Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En kvantitativ måling av reaktive oksygen arter og Senescence-assosiert sekretoriske fenotypen i Normal menneskelig fibroblaster under folkemengde

Published: August 12, 2018 doi: 10.3791/57890
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2
1Department of Biochemistry, College of Medicine, Dong-A University, 2Peripheral Neuropathy Research Center, College of Medicine, Dong-A University
* These authors contributed equally

Summary

Intracellulær ROS har vist seg å spille en viktig rolle i induksjon av mobilnettet senescence. Her beskriver vi en følsom analysen for kvantifisering ROS nivåer under mobilnettet senescence. Vi tilbyr også protokoller for å vurdere senescence-assosiert sekretoriske fenotypen, som angivelig bidrar til ulike alder-relaterte dysfunksjoner.

Abstract

Mobilnettet senescence har vært ansett som en tilstand av irreversible vekst arrestasjon på konsumpsjon av proliferativ kapasitet eller eksponering for ulike påkjenninger. Nyere studier har utvidet rollen mobilnettet senescence til ulike fysiologiske prosesser, inkludert utvikling, sårheling, immun overvåking og alder-relaterte vev dysfunksjon. Celle syklus arrestasjon er et viktig kjennetegn på mobilnettet senescence, har en økt intracellulær reaktive oksygen arter (ROS) produksjon også blitt demonstrert av for å spille en viktig rolle i induksjon av mobilnettet senescence. I tillegg viste studier at senescent celler ha potent paracrine aktiviteter på nærliggende celler og vev gjennom en senescence-assosiert sekretoriske fenotypen (SASP). Den store økningen av interessen angående strategier mot mobilnettet senescence understreker behovet for en nøyaktig forståelse av senescence mekanismer, inkludert intracellulær ROS og SASP. Her beskriver vi protokoller for kvantitativt vurdere intracellulær ROS nivåer under H-Ras-indusert mobilnettet senescence ROS-sensitive fluorescerende fargestoff og flowcytometri. Dessuten, introdusere vi følsom teknikker for analyse av induksjon av mRNA uttrykk og sekresjon av SASP faktorer. Disse protokollene kan brukes på ulike mobilnettet senescence modeller.

Introduction

Mer enn 50 år siden, avslørt Hayflick og Moorhead at normale celler inn irreversibel vekst arrestasjon på konsumpsjon proliferativ potensial etter et visst antall celledelinger1. Dette fenomenet er nå kjent som replicative senescence og antas å sterkt korrelerer med organismebiologi aldring2. Selv om progressive erosjon av telomeres er ansett som en viktig årsak til replicative senescence, har ulike mobilnettet påkjenninger, som DNA skade, kreftfremkallende aktivisering og oksidativt stress, blitt rapportert å indusere en annen type mobilnettet senescence kalt "tidlig senescence" eller "stress-indusert senescence". Interessant, spiller tidlig senescence en potent svulst-undertrykkende rolle ved aktivering av oncogenes som H-Ras og BRAF. Studier av musen modeller og menneskelig vev har produsert sterke bevis som biomarkers av celle senescence fantes hovedsakelig i premalignant lesjoner der kreftfremkallende Ras og BRAF er aktivert, men ble redusert i ondartet kreft som utviklet fra disse lesjonene3,4,5. Utover sin rolle i aldring og svulst undertrykkelse, har mobilnettet senescence vist i tidligere studier å spille en rolle i ulike fysiologiske prosesser, inkludert sårheling, reparasjon av vev, immun overvåking og embryonale utvikling6.

Selv om vekst arrestasjon har vært grundig studert som et kjennetegn på mobilnettet senescence7, antyder en betydelig kropp av bevis at intracellulær reaktive oksygen arter (ROS) bidrar også til mobilnettet senescence8. Høyden av ROS nivåer under ulike typer mobilnettet senescence, inkludert replicative senescence og folkemengde (OIS), opprinnelig ble rapportert tiår siden9,10. En mer direkte, eksogene behandling med en sublethal dose av H2O2 induserer senescence11,12. Hemming av ROS-scavenging enzymer, for eksempel SOD1, forårsaker også tidlig senescence13. Derimot lite ambient oksygen forhold og øke ROS scavenging forsinkelse utbruddet av senescence10,14,15. Disse resultatene indikerer utvilsomt at ROS er viktig meglere eller determinanter av mobilnettet senescence induksjon. Men hvordan ROS bidra til induksjon av mobilnettet senescence og hvordan ROS nivåene er opphøyet i mobilnettet senescence kreve videre etterforskning.

Nyere studier har avdekket at senescent celler har potente paracrine aktiviteter på nærliggende celler og vev gjennom en SASP16,17. I alderen vev fremme senescent celler aldersrelatert vev dysfunksjoner via mange stier gjennom SASP i tillegg til en autonom uttømming av proliferativ celler. Ulike proinflammatory faktorer, for eksempel IL-6, IL-8, TGFβ og matrise metalloproteinases (MMPs), skilles ut av senescent celler, forårsaker aldersrelatert vev dysfunksjoner gjennom svekkelse av vev homeostase, ødeleggelse av vev arkitektur, senescence nabokommunene cellene og sterile betennelse18,19. SASPs kan imidlertid ha gunstige effekter avhengig av biologisk sammenheng. I tillegg avhenger heterogenetic natur SASPs hvilken senescent celle og celle scenen, understreker behovet for ytterligere forskning19.

Her beskriver vi raskere og følsom cytometri-baserte teknikker for å vurdere intracellulær ROS nivåer under OIS. I tillegg er metoder for analyse av SASP faktorer ved hjelp av kvantitative sanntids polymerasekjedereaksjons (qPCR) og ELISA innført.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. inducing folkemengde

  1. Forberede en H-RasV12 retrovirus
    1. Coat 100 mm kultur parabol ved å legge 2 mL 0,001% poly-L-lysin/fosfat bufrede saltløsning (PBS) i 5 minutter ved romtemperatur.
    2. Fjerne poly-L-lysine løsning ved hjelp av en glass pipette koblet til et vakuum og vask kultur parabol ved å legge til 2 mL 1 x PBS.
    3. Plate 3 x 106 ecotropic BOSC-23 emballasje på bestrøket kultur parabol med Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) som inneholder 10% fosterets bovin serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin og kultur dem på 37 ° C i en CO2 vev kultur inkubator for 1 d.
    4. Neste dag, transfect 2 µg pBabe puro-H-RasV12 DNA med retroviral emballasje DNA (2 µg av pGAG/pol og 0,25 µg av pVSVG) med en transfection reagens for 8t i henhold til produsentens instruksjoner.
    5. Fjern transfection media og legge 8 mL av fersk media.
    6. Etter 48 timer, samle mediet som inneholder virus partikler og fjern mobilnettet rusk med sentrifugering på 500 x g i 5 min.
    7. Filtrere H-Ras virus inneholder media med filtere 0,45 µm sprøyten.
      Merk: Unngå alle frysing og tining av virus-supernatants for en effektiv virusinfeksjon. For å få best effektivitet, bruk et virus som ble slaktet på samme dag som infeksjon.
  2. Infisere WI-38 normal menneskelig fibroblaster med H-RasV12 retrovirus
    1. Plate 5 x 104 WI-38 celler i en 60 mm kultur parabol med DMEM som inneholder 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin 1 d før høsting H-RasV12 retrovirus og kultur dem for en dag på 37 ° C.
    2. Fjern vekstmediet neste dag og tilsett 1 mL av H-RasV12 retrovirus media. Legge til en ekstra 1 mL av vekstmediet som inneholder 2 µL av en polybrene lager løsning (8 mg/mL i destillert vann). Inkuber prøven for en dag i en fuktet 37 ° C, 5% CO2 vev kultur inkubator.
    3. Fjerne H-RasV12 retrovirus blandingen 24 timer senere og vask cellene 2 x med 1 x PBS. Legg oppblomstringen medium og behandle cellene med 2 µg/mL puromycin for 2 dager i en fuktet 37 ° C, 5% CO2 vev kultur inkubator.
    4. 2 d puromycin utvalg, fjerne vekstmediet og vaskes cellene 2 x med 1 x PBS. Legg oppblomstringen medium og kultur cellene i en fuktet 37 ° C, 5% CO2 inkubator til den angitte tiden peke (se figur 1A for en skjematisk diagram).

2. overvåking Senescence via Senescence-assosiert β-galactosidase flekker

  1. Klargjør følgende lager løsninger.
    1. Forberede 20 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) i dimethyl formamide (DMF). Lagre løsningen på 20 ° C.
    2. Forberede en sitronsyre/natrium fosfatbuffer ved oppløsning 3.377 g av Na2HPO4.7H2O (126 mM) og 0.708 g av sitronsyre (36,8 mM) i 100 mL destillert vann. Justere pH 6.0, om nødvendig.
    3. Forberede 0,5 M kalium ferrocyanide. Lagre løsningen i mørket på 4 ° C.
    4. Forberede 0,5 M kalium ferricyanide. Lagre løsningen i mørket på 4 ° C.
      Merk: pH i senescence-assosiert β-galactosidase (SA β-gal) flekker løsningen er avgjørende for nøyaktige resultater.
  2. Lage en frisk SA β-gal flekker løsning fortynne lager løsningen inneholder 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM kalium ferrocyanide, 5 mM kalium ferricyanide, 20% (v/v) sitronsyre/natrium fosfatbuffer og 1 mg/mL X-gal.
  3. Fjerne kultur media og vask cellene 1 x med 1 x PBS. Fastsette cellene med 3% formaldehyd i 5 minutter ved romtemperatur.
    Merk: Celler som ikke er infisert av retrovirus skal brukes som en negativ kontroll. Infisert kontroll cellene bør fortsette å være passaged for å opprettholde deres voksende status.
  4. Fjerne fiksering løsningen fra cellene og vask dem med 1 x PBS. Legg nylagde 1 x SA β-gal flekker løsning (1,5 mL i 60 mm kultur parabol). Forsegle parabolen med en parafin film å hindre tørking og ruge det 24 h på 37 ° C. Alternativt ruge retter sammen i en fuktighet kammer.
    Merk: Etappe, den stabiliserende løsningen inneholder 3% formaldehyd bør behandles som spesialavfall. En inkubator uten CO2 er ønskelig, å forhindre pH endringer under incubation.
  5. Sjekk statusen flekker av cellene under et mikroskop på dagen; SA β-gal-positiv cellene vises blå i regionen perinuclear.
    Merk: Voksende kontroll cellene viser en lav frekvens SA β-gal-positiv celler. Hvis den flekker er for lyst, fortsetter inkubasjonstiden for en lengre periode (se figur 1B for representative eksempler).
  6. Hent en SA β-gal flekker bilde med CCD kamera ved hjelp av en 10 X eller høyere linsen. Ta et tilstrekkelig antall bilder for å beregne den flekker (> 200 celler).
  7. Beregning av SA β-gal-farget celler av kvantifisere antall SA β-gal-positiv cellene i forhold til totalt antall celler.
    Merk: SA β-gal flekker skal gjentas uavhengig minst 3 x og mener verdiene skal beregnes basert på resultatene av Repliker eksperimenter (figur 1 C). Den aktuelle celle tettheten er avgjørende for SA β-gal flekker eksperimentet. En høy confluency kan forstyrre endringen til en senescence-assosiert morfologi og indusere en falske positive signalet i kontroll cellene.

3. kvantifisering en reaktive oksygen arter induksjon under H-Ras-indusert Senescence

  1. Plate 2 x 105 WI-38 celler i en 60 mm kultur parabol og provosere H-Ras-indusert senescence som beskrevet i trinn 1.
    Merk: Denne protokollen kan brukes på andre typer mobilnettet senescence modeller.
  2. Fjerne vekstmediet på angitt tidspunktet (2, 4 eller 6 dager), og vask cellene med 1 x PBS. Koble cellene ved å behandle dem med 1 mL 0,05% trypsin/EDTA og deaktivere trypsin ved å legge til 1 mL av vekstmediet som inneholder 10% FBS. Bestemme celletall.
  3. Overføre 1 x 105 celler i en 15 mL konisk rør, og samle celler med sentrifugering på 500 x g i 5 min.
  4. Forberede frisk 2', 7'-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA) flekker media ved å legge til 50 µL av 10 mM DCF-DA 10 mL av kultur medium (arbeider konsentrasjonen av DCF-DA er 50 µM).
    Merk: DCF-DA er lysfølsom. Lyseksponering bør unngås. Konsentrasjonen DCF-DA og flekker kan justeres avhengig celle.
  5. Fjern vekstmediet nøye fra 15 mL konisk røret og tilsett 1 mL av nylagde DCF-DA flekker medium. Nøye resuspend celle pellets og ruge det på 37 ° C i 30 min i mørket. Inkludere et ikke-farget utvalg som en negativ flekker.
    Merk: Voksende celler som ikke er flekket med DCF-DA bør være forberedt som en negativ kontroll.
  6. Samle cellene med sentrifugering på 500 x g i 5 min og vaske dem 1 x med 2 mL 1 x PBS. Resuspend cellene med 1 mL 1 x PBS og overføre prøven til riktig fluorescens-aktivert cellen sortering (FACS) rør.
  7. Måle den 2 ', 7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-DA) fluorescens signalet med en flyt cytometer utstyrt med en passende laser. Opphisse prøvene med en blå laser (488 nm) og oppdage den slippes ut fluorescensen med en 530 ± 30 nm detektor (FITC) bruker en logaritmisk skala.
    1. Analysere ikke-farget negativ kontroll cellene først. I en prikk tomt frem xy (FSC) versus siden xy (SSC), velger du lever celler med et gating verktøy og fjerne døde celler og mobilnettet rusk.
      Merk: Cellen størrelse endringen bør nøye overvåket i dot plottet av FSC versus SSC. Hvis størrelsen på senescent celler økes betydelig, skal DCF-DA intensiteten sammenlignes i celle populasjoner med samme størrelse etter gating i dot plottet av FSC versus SSC.
    2. I en enkelt-parameteren histogram viser DCF-DA (488 nm) fluorescens på logaritmisk skala av x-aksen og antall hendelser (celle nummer) på lineær skala av y-aksen, justere spenningen av 488 nm laser plassere toppen fra ikke-farget cellene på venstre kant.
    3. Analysere DCF-DA farget prøver og registrere minst 10.000 hendelser for hvert utvalg. Erverve mener fluorescens verdien av hvert utvalg bruker analyseprogramvare bestemte å flyt-cytometer.
      Merk: ROS målene skal gjentas uavhengig minst 3 x og mener verdiene skal beregnes fra disse resultatene. Representant H-Ras-indusert senescence resultater er vist i figur 2.

4. Quantifying IL-6 og IL-8 mRNA uttrykket for Senescence-assosiert sekretoriske fenotypen analyse ved hjelp av en sanntids polymerasekjedereaksjons

  1. Totalt RNA forberedelse
    1. Plate 3 x 105 WI-38 celler i en 100 mm kultur parabol i DMEM som inneholder 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin, og kultur dem på 37 ° C i en vev kultur inkubator for 1 dag. Forberede like kulturer hvert tidspunkt.
    2. Indusere senescence ved å infisere cellene med H-RasV12 retrovirus som beskrevet i trinn 1.
    3. 1 dag før innhøstingen, vaskes cellene 2 x med 1 x PBS, og legge 3 mL DMEM uten FBS.
      Merk: Dette trinnet utføres for å produsere betinget mediet som brukes for ELISA som beskrevet i trinn 5. Serum sult kan indusere uttrykk for IL-6 og IL-8 mRNAs i noen sensitive celler. Dermed skal IL-6 og IL-8 mRNA uttrykk i celler kultivert med og uten serum sult sammenlignes først. Hvis serum sult medfører betydelige endringer i uttrykket av IL-6 eller IL-8 mRNA, bør den totale RNA for qPCR og betinget medium for ELISA være forberedt separat.
    4. Samle betinget mediet fra hver prøve 24 timer senere og lagre middels på-80 ° C for ELISA.
    5. Koble cellene ved å behandle dem med 1 mL 0,05% trypsin/EDTA og deaktivere trypsin ved å legge til 1 mL av vekstmediet som inneholder 10% FBS. Bestemme cellen teller normalisering av ELISA resultater som beskrevet i trinn 5. Høste cellene i en 1,5 mL microcentrifuge tube med sentrifugering på 500 x g i 5 min.
    6. Fjerne mediet av skånsom og legger 1 mL av RNA utvinning løsning. Deretter vortex microcentrifuge røret kraftig for 15 s. Deretter legge 200 µL kloroform og kraftig vortex blandingen igjen for en ekstra 15 s.
    7. Sentrifuge eksempel rør 17000 x g i 10 min på 4 ° C. Deretter forsiktig overføre den øvre fasen til en ny 1,5 mL microcentrifuge tube.
      Merk: Interphase og lavere organisk fasen bør ikke bli forstyrret under overføringen av øvre fase til en ny tube.
    8. Legge til 400 µL av isopropanol å utløse RNA og bland dem godt av mild inversjon. Deretter ruge røret ved romtemperatur for 10 min.
    9. Sentrifuge røret 17000 x g i 10 min på 4 ° C. Deretter forkaste nedbryting, ta vare for å beholde RNA-pellets. Vask RNA ved å legge til 1 mL av 75% etanol og invertere røret 2-3 x. Sentrifuge røret i 5 min 17 000 x g på 4 ° C og kast nedbryting.
    10. Tørr RNA pellet ved romtemperatur og oppløse RNA i 50 µL av diethyl pyrocarbonate (DEPC)-behandlet destillert vann. Bruker 1 µL av RNA løsning, kvantifisere den totale RNA konsentrasjonen med et spektrofotometer.
      Merk: Uttørring vil redusere Løseligheten av RNA; Derfor unngå uttørring av RNA.
  2. cDNA forberedelse
    1. Forberede omvendt-transkripsjon reaksjonsblandingen hver prøve ved å legge til følgende inn i et tynnvegget PCR rør: 2 µg av totalt (Juster volumet til 10 µL med RNase-fritt vann), 2 µL av 10 x RT buffer, 1 µL av en tilfeldig primer (50 pmol), 0,8 µL av 25 x dNTP mix (100 mM), vann 1 µL av MMLV revers transkriptase (50 U/µL) og 5,2 µL av RNase uten.
    2. Sette opp programmet omvendt transkripsjon reaksjon på den termiske cycler med følgende vilkår: 42 ° C for 60 min og 95 ° C i 5 min. sted PCR rør i termisk cycler og starte programmet.
  3. Sanntids polymerasekjedereaksjons
    1. Forberede sanntid PCR master mix alle reaksjoner. Reaksjonsblandingen for hver prøve er som følger: 25 µL av 2 x sanntid PCR Master Mix, 1 µL hver revers primerne for IL-6 eller IL-8 og 21 µL ultra ren destillert vann (DNase og RNase-gratis). Se tabell 1.
      Merk: Forberede sanntid PCR reaksjonsblandingen hvert utvalg som inneholder begrepsordbok RNA primere som en intern kontroll. GAPDH kan også brukes som en intern kontroll for normalisering.
    2. Legge til 48 µL av master mix og 2 µL 3-fold utvannet cDNA produktet med vann i hver brønn i en 96-brønns optisk qPCR plate. Utføre hver reaksjon i tre eksemplarer. Forberede en kontroll godt som ikke inneholder malen cDNA som en PCR.
    3. Definere sanntid PCR reaksjon programmet på den termiske cycler med følgende vilkår: 10 minutter til 95 ° C, 40 sykluser of15 s på 95 ° C (rødsprit) og 1 min på 60 ° C (avspenning og extension).
    4. Utføre sanntid PCR og registrere syklus (CT) terskelverdien etter ferdigstillelse av PCR sykluser. Beregne mRNA nivåene for IL-6 eller IL-8 bruker 2- ΔΔCΤ metoden20.
      Merk: Relative fold endring i uttrykket fastsettes etter normalisering til utgangen nivåene ved hjelp av følgende formel:
      Brett endre = 2-Δ (ΔCT)
      her
      ΔCT = CT, IL-6 eller IL-8- CT, begrepsordbok; og
      Δ (ΔCT) = ΔCT, stimulert- ΔCT, kontroll.
    5. Beregne middelverdien for hver like prøve.
      Merk: qPCR skal gjentas uavhengig minst 3 x og mener verdiene skal beregnes basert på disse resultatene. Representant H-Ras-indusert senescence resultatene vises i Figur 3. Serum sult kan induserer uttrykk for IL-6 og IL-8 mRNAs i noen sensitive celler. Dermed skal IL-6 og IL-8 mRNA uttrykk i celler kultivert med og uten serum sult sammenlignes først. Hvis serum sult medfører betydelige endringer i uttrykk for IL-6 eller IL-8 mRNA, bør den totale RNA for qPCR og betinget medium for ELISA være forberedt separat.

5. kvantifisering nivåer av utskilles IL-6 og IL-8 proteiner for en Senescence-assosiert sekretoriske fenotypen analyse med ELISA

  1. Tine i 3 mL betinget medium høstet fra senescent WI-38 celler som beskrevet i trinn 4. Fjerne celle rusk ved sentrifugering på 500 x g i 5 min.
  2. Konsentrere betinget medium 10-fold med sentrifugering 3000 x g for 20 min bruker en sentrifugal filter enhet.
    Merk: Konsentrasjonen av betinget mediet ikke nødvendigvis avhenge av hvilken prøve.
  3. Utføre ELISA 50 µL av hvert konsentrert utvalg av betinget medium med de aktuelle IL-6 og IL-8 ELISA kits.
    Merk: Test hvert utvalg i to ELISA brønner. Fordi hvert punkt dupliseres i trinn 4, tillater denne analysen oss å overvåke variasjoner i både ELISA-analysen og prøve forberedelse teknikken.
    1. For ELISA plate belegg, fortynne den IL-6 eller IL-8 antistoff med 1 x PBS til en konsentrasjon på 0,5 µg/mL for IL-6 eller 0.125 µg/mL for IL-8. Tilsett 100 µL av utvannet antistoffer hver brønn av ELISA plate. Seal platen med en ELISA plate tetting film og ruge uten risting over natten i romtemperatur.
    2. Fjerne antistoff løsningen av aspirasjon. Vask hver godt 4 x med 300 µL av 1 x vaskebuffer (0,05% Tween-20 i PBS). Legge til 300 µL blokkerer bufferen (1% BSA i PBS) i hver brønn. Inkuber ved romtemperatur 1t.
    3. Fjerne blokkering løsningen av aspirasjon. Vask hver godt 4 x med 300 µL av 1 x vaskebuffer. Forberede serielt utvannet ELISA standarder i en fortynning buffer (0,05% Tween-20 og 0,1% BSA i PBS) til å generere en standard kurve.
      NOTE Fortsettelsene fortynning i IL-6 er 31.25, 62,5, 125, 250, 500, 1000 og 2000 pg/mL. Seriell fortynning for IL-8 er 2,34, 4.69, 9.38, 18.75, 37,5, 75 og 150 pg/mL.
    4. Tilsett 100 µL av standard løsningen eller 100 µL av prøve løsningen (50 µL av konsentrert medium med 50 µL fortynning bufferen) hver brønn. Inkuber brønnene ved romtemperatur for 2T.
    5. Fjern standard eller eksempel løsningen av aspirasjon. Vask hver godt 4 x med 300 µL av 1 x vaskebuffer. Fortynne oppdagelsen antistoffer med fortynning buffer til en konsentrasjon av 0,1 µg/mL for IL-6 eller 0,25 µg/mL for IL-8. Legg 100 µL av utvannet antistoffer per brønn. Inkuber brønnene ved romtemperatur for 2T.
    6. Fjerne antistoff løsningen av aspirasjon. Vask hver godt 4 x med 300 µL av 1 x vaskebuffer. Fortynn streptavidin-pepperrotperoksidase (HRP) i fortynning bufferen til en konsentrasjon av 0,05 µg/mL. Legg 100 µL streptavidin-HRP løsning per brønn. Inkuber brønnene ved romtemperatur for 30 min.
    7. Fjerne antistoff løsningen av aspirasjon. Vask hver godt 4 x med 300 µL av 1 x vaskebuffer. Legg 100 µL av 3, 3, 5, 5 '-tetramethylbenzidine (TMB) substratløsningen i hver brønn. Inkuber brønnene ved romtemperatur for 20 min å tillate farge utvikling. Stoppe reaksjonen ved å legge til 100 µL av en 1 M HCl stopp løsning.
    8. Lese absorbansen hver godt med en ELISA leser ved 450 nm.
    9. Tegne standardkurven for genererte standarder. Beregn konsentrasjonen av IL-6 og IL-8 i betinget medium i henhold til standard kurvene. Tegne inn resultatene etter en normalisering celle greven. Beregne mener verdiene for dupliserte prøver.
      Merk: ELISAs skal gjentas uavhengig minst 3 x og mener verdiene skal beregnes basert på disse resultatene (Figur 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et eksempel på H-Ras-indusert senescence er vist i figur 1. En infeksjon av WI-38 normal menneskelig fibroblaster med H-RasV12 retrovirus indusert dramatiske morfologiske endringer (figur 1B). Dessuten, som vist i figur 1 c, økt SA β-gal flekker aktivitet bemerkelsesverdig på H-RasV12 uttrykk. Mer enn 70% av cellene viste SA β-gal flekk aktivitet 6 d etter H-RasV12 retrovirus infeksjonen, som angir at et uttrykk for H-RasV12 vellykket induserer mobilnettet senescence i WI-38 celler, som vi og andre grupper rapportert tidligere21 ,22.

Figur 2 viser representant resultatene av DCF-DA flekker analyse for overvåking ROS nivåer under H-Ras-indusert mobilnettet senescence. Økte intracellulær ROS nivåer er observert så tidlig som to dager etter H-Ras uttrykket og vedlikeholdes til 6-dagers tidspunktet. I mellomtiden viser induksjon av SASP forskjellige kinetics. Økt mRNA nivåer av IL-6 og IL-8, representant SASP faktorer, er observert fra 4 dager etter H-Ras uttrykk og peak på 8-dagers tidspunktet (Figur 3). Som illustrert i Figur 4, viser secreted IL-6 og IL-8 nivåer tilsvarende økninger, konsekvent med sanntid PCR resultatene. Disse resultatene tyder på ulike roller av ROS og SASP i induksjon av mobilnettet senescence.

Figure 1
Figur 1 : Morfologiske endringer og økning i SA β-gal flekker under H-Ras-indusert senescence. (A) dette panelet viser den eksperimentelle prosedyren for induksjon av H-Ras-indusert senescence i WI-38 celler. (B) SA β-gal flekker ble utført på det angitte tidspunktet etter infeksjon av WI-38 celler med H-RasV12 retrovirus; Her vises representant bilder av den SA β-gal flekker. (C) SA β-gal-positiv celler ble talt, i tre uavhengige eksperimenter. Resultatene presenteres som betyr, og feilfeltene representerer standardavvik (SD). P < 0,01, Student t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 2
Figur 2 : Øke i intracellulær ROS nivåer under H-Ras-indusert senescence. (A) WI-38 celler var infisert med H-Ras retrovirus og farget med DCF-DA (50 µM) på de angitte tidspunkt. DCF-DA fluorescens intensiteter kvantifisert ved hjelp av en flow cytometer. Representant histogrammer for DCF-DA fluorescens intensiteten på 0 og 6 d tid points vises. (B) representant histogrammer for DCF-DA fluorescens intensiteten på 0 og 6 dagers tid points tegnes sammen for enklere sammenligning. (C) The DCF-DA fluorescens intensitet under H-Ras-indusert senescence ble målt ved angitte poeng 3 x. Resultatene presenteres som betyr, og feilfeltene representerer standardavvik (SD). P < 0,05 og ** P < 0,01, Student t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Kvantifisering av SASP-relaterte mRNAs under H-Ras-indusert senescence. RNA var forberedt fra WI-38 celler i de angitte tidspunkt etter H-RasV12 retrovirus infeksjonen. Disse skjermbildene viser induksjon av IL-6 (A) og (B) IL-8 uttrykket analysert av qPCR ved hjelp av bestemte primerne oppført i tabell 1. Utgangen mRNA nivåer ble brukt for normalisering. Den normaliserte IL-6 eller IL-8 mRNA nivåer målt i 0 dager prøven ble satt til 1 og relativ fold endringene ble beregnet. Eksperimentene var uavhengig gjentatte 3 x. Resultatene presenteres som betyr, og feilfeltene angir standard avvik (SD). P < 0,05 og ** P < 0,01, Student t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 4
Figur 4 : Kvantifisering av utskilles SASP faktorer i H-Ras-indusert senescence. Disse skjermbildene viser standard kurver generert med IL-6 (A) og IL-8 (C) standarder. Betinget media ble høstet fra WI-38 celler i de angitte tidspunkt etter H-RasV12 retrovirus infeksjon. Den utskilles IL-6 (B) og IL-8 nivåer (D) ble analysert med IL-6 og IL-8 ELISA kit, henholdsvis. Eksperimentene var uavhengig gjentatte 3 x. Resultatene presenteres som betyr, og feilfeltene angir standard avvik (SD). P < 0,05 og ** P < 0,01, Student t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Gene navn Fremover primer Omvendt primer
IL-6 5-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3 " 5-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3 "
IL-8 5-ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3 " 5-AACCCTCTGCACCCAGTTTTC-3 "
utgangen 5-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3 " 5-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3 "

Tabell 1: Sanntid PCR primere for SASP faktorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her har vi presentert metoder for overvåking intracellulær ROS nivåer under H-Ras-indusert senescence i WI-38 normal menneskelig fibroblaster. Intracellulær ROS nivåer i levende celler kan måles kvantitativt ved hjelp av celle-permeable reagensen DCF-DA og flow cytometri. På mobilnettet opptak, er DCF-DA deacetylated av intracellulær esterases og deretter oksidert av ROS til svært fluorescerende 2', 7'-dichlorofluorescein (DCF). DCF fluorescens kan oppdages av flowcytometri med en FL1 detektor (grønn fluorescens). Med metoden DCF-DA flekker oppdaget vi har en økning i ROS nivåer under H-Ras-indusert mobilnettet senescence i WI-38 normal menneskelig fibroblaster. Denne metoden kan brukes i ulike modeller av mobilnettet senescence for å overvåke endringer i ROS nivåer. I tillegg DCF-DA inkluderer flekker, flere metoder som har blitt brukt til å måle ROS induksjon overvåking nivåer av oksidert proteiner23 og en AC confocal mikroskopi analyse med ROS-avhengige fluorescerende fargestoffer24. Dermed ytterligere er bekreftelse av endringer i ROS nivåer ved hjelp av flere metoder ønskelig.

Vi har nylig vist at ROS nivåene er økt kreftceller p53-indusert senescence samt H-Ras-indusert senescence21. Økt intracellulær ROS nivåer er observerbare før økningen i SA β-gal flekk aktivitet, tyder forårsaker rollen ROS i induksjon av mobilnettet senescence. Interessant, kontrollert økningen i ROS nivåer separat av Akt-NF-κB-NOX4 veien, mens celle syklus arrestasjon er formidlet av p2121. Om Akt også regulerer ROS økningen i andre typer mobilnettet senescence ville være interessant å utforske.

Vi har også introdusert metoder for å analysere mRNA og utskilles protein nivå av SASP faktorer IL-6 og IL-8 under H-Ras-indusert senescence. Bruker qPCR, kvantifisert vi induksjon av IL-6 og IL-8 mRNA i senescent WI-38 celler. Vi undersøkte begrepsordbok mRNA nivåer som en intern kontroll for normalisering, men GAPDH mRNA kan også brukes som en intern kontroll. 18S ribosomal RNA (rRNA) er en annen housekeeping genet som vanligvis brukes som en intern kontroll qPCR eksperimenter. Men fordi rRNA transkripsjon og ribosom modning er regulert under celle syklus arrestasjon og mobilnettet senescence25,26, kan 18S rRNA ikke være en god intern kontroll for mobilnettet senescence studier. ELISA, bruke en betinget medium fra senescent WI-38 celler, viste lignende øker i utskilles IL-6 og IL-8 nivåer. Samsvar med ideen om at SASP er utviklet på "voksne" senescence scenen19, økning i IL-6 og IL-8 sekresjon er synlig på et senere tidspunkt enn økningen i ROS nivåer. Spesielt varierer SASP faktorer avhengig celletyper og senescence induksjon forhold27. Derfor skal de riktige SASP faktorene velges ifølge mobilnettet senescence modellen.

Selv om vi bekreftet H-Ras-indusert senescence ved å overvåke morfologiske endringer og induksjon av SA β-gal flekker aktivitet, mobilnettet senescence må bekreftes ytterligere ved å overvåke flere senescence egenskaper, inkludert den permanent tap av spredning potensial, senescence-assosiert heterochromatin foci (SAHF), SASP faktorer, aktivering av svulst suppressors som p53 og p16INK4a, forbedret DNA skade signaler og vedvarende kjernefysiske foci, definert som DNA segmenter med chromatin endringer forsterke senescence (DNA-arr). Det er imidlertid viktig å huske at det er en heterogenitet senescence egenskaper i forskjellige senescence typer. Visse senescence biomarkers kan være observerbare bare i noen bestemte typer mobilnettet senescence. SAHF er for eksempel vanligvis tydelig i OIS28,29.

Mobilnettet senescence opprinnelig ble ansett som representerer autonome vekst arrestasjon forårsaket av kunstige kultur forhold. Men har studier i siste halve århundre vist betydningen av mobilnettet senescence under ulike patofysiologiske forhold, herunder aldring og kreft. Årsakssammenhengen mellom mobilnettet senescence og alder-relaterte vev forverring har vist tidligere i BubR1 progeroid mus modeller30,31. Dermed er kontroll celle senescence gjennom enten eliminering av senescent celler eller modulering av SASP nå regnet som en lovende strategi for alder-relaterte sykdommer. Faktisk studier vist at eliminering av senescent celler ville være en lovende behandling for aldersrelatert patologi inkludert stamcelleforskningen utarming, bentap, håravfall og slitasjegikt32,33, 34,35,36. En dypere forståelse av molekylære mekanismer senescence induksjon og senescence fenotyper, inkludert SASPs, gir forbedret strategier for målretting senescence ved å redusere mulig ulempene og selektivt målretting bare skadelige funksjonene i senescent celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra det nasjonale Research Foundation av Korea (2015R1D1A1A01060839) (til unge Yeon Kim) og National Research Foundation av Korea (NRF) stipend finansiert av Korea regjeringen (MSIT) (nei 2016R1A2B2008887, nei. 2016R1A5A2007009) (til Jeanho Yun).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
poly-L-lysine Sigma-Aldrich P2636
BOSC 23 ATCC CRL-11269
FBS GIBCO 16000-044
penicillin/streptomycin wellgene LS202-02
PBS Hyclone SH30013.02
DMEM GIBCO 12800-082
OPTI-MEM  GIBCO 31985-070
pBabe puro-H-RasV12  Addgene 1768
pGAG/pol Addgene 14887
pVSVG Addgene 1733
Turbofect Thermo Fisher Scientific R0531
polybrene Sigma-Aldrich H9268 8 mg/mL
puromycin Sigma-Aldrich P8833 2 mg/mL 
formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) Sigma-Aldrich B4252
potassium ferrocyanide Sigma-Aldrich B4252
potassium ferricyanide Sigma-Aldrich P9387
trypsin-EDTA wellgene LS015-01
DCF-DA Sigma-Aldrich  D6883 10 mM 
Trizol Thermo Fisher Scientific 15596026
MMLV Reverse transcriptase Promega M1701
SYBR Green PCR master 2x mix Takara PR820A
Random Primer Promega C118A
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
Ultra-pure distilled water Invitrogen 10977015
Human IL-6 ELISA assay PeproTech #900-TM16
Human IL-8 ELISA assay PeproTech #900_TM18
EQUIPMENTS
0.45 μm syringe filter sartorius 16555
Parafilm BEMIS  PM-996
Microscope NIKON TS100
Flow cytometer BD Bioscience LSR Fortessa
Amicon Ultra-4ml Merk Millipore UFC800324
NanoDrop spectrophotometer BioDrop 80-3006-61
Real-time PCR System Applied Biosystems ABI Prism 7500
ELISA Reader Molecular Devices EMax microplate reader

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
  3. Braig, M., et al. Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development. Nature. 436 (7051), 660-665 (2005).
  4. Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
  5. Collado, M., et al. Tumour biology: senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642 (2005).
  6. Malaquin, N., Martinez, A., Rodier, F. Keeping the senescence secretome under control: Molecular reins on the senescence-associated secretory phenotype. Experimental Gerontology. 82, 39-49 (2016).
  7. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes & Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  8. Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Experimental Cell Research. 314 (9), 1918-1922 (2008).
  9. Furumoto, K., Inoue, E., Nagao, N., Hiyama, E., Miwa, N. Age-dependent telomere shortening is slowed down by enrichment of intracellular vitamin C via suppression of oxidative stress. Life Sciences. 63 (11), 935-948 (1998).
  10. Lee, A. C., et al. Ras proteins induce senescence by altering the intracellular levels of reactive oxygen species. The Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 7936-7940 (1999).
  11. Chen, Q., Ames, B. N. Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).
  12. Dumont, P., et al. Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast. Free Radical Biology & Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).
  13. Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).
  14. Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
  15. Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).
  16. Rodier, F., Campisi, J. Four faces of cellular senescence. The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).
  17. Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).
  18. Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).
  19. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Kim, Y. Y., et al. Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence. Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).
  22. Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a. Cell. 88 (5), 593-602 (1997).
  23. Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).
  24. Wojtala, A., et al. Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).
  25. Duncan, F. E., et al. Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte. Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).
  26. Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence. Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).
  27. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  28. Kosar, M., et al. Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a). Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).
  29. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  30. Baker, D. J., et al. Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency. Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).
  31. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  32. Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
  33. Farr, J. N., et al. Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice. Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).
  34. Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
  35. Yosef, R., et al. Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL. Nature Communications. 7, 11190 (2016).
  36. Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 138 mobilnettet senescence H-Ras ROS SASP IL-6 IL-8 aldring
En kvantitativ måling av reaktive oksygen arter og Senescence-assosiert sekretoriske fenotypen i Normal menneskelig fibroblaster under folkemengde
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, Y. Y., Um, J. H., Yun, J. A… More

Kim, Y. Y., Um, J. H., Yun, J. A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence. J. Vis. Exp. (138), e57890, doi:10.3791/57890 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter