPCR und dem konditionierten Medium für ELISA separat vorbereitet werden.

(5) Quantifizierung der Ebenen der sekretierten Proteine von IL-6 und IL-8 für eine Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp-Analyse mittels ELISA

  1. Tauwetter der 3 mL der konditionierten Medium aus seneszenten WI-38 Zellen geerntet, wie in Schritt 4 beschrieben. Entfernen Sie zellenrückstand durch Zentrifugation bei 500 X g für 5 min.
  2. Konzentrieren sich die konditionierte Medium 10-fach durch Zentrifugation bei 3.000 X g für 20 min mit einer zentrifugalen Filtereinheit.
    Hinweis: Die Konzentration des konditionierten Mediums kann nicht unbedingt die Probenart abhängen.
  3. Führen Sie die ELISA mit 50 µL jeder konzentrierte Probe des konditionierten Mediums mit den entsprechenden IL-6 und IL-8 ELISA Kits.
    Hinweis: Testen Sie jede Probe in zwei ELISA Brunnen. Weil jeden Zeitpunkt in Schritt 4 doppelt vorhanden ist, diese Analyse ermöglicht es uns, Variationen in der ELISA-Test und die Probe Präparationstechnik zu überwachen.
    1. Verdünnen Sie für ELISA-Platte-Beschichtung die IL-6 oder IL-8 Antikörper mit 1 X PBS zu einer Konzentration von 0,5 µg/mL für IL-6 oder 0,125 µg/mL für IL-8. 100 µL der verdünnten Antikörper in jede Vertiefung der ELISA-Platte hinzufügen. Dichtplatte mit einer ELISA-Platte Abdichten von Film und ohne schütteln über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren.
    2. Entfernen Sie die Antikörperlösung durch Absaugen. Jedes gut 4 X mit 300 µL 1 x Waschpuffer waschen (0,05 % Tween 20 in PBS). Jedes gut 300 µL blocking-Puffer (1 % BSA mit PBS-Puffer) hinzufügen. Inkubation bei Raumtemperatur für 1 h.
    3. Entfernen Sie die blockierende Lösung durch Absaugen. Waschen Sie jedes gut 4 X mit 300 µL 1 x Waschpuffer. Bereiten Sie seriell verdünnt ELISA Normen in einen Verdünnungspuffer (0,05 % Tween-20 und 0,1 % BSA mit PBS-Puffer) eine Standardkurve zu generieren.
      Hinweis: Die serielle Verdünnung für IL-6 ist 31,25 62,5, 125, 250, 500, 1.000 und 2.000 Pg/mL. Die serielle Verdünnung für IL-8 ist 2,34, 4,69 9,38, 18,75, 37,5, 75 und 150 Pg/mL.
    4. Fügen Sie entweder 100 µL der Standardlösung oder 100 µL Probenlösung (50 µL konzentrierten Medium mit 50 µL Verdünnungspuffer) in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Wells in 2 h bei Raumtemperatur.
    5. Entfernen Sie die standard oder Probe Lösung durch Absaugen. Waschen Sie jedes gut 4 X mit 300 µL 1 x Waschpuffer. Verdünnen Sie den detektionsantikörper mit Verdünnungspuffer zu einer Konzentration von 0,1 µg/mL für IL-6 oder 0,25 µg/mL für IL-8. 100 µL der verdünnten Antikörper pro Bohrloch hinzufügen. Inkubieren Sie die Wells in 2 h bei Raumtemperatur.
    6. Entfernen Sie die Antikörperlösung durch Absaugen. Waschen Sie jedes gut 4 X mit 300 µL 1 x Waschpuffer. Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase (HRP) in Verdünnungspuffer zu einer Konzentration von 0,05 µg/mL zu verdünnen. Fügen Sie 100 µL Streptavidin-HRP-Lösung pro Bohrloch. Inkubieren Sie der Brunnen bei Raumtemperatur für 30 min.
    7. Entfernen Sie die Antikörperlösung durch Absaugen. Waschen Sie jedes gut 4 X mit 300 µL 1 x Waschpuffer. Fügen Sie 100 µL 3, 3′, 5, 5 '-Tetramethylbenzidine (TMB) Substratlösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Brunnen bei Raumtemperatur für 20 min auf die Farbentwicklung zu ermöglichen. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 100 µL einer 1 M HCl-Stopp-Lösung.
    8. Lesen Sie die Absorption von jedem Bohrloch mit einem ELISA-Reader bei 450 nm.
    9. Plot der Standardkurve für den generierten Standards. Die Konzentrationen von IL-6 und IL-8 in der konditionierten Medium nach der Standardkurven zu berechnen. Zeichnen Sie die Ergebnisse nach einer Normierung auf die Anzahl der Zellen. Berechnung der Mittelwerte für doppelte Proben.
      Hinweis: ELISAs sollten unabhängig voneinander wiederholt werden mindestens 3 X und die Durchschnittswerte basierend auf diesen Ergebnissen (Abbildung 4) berechnet werden sollte.

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Representative Results

Ein Beispiel für H-Ras-induzierte Seneszenz ist in Abbildung 1dargestellt. Eine Infektion des normalen menschlichen Fibroblasten WI-38 mit der H-RasV12-Retroviren induzierte dramatische morphologische Veränderungen (Abb. 1 b). Darüber hinaus wurde wie in Abbildung 1dargestellt, SA β-gal-Färbung-Aktivität bemerkenswert auf H-RasV12 Ausdruck erhöht. Mehr als 70 % der Zellen zeigte SA β-gal-Färbung Aktivität 6D nach der H-RasV12 Retrovirus Infektion, darauf hinweist, dass ein Ausdruck von H-RasV12 erfolgreich zellulären Seneszenz in WI-38 Zellen induziert, wie wir und andere Gruppen bereits21 berichtet ,22.

Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse der DCF-DA befleckenden Analyse für ROS Überwachungsstufen während H-Ras-induzierte zellulären Seneszenz. Erhöhte intrazelluläre ROS bereits 2 Tage nach der H-Ras Ausdruck eingehalten werden und sind bis zu dem Zeitpunkt 6 Tage gepflegt. Unterdessen zeigt die Induktion der SASP unterschiedliche Kinetik. Die mRNA-Niveaus von IL-6 und IL-8, repräsentative SASP Faktoren, sind Anstiege ab 4 Tage nach der H-Ras Ausdruck und Peak auf der 8-Tage Zeitpunkt (Abbildung 3). Wie in Abbildung 4dargestellt, zeigen die sekretierten IL-6 und IL-8 Ebenen ähnliche Erhöhungen, Einklang mit der Real-Time PCR-Ergebnisse. Diese Ergebnisse zeigen unterschiedliche Rollen von ROS und SASP in der Induktion der zellulären Seneszenz.

Figure 1
Abbildung 1 : Morphologische Veränderungen bei gleichzeitigem SA β-gal-Färbung bei H-Ras-induzierte Seneszenz. (A) dieses Panel zeigt die Versuchsdurchführung zur Einarbeitung von H-Ras-induzierte Seneszenz in WI-38 Zellen. (B) SA β-gal-Färbung erfolgte zum angegebenen Zeitpunkt nach der Infektion mit der H-RasV12 Retrovirus WI-38 Zellen; Hier werden repräsentative Bilder der SA-β-gal-Färbung gezeigt. (C) SA β-gal-positiven Zellen wurden in drei unabhängigen Experimenten gezählt. Die Ergebnisse werden als Mittelwerte und die Fehlerbalken stellen Standardabweichungen (SD). P < 0,01, Student t-test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 2
Abbildung 2 : Erhöhung der intrazellulären ROS Ebenen während H-Ras-induzierte Seneszenz. (A) WI-38 Zellen wurden mit der H-Ras Retrovirus infiziert und gefärbt mit DCF-DA (50 µM) zu den angegebenen Zeitpunkten. DCF-DA Fluoreszenz Intensität wurden mit einem Durchflusszytometer quantifiziert. Repräsentative Histogramme für die DCF-DA-Fluoreszenz-Intensität zu den Zeitpunkten 0 und 6-d werden angezeigt. (B) repräsentative Histogramme der DCF-DA-Fluoreszenz-Intensität zu den Zeitpunkten 0 und 6-Tage werden zusammen für einfacher Vergleich dargestellt. (C) die DCF-DA Fluoreszenzintensität während H-Ras-induzierte Seneszenz zur angegebenen Zeit gemessen wurde weist 3 X. Die Ergebnisse werden als Mittelwerte und die Fehlerbalken stellen Standardabweichungen (SD). P < 0,05 und ** P < 0,01, Student t-test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Im Zusammenhang mit der Quantifizierung der SASP mRNAs während H-Ras-induzierte Seneszenz. RNA wurde aus WI-38 Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten nach der H-RasV12 Retrovirus Infektion vorbereitet. Diese Tafeln zeigen die Induktion des IL-6 (A) und (B) IL-8 Ausdrucks von qPCR unter Verwendung der spezifischen Zündkapseln in Tabelle 1aufgeführten analysiert. Die Actin mRNA-Niveaus wurden für die Normalisierung verwendet. Die normalisierte IL-6 oder IL-8 mRNA-Niveaus in der 0-Tage-Probe gemessen wurden auf 1 gesetzt und die relative Falte Änderungen wurden berechnet. Die Experimente wurden unabhängig voneinander wiederholt 3 X. Die Ergebnisse werden als Mittelwerte und die Fehlerbalken zeigen Standardabweichungen (SD). P < 0,05 und ** P < 0,01, Student t-test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 4
Abbildung 4 : Quantifizierung der sekretierten SASP Faktoren während H-Ras-induzierte Seneszenz. Diese Tafeln zeigen Standardkurven mit IL-6 (A) und IL-8 (C) Standards erzeugt. Konditionierte Medien wurden aus WI-38 Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten nach der H-RasV12 Retrovirus Infektion geerntet. Die sekretierten IL-6 (B) und IL-8 (D) wurden mit einer IL-6 und IL-8 ELISA-Kit, analysiert. Die Experimente wurden unabhängig voneinander wiederholt 3 X. Die Ergebnisse werden als Mittelwerte und die Fehlerbalken zeigen Standardabweichungen (SD). P < 0,05 und ** P < 0,01, Student t-test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Gen Namen Forward primer Rückwärts-primer
IL-6 5'-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3 " 5'-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3 "
IL-8 5'-ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3 " 5'-AACCCTCTGCACCCAGTTTTC-3 "
Aktin 5'-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3 " 5'-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3 "

Tabelle 1: Real-Time PCR Zündkapseln für SASP Faktoren.

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Discussion

Hier haben wir Methoden für die Überwachung der intrazellulärer ROS Ebenen während H-Ras-induzierte Seneszenz in normalen menschlichen Fibroblasten WI-38 vorgestellt. Intrazellulären ROS in lebenden Zellen gemessen werden quantitativ mit der Zelle durchlässig Reagenz DCF-DA und flow Cytometry. Auf zelluläre Aufnahme ist DCF-DA deacetylated von intrazellulären Esterasen und anschließend oxidiert durch ROS stark fluoreszierende 2', 7'-dichlorofluoresceins (DCF) bilden. DCF-Fluoreszenz kann durch Durchflusszytometrie mit einem FL1-Detektor (grüne Fluoreszenz) erkannt werden. Mit der DCF-DA Färbung Methode erkannt wir erfolgreich eine Erhöhung in ROS Ebenen während H-Ras-induzierte zellulären Seneszenz in normalen menschlichen Fibroblasten WI-38. Diese Methode kann in verschiedenen Modellen der zellulären Seneszenz verwendet werden, um die Änderungen in ROS Ebenen überwachen. Färbung, zusätzliche Methoden, die verwendet wurden, um die ROS-Induktion Messen gehören neben DCF-DA Überwachungsstufen oxidierte Proteine23 und einer konfokalen Mikroskopie-Analyse mit ROS-abhängige Fluoreszenzfarbstoffen24. Somit ist eine weitere Bestätigung der Änderungen in ROS Ebenen mit zusätzlichen Methoden wünschenswert.

Vor kurzem haben wir gezeigt, dass ROS Ebenen in Krebszellen während p53-induzierte Seneszenz sowie H-Ras-induzierte Seneszenz21erhöht werden. Erhöhte intrazelluläre ROS sind beobachtbare vor der Erhöhung der SA β-gal-Färbung Aktivität, was darauf hindeutet die ursächliche Rolle von ROS in der Induktion der zellulären Seneszenz. Interessanterweise wird die Zunahme der ROS Ebenen separat von den Akt-NF-κB-NOX4 Weg gesteuert, während Zellzyklus Festnahme von p2121vermittelt wird. Ob Akt auch die Erhöhung der ROS in anderen Arten der zellulären Seneszenz regelt wäre interessant zu erforschen.

Wir haben auch Methoden für die Analyse der mRNA eingeführt und abgesondert proteingehalte der SASP Faktoren IL-6 und IL-8 während der H-Ras-induzierte Seneszenz. Mit qPCR, quantifizieren wir die Induktion von IL-6 und IL-8 mRNA in seneszenten WI-38 Zellen. Wir untersuchten Actin mRNA-Niveaus als interne Kontrolle für die Normalisierung, aber GAPDH mRNA kann auch als interne Kontrolle verwendet werden. Die 18 s Ribosomale RNA (rRNA) ist ein weiteres Zimmermädchen-gen, das gewöhnlich als interne Kontrolle in qPCR Experimente. Jedoch weil rRNA Transkription und Ribosom Reifung unterliegen während der Zellzyklus Festnahme und zelluläre Seneszenz25,26, möglicherweise 18 s rRNA keine gute interne Kontrolle für zelluläre Seneszenz Studien. ELISA, Zunahmen mit einem konditionierten Medium aus seneszenten WI-38-Zellen zeigten ähnliche sekretierten IL-6 und IL-8 Ebenen. Einklang mit der Vorstellung, dass die SASP entwickelt wird sind an die "Reife" Seneszenz Stufe19, IL-6 und IL-8-Sekretion nachweisbar zu einem späteren Zeitpunkt als der Anstieg von ROS Ebenen. SASP Faktoren hängen vor allem vom Zelltypen und Seneszenz Induktion Bedingungen27. Daher sollten die entsprechenden SASP Faktoren nach der zellulären Seneszenz Modell ausgewählt werden.

Obwohl wir H-Ras-induzierte Seneszenz, bestätigt durch morphologische Veränderungen und die Induktion von SA-β-gal-Färbung-Aktivität überwachen, zelluläre Seneszenz weiter überprüft werden durch zusätzliche Seneszenz Merkmale, einschließlich der Überwachung der irreversiblen Verlust der Proliferation Potenzial, Seneszenz-assoziierten Heterochromatin Brennpunkte (SAHF), SASP Faktoren, die Aktivierung der Tumor-Suppressoren wie p53 und p16INK4a, verbesserte DNA-Schäden-Signale und anhaltenden nuklearen Herde, definiert als DNA-Abschnitte mit Chromatin Änderungen Seneszenz (DNA-Narben) zu stärken. Es ist jedoch wichtig zu bedenken, dass es eine Heterogenität der Seneszenz Eigenschaften in verschiedenen Seneszenz Arten. Bestimmte Seneszenz Biomarker können nur in einige spezifischen Arten der zellulären Seneszenz zu beobachten sein. Zum Beispiel SAHF sind in der Regel deutlich OIS28,29.

Zelluläre Seneszenz galt zunächst, autonomes Wachstum Verhaftung verursacht durch künstliche Kulturbedingungen zu vertreten. Jedoch haben Studien in den letzten fünfzig Jahren die Bedeutung der zellulären Seneszenz unter verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen, einschließlich Alterung und Krebs gezeigt. Der ursächliche Zusammenhang zwischen der zellulären Seneszenz und altersbedingte Gewebe Verschlechterung ist zuvor in BubR1 Progeroid Maus Modelle30,31nachgewiesen worden. Somit Steuern Zelle Seneszenz durch entweder die Beseitigung der alternde Zellen oder die Modulation der SASP derzeit eine vielversprechende Strategie für altersbedingte Krankheiten gilt als. In der Tat, jüngste Studien gezeigt, dass die Beseitigung der alternde Zellen wäre eine viel versprechende Behandlung altersbedingter Krankheiten einschließlich Stammzell-Erschöpfung, Knochenabbau, Haarausfall und Arthrose32,33, 34,35,36. Ein tieferes Verständnis der molekularen Mechanismen der Seneszenz Induktion und Seneszenz Phänotypen, einschließlich SASPs, bieten bessere Strategien für die Ausrichtung der Seneszenz durch Verringerung der möglichen Nachteile und selektiv targeting nur schädliche Funktionen der alternde Zellen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Stipendium der National Research Foundation of Korea (2015R1D1A1A01060839) (zu jung Yeon Kim) und durch einen National Research Foundation of Korea (NRF) Zuschuss von der Regierung von Korea (MSIT) finanziert (Nein 2016R1A2B2008887, Nr. 2016R1A5A2007009) (um Jeanho Yun).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
poly-L-lysine Sigma-Aldrich P2636
BOSC 23 ATCC CRL-11269
FBS GIBCO 16000-044
penicillin/streptomycin wellgene LS202-02
PBS Hyclone SH30013.02
DMEM GIBCO 12800-082
OPTI-MEM  GIBCO 31985-070
pBabe puro-H-RasV12  Addgene 1768
pGAG/pol Addgene 14887
pVSVG Addgene 1733
Turbofect Thermo Fisher Scientific R0531
polybrene Sigma-Aldrich H9268 8 mg/mL
puromycin Sigma-Aldrich P8833 2 mg/mL 
formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) Sigma-Aldrich B4252
potassium ferrocyanide Sigma-Aldrich B4252
potassium ferricyanide Sigma-Aldrich P9387
trypsin-EDTA wellgene LS015-01
DCF-DA Sigma-Aldrich  D6883 10 mM 
Trizol Thermo Fisher Scientific 15596026
MMLV Reverse transcriptase Promega M1701
SYBR Green PCR master 2x mix Takara PR820A
Random Primer Promega C118A
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
Ultra-pure distilled water Invitrogen 10977015
Human IL-6 ELISA assay PeproTech #900-TM16
Human IL-8 ELISA assay PeproTech #900_TM18
EQUIPMENTS
0.45 μm syringe filter sartorius 16555
Parafilm BEMIS  PM-996
Microscope NIKON TS100
Flow cytometer BD Bioscience LSR Fortessa
Amicon Ultra-4ml Merk Millipore UFC800324
NanoDrop spectrophotometer BioDrop 80-3006-61
Real-time PCR System Applied Biosystems ABI Prism 7500
ELISA Reader Molecular Devices EMax microplate reader

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References

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Entwicklungsbiologie Ausgabe 138 zelluläre Seneszenz H-Ras ROS SASP IL-6 IL-8 Alterung
Eine Quantitative Messung von reaktiven Sauerstoffspezies und Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp in normalen menschlichen Fibroblasten während Onkogen-induzierte Seneszenz
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Kim, Y. Y., Um, J. H., Yun, J. A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence. J. Vis. Exp. (138), e57890, doi:10.3791/57890 (2018).

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