Summary
세포내 선생님 세포 노화의 유도에 중요 한 역할을 보여줘 왔다. 여기, 우리는 세포 노화 중 선생님 수준 측정을 위한 중요 한 분석 결과 설명 합니다. 우리는 또한 노화 관련 분 비 표현 형, 다양 한 연령과 관련 된 장애에 기여 하는 보도 평가 하기 위한 프로토콜을 제공 합니다.
Abstract
세포 노화 증식 능력 또는 다양 한 스트레스에 노출의 고갈에 따라 돌이킬 수 없는 성장 검거의 상태를 고려 하고있다. 최근 연구 개발, 상처 치유, 면역 감시 및 연령 관련 조직 장애를 포함 하 여 다양 한 생리 적 프로세스를 세포 노화의 역할을 확대 했습니다. 세포 주기 검거 세포 노화의 중요 한 특징은, 증가 된 세포내 반응 산소 종 (선생님) 생산 또한 세포 노화의 유도에 중요 한 역할을 증명 되었습니다. 또한, 최근 연구는 노화 세포 인접 세포와 노화 관련 분 비 형 (SASP)를 통해 조직에 강력한 paracrine 활동 전시 밝혔다. 세포 노화에 대 한 치료 전략에 대 한 관심이 급상승 노화 메커니즘, 세포내 선생님 등은 SASP의 정확한 이해를 위한 필요를 강조 한다. 여기, 우리는 양적 h 조-Ras-유도 세포 노화 선생님-민감한 형광 염료와 cytometry 사용 하 여 동안 세포내 선생님 레벨을 평가 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 또한, mRNA 식의 유도 및 SASP 요인의 분 비의 분석을 위한 중요 한 기술을 소개합니다. 이러한 프로토콜은 다양 한 세포 노화 모델에 적용할 수 있습니다.
Introduction
50 년 이상 전, Hayflick와 무어 헤드 정상 세포 세포 분열1의 특정 번호 후 그들의 증식 잠재력의 고갈에 돌이킬 수 없는 성장 검거 입력 밝혔다. 이 현상은 이제 일차 노화 라고 고 organismal 노화2와 강하게 상관 하기 위하여 믿어진다. Telomeres의 점진적 침식 일차 노화의 주요 원인으로 간주 됩니다, 하지만 DNA 손상, 종양 활성화 및 산화 스트레스 등 다양 한 세포 스트레스 보고 되었습니다 다른 유형의 세포 노화를 유도 "조기 노화" 또는 "-스트레스로 노화" 라고합니다. 흥미롭게도, 조기 노화는 h 조-Ras와 BRAF oncogenes의 활성화에 따라 강력한 종양 진압 역할을 한다. 조직과 인간의 마우스 모델의 연구 생산 biomarkers 세포 노화의 종양 Ras와 BRAF 활성화 하지만에서 개발한 악성 암에 점감 되었다 premalignant 병 변에서 주로 존재 했다 강력한 증거 이러한 병 변3,,45. 노화 및 종양 억제의 역할을 넘어 세포 노화 상처 치유, 조직 복구, 면역 감시, 그리고 배아 개발6을 포함 하 여 다양 한 생리 적 과정에 역할을 이전 연구에 표시 되었습니다.
성장 검거 세포 노화7의 특징으로 광범위 하 게 공부 하고있다, 비록 증거의 중요 한 신체는 세포 반응성 산소 종 (선생님)도 세포 노화8에 기여 나왔다. 세포 노화, 일차 노화 및 노화 (OIS), oncogene 유도 포함 하 여 다양 한 유형의 동안 선생님 수준 상승 수십 년 전 원래 알려졌다9,10. 더 직접, H2O2 의 sublethal 복용량 exogenous 치료 노화11,12유도합니다. SOD1, 같은 선생님 청소 효소의 금지는 또한 조기 노화13발생합니다. 반면, 주변 산소 조건 낮은 선생님 청소 지연 노화10,,1415의 발병을 증가 하 고. 이러한 결과 의심할 여 지 없이 선생님은 중요 한 중재자 또는 세포 노화 유도의 결정 요인 다는 것을 나타냅니다. 그러나, 선생님 세포 노화와 세포 노화 중 선생님 레벨은 상승 하는 어떻게의 유도에 기여 하는 방법 조사 더 필요 합니다.
최근 연구는 노화 세포는 인접 세포와 SASP16,17를 통해 조직에 강력한 paracrine 활동 계시 했다. 세 조직에 노화 세포를 증식 세포의 자치 고갈 뿐만 아니라 SASP 통해 많은 경로 연령 관련 조직 장애를 통해 홍보. 다양 한 proinflammatory 요인, 일리노이-6와 같은 일리노이-8, TGFβ, 그리고 매트릭스 metalloproteinases (MMPs), 노화 세포에 의해 분 비 원인이 조직의 항상성, 조직 구조의 파괴의 장애를 통해 나이 관련 조직 장애 인접 셀과 살 균 염증18,19의 노화. 그러나, SASPs는 생물학 컨텍스트에 따라 유익한 효과 가질 수 있습니다. 또한, SASPs의 heterogenetic 자연 노화 세포 유형과 더 연구19에 대 한 필요성을 강조 셀 단계에 따라 달라 집니다.
여기, OIS 동안 세포내 ROS 수준을 평가 하기 위한, 빠르고 민감한 cytometry 기반 기술을 설명 합니다. 또한, 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)와 ELISA를 사용 하 여 SASP 요인의 분석에 대 한 방법은 소개 했다.
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Protocol
1. 노 쇠를 Oncogene 유도 유도
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준비는 H-RasV12 레트로 바이러스
- 실 온에서 0.001% 폴 리-L-리 신/인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 5 분의 2 개 mL를 추가 하 여 100 mm 문화 접시 코트.
- 진공에 연결 하는 유리 피 펫을 사용 하 여 폴 리-L-리 신 솔루션을 제거 하 고 1 x PBS의 2 개 mL를 추가 하 여 문화 접시를 세척.
- 접시 3 x 106 ecotropic BOSC 23 포장 코팅 문화 접시와 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 1% 페니실린/스, 전지와 CO2 조직 문화에서 37 ° C에서 문화 1 d 인큐베이터입니다.
- 다음 날, transfect retroviral 포장 DNA (pGAG/폴의 2 µ g과 pVSVG의 0.25 µ g) 함께 pBabe 순수 하지 않아-H-RasV12 DNA의 2 µ g transfection 시 약을 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 8 h에 대 한.
- Transfection 미디어를 제거 하 고 신선한 미디어의 8 mL를 추가 합니다.
- 48 h 후 바이러스 성 입자를 포함 하는 미디어를 수집 하 고 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리 하 여 어떤 세포질 파편을 제거 합니다.
- 0.45 μ m 주사기 필터와 h 조-Ras 바이러스 포함 된 미디어를 필터링 합니다.
참고: 어떤 및 효율적인 바이러스 감염에 대 한 바이러스 supernatants의 해빙 하지 마십시오. 최고의 효율을 얻기 위해 바이러스 감염으로 같은 날에 수확 했다를 사용 하 여.
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H-RasV12 레트로 바이러스의 감염 WI-38 정상적인 인간의 fibroblasts
- 10 %FBS 1% 페니실린/스 1 d H RasV12 레트로 바이러스를 수확 하기 전에 포함 된 DMEM 5 x 104 WI-38 셀 60 m m 문화 접시에 접시와 37 ° c.에 1 일에 대 한 문화
- 다음 날 성장 매체를 제거 하 고 H-RasV12 레트로 바이러스 미디어의 1 mL을 추가. Polybrene 재고 솔루션 (증류수에 8 mg/mL)의 2 µ L을 포함 하는 성장 매체의 추가 1 mL를 추가 합니다. 습도 37 ℃, 5% CO2 조직 문화 인큐베이터에에서 1 일에 대 한 샘플을 품 어.
- H RasV12 레트로 바이러스 혼합 후 24 h를 제거 하 고 씻어 셀 2 x 1 x PBS. 성장 매체를 추가 하 고 습도 37 ℃, 5% CO2 조직 문화 인큐베이터에에서 2 일 동안 puromycin의 2 µ g/mL로 세포를 치료.
- Puromycin 선택의 2 d, 후 성장 매체를 제거 하 고 씻어 셀 2 x 1 x PBS. 성장 매체를 추가 하 고 셀 습도 37 ℃, 5% CO2 배양 기 전 까지는 지정 된 시간 ( 그림 1A 는 회로도 참조)에 문화.
2. 모니터링 노화 관련 된 β-galactosidase 통해 노화 얼룩
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다음 재고 솔루션을 준비 합니다.
- 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) 디 메 틸 formamide (DMF)에서 20 mg/mL를 준비 합니다. -20 ° c.에 솔루션 저장
- (126 m m) 나2HPO4.7H2O 3.377 g을 용 해 하 여 연산/나트륨 인산 염 버퍼를 준비와 연산 (36.8 m m) 100 mL의 증류수의 0.708 g. 필요한 경우 6.0, pH를 조정 합니다.
- 0.5 M 칼륨 ferrocyanide 준비. 4 ° c.에 어둠 속에서 솔루션을 저장
- 0.5 M 칼륨 ferricyanide 준비. 4 ° c.에 어둠 속에서 솔루션을 저장
참고: 노화 관련 된 β-galactosidase (SA β-gal) 얼룩 솔루션의 pH는 정확한 결과 위해 중요 한.
- 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5mm 칼륨 ferrocyanide, 5 mM 칼륨 ferricyanide, 20% (v/v) 연산/나트륨 인산 염 버퍼, 그리고 1 mg/mL의 X 재고 솔루션을 diluting 하 여 신선한 SA β-gal 얼룩 솔루션을 확인 합니다.
- 문화 미디어를 제거 하 고 세척 셀 1 x 1 x PBS. 실 온에서 5 분 동안 3% 포름알데히드와 셀을 수정 합니다.
참고: 셀 하지는 레트로 바이러스와 함께 감염 되는 부정적인 컨트롤으로 사용 한다. 감염된 제어 셀 proliferating 그들의 상태를 유지 하기 위해 passaged를 계속 해야 합니다. - 셀에서 고정 솔루션을 제거 하 고 1 x PBS로 그들을 씻어. 추가 갓 1 x SA β-gal 얼룩 솔루션 (1.5 mL 60mm 문화 접시에서)을 준비 합니다. 건조를 방지 하 고 37 ° c.에 24 h에 대 한 그것을 품 어 파라핀 영화와 함께 요리를 봉인 또는, 습도 챔버에 함께 요리를 품 어.
참고: 통 솔루션 3% 포름알데히드를 포함 해야 합니다 수 삭제의 유해 폐기물로. CO2 없이 인큐베이터는 인큐베이션 기간 동안 pH 변화를 방지 하는 것 이다. - 다음 날;에 현미경으로 세포의 착 색 상태를 확인 SA β-gal-긍정적인 세포 perinuclear 지역에 파란색 표시 됩니다.
참고: proliferating 제어 셀 SA β-gal-긍정적인 세포의 낮은 주파수 표시. 경우는 얼룩 빛, 계속 약간 더 긴 기간 동안 보육 (대표 예 그림 1B 를 참조). - CCD 카메라는 10 배 또는 큰 렌즈를 사용 하 여 SA β-gal 얼룩 이미지를 취득 합니다. 충분 한 수 착 색 비율을 계산 하는 이미지의 캡처 (> 200 셀).
- 셀의 총 수를 기준으로 SA β-gal-긍정적인 세포 수를 측정 하 여 SA β-gal 얼룩진 셀의 비율을 계산 합니다.
참고: SA β-gal 얼룩 한다 반복 하지 독립적으로 적어도 3 배, 그리고 평균값 계산 해야 기반 복제 실험 (그림 1 C)의 결과에. 적절 한 셀 밀도 SA β-gal 얼룩 실험을 위해 중요 하다. 높은 confluency 노화 관련 형태에 변화를 방해 하 고 유도 제어 셀에 긍정 신호 수 있습니다.
3. 측정 h 조-Ras-유도 노화 중 반응성 산소 종 유도
- 플레이트 2 x 105 WI-38 세포 60 m m 문화에 요리 하 고 1 단계에서 설명한 대로 h 조-Ras-유도 노화를 자극.
참고:이 프로토콜은 다른 유형의 세포 노화 모델에 적용할 수 있습니다. - 표시 된 시간 시점 (2, 4, 또는 6 일), 성장 매체를 제거 하 고 씻어 1 x PBS와 셀. 0.05 %trypsin / EDTA 용액 1 mL와 함께 그들을 치료 하 여 세포를 분리 하 고 10%를 포함 하는 성장 매체의 1 mL을 추가 하 여는 트립 신을 비활성화 FBS. 셀 수를 결정 합니다.
- 15 mL 원뿔 튜브로 1 x 105 셀을 전송 하 고 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리 하 여 세포를 수집 합니다.
- 신선한 2', 7'-dichlorofluorescin diacetate (DCF-다) 얼룩 미디어 문화 매체 (DCF 다의 작업 농도 50 µ M)의 10 mL를 10mm DCF 다 50 µ L을 추가 하 여 준비 합니다.
참고: DCF 다 빛에 민감한입니다. 빛의 노출은 피해 야 한다. 얼룩 시간과 DCF 다의 농도 세포 유형에 따라 조정할 수 있습니다. - 15 mL 원뿔 튜브에서 성장 매체를 신중 하 게 제거 하 고 갓된 DCF 다 얼룩 매체의 1 mL를 추가 합니다. 조심 스럽게 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 어둠 속에서 30 분 동안 37 ° C에서 품 어. 부정적인 얼룩 제어로 얼룩진 비 샘플을 포함 합니다.
참고: DCF 다 하지 물 확산 셀 부정적인 제어로 준비 한다. - 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리 하 여 세포를 수집 하 고 그들을 씻어 1 x 1 x PBS의 2 mL. 1 x PBS의 1 mL로 세포를 resuspend 하 고 적절 한 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 튜브 샘플을 전송.
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2 ', 7 '-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-다) 형광 신호 교류 cytometer 갖춘 적절 한 레이저 소스를 사용 하 여 측정 합니다. 블루 레이저 샘플을 자극 (488 nm) 530 ± 30 nm 검출기 (FITC) 로그 눈금을 사용 하 여 내보낸된 형광을 검출 하 고.
- 먼저 비 스테인드 부정적인 제어 셀을 분석 합니다. 측면 살포 (SSC) 대 앞으로 분산형 (FSC)의 점 플롯에서 제어 도구를 사용 하 여 라이브 셀을 선택 하 고 죽은 세포 및 세포 잔해 제거.
참고: 셀 크기 변경 해야 신중 하 게 모니터링 FSC 대 SSC의 도트 음모에. 노화 세포의 크기가 크게 증가 하는 경우에, FSC 대 SSC의 도트 음모에서 게이팅 후 DCF 다 강도 같은 크기의 세포 인구에 비교 한다. - DCF 다 표시 하는 단일 매개 변수 히스토그램에서 (488 nm) x의 로그 눈금에 형광-축과 y의 선형 눈금에 이벤트 (휴대폰 번호) 수-축에서 피크를 488 nm 레이저의 전압 조정 왼쪽 가장자리-스테인드 셀.
- DCF 다 스테인드 샘플 및 각 샘플에 대 한 기록 이상 10000 이벤트를 분석 합니다. 특정 흐름 cytometer 분석 소프트웨어를 사용 하 여 각 샘플의 평균 형광 값을 취득 합니다.
참고: 선생님 측정 한다 반복 하지 독립적으로 적어도 3 배, 그리고 평균 값이 결과에서 계산 해야 합니다. 대표 h 조-Ras-유도 노화 결과 그림 2에 표시 됩니다.
- 먼저 비 스테인드 부정적인 제어 셀을 분석 합니다. 측면 살포 (SSC) 대 앞으로 분산형 (FSC)의 점 플롯에서 제어 도구를 사용 하 여 라이브 셀을 선택 하 고 죽은 세포 및 세포 잔해 제거.
4. Quantifying 일리노이-6와 노화 관련 분 비 표현 형 분석을 사용 하 여 실시간 중 합 효소 연쇄 반응에 대 한 IL-8 mRNA 식
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총 RNA 준비
- 100 m m 문화에 접시 3 x 105 부-38 세포 10 %FBS 1% 페니실린/스, 포함 된 DMEM에 요리 하 고 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 문화를 1 일. 각 시간 지점에 대 한 중복 문화를 준비 합니다.
- H-RasV12 레트로 바이러스 1 단계에서 설명한 대로 셀을 감염에 의해 노화를 유도.
- 수확 하기 전에 1 일에서 씻어 셀 2 x 1 x PBS, FBS 없이 DMEM의 3 mL를 추가.
참고:이 단계는 ELISA 단계 5에서에서 설명한 대로 사용 조건된 매체를 생산 하기 위해 실시 됩니다. 혈 청 기아 수 있습니다 일부 민감한 세포에 일리노이-6와 IL-8 mRNAs의 식을 유도 하 고 있다. 따라서, 일리노이-6와 IL-8 mRNA 식 세포와 혈 청 기아 없이 경작 한다 비교 처음. 경우 혈 청 기아 6 IL 또는 IL-8 mRNA의 표현에 상당한 변화를 유도, 정량에 대 한 총 RNA와 ELISA에 대 한 바른된 매체 대비해 야 별도로. - 나중 각 샘플 24 h 조건된 매체를 수집 하 고 ELISA-80 ° C에서 매체 저장.
- 0.05 %trypsin / EDTA 용액 1 mL와 함께 그들을 치료 하 여 세포를 분리 하 고 10%를 포함 하는 성장 매체의 1 mL을 추가 하 여는 트립 신을 비활성화 FBS. 단계 5에서에서 설명한 대로 ELISA 결과의 정규화에 대 한 셀 수를 결정 합니다. 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리에 의해 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포를 수확.
- 부드러운 흡입에 의해 매체를 제거 하 고 RNA 추출 솔루션의 1 mL를 추가 합니다. 다음, 소용돌이 15 microcentrifuge 튜브를 적극적으로 s. 그 후, 클로 프롬 및 적극적으로 소용돌이 다시 추가 15에 대 한 혼합물의 200 µ L을 추가 s.
- 4 ° c.에서 10 분 동안 17000 x g 에서 샘플 튜브를 원심 그럼, 신중 하 게 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브 상단 단계 전송.
참고:은 interphase 및 낮은 유기 단계 한다 교란 되지 새 튜브를 상위 단계의 전송 중. - 소 프로 파 놀 RNA 침전 하 여 부드러운 반전에 의해 잘 그들을 혼합의 400 µ L를 추가 합니다. 그런 다음, 10 분 동안 실내 온도에 튜브를 품 어.
- 17000 x g 4 ° c.에서 10 분 동안에 관을 원심 그런 다음 RNA 펠 릿을 유지 하도록 상쾌한을 삭제 합니다. 75% 에탄올의 1 mL을 추가 하 여 RNA를 세척 하 고 반전 튜브 2-3 배. 17000 x g 4 ° C에서 5 분에 대 한 튜브 원심 및 삭제는 상쾌한.
- 실 온에서 RNA 펠 릿 건조 하 고 diethyl pyrocarbonate (DEPC)의 50 µ L에서 RNA를 분해-증류수를 취급. RNA의 1 µ L를 사용 하는 분 광 광도 계와 총 RNA 농도 계량.
참고: RNA;의 용 해도 감소 시킬 것 이다 Overdrying 따라서, RNA를 overdrying 하지 마십시오.
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cDNA 준비
- 얇은-벽으로 PCR 튜브에 다음을 추가 하 여 각 샘플에 대 한 반전 녹음 방송 반응 혼합물 준비: 총 RNA의 2 µ g (RNase 무료 물으로 10 µ L 볼륨 조정), RT 버퍼, 무작위 뇌관 (50 pmol), 25 x dNTP 믹스 (100의 0.8 µ L의 1 µ L x 10의 2 µ L mM), MMLV 역전사 (50 U / µ L)의 1 µ L와 5.2 µ L의 RNase 무료 물.
- 다음 조건 열 cycler에 반전 녹음 방송 반응 프로그램 설정: 42 ° C 60 분 동안 95 ° C 5 분 장소는 PCR에 대 한 열 cycler에 시작 프로그램 관.
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실시간 중 합 효소 연쇄 반응
- 모든 반응에 대 한 실시간 PCR 마스터 믹스를 준비 합니다. 각 샘플에 대 한 반응 혼합물은 다음과 같습니다: 실시간 PCR 주인 혼합, 1 µ L 각 6 IL 또는 IL-8에 대 한 정방향 및 역방향 뇌관의 및 매우 순수한 증류수 (DNase 및 RNase 프리)의 21 µ L x 2의 25 µ L. 표 1을 참조 하십시오.
참고: 내부 통제로 걸 RNA 뇌관을 포함 하는 각 샘플에 대 한 실시간 PCR 반응 혼합물을 준비 합니다. GAPDH는 정규화에 대 한 내부 컨트롤로 사용할 수 있습니다. - 96-잘 광 정량 접시에 각 잘을 48 µ L 마스터 믹스와 2 µ L의 물으로 3 희석된 cDNA 제품을 추가 합니다. 3 중 각 반응을 수행 합니다. PCR 컨트롤로 cDNA 서식 파일을 포함 하지 않는 컨트롤 잘 준비 합니다.
- 다음 조건 열 cycler에 실시간 PCR 반응 프로그램 설정: 95 ° C, 40 사이클 of15 s 95 ° c (변성), 그리고 (어 닐 링 및 확장) 60 ° C에서 1 분에서 10 분.
- 실시간 PCR을 수행 하 고 PCR 주기 완료 후 임계값 주기 (CT) 값을 기록 합니다. 일리노이-6 또는 IL-8 2-ΔΔCΤ 메서드가20을 사용 하 여 mRNA 레벨을 계산 합니다.
참고 다음 수식을 사용 하 여 말라 수준의 정규화 후 식에 상대 배 변화 결정 됩니다.:
접어 변화 2-Δ (ΔCT)를 =
여기,
ΔCT = CT, 일리노이-6 또는 IL-8-CT, 말라; 그리고
Δ (ΔCT) =T, 자극ΔC-ΔCT, 제어. - 각 중복 된 샘플에 대 한 평균 값을 계산 합니다.
참고: 정량 한다 반복 하지 독립적으로 적어도 3 배, 그리고 평균값 계산 해야 기반으로 이러한 결과에. 대표 h 조-Ras-유도 노화 결과 그림 3에 나와 있습니다. 혈 청 기아 수 있습니다 일부 민감한 세포에 일리노이-6와 IL-8 mRNAs의 식을 유도 하 고 있다. 따라서, 일리노이-6와 IL-8 mRNA 식 세포와 혈 청 기아 없이 경작 한다 비교 처음. 경우 혈 청 기아 6 IL 또는 IL-8 mRNA의 표현에 상당한 변화를 유도, 정량에 대 한 총 RNA와 ELISA에 대 한 바른된 매체 대비해 야 별도로.
- 모든 반응에 대 한 실시간 PCR 마스터 믹스를 준비 합니다. 각 샘플에 대 한 반응 혼합물은 다음과 같습니다: 실시간 PCR 주인 혼합, 1 µ L 각 6 IL 또는 IL-8에 대 한 정방향 및 역방향 뇌관의 및 매우 순수한 증류수 (DNase 및 RNase 프리)의 21 µ L x 2의 25 µ L. 표 1을 참조 하십시오.
5. 분 비 형 노화 관련 분석 ELISA를 사용 하 여 분 비 하는 일리노이-6와 IL-8 단백질의 레벨 측정
- 4 단계에서 설명한 대로 재개 조건된 매체의 3 mL 노화 WI-38 셀에서 수확. 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리에 의해 세포 파편을 제거 합니다.
- 10 배 조절된 매체를 집중 원심 필터 단위를 사용 하 여 20 분 동안 3000 x g 에서 원심 분리 하 여.
참고: 조절된 매체의 농도 샘플 형식에 반드시 의존 하지 않을 수 있습니다. -
조건 화 된 매체의 집중된 각 샘플의 50 µ L를 사용 하 여 적절 한 일리노이-6와 IL-8 ELISA 키트와 ELISA를 수행 합니다.
참고: 두 개의 ELISA 우물에 각 샘플을 테스트 합니다. 각 시간 지점 복제 되므로 4 단계에서이 분석 ELISA 분석 결과 샘플 준비 기술 모니터링을 우리가 있습니다.- ELISA 플레이트 코팅에 대 한 희석 IL 6 또는 1 x PBS 0.5 µ g/mL의 농도를 가진 항 체 IL-8 일리노이-6 또는 0.125 µ g/mL에 대 한 IL-8. ELISA 격판덮개의 각 음에 희석된 항 체의 100 µ L를 추가 합니다. 필름을 밀봉 하는 ELISA 플레이트와 플레이트를 봉인 하 고 실 온에서 하룻밤 동요 없이 품 어.
- 포부에 의해 항 체 솔루션을 제거 합니다. 워시 워시 버퍼 x 1의 300 µ L 각 잘 4 x (0.05 %PBS 트윈-20). 각 잘을 블로킹 버퍼 (PBS에 1 %BSA)의 300 µ L를 추가 합니다. 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어.
- 포부에 의해 차단 솔루션을 제거 합니다. 워시 워시 버퍼 x 1의 300 µ L 각 잘 4 x. 표준 곡선을 생성 하기 위해 순차적으로 희석된 ELISA 희석 버퍼 (0.05% 트윈-20 및 0.1 %BSA PBS)에서 표준을 준비 합니다.
참고: 일리노이-6에 대 한 직렬 희석은 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1000, 및 2000 pg/mL. IL-8에 대 한 직렬 희석 2.34, 4.69, 9.38, 18.75, 37.5, 75, 및 150 pg/mL 이다. - 각 잘을 100 µ L의 표준 솔루션 또는 샘플 솔루션 (µ 집중된 매체 50 L 희석 버퍼의 50 µ L) 100 µ L를 추가 합니다. 2 시간에 대 한 실 온에서 웰 스를 품 어.
- 열망 하 여 표준 또는 샘플 솔루션을 제거 합니다. 워시 워시 버퍼 x 1의 300 µ L 각 잘 4 x. IL-8에 대 한 IL 6 또는 0.25 µ g/ml 0.1 µ g/mL의 농도를 희석 버퍼와 탐지 항 체 희석. 잘 당 희석된 항 체의 100 µ L를 추가 합니다. 2 시간에 대 한 실 온에서 웰 스를 품 어.
- 포부에 의해 항 체 솔루션을 제거 합니다. 워시 워시 버퍼 x 1의 300 µ L 각 잘 4 x. 0.05 µ g/mL의 농도를 희석 버퍼 streptavidin 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)를 희석. 잘 당 streptavidin HRP 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 실내 온도에 우물을 품 어.
- 포부에 의해 항 체 솔루션을 제거 합니다. 워시 워시 버퍼 x 1의 300 µ L 각 잘 4 x. 3, 3, 5, 5 '-tetramethylbenzidine (TMB) 기판 솔루션을 각 영역 100 µ L를 추가 합니다. 색상 개발에 대 한 수 있도록 20 분 동안 실내 온도에 우물을 품 어. 1 M HCl 정지 솔루션의 100 µ L을 추가 하 여 반응을 중지 합니다.
- 450에서 ELISA 리더와 각의 흡 광도 읽고 nm.
- 생성 된 표준에 대 한 표준 곡선을 플롯. 표준 곡선에 따라 조건된 중간에 IL 6와 IL-8의 농도 계산 합니다. 세포 수를 정규화 한 후 결과 플롯 합니다. 중복 된 샘플에 대 한 평균 값을 계산 합니다.
참고: ELISAs 한다 반복 하지 독립적으로 적어도 3 배, 그리고 평균값 계산 해야 따라 이러한 결과 (그림 4)에.
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Representative Results
H 조-Ras-유도 노화의 예는 그림 1에 표시 됩니다. WI-38 정상적인 인간의 섬유 아 세포와 H-RasV12 레트로 바이러스의 감염 유도 극적인 형태 변화 (그림 1B). 또한, 그림 1C에서 같이, SA β-gal 얼룩 활동 H RasV12 식에 따라 현저 하 게 증가 되었다. 셀의 70% 이상 보여준 SA β-gal 활동 6 d H RasV12 레트로 바이러스 감염 후 얼룩, 우리와 다른 그룹 보고 이전21 H-RasV12의 식을 성공적으로 WI-38 세포, 세포 노화 유도 나타내는 22.
그림 2 h 조-Ras-유도 세포 노화 중 선생님 레벨을 모니터링 하기 위한 DCF 다 얼룩 분석의 대표적인 결과 보여 줍니다. 증가 시킨된 세포내 선생님 수준 h 조-Ras 식 후 2 일 관찰 하 고 6 일 시간 시점까지 유지 됩니다. 한편, 유도 SASP의 다른 활동을 보여줍니다. 일리노이-6의 mRNA 수준 향상, IL-8, 대표 SASP 요인 h 조-Ras 표현과 하루 8 시간 포인트 (그림 3)에 피크 후 4 일에서 관찰 된다. 그림 4에서 볼 수 있듯이 secreted 일리노이-6와 IL-8 레벨 표시 비슷한 증가, 실시간 PCR 결과와 일치 합니다. 이 결과 세포 노화의 유도에서 선생님과 SASP의 다른 역할을 건의 한다.
그림 1 : 형태 변화와 SA β-gal h 조-Ras-유도 노화 동안 얼룩에 증가. (A)이이 패널 WI-38 셀에서 h 조-Ras-유도 노화의 유도 대 한 실험 절차를 보여줍니다. H-RasV12 레트로 바이러스; WI-38 셀의 감염 후 지정 된 시간 시점에서 수행 되었다 (B) SA β-gal 얼룩 여기에, SA β-gal 얼룩의 대표 이미지는 표시 됩니다. (C) SA β-gal-긍정적인 세포는 3 개의 독립적인 실험에 포함 되었습니다. 결과 평균 값으로 제시 하 고 오차 막대를 나타내는 표준 편차 (SD). P < 0.01, 학생의 t-테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : H 조-Ras-유도 노화 동안 세포내 선생님 레벨 증가. (A)와 38 셀 h 조-Ras 레트로 바이러스에 감염 되었고 DCF-다 물 (50 µ M) 표시 시간 지점에서. DCF 다 형광 농도 교류 cytometer를 사용 하 여 정량 했다. 0-6-d 시간 포인트에서 DCF 다 형광 강도의 대표 히스토그램이 표시 됩니다. (B) 대표 히스토그램의 0-6-일 시간 포인트에서 DCF 다 형광 강도 쉽게 비교를 위해 함께 그려집니다. (C)는 DCF-다 형광 강도 h 조-Ras-유도 노화 중 지정 된 시간에 측정 되었다 3 배 점. 결과 평균 값으로 제시 하 고 오차 막대를 나타내는 표준 편차 (SD). P < 0.05와 * * P < 0.01, 학생의 t-테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : H 조-Ras-유도 노화 동안 mRNAs 정량화의 SASP 관련. RNA는 H-RasV12 레트로 바이러스 감염 후 표시 시간 포인트에서 WI-38 셀에서 준비 되었다. 이러한 패널 표시 표 1에 나열 된 특정 뇌관을 사용 하 여 정량 분석 (A) 일리노이-6와 IL-8 (B) 식의 유도. 말라 mRNA 수준의 정규화에 사용 되었다. 정규화 된 일리노이-6 또는 0-하루 샘플에서 측정 하는 IL-8 mRNA 수준 1로 설정 했다 고 상대 겹 변경 계산 했다. 실험 했다 독립적으로 반복된 3 x. 결과 평균 값으로 표시 됩니다 하 고 오차 막대 표준 편차 (SD)를 나타냅니다. P < 0.05와 * * P < 0.01, 학생의 t-테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 분 비 SASP의 부 량 요인 h 조-Ras-유도 노화 중. 이러한 패널 일리노이-6 (A)와 IL-8 (C) 표준 생성 하는 표준 곡선을 표시 합니다. 바른된 미디어 H RasV12 레트로 바이러스 감염 후 표시 시간 지점에서 WI-38 셀에서 수확 했다. 은닉 일리노이-6 (B) 및 IL-8 레벨 (D)는 일리노이-6와 IL-8 ELISA 키트, 각각 분석 했다. 실험 했다 독립적으로 반복된 3 x. 결과 평균 값으로 표시 됩니다 하 고 오차 막대 표준 편차 (SD)를 나타냅니다. P < 0.05와 * * P < 0.01, 학생의 t-테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 유전자 이름 | 앞으로 뇌관 | 반전 뇌관 |
| 일리노이-6 | 5'-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3' | 5'-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3' |
| IL-8 | 5'-ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3' | 5'-AACCCTCTGCACCCAGTTTTC-3' |
| 말라 | 5'-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3' | 5'-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3' |
표 1: SASP 요소에 대 한 실시간 PCR 뇌관.
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Discussion
여기, 우리는 WI-38 정상적인 인간의 섬유 아 세포에서 h 조-Ras-유도 노화 동안 세포내 선생님 레벨을 모니터링 하기 위한 방법을 제시. 라이브 세포에서 세포내 선생님 수준 양적 세포 투과 시 DCF 다를 사용 하 여 측정 될 수 있다과 cytometry 합니다. 세포질 통풍 관에 DCF 다 세포내 esterases에 의해 deacetylated 이며, 형성 높은 형광 2', dichlorofluorescein (DCF)-7' 선생님에 의해 연속적으로, 산화. DCF 형광 cytometry FL1 검출기 (그린 형광)를 사용 하 여 검색할 수 있습니다. DCF 다 얼룩 방법을 사용 하 여, 우리가 성공적으로 증가 선생님 수준에서 동안 검색 WI-38 정상적인 인간의 섬유 아 세포에서 h 조-Ras-유도 세포 노화. 이 메서드는 선생님 수준에서 변경 사항을 모니터링 하 세포 노화의 다양 한 모델에 사용할 수 있습니다. DCF-다 함께 선생님 유도 측정 하는 데 사용 된 얼룩, 추가 방법 산화 단백질23 와 선생님-종속 형광 염료24를 사용 하 여 confocal 현미경 검사 법 분석의 수준을 모니터링 포함 됩니다. 따라서, 추가 선생님 수준 추가 메서드를 사용 하 여 변경 내용 확인은 바람직하다.
최근, 우리 선생님 수준 h 조-Ras-유도 노화21뿐만 아니라 노화를 유도 하는 p53 암 세포에서 증가 된다 나타났습니다. 증가 된 세포내 선생님 수준은 SA β-gal 활동 얼룩, 세포 노화의 유도에 선생님의 원인이 역할 제안에 증가 하기 전에 관찰입니다. 흥미롭게도, 선생님 수준에 증가 별도로 제어 Akt-NF-κB-NOX4 통로, p2121세포 주기 검거를 중재 하는 동안. Akt 또한 다른 유형의 세포 노화에 선생님 증가 조절 여부를 탐험 흥미로울 것입니다.
우리도 mRNA를 분석 하기 위한 방법을 소개 하 고 h 조-Ras-유도 노화 중 단백질 수준 일리노이-6와 IL-8 SASP 요소의 분 비. 우리는 일리노이-6와 노화와 38 셀에서 IL-8 mRNA의 유도 측정할 정량 Pcr를 사용 하 여. 우리는 정규화에 대 한 내부 통제로 걸 mRNA 수준 검사 하지만 내부 컨트롤로 GAPDH mRNA를 사용하실 수 있습니다. 18S ribosomal RNA (rRNA) 정량 실험에서 내부 통제로 일반적으로 사용 되는 다른 내부 관리 유전자 이다. 그러나, rRNA 전사 및 리보솜 성숙 세포 주기 검거와 세포 노화25,26동안 통제 된다, 때문에 18S rRNA는 세포 노화 연구에 대 한 좋은 내부 제어 되지 않을 수 있습니다. ELISA, 일리노이-6 분 비 및 IL-8 레벨 증가 보여 비슷한 노화 WI-38 셀에서 조건 화 된 매체를 사용 하 여. SASP을 개발 하는 개념와 일치 "성숙" 노화 단계19, 일리노이-6와 IL-8 분 비 증가 선생님 수준 증가 보다 나중 시간에 감지. 특히, SASP 요소는 세포 유형 및 노화 유도 조건27에 따라 다릅니다. 따라서, 세포 노화 모델에 따라 적절 한 SASP 요소를 선택 합니다.
비록 우리가 모니터링 형태 변화와 SA β-gal 얼룩 활동의 유도 의해 h 조-Ras-유도 노화 확인, 세포 노화 더 추가 노화 특성을 포함 하 여 모니터링 하 여 확인 되어야 한다는 종양 억제기 p53 등, p16INK4a의 활성화, SASP 요인, 노화 관련 섬으로 foci (SAHF), 확산 가능성의 돌이킬 수 없는 손실 향상 된 DNA 손상 신호, 및 지속적인 핵 foci, DNA 세그먼트 정의 chromatin 변경 노화 (DNA-흉터) 강화와. 그러나, 그것은 다른 노화 종류에서 노화 특성의이 기억 하는 것이 중요입니다. 특정 노화 biomarkers 세포 노화의 일부 특정 종류에서 서만 관찰 될 수 있습니다. 예를 들어 SAHF은 일반적으로 분명 OIS28,29에 있습니다.
세포 노화 인공 문화 조건으로 인해 발생 하는 자율 성장 검거를 표현 하기 위해 처음으로 여겨졌다. 그러나, 과거 반세기에에서 연구는 노화, 암 등 다양 한 병 태 생리 조건 하에서 세포 노화의 중요성을 설명 했다. 세포 노화 및 열화 나이 관련 조직 사이의 인과 관계 링크 BubR1 progeroid 마우스 모델30,31이전 입증 되었습니다. 따라서, 노화 세포의 제거는 SASP의 변조를 통해 세포 노화 제어 현재 나이-관련 질환에 대 한 유망 전략으로 간주 됩니다. 실제로, 최근 연구 결과 노화 세포의 제거 나이 관련 된 병 리 등 줄기 세포 고갈, 뼈 손실, 탈모, 관절염32,33, 에 대 한 유망 치료 될 것 이라고 설명 했다 34,,3536. 노화 유도 및 노화 고기, SASPs, 등의 분자 메커니즘에 대 한 깊은 이해 가능한 단점을 줄이고 선택적으로 해로운만 타겟팅 하 여 노화를 타겟팅에 대 한 향상 된 전략을 제공할 것입니다. 노화 세포의 기능입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 (김 영 연)를 국가 연구 한국 재단 (2015R1D1A1A01060839)에서 교부 금에 의해 그리고 (MSIT) 한국 정부에 의해 자금 한국 국가 연구 재단 (NRF) 교부 금에 의해 지원 되었다 (번호 2016R1A2B2008887 호 2016R1A5A2007009) (Jeanho 윤)에.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| BOSC 23 | ATCC | CRL-11269 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| pBabe puro-H-RasV12 | Addgene | 1768 | |
| pGAG/pol | Addgene | 14887 | |
| pVSVG | Addgene | 1733 | |
| Turbofect | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/mL |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/mL |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| DCF-DA | Sigma-Aldrich | D6883 | 10 mM |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| MMLV Reverse transcriptase | Promega | M1701 | |
| SYBR Green PCR master 2x mix | Takara | PR820A | |
| Random Primer | Promega | C118A | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Human IL-6 ELISA assay | PeproTech | #900-TM16 | |
| Human IL-8 ELISA assay | PeproTech | #900_TM18 | |
| EQUIPMENTS | |||
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| Parafilm | BEMIS | PM-996 | |
| Microscope | NIKON | TS100 | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | LSR Fortessa | |
| Amicon Ultra-4ml | Merk Millipore | UFC800324 | |
| NanoDrop spectrophotometer | BioDrop | 80-3006-61 | |
| Real-time PCR System | Applied Biosystems | ABI Prism 7500 | |
| ELISA Reader | Molecular Devices | EMax microplate reader |
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