Summary
Intracellulära ROS har visat sig spela en viktig roll i induktion av cellulära åldras. Här beskriver vi en känslig analys för att kvantifiera ROS nivåer under cellulära åldras. Vi tillhandahåller även protokoll för att bedöma den åldras-associerade sekretoriska fenotyp, som enligt uppgift bidrar till olika åldersrelaterade dysfunktioner.
Abstract
Cellulära åldras har ansetts vara ett tillstånd av irreversibel tillväxt gripandet vid konsumtion av proliferativ kapacitet eller exponering för olika påfrestningar. Nyligen genomförda studier har utökat rollen av cellulära åldras olika fysiologiska processer, inklusive utveckling, sårläkning, immun övervakning och åldersrelaterade vävnad dysfunktion. Även om cellcykelarrest är ett avgörande kännetecken för cellulära åldras, har en ökad intracellulär reaktivt syre arter (ROS) produktion också visats spela en viktig roll i induktion av cellulära åldras. Senare studier visade dessutom att senescent celler uppvisar potent parakrin aktiviteter på angränsande celler och vävnader genom en åldras-associerade sekretoriska fenotyp (SASP). Den kraftiga ökningen intresse angående terapeutiska strategier mot cellulära åldras betonar behovet av en exakt förståelse åldras mekanismer, inklusive intracellulära ROS och SASP. Här beskriver vi protokoll för att kvantitativt bedöma intracellulära ROS nivåer under H-Ras-inducerad cellulära åldras med ROS-känsliga fluorescerande färgämne och flödescytometri. Dessutom introducerar vi känsliga tekniker för analys av induktion av mRNA uttryck och utsöndring av SASP faktorer. Dessa protokoll kan tillämpas på olika cellulära åldras modeller.
Introduction
Mer än 50 år sedan visade att normala celler in irreversibel tillväxt gripandet vid konsumtion av deras proliferativ potential efter ett visst antal celldelningar1Hayflick och Moorhead. Detta fenomen kallas nu replikationsförmåga åldras och tros starkt korrelerar med organismers åldrande2. Även om en gradvis urholkning av telomerer anses vara en viktig orsak till replikationsförmåga åldras, har olika cellulära påfrestningar, som DNA skador, onkogena aktivering och oxidativ stress, rapporterats inducera en annan typ av cellulära åldras kallas ”förtida åldrande” eller ”stressinducerade åldras”. Intressant, spelar för tidigt åldrande en potent tumör-suppressiv roll vid aktivering av onkogener som H-Ras och BRAF. Studier av musmodeller och mänskliga vävnader har producerat starka bevis som biomarkörer för cellen åldras fanns huvudsakligen i premaligna lesioner där onkogena Ras och BRAF aktiveras men minskades i elakartade cancerformer som utvecklats från dessa lesioner3,4,5. Utöver sin roll i åldrande och tumör dämpning, har cellulära åldras visats i tidigare studier att spela en roll i olika fysiologiska processer, inklusive sårläkning, vävnad reparera, immun övervakning och embryonal utveckling6.
Även om tillväxt gripandet har studerats som ett kännetecken för cellulära åldras7, tyder en betydande mängd bevis det intracellulära reaktiva syreradikaler (ROS) bidrar också till cellulära åldras8. Höjden av ROS nivåer under olika typer av cellulära åldras, inklusive replikationsförmåga åldras och onkogen-inducerad åldras (OIS), rapporterades ursprungligen decennier sedan9,10. En mer direkt, exogena behandling med en subletala dos av H2O2 inducerar åldras11,12. Hämning av ROS-rensning enzymer, såsom SOD1, orsakar också tidig åldras13. Däremot låg omgivande Syreförhållandena och öka ROS rensning försening uppkomsten av åldras10,14,15. Resultaten visar utan tvekan att ROS är viktiga medlare eller bestämningsfaktorerna för cellulära åldras induktion. Men hur ROS bidrar till induktion av cellulära åldras och hur ROS-nivåerna är förhöjda under cellulärt åldrande kräver ytterligare utredning.
Senare studier visat att senescent celler har potent parakrin aktiviteter på angränsande celler och vävnader genom en SASP16,17. I år vävnad främja senescent celler åldersrelaterade vävnad dysfunktioner via många vägar genom SASP förutom en autonom uttömning av proliferativ celler. Olika proinflammatoriska faktorer, till exempel IL-6, IL-8, TGFβ och matrix metalloproteinaser (MMP), utsöndras av senescent celler, orsaka åldersrelaterade vävnad dysfunktioner genom nedskrivning av vävnad homeostas, förstörelse av vävnad arkitektur, åldras av närliggande celler och steril inflammation18,19. Dock kan SASPs ha gynnsamma effekter beroende på de biologiska sammanhanget. Dessutom beror heterogenetic arten av SASPs på den senescent celltypen och cellen scenen, betonar behovet av ytterligare forskning19.
Här beskriver vi snabba och känsliga flödescytometri-baserad teknik för att bedöma intracellulära ROS nivåer under OIS. Dessutom introduceras metoder för analys av SASP faktorer med hjälp av kvantitativ realtids polymeras-kedjereaktion (qPCR) och ELISA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. inducerande onkogen-inducerad åldras
-
Förbereda en H-RasV12 retrovirus
- Coat 100 mm kultur skålen genom att lägga till 2 mL av 0,001% poly-L-lysin/fosfat buffrad saltlösning (PBS) för 5 min i rumstemperatur.
- Ta bort den poly-L-lysin lösningen med glas pipett ansluten till ett vakuum och tvätta kultur skålen genom att tillsätta 2 mL 1 x PBS.
- Plate 3 x 106 ecotropic BOSC-23 förpackningar celler på bestruket kulturen skålen med Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin och kultur dem vid 37 ° C i en CO2 vävnadsodling inkubator för 1 d.
- Nästa dag, transfect 2 µg pBabe puro-H-RasV12 DNA tillsammans med retrovirala förpackning DNA (2 µg till pGAG/pol och 0,25 µg pVSVG) använder en transfection reagens för 8 h enligt tillverkarens anvisningar.
- Ta bort transfection media och tillsätt 8 mL färsk media.
- Efter 48 h, samla media som innehåller viruspartiklarna och ta bort eventuella cellulära skräp genom centrifugering vid 500 x g i 5 min.
- Filtrera H-Ras virusinnehållande media med 0,45 µm spruta filter.
Obs: Undvik alla frysning och upptining av virus supernatanterna för en effektiv viral infektion. För att få den bästa effektiviteten, Använd ett virus som har skördats på samma dag som infektion.
-
Infekterar WI-38 normala mänskliga fibroblaster med den H-RasV12 retrovirus
- Tallrik 5 x 104 WI-38 celler i en 60 mm kultur skålen med DMEM innehållande 10% FBS och 1% penicillin/streptomycin 1 d före skörd av H-RasV12 retrovirus och kultur dem för 1 dag vid 37 ° C.
- Ta bort odlingsmedium nästa dag och tillsätt 1 mL H-RasV12 retrovirus media. Lägga till en ytterligare 1 mL odlingsmedium som innehåller 2 µL av polybrene stamlösning (8 mg/mL i destillerat vatten). Inkubera provet i 1 dag i en fuktad 37 ° C, 5% CO2 vävnadsodling inkubator.
- Ta bort H-RasV12 retrovirus blandningen 24 h senare och tvätta cellerna 2 x med 1 x PBS. Lägg till odlingsmedium och behandla cellerna med 2 µg/mL puromycin för 2 dagar i en fuktad 37 ° C, 5% CO2 vävnadsodling inkubator.
- Efter 2 d puromycin val, ta bort odlingsmedium och tvätta cellerna 2 x med 1 x PBS. Lägg till odlingsmedium och odla cellerna i en fuktad 37 ° C, 5% CO2 inkubator tills den angivna tiden pekar (se figur 1A för en principskiss).
2. övervakning åldras via åldras-associerade β-galaktosidas färgning
-
Förbered följande lager lösningar.
- Bereda 20 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) i dimetylformamid (DMF). Förvara lösningen vid-20 ° C.
- Förbereda en citronsyra, natrium fosfatbuffert genom upplösning 3.377 g Na2HPO4.7H2O (126 mM) och 0.708 g citronsyra (36,8 mM) i 100 mL destillerat vatten. Justera pH till 6.0, om det behövs.
- Förbereda 0,5 M kaliumferrocyanid. Förvara lösningen i mörker vid 4 ° C.
- Förbereda 0,5 M Kaliumferricyanid. Förvara lösningen i mörker vid 4 ° C.
Obs: pH i färglösningen åldras-associerade β-galaktosidas (SA β-gal) är avgörande för korrekt resultat.
- Gör en fräsch SA β-gal färglösningen genom att späda ut stamlösning innehållande 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM kaliumferrocyanid, 5 mM Kaliumferricyanid, 20% (v/v) citronsyra, natrium fosfatbuffert och 1 mg/mL X-gal.
- Ta bort kultur media och tvätta cellerna 1 x med 1 x PBS. Fixa cellerna med 3% formaldehyd under 5 minuter i rumstemperatur.
Obs: Celler som inte är smittade med retrovirus bör användas som en negativ kontroll. Oinfekterade kontroll cellerna bör fortsätta att vara anpassade för att upprätthålla deras prolifererande status. - Ta bort fixering lösningen från cellerna och tvätta dem med 1 x PBS. Lägg till nylagade 1 x SA β-gal färglösningen (1,5 mL i en 60 mm kultur maträtt). Tätning skålen med ett paraffin-film för att förhindra uttorkning och inkubera det i 24 timmar vid 37 ° C. Alternativt, inkubera rätter tillsammans i en fuktkammare.
Obs: Fixativ lösningen innehållande 3% formaldehyd bör kasseras som riskavfall. En inkubator utan CO2 är önskvärt att förhindra pH-förändringar under ruvningen. - Kontrollera statusen färgning av celler i Mikroskop på den nästa dagen; SA β-gal-positiva celler visas blå i regionen perinukleära.
Obs: Kontroll prolifererande cellerna visar en låg frekvens av SA β-gal-positiva celler. Om färgningen är för ljus, fortsätter inkubering under en något längre period (se figur 1B för representativa exempel). - Förvärva en SA β-gal färgning bild med en CCD-kamera med en 10 X eller större objektiv. Fånga ett tillräckligt antal bilder att beräkna procentandelen färgning (> 200 celler).
- Beräkna procentandelen av SA β-gal-färgade celler genom att kvantifiera antalet SA β-gal-positiva celler i förhållande till det totala antalet celler.
Obs: SA β-gal färgning bör upprepas självständigt minst 3 x och medelvärdena ska beräknas baserat på resultaten av replikera experiment (figur 1 C). Lämpliga cell densiteten är kritisk för SA β-gal färgning experimentet. En hög konfluens kan störa ändringen till en åldras-associerade morfologi och framkalla en falsk-positiv signal i kontroll cellerna.
3. kvantifiera ett reaktivt syre arter induktion under H-Ras-inducerad åldras
- Plattan 2 x 105 WI-38 celler på en 60 mm kultur skålen och provocera H-Ras-inducerad åldras som beskrivs i steg 1.
Obs: Detta protokoll kan tillämpas på andra typer av cellulära åldras modeller. - Ta bort odlingsmedium vid den angivna tidpunkten (2, 4 eller 6 dagar) och tvätta cellerna med 1 x PBS. Lossa cellerna genom att behandla dem med 1 mL 0,05% trypsin/EDTA-lösning och inaktivera trypsin genom att tillsätta 1 mL odlingsmedium som innehåller 10% FBS. Avgöra celltalet.
- Överföra 1 x 105 celler in i en 15 mL koniska rör, och samla cellerna genom centrifugering vid 500 x g i 5 min.
- Förbereda färska 2', 7'-dichlorofluorescin diacetat (DCF-DA) färgning media genom att lägga till 50 µL 10 mm DCF-DA 10 mL odlingsmedium (arbetande koncentrationen av DCF-DA är 50 µM).
Obs: DCF-DA är ljuskänsligt. Ljus exponering bör undvikas. Koncentrationen av DCF-DA och färgning tiden kan justeras beroende på cellen. - Ta bort odlingsmedium noggrant från 15 mL koniska röret och tillsätt 1 mL av nylagade DCF-DA färgning medium. Noggrant Omsuspendera cellpelleten och inkubera det vid 37 ° C i 30 min i mörker. Inkludera en icke-färgade prov som en negativ färgning kontroll.
Obs: Prolifererande celler inte färgas med DCF-DA bör förberedas som en negativ kontroll. - Samla in cellerna genom centrifugering vid 500 x g i 5 min och tvätta dem 1 x med 2 mL 1 x PBS. Omsuspendera cellerna med 1 mL 1 x PBS och överföra provet till lämpliga fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) tube.
-
Mäta den 2′, 7-Dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCF-DA) fluorescens signal med en flödescytometer utrustad med en lämplig laserkälla. Excitera proverna med blå laser (488 nm) och upptäcka den utsända fluorescensen med en 530 ± 30 nm detektor (FITC) använder en logaritmisk skala.
- Analysera icke-färgade negativ kontroll cellerna först. I en dot tomt framåt scatter (FSC) kontra side scatter (SSC), Välj levande celler med ett Usenets verktyg och eliminera döda celler och cellulära skräp.
Obs: Cell storlek ändringen bör övervakas noggrant i dot handlingen i FSC kontra SSC. Om storleken på de senescent cellerna ökas avsevärt, bör DCF-DA intensiteten jämföras i cellpopulationer av samma storlek efter gating i dot handlingen i FSC kontra SSC. - I ett singel-parameter histogram visar DCF-DA (488 nm) fluorescens på logaritmisk skala av x-axeln och antalet händelser (cell nummer) på den linjära skalan på y-axeln, justera spänningen av 488 nm laser att placera toppen från de icke-färgade cellerna på vänsterkanten.
- Analysera DCF-DA målat prover och registrera minst 10.000 händelser för varje prov. Förvärva genomsnittlig fluorescens värdet av varje prov med hjälp av analysprogrammet som är specifika för flödescytometer.
Obs: ROS mätningarna upprepas självständigt minst 3 x och medelvärdena ska beräknas från dessa resultat. Representant H-Ras-inducerad åldras resultaten visas i figur 2.
- Analysera icke-färgade negativ kontroll cellerna först. I en dot tomt framåt scatter (FSC) kontra side scatter (SSC), Välj levande celler med ett Usenets verktyg och eliminera döda celler och cellulära skräp.
4. beräkning IL-6 och IL-8 mRNA uttryck för åldras-associerade sekretoriska fenotyp analys med hjälp av en realtid polymeras-kedjereaktion
-
Total RNA förberedelse
- Plate 3 x 105 WI-38 celler på en 100 mm kultur skålen i DMEM innehållande 10% FBS och 1% penicillin/streptomycin och kultur dem vid 37 ° C i en vävnadskultur inkubator för 1 dag. Förbereda dubbla kulturer för varje tidpunkt.
- Inducera åldras genom att infektera cellerna med den H-RasV12 retrovirus som beskrivs i steg 1.
- 1 dag före skörden, tvätta cellerna 2 x med 1 x PBS, och tillsätt 3 mL DMEM utan FBS.
Obs: Detta steg utförs för att producera den luftkonditionerade medium som används för ELISA som beskrivs i steg 5. Serum svält kan inducera ett uttryck av IL-6 och IL-8 mRNA i vissa känsliga celler. Således bör den IL-6 och IL-8 mRNA uttryck i celler odlade med och utan serum svält jämföras initialt. Om serum svält framkallar betydande förändringar i uttrycket av IL-6 eller IL-8 mRNA, ska de total-RNA för qPCR och konditionerat mediet för ELISA beredas separat. - Samla in luftkonditionerade mediet från varje prov 24 h senare och lagra mediet vid-80 ° C för ELISA.
- Lossa cellerna genom att behandla dem med 1 mL 0,05% trypsin/EDTA-lösning och inaktivera trypsin genom att tillsätta 1 mL odlingsmedium som innehåller 10% FBS. Avgöra celltalet för normalisering av ELISA resultaten som beskrivs i steg 5. Skörda cellerna i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör genom centrifugering vid 500 x g i 5 min.
- Ta bort mediet genom skonsam sugkraft och tillsätt 1 mL RNA extraktionslösning. Sedan, vortex mikrocentrifug röret kraftigt i 15 s. Därefter tillsätt 200 µL av kloroform och kraftfullt vortex blandningen igen för ytterligare 15 s.
- Centrifugera provet rören vid 17 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Försiktigt överför sedan den övre fasen till ett nytt 1,5 mL mikrocentrifug rör.
Obs: Interphasen och den lägsta organiska fasen inte bör störas under överföringen av den övre fasen till en ny tub. - Tillsätt 400 µL av isopropanol fällningen RNA och blanda dem väl genom varsam inversion. Sedan, Inkubera röret i rumstemperatur i 10 min.
- Centrifugera röret vid 17 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Sedan Kassera supernatanten, noga med för att behålla RNA pelleten. Tvätta RNA genom att tillsätta 1 mL 75% etanol och Invertera röret 2 – 3 x. Centrifugera röret för 5 min vid 17 000 x g vid 4 ° C och kasta bort supernatanten.
- Torka RNA pelleten i rumstemperatur och upplösa RNA i 50 µL av dietyleter pyrocarbonate (DEPC)-behandlat destillerat vatten. Använder 1 µL RNA lösning, kvantifiera den totala RNA-koncentrationen med en spektrofotometer.
Obs: Overdrying minskar lösligheten hos RNA; därför undvika overdrying RNA.
-
cDNA förberedelse
- Förbereda omvänd-Transkription reaktionsblandningen för varje prov genom att lägga till följande i en tunna PCR-röret: 2 µg av total-RNA (justera volymen till 10 µL med RNase-fritt vatten), 2 µL 10 x RT buffert, 1 µL av en slumpmässig primer (50 pmol), 0.8 µL av 25 x dNTP mix (100 (mM), vatten 1 µL MMLV omvänt transkriptas (50 U/µL), och 5.2 µL RNase-gratis.
- Ställ in programmet omvänd Transkription reaktion på termocykel med följande villkor: 42 ° C i 60 min och 95 ° C i 5 min. plats PCR-rör i termocykel och starta programmet.
-
Realtid polymeras-kedjereaktion
- Förbereda den realtidsdata PCR master mix för alla reaktioner. Reaktionsblandningen för varje prov är följande: 25 µL av 2 x realtids PCR Master Mix, 1 µL varje framåt och bakåt primers för IL-6 och IL-8 och 21 µL ultrarent destillerat vatten (DNAS - och RNase-fri). Se tabell 1.
Obs: Förbereda realtids PCR-reaktionsblandningen för varje prov som innehåller aktin RNA primers som intern kontroll. GAPDH kan också användas som intern kontroll för normalisering. - Lägga till 48 µL av master mix och 2 µL av 3-faldig utspädning cDNA produkten med vatten till varje brunn i en 96 brunnar optiska qPCR-plattan. Utför varje reaktion i tre exemplar. Förbereda en kontrollbrunnen som inte innehåller mallen cDNA som PCR-kontroll.
- Ställ in programmet realtids PCR-reaktion på termocykel med följande villkor: 10 min vid 95 ° C, 40 cykler of15 s vid 95 ° C (denaturering), och 1 min vid 60 ° C (glödgning och förlängning).
- Utför realtids-PCR och registrera tröskelvärdet för cykel (CT) efter slutförandet av de PCR-cyklerna. Beräkna de mRNA nivåerna för IL-6 och IL-8 med 2- ΔΔCΤ Metod20.
Obs: Relativa fold förändringen i uttryck bestäms efter normalisering till aktin nivåer med hjälp av följande formel:
Faldig förändring = 2-Δ (ΔCT)
Här
ΔCT = CT, IL-6 och IL-8- CT, aktin; och
Δ (ΔCT) = ΔCT, stimuleras- ΔCT, kontroll. - Beräkna medelvärdet för varje prov som dubbletter.
Obs: qPCR bör upprepas självständigt minst 3 x och medelvärdena ska beräknas baserat på dessa resultat. Representant H-Ras-inducerad åldras resultaten visas i figur 3. Serum svält kan inducera ett uttryck för den IL-6 och IL-8 mRNA i vissa känsliga celler. Således bör den IL-6 och IL-8 mRNA uttryck i celler odlade med och utan serum svält jämföras initialt. Om serum svält framkallar betydande förändringar i uttrycket av IL-6 och IL-8 mRNA, ska de total-RNA för qPCR och konditionerat mediet för ELISA beredas separat.
- Förbereda den realtidsdata PCR master mix för alla reaktioner. Reaktionsblandningen för varje prov är följande: 25 µL av 2 x realtids PCR Master Mix, 1 µL varje framåt och bakåt primers för IL-6 och IL-8 och 21 µL ultrarent destillerat vatten (DNAS - och RNase-fri). Se tabell 1.
5. kvantifiera nivåerna av utsöndrade IL-6 och IL-8 proteiner för en åldras-associerade sekretoriska fenotyp analys med hjälp av ELISA
- Tina den 3 mL luftkonditionerade medium skördas från senescent WI-38 celler som beskrivs i steg 4. Ta bort cellen skräp genom centrifugering vid 500 x g i 5 min.
- Koncentrera sig luftkonditionerade medium 10-faldig genom centrifugering vid 3 000 x g i 20 min med en centrifugal filterenhet.
Obs: Koncentrationen av konditionerat mediet inte nödvändigtvis bero på provtypen. -
Utföra ELISA med 50 µL av varje koncentrerad urval av luftkonditionerade medium med lämplig IL-6 och IL-8 ELISA kits.
Obs: Varje prov i två ELISA brunnar. Eftersom varje tidpunkt dupliceras i steg 4, tillåter denna analys oss att övervaka variationer både ELISA-testet och prov förberedelse teknik.- För ELISA plattan beläggning, späd den IL-6 och IL-8 antikropp med 1 x PBS till en koncentration av 0,5 µg/mL för IL-6 eller 0,125 µg/mL för IL-8. Tillsätt 100 µL utspätt antikroppar till varje brunn i ELISA-plattan. Försegla plattan med en ELISA-plattan tätning film och inkubera utan skakningar över natten i rumstemperatur.
- Ta bort antikropp lösningen genom aspiration. Tvätta varje väl 4 x med 300 µL av 1 x Tvättbuffert (0,05% Tween-20 i PBS). Tillsätt 300 µL blockerande buffert (1% BSA i PBS) till varje brunn. Odla i rumstemperatur för 1 h.
- Ta bort blockering lösningen genom aspiration. Tvätta varje väl 4 x med 300 µL av 1 x tvättbuffert. Förbereda seriellt utspädda ELISA standarder i en förtunningsbuffert (0,05% Tween-20 och 0,1% BSA i PBS) att generera en standardkurva.
Obs: Den seriella utspädningen för IL-6 är 31.25, 62,5, 125, 250, 500, 1 000 och 2 000 pg/mL. Den seriella utspädningen för IL-8 är 2.34, 4,69, 9,38, 18,75, 37,5, 75 och 150 pg/mL. - Tillsätt 100 µL standardlösning eller 100 µL av provlösningen (50 µL av koncentrerad medium med 50 µL förtunningsbuffert) till varje brunn. Inkubera brunnarna i rumstemperatur i 2 h.
- Ta bort standard eller prova lösningen genom aspiration. Tvätta varje väl 4 x med 300 µL av 1 x tvättbuffert. Späd detektionsantikropp med utspädning bufferten till en koncentration av 0,1 µg/mL för IL-6 eller 0,25 µg/mL för IL-8. Tillsätt 100 µL utspätt antikroppens per brunn. Inkubera brunnarna i rumstemperatur i 2 h.
- Ta bort antikropp lösningen genom aspiration. Tvätta varje väl 4 x med 300 µL av 1 x tvättbuffert. Späd streptividin-pepparrotsperoxidas (HRP) i utspädning bufferten till en koncentration av 0.05 µg/mL. Tillsätt 100 µL av streptividin-HRP lösning per brunn. Inkubera brunnarna i rumstemperatur i 30 min.
- Ta bort antikropp lösningen genom aspiration. Tvätta varje väl 4 x med 300 µL av 1 x tvättbuffert. Tillsätt 100 µL av 3, 3 ', 5, 5 '-tetrametylbensidin (TMB) substratlösningen i varje brunn. Inkubera brunnarna i rumstemperatur i 20 min till tillåta färgutveckling. Stoppa reaktionen genom att lägga till 100 µL av en 1 M HCl stopplösning.
- Läs absorbansen hos varje brunn med en ELISA-avläsare vid 450 nm.
- Rita standardkurvan för de genererade standarderna. Beräkna koncentrationerna av IL-6 och IL-8 i konditionerat medium enligt standard kurvorna. Rita resultaten efter en normalisering till cell räkningen. Beräkna de genomsnittliga värdena för dubbla prover.
Obs: ELISAs bör upprepas självständigt minst 3 x och medelvärdena ska beräknas baserat på dessa resultat (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett exempel på H-Ras-inducerad åldras visas i figur 1. En infektion i WI-38 normala mänskliga fibroblaster med den H-RasV12 retrovirus inducerad dramatiska morfologiska förändringar (figur 1B). Dessutom, som visas i figur 1 c, var SA β-gal färgning aktivitet anmärkningsvärt ökade på H-RasV12 uttryck. Mer än 70% av cellerna visade SA β-gal färgning aktivitet 6 d efter H-RasV12 retrovirus infektionen, som anger att ett uttryck för H-RasV12 framgångsrikt inducerar cellulära åldras i WI-38 celler, som vi och andra grupper rapporterade tidigare21 ,22.
Figur 2 visar representativa resultat av DCF-DA färgning analysen för att övervaka ROS nivåer under H-Ras-inducerad cellulära åldras. Ökade intracellulära ROS observeras så tidigt som 2 dagar efter uttrycket H-Ras och bibehålls fram till 6-dagars tidpunkt. Under tiden, induktion av SASP visar olika kinetik. Ökningar av mRNA nivåer av IL-6 och IL-8, representativa SASP faktorer, observeras från 4 dagar efter H-Ras uttryck och topp på 8-dagars tidpunkt (figur 3). Som illustreras i figur 4, visar de utsöndrade IL-6 och IL-8 nivåerna liknande ökningar, överensstämmer med realtids PCR-resultaten. Dessa resultat tyder på olika roller av ROS och SASP i induktion av cellulära åldras.
Figur 1 : Morfologiska förändringar och ökad SA β-gal färgning under H-Ras-inducerad åldras. (A) denna panel visar experimentella förfarandet för induktion av H-Ras-inducerad åldras i WI-38 celler. (B), SA β-gal färgning utfördes vid den angivna tidpunkten efter infektion av WI-38 celler med den H-RasV12 retrovirus; Här visas representativa bilder av SA β-gal färgningen. (C), SA β-gal-positiva celler räknades i tre oberoende experiment. Resultaten presenteras som medelvärden och felstaplar representera standardavvikelser (SD). P < 0,01, Student's t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Öka i intracellulära ROS nivåer under H-Ras-inducerad åldras. (A) WI-38 celler var infekterade med den H-Ras retrovirus och färgas med DCF-DA (50 µM) vid angivna punkter. DCF-DA fluorescens stödnivåer kvantifierades med hjälp av en flödescytometer. Representativa histogrammen för DCF-DA fluorescensintensiteten på 0 - och 6-d punkter visas. (B) representativa histogrammen för DCF-DA fluorescensintensiteten på 0 - och 6-dagars punkter ritas tillsammans för enklare jämförelse. (C) DCF-DA fluorescensintensiteten under H-Ras-inducerad åldras mättes vid angivna tiden pekar 3 x. Resultaten presenteras som medelvärden och felstaplar representera standardavvikelser (SD). P < 0,05 och ** P < 0,01, Student's t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Kvantifiering av SASP-relaterade mRNA under H-Ras-inducerad åldras. RNA var beredd från WI-38 celler vid angivna tidpunkter efter H-RasV12 retrovirus infektionen. Dessa paneler visar induktion av den (A) IL-6 och (B) IL-8 uttryck analyseras med qPCR med specifika primers som anges i tabell 1. Aktin mRNA nivåer användes för normalisering. Den normaliserade IL-6 eller IL-8 mRNA nivåer uppmätts i ett 0-dag prov sattes till 1 och relativa fold ändringarna beräknades. Experimenten var självständigt upprepade 3 x. Resultaten presenteras som medelvärden och felstaplarna visar standardavvikelser (SD). P < 0,05 och ** P < 0,01, Student's t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Kvantifiering av utsöndrade SASP faktorer under H-Ras-inducerad åldras. Dessa paneler visar standard kurvor genererade med IL-6 (A) och IL-8 (C) standarder. Konditionerat media skördades från WI-38 celler vid angivna tidpunkter efter H-RasV12 retrovirus infektion. De utsöndrade IL-6 (B) och IL-8 nivåer (D) analyserades med en IL-6 och IL-8 ELISA kit, respektive. Experimenten var självständigt upprepade 3 x. Resultaten presenteras som medelvärden och felstaplarna visar standardavvikelser (SD). P < 0,05 och ** P < 0,01, Student's t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Gen namn | Forward primer | Reverse primer |
| IL-6 | 5'-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3' | 5'-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3' |
| IL-8 | 5'-ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3' | 5'-AACCCTCTGCACCCAGTTTTC-3' |
| aktin | 5'-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3' | 5'-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3' |
Tabell 1: Realtids-PCR primers för SASP faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här har vi presenterat metoder för att övervaka intracellulära ROS nivåer under H-Ras-inducerad åldras i WI-38 normala mänskliga fibroblaster. Intracellulära ROS nivåer i levande celler kan mätas kvantitativt med hjälp av cell-permeable reagensen DCF-DA och flödescytometri. På cellernas upptag, DCF-DA deacetylated av intracellulära esteraser och därefter oxideras av ROS bildar starkt fluorescerande 2', 7'-dichlorofluorescein (DCF). DCF fluorescens kan upptäckas av flödescytometri med en FL1 detektor (grön fluorescens). Med metoden DCF-DA färgning, upptäckt vi framgångsrikt en ökning i ROS nivåer under H-Ras-inducerad cellulära åldras i WI-38 normala mänskliga fibroblaster. Denna metod kan användas i olika modeller av cellulära åldras för att övervaka förändringar i ROS nivåer. Utöver DCF-DA omfatta färgning, ytterligare metoder som har använts för att mäta ROS induktion övervakning av oxiderade proteiner23 och en konfokalmikroskopi analys med ROS-beroende fluorescerande färger24. Ytterligare är bekräftelse av förändringar i ROS nivåer med ytterligare metoder således önskvärt.
Nyligen har visat vi att ROS nivåerna ökar i cancerceller under p53-inducerade åldras samt H-Ras-inducerad åldras21. Ökade intracellulära ROS nivåer är observerbara före ökningen SA β-gal färgning aktivitet, vilket tyder på ROS orsakande roll i induktion av cellulära åldras. Intressant är styrs ökningen av ROS nivåer separat den Akt-NF-κB-NOX4 vägen, medan cellcykelarrest medieras av p2121. Om Akt också reglerar ROS ökningen i andra typer av cellulära åldras skulle vara intressant att utforska.
Vi har också infört metoder för att analysera mRNA och utsöndras proteinnivåer SASP faktorer IL-6 och IL-8 under H-Ras-inducerad åldras. Med hjälp av qPCR, kvantifieras vi induktion av IL-6 och IL-8 mRNA i senescent WI-38 celler. Vi undersökte aktin mRNA nivåer som intern kontroll för normalisering, men GAPDH mRNA kan också användas som intern kontroll. 18S ribosomal RNA (rRNA) är en annan städning gen som ofta används som intern kontroll i qPCR experiment. Eftersom rRNA transkription och Ribosomen mognad regleras under cellcykelarrest och cellulära åldras25,26, kan 18S rRNA dock inte en god intern kontroll för cellulära åldras studier. ELISA, använder ett konditionerat medium från senescent WI-38 celler, visade liknande ökar i utsöndrade IL-6 och IL-8 nivåer. Överensstämmer med uppfattningen att SASP är utvecklad på ”mogna” åldras etapp19, ökningar av IL-6 och IL-8 sekretion kan påvisas vid en senare tidpunkt än ökningen av ROS nivåer. Noterbart varierar SASP faktorer beroende på celltyper och åldras induktion villkor27. De lämpliga SASP faktorerna bör därför väljas enligt cellulära åldras modellen.
Även om vi bekräftat H-Ras-inducerad åldras genom att övervaka morfologiska förändringar och induktion av SA β-gal färgning aktivitet, cellulära åldras bör kontrolleras ytterligare av övervakning ytterligare åldras egenskaper, inbegripet den irreversibel förlust av spridning potential, åldras-associerade Heterokromatin foci (SAHF), SASP faktorer, aktivering av tumören dämpning som p53 och p16INK4a, förbättrade DNA skador signaler och ihållande nukleära foci, definierat som DNA-segment med kromatin förändringar förstärka åldras (DNA-ärr). Det är dock viktigt att komma ihåg att det finns en heterogenitet åldras egenskaper i olika åldras typer. Vissa åldras biomarkörer kan vara observerbara endast i vissa specifika typer av cellulära åldras. SAHF märks till exempel vanligtvis i OIS28,29.
Cellulära åldras ansågs initialt att representera autonoma tillväxt gripandet orsakas av konstgjorda odlingsbetingelser. Studier i senaste halvseklet har dock visat vikten av cellulära åldras under olika patofysiologiska förhållanden, inklusive åldrande och cancer. Orsakssambandet mellan cellulärt åldrande och åldersrelaterade vävnad försämring har visat tidigare i BubR1 progeroid mus modeller30,31. Således anses styr cellen åldras genom antingen elimineringen av senescent celler eller moduleringen av SASP för närvarande som en lovande strategi för åldersrelaterade sjukdomar. Ja, senaste studier visat att elimineringen av senescent celler skulle vara en lovande behandling för åldersrelaterade sjukdomar inklusive stamceller utarmning, benförlust, håravfall och artros32,33, 34,35,36. En djupare förståelse av de molekylära mekanismerna som åldras induktion och åldras fenotyper, inklusive SASPs, kommer att ge bättre strategier för inriktning åldras genom att minska möjliga nackdelar och selektivt inriktning endast skadliga funktioner av senescent celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete var stöds av ett bidrag från den National Research Foundation of Korea (2015R1D1A1A01060839) (till ung Yeon Kim) och National Research Foundation i Korea (NRF) bidrag finansieras av Korea regeringen (MSIT) (nr 2016R1A2B2008887, Nr. 2016R1A5A2007009) (till Jeanho Yun).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| BOSC 23 | ATCC | CRL-11269 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| pBabe puro-H-RasV12 | Addgene | 1768 | |
| pGAG/pol | Addgene | 14887 | |
| pVSVG | Addgene | 1733 | |
| Turbofect | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/mL |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/mL |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| DCF-DA | Sigma-Aldrich | D6883 | 10 mM |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| MMLV Reverse transcriptase | Promega | M1701 | |
| SYBR Green PCR master 2x mix | Takara | PR820A | |
| Random Primer | Promega | C118A | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Human IL-6 ELISA assay | PeproTech | #900-TM16 | |
| Human IL-8 ELISA assay | PeproTech | #900_TM18 | |
| EQUIPMENTS | |||
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| Parafilm | BEMIS | PM-996 | |
| Microscope | NIKON | TS100 | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | LSR Fortessa | |
| Amicon Ultra-4ml | Merk Millipore | UFC800324 | |
| NanoDrop spectrophotometer | BioDrop | 80-3006-61 | |
| Real-time PCR System | Applied Biosystems | ABI Prism 7500 | |
| ELISA Reader | Molecular Devices | EMax microplate reader |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
- Braig, M., et al. Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development. Nature. 436 (7051), 660-665 (2005).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Collado, M., et al. Tumour biology: senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642 (2005).
- Malaquin, N., Martinez, A., Rodier, F. Keeping the senescence secretome under control: Molecular reins on the senescence-associated secretory phenotype. Experimental Gerontology. 82, 39-49 (2016).
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S.
- Lu, T., Finkel, T.
- Furumoto, K., Inoue, E., Nagao, N., Hiyama, E., Miwa, N. Age-dependent telomere shortening is slowed down by enrichment of intracellular vitamin C via suppression of oxidative stress. Life Sciences. 63 (11), 935-948 (1998).
- Lee, A. C., et al. Ras proteins induce senescence by altering the intracellular levels of reactive oxygen species. The Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 7936-7940 (1999).
- Chen, Q., Ames, B. N. Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).
- Dumont, P., et al. Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast. Free Radical Biology & Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).
- Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
- Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).
- Rodier, F., Campisi, J.
- Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).
- Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).
- van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kim, Y. Y., et al. Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence. Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).
- Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a. Cell. 88 (5), 593-602 (1997).
- Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).
- Wojtala, A., et al. Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).
- Duncan, F. E., et al. Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte. Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).
- Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence. Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).
- Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Kosar, M., et al. Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a). Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).
- Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
- Baker, D. J., et al. Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency. Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
- Farr, J. N., et al. Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice. Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).
- Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
- Yosef, R., et al. Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL. Nature Communications. 7, 11190 (2016).
- Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
