Summary
ROS intracellulari è stato indicato per svolgere un ruolo importante nell'induzione della senescenza cellulare. Qui, descriviamo un test sensibile per quantificare i livelli di ROS durante la senescenza cellulare. Forniamo anche i protocolli per la valutazione del fenotipo secretivo senescenza-collegata, che secondo come riferito contribuisce a varie disfunzioni relative all'età.
Abstract
La senescenza cellulare è stata considerata uno stato di arresto di crescita irreversibile salvo esaurimento della capacità proliferativa o l'esposizione a varie sollecitazioni. Studi recenti hanno esteso il ruolo della senescenza cellulare ai vari processi fisiologici, tra cui lo sviluppo, la guarigione della ferita, sorveglianza immune e disfunzione del tessuto senile. Anche se l'arresto del ciclo cellulare è una caratteristica fondamentale della senescenza cellulare, una produzione di ossigeno reattivo intracellulare aumentato specie (ROS) è stata dimostrata anche a giocare un ruolo importante nell'induzione della senescenza cellulare. Inoltre, studi recenti hanno rivelato che le cellule senescenti esibiscono le attività paracrina potente sulle vicine cellule e tessuti attraverso un fenotipo secretivo senescenza-collegata (SASP). Il forte aumento di interesse per quanto riguarda le strategie terapeutiche contro la senescenza cellulare dà risalto all'esigenza di una precisa comprensione dei meccanismi di senescenza, compreso ROS intracellulari e la SASP. Qui, descriviamo protocolli per valutare quantitativamente i livelli intracellulari di ROS durante la senescenza cellulare indotta da H-Ras usando la tintura fluorescente ROS sensibile e citometria a flusso. Inoltre, vi presentiamo le tecniche sensibili per l'analisi dell'induzione dell'espressione del mRNA e la secrezione di fattori SASP. Questi protocolli possono essere applicati a vari modelli di senescenza cellulare.
Introduction
Più di 50 anni fa, Hayflick e Moorhead ha rivelato che le cellule normali immettere arresto di crescita irreversibile salvo l'esaurimento della loro potenziale proliferativo dopo un certo numero di divisioni cellulari1. Questo fenomeno è ora conosciuto come senescenza replicativa e si crede per correlare fortemente con invecchiamento organismal2. Anche se la progressiva erosione dei telomeri è considerata delle principali cause di senescenza replicativa, vari sforzi cellulari, come il danno del DNA, l'attivazione oncogenica e stress ossidativo, sono stati segnalati per indurre un altro tipo di senescenza cellulare chiamato "la senescenza prematura" o "stress-indotta senescenza". Interessante, la senescenza prematura svolge un ruolo di tumore-soppressiva potente al momento dell'attivazione di oncogeni come H-Ras e BRAF. Studi di modelli murini e tessuti umani hanno prodotto la prova ben fondata che biomarcatori di senescenza cellulare erano principalmente presenti nelle lesioni premaligne dove oncogeni Ras e BRAF sono attivati ma sono stati diminuiti nei tumori maligni che si è sviluppato da Queste lesioni3,4,5. Oltre il suo ruolo nell'invecchiamento e nella soppressione del tumore, senescenza cellulare ha dimostrata in studi precedenti di svolgere un ruolo in vari processi fisiologici, tra cui la guarigione della ferita, riparazione dei tessuti, sorveglianza immune e sviluppo embrionale6.
Anche se l'arresto di crescita è stato ampiamente studiato come un segno distintivo della senescenza cellulare7, un corpo significativo di prova suggerisce che le specie reattive intracellulari dell'ossigeno (ROS) contribuiscono anche alla senescenza cellulare8. L'elevazione dei livelli di ROS durante vari tipi di senescenza cellulare, tra cui senescenza replicativa e senescenza indotta da oncogene (OIS), è stato segnalato originariamente decenni fa9,10. Più direttamente, il trattamento esogeno con una dose subletale di H2O2 induce senescenza11,12. L'inibizione di enzimi di ROS-lavaggio, come SOD1, causa anche la senescenza prematura13. Al contrario, basse condizioni di ossigeno ambientale e aumentando il ritardo ROS scavenging l'insorgenza della senescenza10,14,15. Questi risultati indicano senza dubbio che i ROS sono mediatori importanti o determinanti dell'induzione della senescenza cellulare. Tuttavia, come ROS contribuiscono all'induzione della senescenza cellulare e come i livelli di ROS sono elevati durante la senescenza cellulare richiedono ulteriori indagini.
Recenti studi hanno rivelato che le cellule senescenti hanno attività paracrina potente sulle vicine cellule e tessuti attraverso un' SASP16,17. In tessuto invecchiato, cellule senescenti promuovono tessuto senile disfunzioni attraverso molte vie attraverso SASP oltre uno svuotamento autonoma di cellule proliferative. Vari fattori proinflammatory, quali IL-6, IL-8, TGFβ e metalloproteinasi di matrice (MMP), secernute dalle cellule senescenti, causano disfunzioni relative all'età del tessuto attraverso la compromissione dell'omeostasi tissutale, distruzione dell'architettura del tessuto, senescenza delle cellule vicine e infiammazione sterile18,19. Tuttavia, SASPs può avere effetti benefici a seconda del contesto biologico. Inoltre, la natura di heterogenetic di SASPs dipende il tipo delle cellule senescenti e la fase delle cellule, dante risalto all'esigenza di ulteriore ricerca19.
Qui, descriviamo le tecniche basate su cytometry veloce e sensibile per la valutazione dei livelli intracellulari di ROS durante OIS. Inoltre, vengono presentati i metodi per l'analisi dei fattori SASP usando reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qPCR) ed ELISA.
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Protocol
1. induzione della senescenza indotta da Oncogene
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Preparare un H-RasV12 retrovirus
- Cappotto piastra di coltura di 100 mm con l'aggiunta di 2 mL di 0,001% poly-L-lisina/fosfato tampone salino (PBS) per 5 min a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione di poli-L-lisina usando una pipetta di vetro collegata ad un vuoto e lavare la piastra di coltura con l'aggiunta di 2 mL di 1X PBS.
- Piastra 3 x 106 ecotropic BOSC-23 imballaggio cellule sulla cultura rivestito piatto con di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) contenente 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina e li della coltura a 37 ° C in una coltura di tessuti di CO2 incubatrice per 1D.
- Il giorno successivo, transfect 2 µ g di DNA puro-H-RasV12 pBabe insieme a DNA retrovirali imballaggio (2 µ g di pGAG/pol e 0,25 µ g di pVSVG) utilizzando un reagente di transfezione per 8 h secondo le istruzioni del produttore.
- Rimuovere il supporto di transfezione e aggiungere 8 mL di terreno fresco.
- Dopo 48 h, raccogliere i supporti contenenti particelle virali e rimuovere eventuali detriti cellulari mediante centrifugazione a 500 x g per 5 min.
- Filtrare i supporti contenenti virus H-Ras con un filtro per siringa da 0,45 µm.
Nota: Evitare qualsiasi congelamento e scongelamento dei surnatanti virus per un'infezione virale efficiente. Per ottenere la migliore efficienza, utilizzare un virus che è stato raccolto sullo stesso giorno di infezione.
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Infettare WI-38 fibroblasti umani normali con il retrovirus di H-RasV12
- Piastra 5x104 WI-38 celle in una piastra di coltura di 60mm con DMEM contenente 10% FBS e 1% penicillina/streptomicina 1 g prima della raccolta il retrovirus di H-RasV12 e la loro cultura per 1 giorno a 37 ° C.
- Rimuovere il mezzo di crescita il giorno successivo e aggiungere 1 mL di H-RasV12 media di retrovirus. Aggiungere un ulteriore 1 mL di terreno di coltura contenente 2 µ l di una soluzione di riserva polybrene (8 mg/mL in acqua distillata). Incubare il campione per 1 giorno in un umidificata 37 ° C, 5% CO2 incubatore di coltura del tessuto.
- Rimuovere la miscela di retrovirus di H-RasV12 24 ore più tardi e lavare le cellule 2 x con PBS 1X. Aggiungere il terreno di crescita e trattare le cellule con 2 µ g/mL di con puromicina per 2 giorni in un umidificata 37 ° C, 5% CO2 incubatore di coltura del tessuto.
- Dopo 2 d di selezione con puromicina, rimuovere il mezzo di crescita e lavare le cellule 2 x con PBS 1X. Aggiungere il terreno di coltura e cultura le cellule in un umidificata 37 ° C, 5% CO2 incubatrice fino a che il tempo indicato (Vedi Figura 1A per un diagramma schematico).
2. monitoraggio senescenza tramite colorazione di β-galattosidasi senescenza-collegata
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Preparare le seguenti soluzioni stock.
- Preparare 20 mg/mL di 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galattopiranoside (X-gal) in dimetilformammide (DMF). Conservare la soluzione a-20 ° C.
- Preparare un tampone di fosfato di sodio acido citrico sciogliendo 3,377 g di Na2HPO4.7h2O (126 mM) e 0,708 g di acido citrico (36,8 mM) in 100 mL di acqua distillata. Se necessario, regolare il pH a 6.0.
- Preparare il ferrocianuro di potassio 0,5 M. Conservare la soluzione al buio a 4 ° C.
- Preparare il ferricianuro di potassio 0,5 M. Conservare la soluzione al buio a 4 ° C.
Nota: Il pH della soluzione colorante β-galattosidasi senescenza-collegata (SA β-gallone) è fondamentale per ottenere risultati accurati.
- Fare una soluzione colorante di fresco SA β-gallone diluendo la soluzione di riserva contenenti NaCl 150 mM, 2 mM MgCl2, ferrocianuro di potassio 5 mM, ferricianuro di potassio 5 mM, tampone di fosfato di sodio acido citrico 20% (v/v) e 1 mg/mL del X-gal.
- Rimuovere il supporto di cultura e lavare le cellule 1 x con PBS 1X. Fissare le cellule con 3% di formaldeide per 5 min a temperatura ambiente.
Nota: Le cellule che non sono infettate con il retrovirus dovrebbero essere usate come controllo negativo. Le cellule di controllo non infetto dovrebbero continuare a essere attraversate per mantenere il loro status di proliferazione. - Rimuovere la soluzione di fissaggio dalle cellule e lavarli con PBS 1X. Aggiungere il preparato fresco 1 x SA β-gallone soluzione colorante (1,5 mL in una piastra di coltura di 60 mm). Sigillare il piatto con una pellicola di paraffina per prevenire la secchezza e incubare per 24 h a 37 ° C. In alternativa, incubare i piatti insieme in una camera umida.
Nota: La soluzione fissante contenenti formaldeide 3% deve essere smaltita come rifiuti pericolosi. Un incubatore senza CO2 è auspicabile, per evitare variazioni di pH durante l'incubazione. - Controllare lo stato di colorazione delle cellule al microscopio il giorno successivo; Cellule β-gal-positive SA appaiono blue nella regione perinucleare.
Nota: Le cellule di controllo proliferazione mostrano una bassa frequenza delle cellule β-gal-positive SA. Se la colorazione è troppo chiara, continuare l'incubazione per un periodo leggermente più lungo (cfr. Figura 1B per esempi rappresentativi). - Acquisire un'immagine di macchiatura del β-gallone SA con una telecamera CCD utilizzando un 10x o superiore dell'obiettivo. Catturare un numero sufficiente di immagini per calcolare la percentuale di colorazione (> 200 cellule).
- Calcolare la percentuale delle cellule β-gal-macchiate SA di quantificare il numero delle cellule β-gal-positive SA rispetto al numero totale delle cellule.
Nota: SA β-gallone colorazione deve essere ripetuto in modo indipendente almeno 3x ed i valori medi va calcolata in base ai risultati di replicati esperimenti (C di fig. 1). La densità di cella appropriata è fondamentale per l'esperimento di macchiatura del β-gallone SA. Un confluency di alta può interferire con il cambiamento di una morfologia di senescenza-collegata e indurre un segnale di falsi positivi in cellule di controllo.
3. quantificare un'induzione di specie reattive dell'ossigeno durante la senescenza indotta da H-Ras
- Piastra 2 x 105 WI-38 celle su una cultura di 60 mm piatto e provocano H-Ras-indotta senescenza come descritto nel passaggio 1.
Nota: Questo protocollo può essere applicato ad altri tipi di modelli di senescenza cellulare. - Rimuovere il mezzo di crescita dal punto di tempo indicato (2, 4 o 6 giorni) e lavare le cellule con PBS 1X. Staccare le cellule trattandole con 1 mL di soluzione di tripsina/EDTA 0,05% e inattivare la tripsina aggiungendo 1 mL di terreno di coltura contenente 10% FBS. Determinare il conteggio delle cellule.
- Trasferire 1 x 105 celle in una provetta conica da 15 mL e raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 500 x g per 5 min.
- Preparare fresco 2', 7'-il dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA) colorazione media aggiungendo 50 µ l di 10 mM DCF-DA a 10 mL di terreno di coltura (la concentrazione di lavoro di DCF-DA è 50 µM).
Nota: DCF-DA è sensibile alla luce. Evitare l'esposizione alla luce. La concentrazione di DCF-DA e il tempo di colorazione può essere regolata a seconda del tipo di cella. - Rimuovere con attenzione il mezzo di crescita dalla provetta conica da 15 mL e aggiungere 1 mL di preparati DCF-DA colorazione media. Attentamente, risospendere il pellet cellulare e incubare a 37 ° C per 30 min al buio. Includere un campione non macchiato come controllo negativo colorazione.
Nota: Non macchiate con DCF-DA proliferazione delle cellule deve essere preparati come controllo negativo. - Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 500 x g per 5 min e lavarli 1x con 2 mL di PBS 1X. Risospendere le cellule con 1 mL di PBS 1X e trasferire il campione per la cella appropriata di fluorescenza-attivato l'ordinamento tubo (FACS).
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Misurare il 2 ′, 7 ′-Dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCF-DA) segnale di fluorescenza utilizzando un citometro a flusso dotato di una fonte laser appropriato. Eccitare i campioni con un laser blu (488 nm) e rilevare la fluorescenza emessa con un rilevatore di 530 ± 30 nm (FITC) utilizzando una scala logaritmica.
- Analizzare innanzitutto le cellule di controllo negativo non tinto. In un terreno di puntino di forward scatter (FSC) rispetto al lato a dispersione (SSC), selezionare cellule vive utilizzando uno strumento di gating ed eliminare le cellule morte e detriti cellulari.
Nota: La modifica della dimensione delle cellule deve essere attentamente monitorata nella trama del puntino di FSC vs SSC. Se la dimensione delle cellule senescenti è aumentata significativamente, l'intensità di DCF-DA deve essere confrontato in popolazioni di cellule della stessa dimensione dopo gating nella trama del puntino di FSC vs SSC. - In un istogramma di singolo-parametro visualizzazione DCF-DA (488 nm) fluorescenza su scala logaritmica della x-asse e il numero di eventi (numero delle cellule) su scala lineare di y-axis, regolare la tensione del laser 488 nm per posizionare il picco da le cellule non-macchiato al margine sinistro.
- Analizzare il DCF-DA macchiato campioni e registrare almeno 10.000 eventi per ciascun campione. Acquisire il valore di fluorescenza media di ciascun campione utilizzando software di analisi specifico per il citometro a flusso.
Nota: Le misurazioni ROS dovrebbero essere ripetute in modo indipendente almeno 3 volte e i valori medi devono essere calcolati da questi risultati. Rappresentante H-Ras-indotta senescenza risultati sono mostrati nella Figura 2.
- Analizzare innanzitutto le cellule di controllo negativo non tinto. In un terreno di puntino di forward scatter (FSC) rispetto al lato a dispersione (SSC), selezionare cellule vive utilizzando uno strumento di gating ed eliminare le cellule morte e detriti cellulari.
4. Quantifying IL-6 e l'espressione di IL-8 mRNA per senescenza-collegata secretiva fenotipo analisi usando una reazione a catena della polimerasi in tempo reale
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Preparazione di RNA totale
- Piastra 3 x 105 WI-38 celle su una cultura di 100 mm piatto in DMEM contenente 10% FBS e 1% di penicillina/streptomicina e loro coltura a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto per 1 giorni. Preparare due colture per ciascun punto di tempo.
- Indurre senescenza di infettare le cellule con il retrovirus di H-RasV12, come descritto nel passaggio 1.
- A 1 giorno prima della raccolta, lavare le cellule 2 x con PBS 1X e aggiungere 3 mL di DMEM senza FBS.
Nota: Questo passaggio è condotto per produrre il medium condizionato utilizzato per ELISA come descritto nel passaggio 5. Inedia del siero può indurre l'espressione di IL-6 e IL-8 mRNA in alcune cellule sensibili. Così, l'IL-6 e l'espressione di IL-8 mRNA in cellule coltivate con e senza inedia del siero dovrebbe essere paragonati inizialmente. Se inedia del siero induce cambiamenti significativi nell'espressione del-6 o IL-8 mRNA, il RNA totale per qPCR e il medium condizionato per ELISA dovrebbe essere preparati separatamente. - Raccogliere il medium condizionato da ciascun campione 24 ore più tardi e conservare il mezzo a-80 ° C per ELISA.
- Staccare le cellule trattandole con 1 mL di soluzione di tripsina/EDTA 0,05% e inattivare la tripsina aggiungendo 1 mL di terreno di coltura contenente 10% FBS. Determinare il numero di celle per la normalizzazione dei risultati ELISA come descritto nel passaggio 5. Raccogliere le cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL mediante centrifugazione a 500 x g per 5 min.
- Rimuovere il supporto di aspirazione delicata e aggiungere 1 mL di soluzione di estrazione di RNA. Quindi, vortice il tubo del microcentrifuge vigorosamente per 15 s. Successivamente, aggiungere 200 µ l di cloroformio e vigorosamente vortice la miscela ancora per un supplemento di 15 s.
- Centrifugare le provette a 17.000 x g per 10 min a 4 ° C. Quindi, trasferire con cautela la fase superiore ad un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL.
Nota: L'interfase e la fase organica inferiore non deve essere disturbati durante il trasferimento della fase superiore ad un nuovo tubo. - Aggiungere 400 µ l di isopropanolo per far precipitare il RNA e mescolarle bene capovolgendo delicatamente. Quindi, incubare la provetta a temperatura ambiente per 10 min.
- Centrifugare la provetta a 17.000 x g per 10 min a 4 ° C. Quindi, eliminare il supernatante, avendo cura di mantenere la pallina del RNA. Lavare il RNA aggiungendo 1 mL di etanolo al 75% e capovolgere la provetta 2-3 volte. Centrifugare la provetta per 5 min a 17.000 x g a 4 ° C e scartare il surnatante.
- Asciugare il pellet di RNA a temperatura ambiente e sciogliere il RNA in 50 µ l di pirocarbonato dietilico (DEPC)-acqua distillata trattata. Utilizzando 1 µ l di soluzione di RNA, quantificare la concentrazione di RNA totale con uno spettrofotometro.
Nota: Sgualciscano riduce la solubilità del RNA; Pertanto, evitare di seccare il RNA.
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preparazione di cDNA
- Preparare la miscela di reazione d'inversione-trascrizione per ciascun campione aggiungendo quanto segue in una provetta PCR sottili: 2 µ g di RNA totale (regolare il volume a 10 µ l con acqua RNAsi-libera), 2 µ l di tampone di RT, 1 µ l di una casuale dell'iniettore (50 pmol), 0,8 µ l del 25 x dNTP mix (100 10x mM), 1 µ l di MMLV della trascrittasi inversa (50 U / µ l) e 5,2 µ l di RNAsi-libera d'acqua.
- Impostare il programma di reazione di trascrizione inversa il termociclatore con le seguenti condizioni: tubi di 42 ° C per 60 min e 95 ° C per 5 min, posto la PCR nel termociclatore e iniziare il programma.
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Reazione a catena della polimerasi in tempo reale
- Preparare il mix master di PCR in tempo reale per tutte le reazioni. La miscela di reazione per ogni campione è come segue: 25 µ l di 2 x Real-Time PCR Master Mix, 1 µ l di primer forward e reverse per IL-6 o IL-8 e 21 µ l di acqua distillata ultrapura (DNasi e RNasi-senza). Vedere tabella 1.
Nota: Preparare la miscela di reazione PCR in tempo reale per ogni campione contenente primer di RNA di actina come controllo interno. GAPDH può anche essere utilizzato come controllo interno per la normalizzazione. - Aggiungere 48 µ l di mix master e 2 µ l di prodotto 3 volte cDNA diluito con acqua in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti ottico qPCR. Eseguire ogni reazione in triplice copia. Preparare un controllo ben che non contiene il modello di cDNA come un controllo PCR.
- Impostare il programma di reazione PCR in tempo reale il termociclatore con le seguenti condizioni: 10 min a 95 ° C, 40 cicli of15 s a 95 ° C (denaturazione) e 1 min a 60 ° C (ricottura ed estensione).
- Eseguire PCR in tempo reale e registrare il valore di soglia ciclo (CT) dopo il completamento dei cicli di PCR. Calcolare i livelli di mRNA per IL-6 o IL-8 utilizzando il metodo di 2- ΔΔCΤ 20.
Nota: La variazione piega relativa espressione è determinata dopo la normalizzazione ai livelli dell'actina utilizzando la seguente formula:
Piegare il cambiamento = 2-Δ (ΔCT)
Qui,
ΔCT = CT, IL-6 o IL-8- CT, actina; e
Δ (ΔCT) = ΔCT, stimolato- ΔCT, controllo. - Calcolare il valore medio per ogni campione duplicati.
Nota: qPCR deve essere ripetuto in modo indipendente almeno 3x ed i valori medi va calcolata in base a questi risultati. Rappresentante H-Ras-indotta senescenza risultati sono mostrati nella Figura 3. Inedia del siero può indurre l'espressione dei mRNAs IL-6 e IL-8 in alcune cellule sensibili. Così, l'IL-6 e l'espressione di IL-8 mRNA in cellule coltivate con e senza inedia del siero dovrebbe essere paragonati inizialmente. Se inedia del siero induce cambiamenti significativi nell'espressione di IL-6 o IL-8 mRNA, il RNA totale per qPCR e il medium condizionato per ELISA dovrebbe essere preparati separatamente.
- Preparare il mix master di PCR in tempo reale per tutte le reazioni. La miscela di reazione per ogni campione è come segue: 25 µ l di 2 x Real-Time PCR Master Mix, 1 µ l di primer forward e reverse per IL-6 o IL-8 e 21 µ l di acqua distillata ultrapura (DNasi e RNasi-senza). Vedere tabella 1.
5. quantificare i livelli di proteine secrete del-6 e IL-8 per un'analisi del fenotipo secretivo senescenza-collegata usando ELISA
- Disgelo i 3 mL di medium condizionato raccolte dalle cellule senescenti WI-38 come descritto nel passaggio 4. Rimuovere detriti cellulari mediante centrifugazione a 500 x g per 5 min.
- Concentrare il medium condizionato 10 volte per centrifugazione a 3.000 x g per 20 min utilizzando un'unità filtro centrifugo.
Nota: La concentrazione del medium condizionato può non necessariamente dipendono il tipo di campione. -
Eseguire il ELISA utilizzando 50 µ l di ciascun campione concentrato del medium condizionato con gli appositi kit di IL-6 e IL-8 ELISA.
Nota: Test di ciascun campione in due pozzetti ELISA. Poiché ogni punto di tempo è duplicato nel passaggio 4, questa analisi consente di monitorare variazioni sia il test ELISA e la tecnica di preparazione del campione.- Rivestimento della piastra ELISA, diluire l'IL-6 o l'anticorpo di IL-8 con 1x PBS a una concentrazione di 0,5 µ g/mL per IL-6 o 0.125 µ g/mL per IL-8. Aggiungere 100 µ l di anticorpi diluiti in ciascun pozzetto della piastra ELISA. Sigillare la piastra con una piastra ELISA pellicola sigillante e incubare senza agitare durante la notte a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione di anticorpo dall'aspirazione. Lavare ogni ben 4 x con 300 µ l di tampone di lavaggio 1X (0.05% Tween-20 in PBS). Aggiungere 300 µ l di tampone bloccante (1% BSA in PBS) ad ogni pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 1 h.
- Eliminare la soluzione bloccante tramite aspirazione. Lavare ogni ben 4 x con 300 µ l di tampone di lavaggio 1X. Preparare in modo seriale diluita ELISA standard in un tampone di diluizione (0.05% Tween-20 e 0.1% BSA in PBS) per generare una curva standard.
Nota: La diluizione seriale per IL-6 è 31.25, 62,5, 125, 250, 500, 1.000 e 2.000 pg/mL. La diluizione seriale per IL-8 è 2,34, 4.69, 9,38, 18,75, 37,5, 75 e 150 pg/mL. - Aggiungere 100 µ l della soluzione standard o 100 µ l della soluzione del campione (50 µ l di terreno concentrato con 50 µ l di tampone di diluizione) in ciascun pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 2 h.
- Eliminare la soluzione standard o campione tramite aspirazione. Lavare ogni ben 4 x con 300 µ l di tampone di lavaggio 1X. Diluire l'anticorpo di rilevazione con il tampone di diluizione a una concentrazione di 0,1 µ g/mL per IL-6 o 0,25 µ g/mL per IL-8. Aggiungere 100 µ l di anticorpo diluito per pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 2 h.
- Rimuovere la soluzione di anticorpo dall'aspirazione. Lavare ogni ben 4 x con 300 µ l di tampone di lavaggio 1X. Diluire perossidasi di streptavidina-rafano (HRP) in tampone di diluizione a una concentrazione di 0,05 µ g/mL. Aggiungere 100 µ l di soluzione di streptavidina-HRP per pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
- Rimuovere la soluzione di anticorpo dall'aspirazione. Lavare ogni ben 4 x con 300 µ l di tampone di lavaggio 1X. Aggiungere 100 µ l di 3, 3 ', 5, 5 '-tetrametilbenzidina (TMB) soluzione di substrato in ciascun pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti consentire lo sviluppo di colore. Fermare la reazione aggiungendo 100 µ l di una soluzione 1 M HCl.
- Leggere l'assorbanza di ciascun pozzetto con un lettore ELISA a 450 nm.
- Tracciare la curva standard per gli standard generati. Calcolare le concentrazioni di IL-6 e IL-8 nel medium condizionato secondo le curve standard. Rappresentare graficamente i risultati dopo una normalizzazione per il conteggio delle cellule. Calcolare i valori medi per campioni duplicati.
Nota: Elisa deve essere ripetuta in modo indipendente almeno 3x ed i valori medi va calcolata in base a questi risultati (Figura 4).
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Representative Results
Nella Figura 1è riportato un esempio di H-Ras-indotta senescenza. Un'infezione di fibroblasti umani normali WI-38 con il retrovirus di H-RasV12 indotto da drammatici cambiamenti morfologici (Figura 1B). Inoltre, come illustrato nella Figura 1, attività di colorazione β-gallone SA è stata aumentata notevolmente sull'espressione di H-RasV12. Oltre il 70% delle cellule ha mostrato SA β-gallone macchiatura attività 6 d dopo l'infezione di retrovirus di H-RasV12, che indica che un'espressione di H-RasV12 con successo induce la senescenza cellulare in cellule WI-38, come altri gruppi e abbiamo riferito precedentemente21 ,22.
La figura 2 Mostra i risultati rappresentativi dell'analisi per il monitoraggio dei livelli di ROS durante la senescenza cellulare indotta da H-Ras colorazione DCF-DA. Aumento dei livelli di ROS intracellulari sono osservati già dopo 2 giorni dopo l'espressione di H-Ras e sono mantenuti fino al punto di tempo di 6 giorni. Nel frattempo, l'induzione della SASP Mostra cinetiche diverse. Aumenti i livelli di mRNA di IL-6 e IL-8, rappresentante fattori SASP, sono osservati da 4 giorni dopo l'espressione di H-Ras e picco sul punto di tempo di 8 giorni (Figura 3). Come illustrato nella Figura 4, i livelli di IL-6 e IL-8 secernuti mostrano simili aumenti, coerenti con i risultati PCR in tempo reale. Questi risultati indicano diversi ruoli di ROS e SASP nell'induzione della senescenza cellulare.
Figura 1 : i cambiamenti morfologici e aumento SA β-gallone macchiatura durante la senescenza indotta da H-Ras. (A), questo pannello mostra la procedura sperimentale per l'induzione di H-Ras-indotta senescenza in cellule WI-38. (B) SA β-gallone macchiatura è stata effettuata presso il punto di tempo indicato dopo l'infezione delle cellule WI-38 con il retrovirus di H-RasV12; qui mostrati immagini rappresentative della β-gallone SA colorazione. (C) SA cellule β-gal-positive sono stati contati in tre esperimenti indipendenti. I risultati sono presentati come i valori medi e le barre di errore rappresentano deviazioni standard (SD). P < 0.01, di Student t-test. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Aumento nei livelli intracellulari di ROS durante la senescenza indotta da H-Ras. (A) cellule WI-38 sono state infettate con il retrovirus di H-Ras e macchiate con DCF-DA (50 µM) presso i punti di tempo indicato. DCF-DA intensità di fluorescenza sono stati quantificati utilizzando un citometro a flusso. Sono mostrati gli istogrammi rappresentativi dell'intensità di fluorescenza DCF-DA presso i punti di tempo 0 - e 6-d. (B) istogrammi rappresentativi dell'intensità di fluorescenza DCF-DA presso i punti di tempo 0 e 6 giorni sono tracciati insieme per un più facile confronto. (C) The DCF-DA intensità di fluorescenza durante la senescenza indotta da H-Ras è stata misurata al tempo indicato punti x 3. I risultati sono presentati come i valori medi e le barre di errore rappresentano deviazioni standard (SD). P < 0.05 e * * P < 0.01, di Student t-test. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Correlate a quantificazione di SASP mRNA durante la senescenza indotta da H-Ras. RNA è stato preparato dalle cellule WI-38 presso i punti di tempo indicato dopo l'infezione di retrovirus di H-RasV12. Questi pannelli mostrano l'induzione dell'espressione di IL-6 (A) e (B) IL-8 analizzato da qPCR utilizzando primers specifici elencati nella tabella 1. I livelli di mRNA di actina sono stati utilizzati per la normalizzazione. Il normalizzato IL-6 o i livelli di IL-8 mRNA misurati nel campione 0-day sono stati impostati su 1 e i cambiamenti relativi piega sono stati calcolati. Gli esperimenti sono stati ripetuti in modo indipendente 3 x. I risultati sono presentati come i valori medi e le barre di errore indicano le deviazioni standard (SD). P < 0.05 e * * P < 0.01, di Student t-test. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Fattori di quantificazione di SASP secrete durante la senescenza indotta da H-Ras. Questi pannelli mostrano curve standard generate con IL-6 (A) e IL-8 (C) standard. Media condizionati sono state raccolte dalle cellule WI-38 presso i punti di tempo indicato dopo l'infezione del retrovirus H-RasV12. I livelli di IL-8 (D) e secernuto IL-6 (B) sono stati analizzati con IL-6 e kit ELISA di IL-8, rispettivamente. Gli esperimenti sono stati ripetuti in modo indipendente 3 x. I risultati sono presentati come i valori medi e le barre di errore indicano le deviazioni standard (SD). P < 0.05 e * * P < 0.01, di Student t-test. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Nome del gene | Forward primer | Reverse primer |
| IL-6 | 5'-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3' | 5'-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3' |
| IL-8 | 5'-ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3' | 5'-AACCCTCTGCACCCAGTTTTC-3' |
| actina | 5'-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3' | 5'-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3' |
Tabella 1: Gli iniettori di PCR in tempo reale per i fattori di SASP.
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Discussion
Qui, abbiamo presentato metodi per il monitoraggio dei livelli intracellulari di ROS durante H-Ras-indotta senescenza in fibroblasti umani normali WI-38. I livelli intracellulari di ROS in cellule vive, che possono essere misurati quantitativamente utilizzando il reagente cellula-permeabile DCF-DA e citometria a flusso. Al momento l'assorbimento cellulare, DCF-DA è viene desacetilato agli acidi dalle esterasi intracellulari e, successivamente, ossidato dai ROS per formare altamente fluorescente 2', 7'-diclorofluorescina (DCF). Fluorescenza DCF possa essere rilevato mediante citometria a flusso mediante un rivelatore di FL1 (fluorescenza verde). Utilizzando il metodo di macchiatura DCF-DA, abbiamo rilevato con successo un aumento nei livelli di ROS durante la senescenza cellulare indotta da H-Ras in fibroblasti umani normali WI-38. Questo metodo può essere utilizzato in vari modelli di senescenza cellulare per monitorare i cambiamenti nei livelli ROS. Oltre a DCF-DA colorazione, ulteriori metodi che sono stati utilizzati per misurare l'induzione ROS includono il monitoraggio i livelli di proteine ossidate23 e un'analisi di microscopia confocale utilizzando ROS-dipendente tinture fluorescenti24. Quindi, ulteriore conferma delle variazioni dei livelli ROS utilizzando metodi aggiuntivi è auspicabile.
Recentemente, abbiamo dimostrato che i livelli di ROS sono aumentati in cellule tumorali durante la senescenza indotta da p53 come pure H-Ras-indotta senescenza21. Aumento dei livelli di ROS intracellulari sono osservabili prima l'aumento in SA β-gallone attività di colorazione, suggerendo il ruolo causativo del ROS nell'induzione della senescenza cellulare. È interessante notare che, l'aumento nei livelli ROS separatamente è controllata attraverso la via Akt-NF-κB-NOX4, mentre l'arresto del ciclo cellulare è mediato da p2121. Se Akt regola anche l'aumento ROS in altri tipi di senescenza cellulare sarebbe interessante da esplorare.
Abbiamo anche introdotto metodi per l'analisi del mRNA e secernuto i livelli della proteina dei fattori SASP IL-6 e IL-8 durante la senescenza indotta da H-Ras. Utilizzando qPCR, abbiamo quantificato l'induzione di IL-6 e IL-8 mRNA in cellule senescenti WI-38. Abbiamo esaminato i livelli di mRNA di actina come controllo interno per la normalizzazione, ma GAPDH mRNA può anche essere utilizzato come controllo interno. 18S RNA ribosomiale (rRNA) è un altro gene housekeeping che viene comunemente utilizzato come controllo interno negli esperimenti di qPCR. Tuttavia, poiché la maturazione di trascrizione e ribosomi rRNA sono regolati durante l'arresto del ciclo cellulare e la senescenza cellulare25,26, rRNA 18S può non essere un buon controllo interno per gli studi di senescenza cellulare. ELISA, utilizzando un medium condizionato dalle cellule senescenti WI-38, ha mostrate i simili aumenti nella secrezione di IL-6 e IL-8 livelli. Coerenti con la nozione che la SASP è sviluppato presso la fase di senescenza "maturo"19, aumento della secrezione di IL-8 e IL-6 è rilevabili in un secondo tempo rispetto all'aumento dei livelli di ROS. In particolare, SASP fattori variano a seconda del tipi di cellule e senescenza induzione condizioni27. Pertanto, i fattori SASP appropriati dovrebbero essere selezionati secondo il modello della senescenza cellulare.
Anche se abbiamo confermato H-Ras-indotta senescenza monitorando i cambiamenti morfologici e l'induzione di attività di colorazione β-gallone SA, senescenza cellulare dovrebbe essere ulteriormente verificata monitorando caratteristiche aggiuntive senescenza, tra cui il perdita irreversibile del potenziale di proliferazione, i fuochi dell'eterocromatina senescenza-collegata (SAHF), fattori SASP, l'attivazione di soppressori tumorali quali p53 e p16INK4a, migliorato i segnali di danno del DNA e foci nucleari persistente, definiti come segmenti di DNA con alterazioni della cromatina rinforzo senescenza (DNA-cicatrici). Tuttavia, è importante ricordare che c'è un'eterogeneità di caratteristiche di senescenza in senescenza diversi tipi. Determinati biomarcatori di senescenza possono essere osservabili solo in alcuni tipi specifici di senescenza cellulare. Ad esempio, SAHF sono di solito evidenti OIS28,29.
Senescenza cellulare inizialmente è stata considerata per rappresentare l'arresto di crescita autonoma causato da condizioni di coltura artificiale. Tuttavia, gli studi in passato mezzo secolo hanno dimostrato l'importanza della senescenza cellulare in varie condizioni fisiopatologiche, compreso invecchiamento ed il cancro. Il nesso di causalità tra senescenza cellulare e deterioramento senile del tessuto è stato dimostrato in precedenza in BubR1 progeroide mouse modelli30,31. Così, la senescenza cellulare attraverso sia l'eliminazione delle cellule senescenti o la modulazione della SASP di controllo attualmente è considerato come una strategia promettente per malattie legate all'età. Infatti, studi recenti hanno dimostrato che l'eliminazione delle cellule senescenti sarebbe un trattamento promettente per patologie relative all'età, compreso lo svuotamento delle cellule staminali, la perdita dell'osso, perdita di capelli e osteoartrite32,33, 34,35,36. Una più profonda comprensione dei meccanismi molecolari dell'induzione di senescenza e fenotipi di senescenza, compreso SASPs, fornirà le strategie migliori per il targeting senescenza riducendo i possibili inconvenienti e selettivamente solo deleteri funzioni delle cellule senescenti.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della Fondazione ricerca nazionale di Corea (2015R1D1A1A01060839) (a Young Yeon Kim) e da una sovvenzione del National Research Foundation di Corea (NRF) finanziata dal governo di Corea (MSIT) (No. 2016R1A2B2008887, no. 2016R1A5A2007009) (a Jeanho Yun).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| BOSC 23 | ATCC | CRL-11269 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| pBabe puro-H-RasV12 | Addgene | 1768 | |
| pGAG/pol | Addgene | 14887 | |
| pVSVG | Addgene | 1733 | |
| Turbofect | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/mL |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/mL |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| DCF-DA | Sigma-Aldrich | D6883 | 10 mM |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| MMLV Reverse transcriptase | Promega | M1701 | |
| SYBR Green PCR master 2x mix | Takara | PR820A | |
| Random Primer | Promega | C118A | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Human IL-6 ELISA assay | PeproTech | #900-TM16 | |
| Human IL-8 ELISA assay | PeproTech | #900_TM18 | |
| EQUIPMENTS | |||
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| Parafilm | BEMIS | PM-996 | |
| Microscope | NIKON | TS100 | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | LSR Fortessa | |
| Amicon Ultra-4ml | Merk Millipore | UFC800324 | |
| NanoDrop spectrophotometer | BioDrop | 80-3006-61 | |
| Real-time PCR System | Applied Biosystems | ABI Prism 7500 | |
| ELISA Reader | Molecular Devices | EMax microplate reader |
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