Summary
胞内活性氧在细胞衰老诱导中起着重要作用。在这里, 我们描述了一个敏感的测定细胞衰老过程中的 ROS 水平。我们还提供了评估衰老相关分泌表型的协议, 据报告, 这有助于各种年龄相关的功能障碍。
Abstract
细胞衰老被认为是一种不可逆的生长状态, 在衰竭的增生能力或接触到各种压力。最近的研究扩大了细胞衰老在各种生理过程中的作用, 包括发育, 伤口愈合, 免疫监测和年龄相关的组织功能障碍。虽然细胞周期骤停是细胞衰老的一个重要标志, 但增加的细胞内活性氧 (ROS) 的生产也被证明对细胞衰老的诱导起着重要作用。此外, 最近的研究表明衰老细胞通过衰老相关的分泌表型 (SASP) 在邻近细胞和组织中表现出强有力的分泌活动。对细胞衰老的治疗策略的兴趣急剧增加强调需要对衰老机制, 包括胞内活性氧和 SASP 进行精确的了解。在这里, 我们描述了用 ros 敏感荧光染料和流式细胞仪定量评估 h-Ras 诱导的细胞衰老过程中细胞内 ROS 含量的协议。此外, 我们还介绍了敏感技术, 以分析诱导的 mRNA 表达和分泌的 SASP 因素。这些协议可应用于各种细胞衰老模型。
Introduction
50年前, 佛烈克和穆尔黑德发现, 正常细胞在细胞分裂1后, 在其增殖潜能耗尽后进入不可逆转的生长。这种现象现在被称为复制衰老, 并被认为与生物体衰老有强烈的关联2。虽然端粒的渐进侵蚀被认为是复制衰老的主要原因, 但据报道, 各种细胞应力, 如 DNA 损伤、致癌活化和氧化应激等, 都被报告诱发另一种细胞衰老。称为 "过早衰老" 或 "应力诱发衰老"。有趣的是, 过早衰老对肿瘤的激活起到了强有力的抑制作用, 如 H-Ras 和 BRAF。对小鼠模型和人体组织的研究已经产生了强有力的证据, 表明细胞衰老的生物标志物主要存在于前病变中, 在那里致癌 Ras 和 BRAF 被激活, 但在恶性癌症中被减少, 从这些病变3,4,5。除了它在衰老和肿瘤抑制方面的作用, 细胞衰老已经在以前的研究中显示, 在各种生理过程中发挥作用, 包括伤口愈合, 组织修复, 免疫监测, 胚胎发育6。
尽管生长骤停已被广泛研究为7细胞衰老的标志, 但大量的证据表明胞内活性氧 (ROS) 也有助于细胞衰老8。在不同类型的细胞衰老过程中, ROS 水平的升高, 包括复制衰老和癌基因引起的衰老, 最初是在数十年前的9,10。一个更直接, 外源治疗与致死剂量的 H2O2诱导衰老11,12。抑制 ROS 清除酶, 如 SOD1, 也导致过早衰老13。相比之下, 低环境氧条件和增加 ROS 清除延缓衰老的开始10,14,15。这些结果无疑表明, ROS 是细胞衰老诱导的重要调解人或决定因素。然而, ros 是如何促进细胞衰老的诱导以及在细胞衰老过程中 ros 水平的升高需要进一步的研究。
最近的研究表明, 衰老细胞通过 SASP16、17, 在邻近细胞和组织中具有强大的分泌活性。在衰老的组织中, 衰老细胞通过 SASP 的多种途径促进与年龄相关的组织功能障碍, 除了对增生细胞的自主耗尽之外。衰老细胞分泌的各种促炎因子, 如 IL-6、IL-8、TGFβ和基质金属蛋白酶 (金属蛋白酶), 通过组织稳态的损伤、组织结构的破坏, 引起与年龄相关的组织功能障碍,邻近细胞衰老, 无菌炎症18,19。然而, SASPs 可以产生有益的影响, 取决于生物环境。此外, SASPs 的 heterogenetic 性质取决于衰老细胞类型和细胞阶段, 强调需要进一步研究19。
在这里, 我们描述了快速和灵敏的细胞技术, 以评估细胞内活性氧的水平。此外, 还介绍了利用定量实时聚合酶链反应 (qPCR) 和 ELISA 法分析 SASP 因子的方法。
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Protocol
1. 诱发癌基因引起的衰老
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制备 RasV12 逆转录病毒
- 在室温下添加2毫升0.001% 聚 l-赖氨酸/磷酸盐缓冲盐水 (PBS), 将 100 mm 培养皿涂成5分钟。
- 使用连接到真空的玻璃吸管去除聚 l-赖氨酸溶液, 并通过添加2毫升 1x PBS 来洗涤培养皿。
- 板 3 x 106 ecotropic BOSC-23 包装细胞在涂层培养皿与 Dulbecco 的改性鹰培养基 (DMEM) 含有10% 胎牛血清 (血清) 和1% 青霉素/链霉素, 并培养他们在37°c 的共同2组织培养孵化器 1 d。
- 第二天, 染2µg 的 pBabe puro-H-RasV12 dna 与逆转录病毒包装 dna (2 µg 的 pGAG/波兰和0.25 µg pVSVG) 使用一个转染试剂 8 H 根据制造商的指示。
- 去除转染介质, 加入8毫升的新鲜介质。
- 48小时后, 收集含有病毒粒子的介质, 并通过离心 500 x g以5分钟的方法去除任何细胞碎片。
- 用0.45 µm 注射器过滤器过滤含 h-Ras 病毒的介质。
注意: 避免任何冰冻和解冻的病毒上清液有效的病毒感染。要获得最佳效率, 请使用在感染的同一天收获的病毒。
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H-RasV12 逆转录病毒感染 WI-38 正常人成纤维细胞
- 板 5 x 104 WI-38 细胞在60毫米培养皿与 DMEM 包含10% 个血清和1% 青霉素/链霉素 1 d 在收获 H-RasV12 逆转录病毒之前, 并且培养他们1天在37°c。
- 第二天去除生长培养基, 加入1毫升的 H-RasV12 逆转录病毒培养基。添加额外的1毫升的生长培养基, 含有2µL 的凝聚胺溶液 (8 毫克/毫升蒸馏水)。在湿润37°c, 5% CO2组织培养孵化器中孵化样品1天。
- 去除 H-RasV12 逆转录病毒混合物24小时后, 用 1x PBS 清洗细胞2x。添加生长培养基和治疗细胞与2µg/毫升嘌呤霉素2天的湿润37°c, 5% CO2组织培养孵化器。
- 经过2嘌呤霉素选择, 去除生长培养基, 并用 1x PBS 清洗细胞2x。添加生长培养基和培养细胞在一个湿润的37°c, 5% CO2孵化器, 直到指定的时间点 (见图 1A的示意图)。
2.通过衰老相关的β-乳糖酶染色监测衰老
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准备以下库存解决方案。
- 在二甲酰胺 (DMF) 中制备20毫克/毫升 5-溴-4-氯-3-哚β-galactopyranoside (X 加仑)。将解决方案存储在摄氏-20 摄氏度。
- 在126毫升蒸馏水中溶解3.377 克钠2HPO4. 7H2O (0.708 毫米) 和36.8 克柠檬酸 (100 毫米), 制备柠檬酸/磷酸钠缓冲液。如有必要, 将 pH 值调整为6.0。
- 准备0.5 米盐钾。在4摄氏度的黑暗中存储解决方案。
- 准备0.5 米氰化钾钾。在4摄氏度的黑暗中存储解决方案。
注: 与衰老相关的β-乳糖酶 (SA β-加仑) 染色溶液的 pH 值对于准确的结果是至关重要的。
- 通过稀释含有150毫米氯化钠、2毫米氯化镁2、5毫米钾盐、5毫米钾氰化钾、20% (v/v) 柠檬酸/磷酸钠缓冲液和1毫克/毫升 X 加仑的库存溶液, 制作新鲜的 SA β-gal 染色液。
- 卸下培养基并用 1x PBS 清洗单元格1x。室温下用3% 甲醛固定细胞5分钟。
注意: 未感染逆转录病毒的细胞应用作阴性对照。未感染的控制细胞应继续传代以保持其增殖状态。 - 从细胞中取出固定液, 用 1x PBS 冲洗。添加新鲜准备的 1x SA β-gal 染色溶液 (1.5 毫升在60毫米培养皿)。用石蜡膜封住盘子以防止干燥, 在37摄氏度时将其孵化24小时。或者, 在湿度室中一起孵化盘子。
注: 含有3% 甲醛的固定液应作为危险废物处置。没有 CO2的孵化器是可取的, 以防止在孵化期间 pH 值的变化。 - 第二天检查显微镜下细胞的染色状态;在核周地区, SA β-gal 阳性细胞呈蓝色。
注: 增殖控制细胞显示低频率的 SA β-gal 阳性细胞。如果染色太轻, 继续孵化一段较长的时间 (见图 1B的代表性例子)。 - 使用10X 或更大物镜获取带有 CCD 摄像机的 SA β-gal 染色图像。捕获足够数量的图像来计算染色百分比 (> 200 细胞)。
- 通过量化 sa β-gal 阳性细胞的数量相对于单元格总数, 计算 sa β-gal 染色细胞的百分比。
注: SA β-gal 染色应单独重复至少 3x, 并应根据复制实验结果计算平均值 (图 1C)。适当的细胞密度对 SA β-gal 染色实验至关重要。高融合可以干扰衰老相关形态学的改变, 并在控制细胞中诱发假阳性信号。
3. 在 H-Ras 诱导衰老过程中量化活性氧的诱导
- 板 2 x 105 WI-38 细胞在60毫米培养皿和挑衅 H Ras 导致的衰老如步骤1所述。
注: 本协议可应用于其他类型的细胞衰老模型。 - 在指定的时间点 (2、4或6天) 移除生长介质, 并用 1x PBS 冲洗细胞。用1毫升0.05% 胰蛋白酶/EDTA 溶液将细胞分离, 并通过增加1毫升的生长培养基来使胰蛋白酶钝化, 其中含有10% 的血清。确定单元格计数。
- 将 1 x 105细胞转移到15毫升圆锥管中, 并通过离心在 500 x g处收集细胞以5分钟。
- 制备新鲜的 2 ', 7 '-dichlorofluorescin 双乙酸 (dcf-da) 染色介质通过增加50µL 10 毫米 DCF-da 到10毫升培养基 (dcf 的工作浓度为50µM)。
注: DCF-DA 是轻敏感的。应避免轻曝光。根据细胞类型的不同, 可以调整 DCF 浓度和染色时间。 - 从15毫升锥形管中仔细去除生长介质, 加入1毫升新鲜制备的 DCF-DA 染色培养基。仔细并用重悬细胞颗粒, 在黑暗中孵化37摄氏度, 30 分钟。包括无染色样品作为阴性染色控制。
注: 未沾上 DCF 的增殖细胞应作阴性对照。 - 通过离心 500 x g 5 分钟收集细胞, 并用2毫升 1x PBS 清洗1x。并用重悬1毫升 1x PBS 的细胞, 并将样品转移到适当的荧光活化细胞分选管。
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使用配备适当激光源的流式细胞仪测量-2′-、7′-Dichlorodihydrofluorescein 双乙酸 (DCF) 荧光信号。用蓝色激光 (488 nm) 激发样品, 用对数刻度检测出 530 # 30 nm 探测器 (FITC) 发出的荧光。
- 首先分析非染色阴性控制单元。在一个点图的正散射 (FSC)与侧面散射 (SSC), 选择活细胞使用浇口工具, 并消除死细胞和细胞碎片。
注意: 在 FSC与SSC 的点图中应该仔细监视细胞大小的变化。如果衰老细胞的大小显著增加, 则在 FSC与SSC 的点图中, 在相同大小的细胞群中, 应将 DCF 的强度进行比较。 - 在单参数直方图中, 在x轴的对数刻度上显示 DCF (488 nm) 荧光, 以及y轴线性刻度上的事件数 (单元数), 调整 488 nm 激光器的电压, 将峰值从左边缘的非染色细胞。
- 分析每样样品的流量, 并记录至少1万件事件。使用特定于流式细胞仪的分析软件获取每个样本的平均荧光值。
注: ROS 测量应该独立地重复至少 3x, 并且平均值应该从这些结果计算。典型的 H-Ras 引起的衰老结果如图 2所示。
- 首先分析非染色阴性控制单元。在一个点图的正散射 (FSC)与侧面散射 (SSC), 选择活细胞使用浇口工具, 并消除死细胞和细胞碎片。
4. 利用实时聚合酶链反应量化 IL-6 和 IL-8 mRNA 表达与衰老相关的分泌表型分析
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总 RNA 准备
- 板 3 x 105 WI-38 细胞在100毫米培养皿在 DMEM 包含10% 个血清和1% 青霉素或链霉素, 并且培养他们在37°c 在一个组织培养孵化器为1天。为每个时间点准备重复的区域性。
- 通过在步骤1中所述的 H-RasV12 逆转录病毒感染细胞来诱导衰老。
- 在收割前1天, 用 1x PBS 洗涤细胞 2x, 并添加3毫升的 DMEM, 不需加血清。
注: 这一步骤是为了生产用于 ELISA 的条件介质, 如步骤5所述。血清饥饿可诱发 IL-6 和 IL-8 基因在某些敏感细胞中的表达。因此, 应首先比较 IL-6 和无血清饥饿培养细胞中的 IL-8 mRNA 表达。如果血清饥饿引起 IL-6 或 IL-8 mRNA 表达的显著变化, 则应分别制备 qPCR 的总 RNA 和 ELISA 的条件培养基。 - 收集每样样品24小时后的条件培养基, 并存储培养基在-80 °c 的 ELISA。
- 用1毫升0.05% 胰蛋白酶/EDTA 溶液将细胞分离, 并通过增加1毫升的生长培养基来使胰蛋白酶钝化, 其中含有10% 的血清。确定 ELISA 结果规范化的单元计数, 如步骤5所述。以 500 x g为5分钟, 在1.5 毫升离心管中采集细胞。
- 用温和的吸力去除培养基, 加入1毫升的 RNA 萃取液。然后, 离心管在十五年代大力涡旋。随后, 增加200µL 氯仿和强烈漩涡混合物再为另外的十五年代。
- 离心样品管在 1.7万 x g 10 分钟在4°c。然后, 小心地将上相转移到一个新的1.5 毫升离心管。
注: 在上部相转移到新管时, 界面和下部有机相不应受到干扰。 - 添加400µL 的异丙醇沉淀 RNA, 并通过温和的反转混合。然后, 在室温下孵化管10分钟。
- 离心管在 1.7万 x g 10 分钟在4摄氏度。然后, 丢弃上清, 注意保留 RNA 颗粒。通过添加1毫升75% 乙醇和反转管2–3x 来洗涤 RNA。离心管为5分钟在 1.7万 x g在4°c 和放弃上清。
- 在室温下干燥 rna 颗粒, 在焦碳酸 (DEPC) 处理的蒸馏水中溶解 rna 50 µL。利用1µL rna 溶液, 用分光光度法定量测定总 rna 浓度。
注: Overdrying 可降低 RNA 的溶解度;因此, 避免 overdrying RNA。
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cDNA 制备
- 将以下内容添加到薄壁 PCR 管中, 为每个样品准备反向转录反应混合物: 2 µg 总 RNA (调整容量到10µL 以 RNase 无水), 2 µL 10x RT 缓冲器, 1 µL 一个随机底漆 (50 pmol), 0.8 µL 25x dNTP 混合 (100 毫米), 1 µL MMLV 逆转录酶 (50 U/µL), 5.2 µL 无 RNase 水。
- 在热循环仪上设置反向转录反应程序, 条件如下:42 °c 为60分钟, 95 摄氏度为5分钟. 将 PCR 管放在热循环仪中, 启动程序。
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实时聚合酶链反应
- 为所有反应准备实时 PCR 大师组合。每个样品的反应混合物如下:25 µL 的2x 实时 PCR 总组合, 1 µL 每一个向前和反向底漆 IL-6 或 IL-8, 21 µL 的超纯净蒸馏水 (DNase 和 RNase)。见表 1。
注: 为每个含有肌动蛋白 RNA 引物的样品准备实时 PCR 反应混合物作为内部控制。GAPDH 还可以用作规范化的内部控制。 - 在96井光学 qPCR 板中添加48µL 的主混合和2µL 的3倍稀释 cDNA 产品与水。每三个反应进行三份。准备一个不包含 cDNA 模板作为 PCR 控制的控制井。
- 在热循环仪上建立实时 PCR 反应程序, 条件如下:10 分钟在95°c, 40 循环 of15 s 在95°c (变性), 并且1分钟在60°c (退火和引伸)。
- 在 pcr 循环完成后进行实时 pcr 和记录阈值周期 (CT)。使用 2-ΔΔCΤ方法20计算 IL-6 或 IL-8 的 mRNA 水平。
注意: 表达式中的相对褶皱变化是在规范化到肌动蛋白水平之后, 使用以下公式确定的:
折变 = 2-Δ (ΔCT)
这里
ΔC , IL-6 或 IL-8t,肌动蛋白;和
Δ (ΔCt) = ΔCt, 被刺激的ΔCt,控制. - 计算每个重复样本的平均值。
注: qPCR 应独立地重复至少 3x, 并根据这些结果计算平均值。典型的 H-Ras 引起的衰老结果如图 3所示。血清饥饿可诱发 IL-6 和 IL-8 基因在某些敏感细胞中的表达。因此, 应首先比较 IL-6 和无血清饥饿培养细胞中的 IL-8 mRNA 表达。如果血清饥饿引起 IL-6 或 IL-8 mRNA 表达的显著变化, 则应分别制备 qPCR 的总 RNA 和 ELISA 的条件培养基。
- 为所有反应准备实时 PCR 大师组合。每个样品的反应混合物如下:25 µL 的2x 实时 PCR 总组合, 1 µL 每一个向前和反向底漆 IL-6 或 IL-8, 21 µL 的超纯净蒸馏水 (DNase 和 RNase)。见表 1。
5. 用 ELISA 方法定量测定与衰老相关的分泌表型分析中分泌的 IL-6 和 IL-8 蛋白的含量
- 解冻3毫升的条件培养基收获从衰老 WI-38 细胞如步骤4所述。以 500 x g为5分钟的离心去除细胞碎片。
- 用离心过滤装置将条件介质10倍的离心浓缩为 3000 x克, 以20分钟为单位。
注意: 条件介质的浓度不一定取决于样品类型。 -
用适当的 IL-6 和 IL-8 elisa 试剂盒, 使用每个浓缩样品的50µL 进行 elisa。
注: 在两个 ELISA 井中测试每个样本。由于每个时间点在步骤4中都重复, 因此此分析允许我们监测 ELISA 检测和样品制备技术的变化。- 对于 ELISA 板涂层, 稀释 IL-6 或 IL-8 抗体与 1x PBS 的浓度为0.5 µg/毫升为 IL-6 或0.125 µg/毫升 IL-8。添加100µL 的稀释抗体的每一个良好的 ELISA 板。用 ELISA 钢板密封膜密封钢板, 在室温下进行孵化, 不需夜间晃动。
- 通过吸入去除抗体溶液。洗净每个井4x 与300µL 1x 洗涤缓冲器 (0.05% Tween-20 在 PBS)。向每个井中添加300µL 的阻塞缓冲器 (PBS 中的 1% BSA)。室温孵育1小时。
- 通过吸尘消除阻塞解决方案。用300µL 1x 洗涤缓冲器清洗每井4x。在稀释缓冲器 (PBS 中的 0.05% Tween-20 和 0.1% BSA) 中制备连续稀释的 ELISA 标准, 以生成标准曲线。
注: IL-6 的系列稀释为31.25、62.5、125、250、500、1000和 2000 pg/毫升。IL-8 的系列稀释为2.34、4.69、9.38、18.75、37.5、75和 150 pg/毫升。 - 添加100µL 的标准溶液或100µL 的样品溶液 (50 µL 的浓缩介质与50µL 稀释缓冲), 每井。在室温下孵化水井2小时。
- 取出标准或样品解决方案的愿望。用300µL 1x 洗涤缓冲器清洗每井4x。稀释的检测抗体与稀释缓冲液浓度为0.1 µg/毫升为 IL-6 或0.25 µg/毫升 IL-8。添加100µL 的稀释抗体每井。在室温下孵化水井2小时。
- 通过吸入去除抗体溶液。用300µL 1x 洗涤缓冲器清洗每井4x。稀释链亲和素中的辣根过氧化物酶 (HRP), 浓度为0.05 µg/毫升。每井添加100µL 的链亲和素溶液。在室温下孵化水井30分钟。
- 通过吸入去除抗体溶液。用300µL 1x 洗涤缓冲器清洗每井4x。添加100µL 的 3,3′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) 基质溶液, 每个井。在室温下孵化出20分钟的水井, 以允许颜色的发展。通过添加100µL 1 米的 HCl 停止溶液来停止反应。
- 用 450 nm 的 ELISA 阅读器读出每个井的吸光度。
- 为生成的标准绘制标准曲线。根据标准曲线计算条件介质中 IL-6 和 IL-8 的浓度。在对单元格计数进行规范化后绘制结果。计算重复样本的平均值。
注: ELISAs 应独立地重复至少 3x, 并且应根据这些结果计算平均值 (图 4)。
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Representative Results
图 1显示了 H-Ras 引起的衰老的例子。WI-38 正常人成纤维细胞感染 H-RasV12 逆转录病毒诱发戏剧性形态学改变 (图 1B)。此外, 如图 1C所示, 在 H-RasV12 表达时, SA β-gal 染色活性显著增加。在 H-RasV12 逆转录病毒感染后, 超过70% 的细胞显示 SA β-gal 染色活性 6 d, 表明 H-RasV12 的表达成功地诱导 WI-38 细胞的细胞衰老, 正如我们和其他组报告的以前的21 ,22。
图 2显示了在 H-Ras 诱导的细胞衰老过程中, 用于监测 ROS 水平的 DCF-DA 染色分析的代表性结果。在 H-Ras 表达后的2天内, 观察到细胞内 ROS 含量的增加, 并保持到6天的时间点。同时, SASP 的诱导表现出不同的动力学。IL-6 和 IL-8 的 mRNA 水平的增加, 代表性的 SASP 因素, 从4天后, 从 H Ras 表达和峰值的8天的时间点 (图 3) 观察到。如图 4所示, 分泌的 IL-6 和 IL-8 水平显示相似的增加, 与实时 PCR 结果一致。这些结果表明 ROS 和 SASP 在细胞衰老诱导中的作用不同。
图 1:H-Ras 诱导衰老过程中 SA β-加仑染色的形态学变化和增加.(A) 本小组展示了诱导 WI-38 细胞中 H-Ras 诱导衰老的实验程序。(B) 在 WI-38 细胞感染 H-RasV12 逆转录病毒后, 在指定的时间点进行 SA β-gal 染色;这里展示了 SA β-gal 染色的代表性图像。(C) 在三项独立实验中计数了 SA β-gal 阳性细胞。结果显示为平均值, 误差条表示标准偏差 (SD)。** < 0.01, 学生的t测试。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 在 H-Ras 引起的衰老过程中, 细胞内 ROS 含量增加.(A) WI-38 细胞感染了 H-Ras 逆转录病毒, 并在所述时间点上染有 DCF (50 µM)。利用流式细胞仪对 DCF-DA 荧光强度进行量化。给出了0和6维时间点上的 DCF-DA 荧光强度的代表直方图。(B) 将0和6天时间点的 DCF-DA 荧光强度的代表性直方图绘制在一起, 便于比较。(C) 测定了 H-Ras 诱导衰老过程中的 DCF-DA 荧光强度, 并在指定的时间点3x 进行了测量。结果显示为平均值, 误差条表示标准偏差 (SD)。* p < 0.05 和 ** p < 0.01, 学生的t检验。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3:SASP 相关基因在 H-Ras 诱导衰老过程中的定量研究.RNA 是由 WI-38 细胞在 H-RasV12 逆转录病毒感染后的指示时间点制备的。这些面板显示由 qPCR 使用表 1所列的特定引物分析的 (A) IL-6 和 (B) IL-8 表达式的诱导。肌动蛋白 mRNA 水平被用于规范化。在0天样本中测量的归一化 IL-6 或 IL-8 mRNA 水平设置为 1, 并计算了相对褶皱的变化。实验独立地重复了3x。结果显示为平均值, 误差条表示标准偏差 (SD)。* p < 0.05 和 ** p < 0.01, 学生的t检验。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: H-Ras 诱导衰老过程中分泌 SASP 因子的量化.这些面板显示了 IL-6 (A) 和 IL-8 (C) 标准生成的标准曲线。WI-38 细胞在 H-RasV12 逆转录病毒感染后的指示时间点采集到条件培养基。分别用 IL-6 和 IL-8 ELISA 试剂盒对分泌 IL-6 (B) 和 IL-8 水平 (D) 进行了分析。实验独立地重复了3x。结果显示为平均值, 误差条表示标准偏差 (SD)。* p < 0.05 和 ** p < 0.01, 学生的t检验。请单击此处查看此图的较大版本.
| 基因名称 | 前进底漆 | 反向底漆 |
| IL-6 | 5 '-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3 ' | 5 '-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3 ' |
| IL-8 | 5 '-ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3 ' | 5 '-AACCCTCTGCACCCAGTTTTC-3 ' |
| 肌 动 蛋白 | 5 '-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3 ' | 5 '-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3 ' |
表 1: SASP 因子的实时 PCR 引物。
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Discussion
在这里, 我们提出了监测 WI-38 正常人成纤维细胞在 H-Ras 诱导衰老过程中胞内活性氧水平的方法。用细胞渗透性试剂 DCF-DA 和流式细胞仪定量测定活细胞内的活性氧水平。细胞吸收后, 脱乙酰度细胞内酯, 然后由 ROS 氧化, 形成高度荧光 2 ', 7 '-dichlorofluorescein (dcf)。用 FL1 检测器 (绿色荧光) 检测流式细胞仪可以探测到 DCF 荧光。利用 DCF-DA 染色法, 成功检测了 WI-38 正常人成纤维细胞在 H-Ras 诱导的细胞衰老过程中 ROS 含量的增加。这种方法可用于各种细胞衰老模型, 以监测 ROS 水平的变化。除 DCF 染色外, 用于测量 ROS 诱导的其他方法包括监测氧化蛋白23的水平和使用 ROS 依赖性荧光染料的共焦显微分析24。因此, 使用其他方法进一步确认 ROS 水平的变化是可取的。
最近, 我们已经表明, 在 p53-induced 衰老和 H-Ras 诱导的衰老21中, 癌细胞中的 ROS 水平增加。在 SA β-加仑染色活性增加之前, 细胞内活性氧含量增加是可见的, 这表明 ros 在细胞衰老诱导中的作用。有趣的是, ROS 水平的增加是由 Akt-NF-κB-NOX4 途径单独控制的, 而细胞周期的拘捕是介导的 p2121。Akt 是否也调节了其他类型的细胞衰老的 ROS 增加将是有趣的探索。
我们还介绍了在 H-Ras 诱导衰老过程中, SASP 因子 IL-6 和 IL-8 的 mRNA 和分泌蛋白水平的分析方法。利用 qPCR, 我们量化了衰老 WI-38 细胞中 IL-6 和 IL-8 mRNA 的诱导。我们检查肌动蛋白 mrna 水平作为一个内部控制的规范化, 但 GAPDH mRNA 也可以作为内部控制。18S 核糖体 RNA (rRNA) 是另一种管家基因, 通常被用作内部控制的 qPCR 实验。然而, 由于 rRNA 转录和核糖体成熟被调控在细胞周期拘捕和细胞衰老25,26, 18S rRNA 可能不是一个良好的内部控制的细胞衰老研究。ELISA, 使用一个条件培养基从衰老 WI-38 细胞, 显示相似的增加分泌 IL-6 和 IL-8 水平。与 SASP 在 "成熟的" 衰老阶段19发展的概念一致, IL-6 和 IL-8 分泌物的增加在以后的时间点是可检测的, 而不是 ROS 水平的增加。值得注意的是, SASP 因子的变化取决于细胞类型和衰老诱导条件27。因此, 应根据细胞衰老模型选择合适的 SASP 因子。
虽然通过监测形态学变化和诱导 SA β-gal 染色活性, 证实了 H-Ras 诱导的衰老, 但通过监测其他衰老特性, 可以进一步验证细胞衰老, 包括不可逆性丧失增殖潜能, 衰老相关的染色质灶 (SAHF), SASP 因子, 活化肿瘤抑制物如 p53 和 p16INK4a, 增强的 dna 损伤信号和持久性核病灶, 定义为 DNA 片段随着染色质的改变, 增强衰老 (DNA 疤痕)。然而, 重要的是要记住, 有一个异质性的衰老特征在不同的衰老类型。某些衰老生物标志物只能在某些特定类型的细胞衰老中观察到。例如, SAHF 通常是明显的在28,29。
细胞衰老最初被认为是由人工培养条件引起的自主生长停止。然而, 在过去半个世纪的研究表明, 细胞衰老的重要性, 在各种病理生理条件, 包括衰老和癌症。细胞衰老与年龄相关的组织恶化之间的因果关系已经在 BubR1 progeroid 鼠模型30,31中被证实。因此, 通过消除衰老细胞或调节 SASP 来控制细胞衰老, 目前被认为是一种很有前途的与年龄相关的疾病的策略。事实上, 最近的研究表明, 消除衰老细胞将是一个有希望的治疗与年龄相关的病理, 包括干细胞耗竭, 骨质流失, 脱发, 骨关节炎32,33, 34,35,36。深入了解衰老诱导和衰老表型的分子机制, 包括 SASPs, 将提供改进的战略, 以减少可能的缺点和选择性地针对仅有害的衰老衰老细胞的功能。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了韩国国家研究基金会 (2015R1D1A1A01060839) 和韩国政府 (NRF) 资助的韩国国家研究基金会 (MSIT) 的资助 (不 2016R1A2B2008887, 不。2016R1A5A2007009) (Jeanho 云)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| BOSC 23 | ATCC | CRL-11269 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| pBabe puro-H-RasV12 | Addgene | 1768 | |
| pGAG/pol | Addgene | 14887 | |
| pVSVG | Addgene | 1733 | |
| Turbofect | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/mL |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/mL |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| DCF-DA | Sigma-Aldrich | D6883 | 10 mM |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| MMLV Reverse transcriptase | Promega | M1701 | |
| SYBR Green PCR master 2x mix | Takara | PR820A | |
| Random Primer | Promega | C118A | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Human IL-6 ELISA assay | PeproTech | #900-TM16 | |
| Human IL-8 ELISA assay | PeproTech | #900_TM18 | |
| EQUIPMENTS | |||
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| Parafilm | BEMIS | PM-996 | |
| Microscope | NIKON | TS100 | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | LSR Fortessa | |
| Amicon Ultra-4ml | Merk Millipore | UFC800324 | |
| NanoDrop spectrophotometer | BioDrop | 80-3006-61 | |
| Real-time PCR System | Applied Biosystems | ABI Prism 7500 | |
| ELISA Reader | Molecular Devices | EMax microplate reader |
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