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Developmental Biology

Oncogene-प्रेरित वार्धक्य के दौरान सामान्य मानव Fibroblasts में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों और वार्धक्य-संबद्ध स्रावी Phenotype का एक मात्रात्मक मापन

Published: August 12, 2018 doi: 10.3791/57890
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2
1Department of Biochemistry, College of Medicine, Dong-A University, 2Peripheral Neuropathy Research Center, College of Medicine, Dong-A University
* These authors contributed equally

Summary

Intracellular ROS को सेल्यूलर वार्धक्य की प्रेरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हुए दिखाया गया है. यहां, हम सेलुलर वार्धक्य के दौरान ROS स्तर को बढ़ाता के लिए एक संवेदनशील परख का वर्णन । हम भी वार्धक्य-एसोसिएटेड स्रावी phenotype का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जो कथित तौर पर विभिन्न आयु-संबंधी शिथिलताओं के लिए योगदान देता है ।

Abstract

सेलुलर वार्धक्य प्रफलन क्षमता या विभिंन तनावों के लिए जोखिम के निकास पर अपरिवर्तनीय विकास की गिरफ्तारी का एक राज्य माना गया है । हाल के अध्ययनों के विकास, घाव भरने, प्रतिरक्षा निगरानी, और उम्र से संबंधित ऊतक रोग सहित विभिन्न शारीरिक प्रक्रियाओं, के लिए सेलुलर वार्धक्य की भूमिका बढ़ा दिया है. हालांकि सेल साइकिल गिरफ्तारी सेलुलर वार्धक्य की एक महत्वपूर्ण पहचान है, एक वृद्धि हुई intracellular प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) उत्पादन भी सेलुलर वार्धक्य की प्रेरण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए प्रदर्शन किया गया है । इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं पड़ोसी कोशिकाओं और ऊतकों पर शक्तिशाली paracrine गतिविधियों का प्रदर्शन एक वार्धक्य के माध्यम से जुड़े स्रावी phenotype (SASP) । सेलुलर वार्धक्य के खिलाफ चिकित्सीय रणनीतियों के बारे में ब्याज में तेज वृद्धि intracellular ROS और SASP सहित वार्धक्य तंत्र, की एक सटीक समझ के लिए की आवश्यकता पर जोर देती है । यहां, हम मात्रात्मक एच रास के दौरान intracellular ROS स्तरों का आकलन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन-प्रेरित सेलुलर वार्धक्य ROS के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई और प्रवाह cytometry का उपयोग कर । इसके अलावा, हम mRNA अभिव्यक्ति और SASP कारकों के स्राव के प्रेरण के विश्लेषण के लिए संवेदनशील तकनीक का परिचय । इन प्रोटोकॉल विभिंन सेलुलर वार्धक्य मॉडल के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

से अधिक ५० साल पहले, Hayflick और मूरहेड से पता चला कि सामांय कोशिकाओं को अपने प्रफलन क्षमता के निकास पर कोशिका विभाजन1की एक निश्चित संख्या के बाद अपरिवर्तनीय विकास की गिरफ्तारी दर्ज करें । इस घटना को अब नकल वार्धक्य के रूप में जाना जाता है और दृढ़ता से जीव2उंर बढ़ने के साथ सहसंबंधी माना जाता है । हालांकि telomeres के प्रगतिशील कटाव प्रतिकृति वार्धक्य का एक प्रमुख कारण माना जाता है, विभिन्न सेलुलर तनाव, जैसे डीएनए क्षति, oncogenic सक्रियण, और ऑक्सीडेटिव तनाव, सेलुलर वार्धक्य के एक अन्य प्रकार के प्रेरित करने के लिए सूचित किया गया है "समयपूर्व वार्धक्य" या "तनाव प्रेरित वार्धक्य" कहा जाता है । दिलचस्प है, समय से पहले वार्धक्य ऐसे एच के रूप में oncogenes के सक्रियकरण पर एक शक्तिशाली ट्यूमर-दमन भूमिका निभाता है रास और BRAF । माउस मॉडल और मानव ऊतकों के अध्ययन मजबूत सबूत है कि सेल वार्धक्य के oncogenic रास और BRAF सक्रिय कर रहे हैं, लेकिन घातक कैंसर है कि विकसित से कम थे में प्रमुख रूप से उपस्थित थे का उत्पादन किया है ये घाव3,4,5। उंर बढ़ने और ट्यूमर दमन में अपनी भूमिका से परे, सेलुलर वार्धक्य पिछले अध्ययनों में दिखाया गया है कि घाव भरने, ऊतक की मरंमत, प्रतिरक्षा निगरानी, और भ्रूण विकास6सहित विभिंन शारीरिक प्रक्रियाओं, में एक भूमिका निभाते हैं ।

हालांकि विकास की गिरफ्तारी बड़े पैमाने पर सेलुलर वार्धक्य7, सबूत के एक महत्वपूर्ण शरीर की एक बानगी के रूप में अध्ययन किया गया है पता चलता है कि intracellular प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) भी सेलुलर वार्धक्य8के लिए योगदान देता है । ROS स्तर के सेलुलर वार्धक्य के दौरान विभिन्न प्रकार के उन्नयन, जिसमें प्रतिकृति वार्धक्य और oncogene-प्रेरित वार्धक्य (OIS) शामिल हैं, मूल रूप से दशकों पहले9,10बताया गया था । एक अधिक सीधे, एच2ओ2 के एक घातक खुराक के साथ exogenous उपचार वार्धक्य11,12लाती है । इस तरह के SOD1 के रूप में ROS-सफ़ाई एंजाइमों के निषेध, भी समयपूर्व वार्धक्य13का कारण बनता है । इसके विपरीत, कम परिवेश ऑक्सीजन की स्थिति और बढ़ती ROS सफाई वार्धक्य10,14,15की शुरुआत देरी । इन परिणामों निस्संदेह संकेत मिलता है कि ROS महत्वपूर्ण मध्यस्थों या सेलुलर वार्धक्य प्रेरण के निर्धारक हैं । हालांकि, सेलुलर वार्धक्य की प्रेरण में कैसे ROS योगदान देते हैं और सेलुलर वार्धक्य के दौरान ROS स्तरों को कैसे ऊंचा किया जाता है और जांच की आवश्यकता होती है ।

हाल के अध्ययनों से पता चला है कि वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं एक SASP16,17के माध्यम से पड़ोसी कोशिकाओं और ऊतकों पर शक्तिशाली paracrine गतिविधियों है । ऊतक वृद्ध में, वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं प्रफलन कोशिकाओं के एक स्वायत्त कमी के अलावा SASP के माध्यम से कई रास्ते के माध्यम से उम्र से संबंधित ऊतक शिथिलताओं को बढ़ावा देने के. विभिन्न भड़काऊ कारकों, जैसे il-6, il-8, TGFβ, और मैट्रिक्स metalloproteinases (MMPs), वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं द्वारा स्रावित, ऊतक homeostasis की हानि के माध्यम से उम्र से संबंधित ऊतक रोग, ऊतक वास्तुकला के विनाश के कारण, पड़ोसी कोशिकाओं के वार्धक्य, और बाँझ सूजन18,19. हालांकि, SASPs जैविक संदर्भ के आधार पर लाभकारी प्रभाव हो सकता है । इसके अलावा, SASPs की heterogenetic नेचर वृद्ध होनेवाला सेल टाइप और सेल स्टेज पर निर्भर करती है, आगे रिसर्च की जरूरत पर बल देते हुए19।

यहाँ, हम OIS के दौरान intracellular ROS स्तर का आकलन करने के लिए तेजी से और संवेदनशील cytometry आधारित तकनीक का वर्णन. इसके अलावा, मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) और एलिसा का उपयोग कर SASP कारकों के विश्लेषण के लिए तरीके पेश कर रहे हैं ।

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Protocol

1. उत्प्रेरण Oncogene-प्रेरित वार्धक्य

  1. एक H-RasV12 retrovirus की तैयारी
    1. कोट कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ०.००१% पाली-एल-lysine/फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के 2 मिलीलीटर जोड़कर १०० mm संस्कृति पकवान ।
    2. एक निर्वात से जुड़े एक गिलास पिपेट का उपयोग कर पाली-एल lysine समाधान निकालें और 1x पंजाबियों के 2 मिलीलीटर जोड़कर संस्कृति पकवान धो लो ।
    3. प्लेट 3 एक्स 106 ecotropic BOSC-23 Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के साथ लेपित संस्कृति डिश पर पैकेजिंग कोशिकाओं 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन/streptomycin, और संस्कृति एक सह में ३७ डिग्री सेल्सियस पर उन्हें2 ऊतक संस्कृति 1 डी के लिए मशीन ।
    4. अगले दिन, transfect 2 µ जी के pBabe पूरो-H-RasV12 डीएनए के साथ मिलकर retroviral पैकेजिंग डीएनए (2 µ जी के pGAG/पोल और ०.२५ µ जी के pVSVG) निर्माता के निर्देशों के अनुसार 8 ज के लिए एक अभिकर्मक रिएजेंट का उपयोग कर ।
    5. अभिकर्मक मीडिया निकालें और ताजा मीडिया के 8 मिलीलीटर जोड़ें ।
    6. ४८ ज के बाद, वायरल कणों युक्त मीडिया इकट्ठा और 5 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा किसी भी सेलुलर मलबे को हटा दें ।
    7. एक ०.४५ µm सिरिंज फिल्टर के साथ एच रास वायरस युक्त मीडिया फ़िल्टर.
      नोट: एक कुशल वायरल संक्रमण के लिए वायरस supernatants के किसी भी ठंड और गल से बचें । सबसे अच्छा दक्षता प्राप्त करने के लिए, एक वायरस है कि संक्रमण के रूप में एक ही दिन में काटा गया था का उपयोग करें ।
  2. वाई संक्रमित-३८ सामान्य मानव fibroblasts साथ एच-RasV12 retrovirus
    1. प्लेट 5 x 104 WI-३८ कोशिकाओं में एक ६० मिमी संस्कृति डिश युक्त DMEM के साथ 10% FBS और 1% पेनिसिलिन/streptomycin 1 d संचयन से पहले H-RasV12 retrovirus, और उन्हें 1 दिन के लिए संस्कृति ३७ ° c.
    2. अगले दिन विकास मध्यम निकालें और H-RasV12 retrovirus मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें । एक polybrene शेयर समाधान के 2 µ एल युक्त विकास मध्यम के एक अतिरिक्त 1 मिलीलीटर जोड़ें (आसुत जल में 8 मिलीग्राम/एमएल) । एक humidified ३७ ° c, 5% सह2 ऊतक संस्कृति मशीन में 1 दिन के लिए नमूना मशीन ।
    3. h-RasV12 retrovirus मिक्सचर 24 h को बाद में निकाल लें और इन कोशिकाओं को 1x पंजाबन के साथ 2x धो दें । वृद्धि मध्यम जोड़ें और 2 µ g/puromycin के 2 दिनों के लिए एक humidified ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2 ऊतक संस्कृति मशीन में के साथ कोशिकाओं का इलाज ।
    4. puromycin चयन के 2 डी के बाद, विकास के माध्यम को हटा दें, और 1x पंजाबियों के साथ 2x कोशिकाओं धो लो । वृद्धि मध्यम और संस्कृति एक humidified ३७ ° c, 5% CO2 मशीन में कक्षों को इंगित समय बिंदु तक जोड़ें (एक योजनाबद्ध आरेख के लिए चित्र 1a देखें) ।

2. निगरानी वार्धक्य via वार्धक्य-जुड़े β-galactosidase धुंधला

  1. निंनलिखित स्टॉक समाधान तैयार करें ।
    1. तैयार 20 मिलीग्राम/एमएल 5-ब्रोमो-4-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-3-indolyl β-D-galactopyranoside (एक्स-लड़की) dimethyl formamide (DMF) में । -20 ° c पर समाधान संग्रहीत है ।
    2. न2HPO4. 7H2ओ (१२६ मिमी) और आसुत जल के १०० मिलीलीटर में साइट्रिक एसिड (३६.८ मिमी) के ०.७०८ ग्राम भंग करके एक साइट्रिक एसिड/सोडियम फॉस्फेट बफर तैयार करें । ६.० के लिए पीएच समायोजित करें, यदि आवश्यक हो ।
    3. तैयार ०.५ मी पोटेशियम ferrocyanide. अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान ।
    4. तैयार ०.५ मी पोटेशियम ferricyanide. अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान ।
      नोट: वार्धक्य-जुड़े β-galactosidase (SA β-gal) के पीएच सटीक परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है ।
  2. एक ताजा सा β-कमजोर द्वारा हल लड़की धुंधला १५० मिमी NaCl, 2 मिमी MgCl2, 5 मिमी पोटेशियम ferrocyanide, 5 मिमी पोटेशियम ferricyanide, 20% (वी/वी) साइट्रिक एसिड/सोडियम फॉस्फेट बफर, और एक्स-लड़की के 1 मिलीग्राम/
  3. संस्कृति मीडिया निकालें और 1x पंजाबियों के साथ सेल 1x धो लो । कक्ष के तापमान पर 5 मिनट के लिए 3% formaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक करें ।
    नोट: retrovirus से संक्रमित नहीं है जो कक्ष एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाना चाहिए । संक्रमित नियंत्रण कोशिकाओं को अपनी proliferating स्थिति बनाए रखने के लिए पारित किया जाना जारी रखना चाहिए ।
  4. कोशिकाओं से निर्धारण समाधान निकालें और उन्हें 1x पंजाबियों के साथ धो लें । हौसले से तैयार 1x SA β-लड़की धुंधला समाधान (एक ६० मिमी संस्कृति डिश में १.५ मिलीलीटर) जोड़ें । एक आयल फिल्म के साथ डिश सील सुखाने और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए यह मशीन को रोकने के लिए । वैकल्पिक रूप से, एक आर्द्रता कक्ष में पकवान एक साथ मशीन ।
    नोट: 3% formaldehyde वाले निर्धारण समाधान के रूप में खतरनाक अपशिष्ट का निपटारा किया जाना चाहिए । 2 CO बिना एक मशीन वांछनीय है, के लिए गर्मी के दौरान पीएच परिवर्तन को रोकने के ।
  5. अगले दिन पर एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की धुंधला स्थिति की जांच करें; SA β-gal-धनात्मक कक्षों perinuclear क्षेत्र में नीला दिखाई देते हैं ।
    नोट: proliferating नियंत्रण कक्ष SA β-gal-धनात्मक कक्षों की एक कम आवृत्ति दिखाएँ । यदि धुंधला भी प्रकाश है, एक से थोड़ा लंबी अवधि के लिए जारी रखने की मशीन (प्रतिनिधि उदाहरण के लिए चित्र 1b देखें) ।
  6. प्राप्त एक सा β-लड़की धुंधला छवि एक सीसीडी कैमरा के साथ एक 10x या अधिक से अधिक उद्देश्य लेंस का उपयोग कर । छवियों की एक पर्याप्त संख्या पर कब्जा करने के लिए धुंधला प्रतिशत की गणना (> 200 कोशिकाओं) ।
  7. सा β-gal-सना हुआ कक्षों के प्रतिशत की संख्या को बढ़ाता है के द्वारा की गणना करें sa के योग-gal-धनात्मक कक्षों की कुल संख्या के सापेक्ष कक्ष ।
    ध्यान दें: SA β-लड़की धुंधला स्वतंत्र रूप से कम से 3x दोहराया जाना चाहिए, और मतलब मान दोहराने प्रयोगों (चित्रा 1C) के परिणामों के आधार पर गणना की जानी चाहिए । उपयुक्त कोशिका घनत्व सा β-लड़की धुंधला प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण है । एक उच्च प्रवाह एक वार्धक्य-संबद्ध आकृति विज्ञान के लिए परिवर्तन के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं और नियंत्रण कोशिकाओं में एक झूठी सकारात्मक संकेत प्रेरित.

3. एच रास प्रेरित वार्धक्य के दौरान एक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों प्रेरण बढ़ाता है

  1. प्लेट 2 x 105 WI-३८ कोशिकाओं एक ६० mm संस्कृति डिश पर और चरण 1 में वर्णित के रूप में एच रास-प्रेरित वार्धक्य भड़काने ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल सेलुलर वार्धक्य मॉडल के अंय प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है ।
  2. संकेत समय बिंदु (2, 4, या 6 दिन) में वृद्धि मध्यम निकालें, और 1x पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें । उंहें ०.०५% trypsin/EDTA समाधान की 1 मिलीलीटर के साथ इलाज करके कोशिकाओं को अलग और 10% FBS युक्त विकास माध्यम की 1 मिलीलीटर जोड़कर trypsin को निष्क्रिय । कक्ष गणना निर्धारित करें ।
  3. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में 1 एक्स 105 कोशिकाओं स्थानांतरण, और 5 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा ।
  4. तैयार ताजा 2 ', 7 '-dichlorofluorescin diacetate (डीसीएफ-da) 10 मिमी डीसीएफ के ५० µ एल जोड़कर मीडिया धुंधला-संस्कृति माध्यम के 10 मिलीलीटर के लिए दा (डीसीएफ के कार्य एकाग्रता-डीए ५० µ मीटर है) ।
    नोट: डीसीएफ-डीए हल्का संवेदनशील है । लाइट एक्सपोजर से बचना चाहिए । डीसीएफ की एकाग्रता-डीए और धुंधला समय कोशिका के प्रकार के आधार पर समायोजित किया जा सकता है ।
  5. 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब से विकास मध्यम ध्यान से निकालें और हौसले से तैयार डीसीएफ-दा दाग मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें । ध्यान से सेल गोली resuspend और अंधेरे में 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर यह मशीन । एक नकारात्मक दाग नियंत्रण के रूप में एक गैर दाग नमूना शामिल करें ।
    नोट: Proliferating कोशिकाओं डीसीएफ के साथ दाग नहीं-दा एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में तैयार किया जाना चाहिए ।
  6. ५०० x g पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करने और उंहें 1x पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ 1x धो लो । 1x पंजाबियों की 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को पुनः निलंबित और नमूना उपयुक्त प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष छँटाई (FACS) ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
  7. उपाय 2 ', 7 '-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (डीसीएफ-DA) प्रतिदीप्ति एक प्रवाह एक उपयुक्त लेजर स्रोत के साथ सुसज्जित cytometer का उपयोग कर संकेत । एक नीली लेजर (४८८ एनएम) के साथ नमूनों को उत्तेजित और एक लघुगणकीय पैमाने का उपयोग कर एक ५३० ± 30 एनएम डिटेक्टर (FITC) के साथ उत्सर्जित प्रतिदीप्ति का पता लगाने ।
    1. पहले गैर-दाग नकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं का विश्लेषण करें । साइड स्कैटर (SSC) बनाम फॉरवर्ड कैटरिंग (FSC) की एक डॉट साजिश में, एक गेटिंग उपकरण का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं का चयन करें और मृत कोशिकाओं और सेलुलर मलबे को खत्म.
      नोट: कक्ष आकार परिवर्तन FSC बनाम एसएससी की डॉट साजिश में सावधानी से नजर रखी जानी चाहिए । यदि वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं का आकार काफी बढ़ जाता है तो डीसीएफ-डीए की तीव्रता FSC बनाम एसएससी के डॉट प्लाट में गेटिंग के बाद उसी साइज की कोशिका आबादी में तुलना की जानी चाहिए ।
    2. एक एकल पैरामीटर में हिस्टोग्राम प्रदर्शित डीसीएफ-DA (४८८ एनएम) x-अक्ष के लघुगणकीय स्केल पर प्रतिदीप्ति और घटनाओं की संख्या ( y-अक्ष के रेखीय स्केल पर कक्ष संख्या), ४८८ एनएम लेजर की वोल्टेज को समायोजित करने से चोटी जगह बाएं किनारे पर गैर-सना हुआ कक्ष ।
    3. विश्लेषण डीसीएफ-दा सना हुआ नमूने और रिकॉर्ड के लिए प्रत्येक नमूने के लिए कम से १०,००० घटनाओं । प्रत्येक नमूने का मतलब प्रतिदीप्ति मूल्य प्राप्त विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रवाह cytometer के लिए विशिष्ट का उपयोग कर ।
      नोट: ROS माप स्वतंत्र रूप से कम से 3x दोहराया जाना चाहिए, और इन परिणामों से मतलब मूल्यों की गणना की जानी चाहिए. प्रतिनिधि एच रास प्रेरित वार्धक्य परिणाम चित्रा 2में दिखाए जाते हैं ।

4. वार्धक्य-एसोसिएटेड स्रावी Phenotype विश्लेषण के लिए il-6 और il-8 mRNA अभिव्यक्ति को बढ़ाता है एक वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया का उपयोग

  1. कुल आरएनए तैयारी
    1. प्लेट 3 एक्स 105 WI-३८ कोशिकाओं DMEM में एक १०० mm संस्कृति डिश पर 10% FBS और 1% पेनिसिलिन/streptomycin, और उंहें एक ऊतक संस्कृति मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति 1 दिन के लिए । प्रत्येक समय बिंदु के लिए डुप्लिकेट संस्कृतियों तैयार करते हैं ।
    2. चरण 1 में वर्णित के रूप में एच-RasV12 retrovirus के साथ कोशिकाओं को संक्रमित द्वारा वार्धक्य प्रेरित ।
    3. 1 फसल से पहले दिन में, 1x पंजाबियों के साथ 2x कोशिकाओं धो, और FBS बिना DMEM के 3 मिलीलीटर जोड़ें ।
      नोट: चरण 5 में वर्णित के रूप में एलिसा के लिए प्रयुक्त वातानुकूलित माध्यम का उत्पादन करने के लिए यह चरण आयोजित किया जाता है । सीरम भुखमरी कुछ संवेदनशील कोशिकाओं में आईएल-6 और आईएल-8 mRNAs की अभिव्यक्ति पैदा कर सकता है । इस प्रकार, के साथ और सीरम भुखमरी के बिना प्रसंस्कृत कोशिकाओं में आईएल-6 और आईएल-8 mRNA अभिव्यक्ति शुरू में तुलना की जानी चाहिए । यदि सीरम भुखमरी il-6 या il-8 mRNA की अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण परिवर्तन लाती है, qPCR के लिए कुल आरएनए और एलिसा के लिए वातानुकूलित माध्यम अलग से तैयार किया जाना चाहिए ।
    4. बाद में प्रत्येक नमूना 24 ज से वातानुकूलित माध्यम लीजिए और एलिसा के लिए मध्यम पर-८० ° c स्टोर ।
    5. उंहें ०.०५% trypsin/EDTA समाधान की 1 मिलीलीटर के साथ इलाज करके कोशिकाओं को अलग और 10% FBS युक्त विकास माध्यम की 1 मिलीलीटर जोड़कर trypsin को निष्क्रिय । चरण 5 में वर्णित के रूप में एलिसा परिणामों के सामान्यीकरण के लिए कक्ष गणना निर्धारित करें । फसल एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में ५०० x g पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा ।
    6. कोमल चूषण द्वारा मध्यम निकालें और आरएनए निष्कर्षण समाधान की 1 मिलीलीटर जोड़ें । फिर, भंवर microcentrifuge ट्यूब के लिए जोरदार 15 एस । बाद में, क्लोरोफॉर्म के २०० µ एल जोड़ें और जोरदार मिश्रण फिर से एक अतिरिक्त 15 एस के लिए भंवर ।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १७,००० x g पर नमूना ट्यूबों केंद्रापसारक । फिर, ध्यान से एक नया १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए ऊपरी चरण स्थानांतरित ।
      नोट: चरण और कम कार्बनिक चरण एक नई ट्यूब के लिए ऊपरी चरण के हस्तांतरण के दौरान परेशान नहीं किया जाना चाहिए ।
    8. isopropanol के ४०० µ एल जोड़ें आरएनए को तेज और कोमल उलटा द्वारा उन्हें अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए । फिर, 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब मशीन ।
    9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १७,००० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक । फिर, supernatant को त्यागें, आरएनए गोली बनाए रखने के लिए देखभाल । ७५% इथेनॉल की 1 मिलीलीटर जोड़कर आरएनए धो और ट्यूब 2 पलटना-3x । 4 डिग्री सेल्सियस पर १७,००० x g पर 5 मिनट के लिए ट्यूब केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
    10. कमरे के तापमान पर आरएनए गोली सूखी और diethyl pyrocarbonate (DEPC) के ५० µ एल में आरएनए भंग-आसुत जल इलाज किया । आरएनए समाधान के 1 µ एल का उपयोग करना, एक spectrophotometer के साथ कुल आरएनए एकाग्रता को बढ़ाता है ।
      ध्यान दें: शाहीन की घुलनशीलता कम हो जाएगी; इसलिए, आरएनए को सूखने से बचें ।
  2. सीडीएनए तयारी
    1. एक पतली घिरी पीसीआर ट्यूब में निम्नलिखित जोड़कर प्रत्येक नमूने के लिए रिवर्स-प्रतिलेखन प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें: कुल आरएनए के 2 µ g (RNase-फ्री वॉटर के साथ 10 µ l तक वॉल्यूम समायोजित करें), 10x RT बफर के 2 µ l, एक यादृच्छिक प्राइमरी के 1 µ l (५० pmol), ०.८ µ l की 25x dNTP मिक्स (१०० मिमी), MMLV रिवर्स transcriptase के 1 µ एल (५० यू/µ एल), और µ के ५.२ RNase एल-मुक्त पानी ।
    2. निंनलिखित शर्तों के साथ थर्मल साइकिल चालक पर रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया कार्यक्रम की स्थापना: ४२ ° c के लिए ६० मिनट और ९५ ° c 5 मिनट के लिए । थर्मल साइकिल चालक में पीसीआर ट्यूब प्लेस और कार्यक्रम शुरू करते हैं ।
  3. रीयल-टाइम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन
    1. सभी प्रतिक्रियाओं के लिए वास्तविक समय पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार करें । प्रत्येक नमूने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण इस प्रकार है: 25 µ एल के 2x वास्तविक समय पीसीआर मास्टर मिक्स, 1 µ एल आगे और रिवर्स प्राइमरों के आईएल-6 या il-8, और अल्ट्रा शुद्ध आसुत जल (DNase-और RNase मुक्त) के 21 µ एल के लिए । तालिका 1देखें ।
      नोट: एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में actin आरएनए प्राइमरों युक्त प्रत्येक नमूने के लिए वास्तविक समय पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें । GAPDH भी सामांय के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    2. जोड़ें ४८ µ के मास्टर मिश्रण और 2 µ एल के l 3 गुना पतला सीडीएनए उत्पाद के पानी के साथ एक अच्छी तरह से एक ९६ ऑप्टिकल qPCR प्लेट में. तपसिल में प्रत्येक प्रतिक्रिया करते हैं । एक नियंत्रण अच्छी तरह से तैयार करें जिसमें सीडीएनए टेम्पलेट को पीसीआर कंट्रोल के रूप में न शामिल करें ।
    3. निंनलिखित शर्तों के साथ थर्मल साइकिल चालक पर वास्तविक समय पीसीआर प्रतिक्रिया कार्यक्रम की स्थापना: 10 मिनट में ९५ ° c, ४० चक्र of15 s पर ९५ ° c (विकार), और 1 मिनट में ६० ° c (एनीलिंग और विस्तार) ।
    4. वास्तविक समय पीसीआर प्रदर्शन और पीसीआर चक्र के पूरा होने के बाद सीमा चक्र (सीटी) मूल्य रिकॉर्ड । 2-ΔΔCΤ विधि20का उपयोग कर il-6 या il-8 के लिए mRNA स्तरों की गणना करें ।
      नोट: सापेक्ष फ़ोल्ड परिवर्तन अभिव्यक्ति में सामांयीकरण करने के बाद actin स्तर करने के लिए निम्न सूत्र का उपयोग करके निर्धारित होता है:
      गुना परिवर्तन = 2-Δ (ΔCT)
      यहाँ
      ΔCटी = सीटी, आईएल-6 या आईएल-8-सीटी, actin; और
      Δ (ΔCt) = ΔCt, उत्तेजित-ΔCt, control.
    5. प्रत्येक डुप्लिकेट नमूने के लिए माध्य मान परिकलित करें ।
      नोट: qPCR स्वतंत्र रूप से कम से 3x दोहराया जाना चाहिए, और मतलब मान इन परिणामों के आधार पर गणना की जानी चाहिए । प्रतिनिधि एच रास प्रेरित वार्धक्य परिणाम चित्रा 3में दिखाए जाते हैं । सीरम भुखमरी कुछ संवेदनशील कोशिकाओं में आईएल-6 और आईएल-8 mRNAs की अभिव्यक्ति पैदा कर सकता है । इस प्रकार, के साथ और सीरम भुखमरी के बिना प्रसंस्कृत कोशिकाओं में आईएल-6 और आईएल-8 mRNA अभिव्यक्ति शुरू में तुलना की जानी चाहिए । यदि सीरम भुखमरी il-6 या il-8 mRNA की अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण परिवर्तन लाती है, qPCR के लिए कुल आरएनए और एलिसा के लिए वातानुकूलित माध्यम अलग से तैयार किया जाना चाहिए ।

5. एक वार्धक्य के लिए गुप्त आईएल-6 और आईएल-8 प्रोटीन के स्तर को बढ़ाता है-एलिसा का उपयोग कर स्रावी Phenotype विश्लेषण के लिए

  1. गल 4 चरण में वर्णित के रूप में वृद्ध होनेवाला वाई-३८ कोशिकाओं से काटा मध्यम वातानुकूलित के 3 मिलीलीटर । 5 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा सेल मलबे निकालें ।
  2. वातानुकूलित मध्यम 10-३,००० x g पर 20 मिनट के लिए एक केंद्रापसारक फिल्टर इकाई का उपयोग कर केंद्रापसारक द्वारा गुना ध्यान केंद्रित ।
    नोट: वातानुकूलित माध्यम की एकाग्रता जरूरी नमूना प्रकार पर निर्भर नहीं हो सकता है ।
  3. एलिसा उचित IL-6 और il-8 एलिसा किट के साथ वातानुकूलित माध्यम के प्रत्येक केंद्रित नमूना के ५० µ एल का उपयोग कर प्रदर्शन ।
    नोट: दो एलिसा कुओं में प्रत्येक नमूने का परीक्षण करें । प्रत्येक समय बिंदु चरण 4 में डुप्लिकेट है, क्योंकि यह विश्लेषण हमें एलिसा परख और नमूना तैयारी तकनीक दोनों में बदलाव पर नजर रखने के लिए अनुमति देता है ।
    1. एलिसा प्लेट कोटिंग के लिए, il-6 या il-8 एंटीबॉडी 1x पंजाबियों के साथ ०.५ µ g/एमएल के लिए एक एकाग्रता के लिए पतला-6 या ०.१२५ µ g/ एलिसा थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से पतला एंटीबॉडी के १०० µ एल जोड़ें । एक एलिसा थाली सील फिल्म और कमरे के तापमान पर रातोंरात मिलाते बिना गर्मी के साथ थाली सील ।
    2. आकांक्षा द्वारा एंटीबॉडी समाधान निकालें । ३०० µ के साथ एक अच्छी तरह 4x धो 1x धो बफर (०.०५% के बीच-पंजाब में 20) के एल । एक अच्छी तरह से करने के लिए ३०० µ एल ब्लॉकिंग बफर (पंजाब में 1% BSA) जोड़ें । 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
    3. आकांक्षा द्वारा अवरुद्ध समाधान निकालें । 1x धो बफर के ३०० µ एल के साथ एक अच्छी तरह से धो लें । एक कमजोर पड़ने बफर में प्रश्नपत्र पतला एलिसा मानकों को तैयार (०.०५% के बीच-20 और ०.१% BSA पंजाब में) एक मानक वक्र उत्पंन करने के लिए ।
      नोट: IL-6 के लिए धारावाहिक कमजोर पड़ने ३१.२५, ६२.५, १२५, २५०, ५००, १,०००, और २,००० स्नातकोत्तर/एमएल है । आईएल-8 के लिए धारावाहिक कमजोर पड़ने २.३४, ४.६९, ९.३८, १८.७५, ३७.५, ७५, और १५० स्नातकोत्तर/
    4. या तो मानक समाधान के १०० µ l जोड़ें या १०० µ l का नमूना समाधान (५० µ एल कमजोर बफर के ५० µ l के साथ केंद्रित माध्यम के) के लिए एक अच्छी तरह से. 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर कुएं की मशीन
    5. आकांक्षा द्वारा मानक या नमूना समाधान निकालें । 1x धो बफर के ३०० µ एल के साथ एक अच्छी तरह से धो लें । कमजोर पड़ने वाले बफर के साथ पता लगाने एंटीबॉडी के लिए ०.१ µ g/ml की एकाग्रता के लिए il-6 या ०.२५ µ g/ पतला एंटीबॉडी के १०० µ l को अच्छी तरह से जोड़ें । 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर कुएं की मशीन
    6. आकांक्षा द्वारा एंटीबॉडी समाधान निकालें । 1x धो बफर के ३०० µ एल के साथ एक अच्छी तरह से धो लें । पतला streptavidin-सहिजन peroxidase (एचआरपी) के कमजोर पड़ने बफर में ०.०५ µ जी की एकाग्रता के लिए/ streptavidin-एचआरपी के प्रति अच्छी तरह से हल १०० µ एल जोड़ें । 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कुएं की मशीन ।
    7. आकांक्षा द्वारा एंटीबॉडी समाधान निकालें । 1x धो बफर के ३०० µ एल के साथ एक अच्छी तरह से धो लें । जोड़ें १०० µ एल के 3, 3 ', 5, 5 '-tetramethylbenzidine (TMB) सब्सट्रेट समाधान के लिए एक अच्छी तरह से. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कुओं की मशीन रंग के विकास के लिए अनुमति देते हैं । 1 एम एचसीएल स्टॉप सॉल्यूशन के १०० µ l को जोड़कर रिएक्शन को रोकें ।
    8. पढ़ें ४५० एनएम में एक एलिसा पाठक के साथ एक अच्छी तरह से अवशोषित ।
    9. मानक वक्र जनरेट किए गए मानकों के लिए प्लॉट । मानक curves के अनुसार वातानुकूलित माध्यम में आईएल-6 और आईएल-8 की सांद्रता की गणना करें । कक्ष गणना करने के लिए एक सामान्यीकरण के बाद परिणाम प्लॉट करें । डुप्लिकेट नमूनों के लिए माध्य मानों की गणना करें ।
      नोट: एलिसाs स्वतंत्र रूप से कम से 3x दोहराया जाना चाहिए, और मतलब मान इन परिणामों के आधार पर गणना की जानी चाहिए (चित्रा 4) ।

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Representative Results

H-Ras-प्रेरित वार्धक्य का एक उदाहरण चित्रा 1में दिखाया गया है । एच-RasV12 retrovirus प्रेरित नाटकीय रूपात्मक परिवर्तन (आंकड़ा 1b) के साथ WI-३८ सामांय मानव fibroblasts के संक्रमण । इसके अलावा, के रूप में चित्रा 1Cमें दिखाया गया है, सा β-लड़की धुंधला गतिविधि एच-RasV12 अभिव्यक्ति पर उल्लेखनीय वृद्धि हुई थी । कोशिकाओं की तुलना में अधिक ७०% सा β-gal धुंधला गतिविधि 6 d-RasV12 retrovirus संक्रमण के बाद दिखाया गया है, यह दर्शाता है कि h-RasV12 की अभिव्यक्ति सफलतापूर्वक सेलुलर वार्धक्य को WI-३८ कोशिकाओं में लाती है, जैसा कि हम और अंय समूहों ने पहले21 रिपोर्ट ,22.

चित्रा 2 एच रास-प्रेरित सेलुलर वार्धक्य के दौरान ROS स्तर की निगरानी के लिए डीसीएफ-दा धुंधला विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है । वृद्धि हुई intracellular ROS स्तर एच रास अभिव्यक्ति के बाद के रूप में जल्दी 2 दिनों के रूप में मनाया जाता है और 6 दिन का समय बिंदु तक बनाए रखा जाता है । इस बीच, SASP की प्रेरण अलग कैनेटीक्स से पता चलता है । il-6 और il-8, प्रतिनिधि SASP कारकों के mRNA स्तर में वृद्धि, एच रास अभिव्यक्ति और 8 दिन के समय बिंदु पर चोटी (चित्रा 3) के बाद 4 दिनों से मनाया जाता है । जैसा कि चित्रा 4में सचित्र, गुप्त आईएल-6 और आईएल-8 स्तर वास्तविक समय पीसीआर परिणामों के अनुरूप, इसी तरह बढ़ता दिखा । ये परिणाम सेलुलर वार्धक्य की प्रेरण में ROS और SASP के विभिंन भूमिकाओं का सुझाव देते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1 : रूपात्मक परिवर्तन और सा में वृद्धि β-एच रास-प्रेरित वार्धक्य के दौरान लड़की धुंधला । (क) यह पैनल वाई-३८ कोशिकाओं में एच रास-प्रेरित वार्धक्य की प्रेरण के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया को दर्शाता है । (ख) सा β-लड़की धुंधला एच-RasV12 retrovirus के साथ WI-३८ कोशिकाओं के संक्रमण के बाद संकेत दिया समय बिंदु पर किया गया था; यहां, सा β-लड़की धुंधला के प्रतिनिधि छवियों को दिखाया जाता है । (ग) सा β-gal-सकारात्मक कोशिकाओं तीन स्वतंत्र प्रयोगों में गिना गया । परिणाम माध्य मानों के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं, और त्रुटि पट्टियां मानक विचलन (SD) का प्रतिनिधित्व करते हैं । * * P < 0.01, Student ' s t-test. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 2
चित्रा 2 : एच रास-प्रेरित वार्धक्य के दौरान intracellular ROS स्तरों में वृद्धि । (क) वाई-३८ कोशिकाओं से संक्रमित थे एच रास retrovirus और डीसीएफ के साथ दाग-दा (५० µ मीटर) संकेत दिया समय बिंदुओं पर. डीसीएफ-दा प्रतिदीप्ति तीव्रता quantified एक प्रवाह cytometer का उपयोग कर रहे थे । 0-और 6-डी समय बिंदुओं पर डीसीएफ-DA प्रतिदीप्ति तीव्रता के प्रतिनिधि हिस्टोग्राम दिखाए जाते हैं । (ख) 0-और 6 दिन के समय बिंदुओं पर डीसीएफ-DA प्रतिदीप्ति तीव्रता के प्रतिनिधि हिस्टोग्राम एक साथ आसान तुलना के लिए प्लॉट किए गए हैं । (ग) एच रास-प्रेरित वार्धक्य के दौरान डीसीएफ-दा प्रतिदीप्ति तीव्रता संकेत दिया समय अंक 3x पर मापा गया था । परिणाम माध्य मानों के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं, और त्रुटि पट्टियां मानक विचलन (SD) का प्रतिनिधित्व करते हैं । * p < 0.05 और * * p < 0.01, Student ' s t-test । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : एच-रास-प्रेरित वार्धक्य के दौरान SASP-संबंधी mRNAs के ठहराव । आरएनए एच-RasV12 retrovirus संक्रमण के बाद संकेत दिया समय बिंदुओं पर WI-३८ कोशिकाओं से तैयार किया गया था । इन पैनलों (क) il-6 और (ख) il-8 अभिव्यक्ति की प्रेरण दिखाने के विशिष्ट 1 तालिकामें सूचीबद्ध प्राइमरों का उपयोग qPCR द्वारा विश्लेषण किया । actin mRNA स्तर सामान्यीकरण के लिए उपयोग किया गया था । 0-दिन नमूने में मापा सामान्यीकृत il-6 या IL-8 mRNA स्तर 1 के लिए सेट किया गया था और सापेक्ष फ़ोल्ड परिवर्तन परिकलित किए गए थे । प्रयोगों के स्वतंत्र रूप से 3x दोहराया गया । परिणाम माध्य मानों के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं, और त्रुटि पट्टियां मानक विचलन (SD) इंगित करते हैं । * p < 0.05 और * * p < 0.01, Student ' s t-test । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 4
चित्र 4 : H-रास-प्रेरित वार्धक्य के दौरान स्रावित SASP कारकों का ठहराव । इन पैनलों मानक il-6 (ए) और आईएल-8 (सी) के साथ उत्पंन घटता दिखाने के मानकों । वातानुकूलित मीडिया एच-RasV12 retrovirus संक्रमण के बाद संकेत दिया समय बिंदुओं पर WI-३८ कोशिकाओं से काटा गया था । गुप्त il-6 (ख) और il-8 स्तर (डी) एक il-6 और il-8 एलिसा किट, क्रमशः के साथ विश्लेषण किया गया । प्रयोगों के स्वतंत्र रूप से 3x दोहराया गया । परिणाम माध्य मानों के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं, और त्रुटि पट्टियां मानक विचलन (SD) इंगित करते हैं । * p < 0.05 और * * p < 0.01, Student ' s t-test । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

जीन नाम फॉरवर्ड प्राइमर रिवर्स प्राइमर
आईएल-6 5 '-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3 ' 5 '-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3 '
आईएल-8 5 '-ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3 ' 5 '-AACCCTCTGCACCCAGTTTTC-3 '
actin 5 '-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3 ' 5 '-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3 '

तालिका 1: SASP कारकों के लिए वास्तविक समय पीसीआर प्राइमरों ।

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Discussion

यहाँ, हमने एच-रास-प्रेरित वार्धक्य में वाई-३८ सामान्य मानव fibroblasts के दौरान intracellular ROS स्तरों की निगरानी के लिए विधियाँ प्रस्तुत की हैं. लाइव कोशिकाओं में Intracellular ROS स्तरों को मात्रात्मक सेल का उपयोग करके मापा जा सकता है-पारगंय रिएजेंट डीसीएफ-DA और फ्लो cytometry. सेलुलर पर ले लो, डीसीएफ-DA intracellular esterases द्वारा deacetylated है और बाद में, ROS द्वारा ऑक्सीकरण के लिए अत्यधिक फ्लोरोसेंट ' 2, 7 '-dichlorofluorescein (डीसीएफ) फार्म । डीसीएफ प्रतिदीप्ति एक FL1 डिटेक्टर (ग्रीन प्रतिदीप्ति) का उपयोग कर प्रवाह cytometry द्वारा पता लगाया जा सकता है । डीसीएफ-दा धुंधला विधि का उपयोग कर, हम सफलतापूर्वक वाई-३८ सामान्य मानव fibroblasts में एच रास-प्रेरित सेलुलर वार्धक्य के दौरान ROS स्तरों में वृद्धि का पता लगाया. इस विधि सेलुलर वार्धक्य के विभिंन मॉडलों में इस्तेमाल किया जा सकता ROS स्तर में परिवर्तन की निगरानी । डीसीएफ के अलावा-दा धुंधला, अतिरिक्त तरीकों कि ROS प्रेरण मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है ऑक्सीकरण प्रोटीन23 के स्तर की निगरानी और एक फोकल माइक्रोस्कोपी ROS-निर्भर फ्लोरोसेंट24रंजक का उपयोग कर विश्लेषण शामिल हैं । इस प्रकार, अतिरिक्त तरीकों का उपयोग कर ROS स्तर में परिवर्तन की आगे की पुष्टि वांछनीय है ।

हाल ही में, हम ROS स्तर p53-प्रेरित वार्धक्य के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एच रास प्रेरित वार्धक्य21के दौरान कैंसर की कोशिकाओं में वृद्धि हुई है कि पता चला है । वृद्धि हुई intracellular ROS स्तर में वृद्धि करने से पहले देख रहे है SA β-लड़की धुंधला गतिविधि, सेलुलर वार्धक्य के प्रेरण में ROS की प्रेरणात्मक भूमिका का सुझाव । दिलचस्प है, ROS के स्तर में वृद्धि अलग से एकेटी-NF-κB-NOX4 मार्ग द्वारा नियंत्रित है, जबकि सेल चक्र गिरफ्तारी21p21 द्वारा मध्यस्थता है । क्या एकेटी भी सेलुलर वार्धक्य के अंय प्रकारों में ROS वृद्धि को नियंत्रित करता है पता लगाने के लिए दिलचस्प होगा ।

हम भी SASP कारकों आईएल-6 और आईएल-8 के दौरान एच रास प्रेरित वार्धक्य के mRNA और स्रावित प्रोटीन के स्तर का विश्लेषण करने के लिए तरीके पेश किया है । qPCR का उपयोग करके, हम वृद्ध होनेवाला WI-३८ कोशिकाओं में आईएल-6 और आईएल-8 mRNA की प्रेरण quantified । हम सामान्यीकरण के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में actin mRNA स्तरों की जांच की, लेकिन GAPDH mRNA भी एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । 18S राइबोसोमल आरएनए (rRNA) एक और गृह व्यवस्था जीन है कि सामांयतः qPCR प्रयोगों में एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है । हालांकि, क्योंकि rRNA प्रतिलेखन और ribosome परिपक्वता सेल चक्र गिरफ्तारी और सेलुलर वार्धक्य25,26, 18S rRNA सेलुलर वार्धक्य अध्ययन के लिए एक अच्छा आंतरिक नियंत्रण नहीं हो सकता है के दौरान विनियमित रहे हैं । एलिसा, वृद्ध होनेवाला WI-३८ कोशिकाओं से एक वातानुकूलित माध्यम का उपयोग कर, secreted il-6 और आईएल-8 के स्तर में इसी तरह बढ़ दिखाया । धारणा है कि SASP "परिपक्व" वार्धक्य चरण19में विकसित की है के साथ संगत, il-6 में वृद्धि और il-8 स्राव ROS के स्तर में वृद्धि की तुलना में एक बाद में समय बिंदु पर detectable हैं । विशेष रूप से, SASP कारकों सेल प्रकार और वार्धक्य प्रेरण शर्तों27के आधार पर बदलती हैं । इसलिए, सेलुलर वार्धक्य मॉडल के अनुसार उपयुक्त SASP कारकों का चयन किया जाना चाहिए ।

हालांकि हम पुष्टि की एच रास-प्रेरित वार्धक्य द्वारा रूपात्मक परिवर्तन और सा β-gal धुंधला गतिविधि की प्रेरण, सेलुलर वार्धक्य और अतिरिक्त वार्धक्य विशेषताओं की निगरानी द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए सहित प्रसार क्षमता की अपरिवर्तनीय हानि, वार्धक्य-जुड़े heterochromatin घावों (SAHF), SASP कारकों, ट्यूमर दमन के सक्रियण जैसे p53 और p16INK4a, बढ़ाया डीएनए क्षति संकेतों, और लगातार परमाणु घावों, डीएनए क्षेत्रों के रूप में परिभाषित क्रोमेटिन वार्धक्य (डीएनए-निशान) मजबूत परिवर्तन के साथ । तथापि, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि वहां विभिंन वार्धक्य प्रकार में वार्धक्य विशेषताओं का एक विविधता है । कुछ विशिष्ट वार्धक्य के मार्क्स केवल सेलुलर वार्धक्य के कुछ विशेष प्रकारों में ही देख सकते हैं । उदाहरण के लिए, SAHF OIS28,29में आम तौर पर स्पष्ट कर रहे हैं ।

सेलुलर वार्धक्य शुरू में कृत्रिम संस्कृति की स्थिति के कारण स्वायत्त विकास गिरफ्तारी का प्रतिनिधित्व करने के लिए विचार किया गया था । हालांकि, पिछली आधी सदी में हुए अध्ययनों ने विभिन्न pathophysiological परिस्थितियों के तहत सेलुलर वार्धक्य के महत्व को प्रदर्शित किया है, जिसमें बुढ़ापा और कैंसर भी शामिल है । सेलुलर वार्धक्य और उंर से संबंधित ऊतक गिरावट के बीच कारण लिंक BubR1 progeroid माउस मॉडल में पहले साबित किया गया है30,31। इस प्रकार, या तो वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं या SASP के मॉडुलन के उन्मूलन के माध्यम से सेल वार्धक्य को नियंत्रित वर्तमान में उम्र से संबंधित रोग के लिए एक आशाजनक रणनीति के रूप में माना जाता है. दरअसल, हाल के अध्ययनों से प्रदर्शन किया है कि वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं के उंमूलन उंर से संबंधित विकृतियों के लिए एक होनहार उपचार स्टेम सेल कमी, हड्डी हानि, बालों के झड़ने, और पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस३२,३३ सहित होगा, ३४,३५,३६. SASPs सहित वार्धक्य प्रेरण और वार्धक्य phenotypes के आणविक तंत्र की गहरी समझ, संभव कमियां और चुनिंदा लक्ष्यीकरण केवल वार्धक्य को कम करने के द्वारा बचके लक्ष्यीकरण के लिए बेहतर रणनीति प्रदान करेगा वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं के कार्य ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम कोरिया की नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (2015R1D1A1A01060839) (यंग येयून किम) और कोरिया सरकार (MSIT) (सं. 2016R1A2B2008887, सं द्वारा वित्त पोषित एनआरएफ) अनुदान के एक राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन द्वारा अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । 2016R1A5A2007009) (Jeanho को यूं) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
poly-L-lysine Sigma-Aldrich P2636
BOSC 23 ATCC CRL-11269
FBS GIBCO 16000-044
penicillin/streptomycin wellgene LS202-02
PBS Hyclone SH30013.02
DMEM GIBCO 12800-082
OPTI-MEM  GIBCO 31985-070
pBabe puro-H-RasV12  Addgene 1768
pGAG/pol Addgene 14887
pVSVG Addgene 1733
Turbofect Thermo Fisher Scientific R0531
polybrene Sigma-Aldrich H9268 8 mg/mL
puromycin Sigma-Aldrich P8833 2 mg/mL 
formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) Sigma-Aldrich B4252
potassium ferrocyanide Sigma-Aldrich B4252
potassium ferricyanide Sigma-Aldrich P9387
trypsin-EDTA wellgene LS015-01
DCF-DA Sigma-Aldrich  D6883 10 mM 
Trizol Thermo Fisher Scientific 15596026
MMLV Reverse transcriptase Promega M1701
SYBR Green PCR master 2x mix Takara PR820A
Random Primer Promega C118A
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
Ultra-pure distilled water Invitrogen 10977015
Human IL-6 ELISA assay PeproTech #900-TM16
Human IL-8 ELISA assay PeproTech #900_TM18
EQUIPMENTS
0.45 μm syringe filter sartorius 16555
Parafilm BEMIS  PM-996
Microscope NIKON TS100
Flow cytometer BD Bioscience LSR Fortessa
Amicon Ultra-4ml Merk Millipore UFC800324
NanoDrop spectrophotometer BioDrop 80-3006-61
Real-time PCR System Applied Biosystems ABI Prism 7500
ELISA Reader Molecular Devices EMax microplate reader

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक १३८ सेलुलर वार्धक्य एच-रास ROS SASP आईएल-6 आईएल-8 एजिंग
Oncogene-प्रेरित वार्धक्य के दौरान सामान्य मानव Fibroblasts में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों और वार्धक्य-संबद्ध स्रावी Phenotype का एक मात्रात्मक मापन
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Kim, Y. Y., Um, J. H., Yun, J. A… More

Kim, Y. Y., Um, J. H., Yun, J. A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence. J. Vis. Exp. (138), e57890, doi:10.3791/57890 (2018).

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