Summary
마이크로 RNAs (miRNAs) 메신저 RNAs (mRNAs)의 post-transcriptional 레 귤 레이 터로 봉사 하는 짧고 높은 동종 RNA 시퀀스입니다. 현재 미르 탐지 방법 감도 특이성에서 변화 한다. 우리는 현장에서 교 잡 및 마우스 심장 조직 섹션에 미르와 단백질 분자의 동시 검출을 위한 immunostaining를 결합 하는 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
마이크로 RNAs (miRNAs) 단일 가닥 RNA 사본 메신저 RNAs (mRNAs) 바인딩할 및 그들의 번역을 억제 또는 그들의 저하를 촉진 하는. 날짜 하려면, miRNAs 미르 증명서의 신뢰할 수 있는 검색 방법에 대 한 필요성을 의미 했다 생물학 및 질병 과정의 많은 수에 연루 되었습니다. 여기, 우리 digoxigenin 분류 (발굴) 잠겨 핵 산 (LNA) 프로브 기반 미르 검색, 마우스 심장 섹션에 단백질 immunostaining와 함께 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 첫째, 우리는 현장에서 교 잡 기술을 미르-182 식 제어 및 심장 비 대 쥐에서 심장 섹션에서을 식별 하는 프로브를 사용 하 여 수행. 다음, 우리는 공동 cardiomyocyte 셀 미르-182 지역화를 동일한 섹션에 심장 분 T (cTnT) 단백질에 대 한 immunostaining를 수행 합니다. 이 프로토콜을 사용 하는 알칼리 성 인산 가수분해 효소를 통해 미르-182 기반 색도계 분석 결과, 및 형광 성 얼룩 통해 cTnT 감지할 수 있었습니다. 이 프로토콜은 모든 miRNA LNA 발굴 표시 된 프로브를 통해 관심의 표현 및 마우스 심장 조직 섹션에 관련 된 단백질 표정 감지 하 사용할 수 있습니다.
Introduction
마이크로 RNAs (miRNAs)는 짧은 (18-25의 뉴클레오티드), 단일 가닥, noncoding RNAs는 메신저 RNA (mRNA) 번역 억제 및 홍보 mRNA 저하 여 post-transcriptional 수준에서 유전자 발현의 부정적인 레 귤 레이 터 기능 1. miRNAs는 introns 또는 코딩의 exons에서 복사할 수 또는 noncoding 유전자와 전조 miRNAs (pre-miRNAs), 70 뉴클레오티드2의 짧은 줄기 루프 구조를 DROSHA에 의해 핵에서 죽 습. 세포질 다음 내보내기, 사전 miRNAs 더 성숙한 miRNAs는 18-25의 뉴클레오티드3,4로 DICER에 의해 처리 됩니다. 그 후, RNA 유도 입을 복잡 한 (RISC) 통합이 miRNAs 단일 가닥 RNAs로 그들의 식3,5 억제 하는 3' 되지 않은 지역 (3'-UTR) 그들의 표적 mRNAs의 바인딩을 수 있는 .
그들은 처음으로 확인 했다, 이후 지난 3 년간 내 miRNAs가 유전자 발현, 그 자신의 식 레벨은 긴밀 하 게 제어6의 마스터 레 귤 레이 터 등장 했습니다. 장기 개발7,,89,10,11,12, 항상성13,14의 유지 보수에에서 miRNAs에 대 한 역할 설명 되었습니다. , 질병 컨텍스트 신경15,,1617,18,19, 심혈 관20를 포함 하는 자기 면역 조건21 뿐만 아니라 ,22, 암23,24, 등25. MiRNA 식 패턴의 관련성에 대 한 증가 감사 미르 증명서의 신뢰할 수 있는 검출 방법에 대 한 필요성을 게 앞으로 가져왔다. 이러한 방법 등이 실시간 PCR, microarrays, 북부에 게 더 럽 히기, 제자리에서 교 잡, 사실은 미르 성적표는 짧은 구성 주로 감도, 특이성, 및 양적 발전에 따라 고 매우 일치 순서6.
우리는 최근 미르-182 심근 비 대26, 높은 hemodynamic 요구27,28응답에서 심장의 구조적 적응을 설명 하는 조건 개발에 대 한 중요 한 역할을 했다. 심장 비 대 maladaptive 개장29와 관련 된 경우 심장 마비, 회계 모든 죽음의 8.5%에 기인 심장 혈관 상태에 대 한 위험 증가에 지도할 수 있는 심근 질량에 있는 증가 의해 특징입니다. 질병30.
우리가 현장에서 교 잡은 digoxigenin 표시 (발굴) 잠겨 핵 산 (LNA) 프로브와 결합 마우스 심장 조직 단면도에 미르와 단백질 분자의 동시 검출을 위한 immunostaining에 우리의 프로토콜을 설명 하는 여기, 우리의 심장 비 대의 모델입니다.
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Protocol
이 연구에 대 한 마우스 심장 조직 샘플 관련 법령 및 기관의 지침에 따라 확인 하 고 예일 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다.
1. 솔루션 준비
- RNase 무료 ddH2O 준비, 5l ddH2O의 0.1 %diethylpyrocarbonate (DEPC)의 5 mL로 하 여 실 온 (RT)에서 (O/N), 하룻밤. 오토 클레이 브 (121 ° C)에서 DEPC를 비활성화 하려면. 사용 DEPC 처리 ddH2O 준비에 대 한 다운스트림 솔루션으로의 표시.
주의: DEPC는 알려진된 발암 물질, 증기 두건에서 처리. - DEPC 처리 ddH2O. 압력솥 (121 ° C) 1 리터에 5 PBS 정제를 용 해 하 여 1 x 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 솔루션을 준비 합니다.
- 1 x PBS의 1 L 당 비 이온 세제의 1 mL를 희석 하 여 0.1% 비 이온 세제/PBS (PBST)를 준비 합니다.
- DEPC 처리 ddH2오 90%, 70%, 50%와 30% 에탄올을 준비
- 10 mg/mL DEPC 처리 ddH2오 약 수에에서 성분을 K (ProK)의 재고 솔루션을 준비 하 고-20 ° c.에 저장 DEPC 처리 ddH2O. 만들어 사용 하기 전에 신선한의 50 ml ProK 재고 솔루션의 100 μ diluting 하 여 ProK의 20 μ g/mL 작업 솔루션을 준비 합니다.
- 1 x PBS의 50 ml에서 PFA의 2 세대를 추가 하 여 4 %paraformaldehyde (PFA)를 준비 합니다. 해산 때까지 가끔 떨고, 65 ° C에서 열. 약 수와-20 ° c.에 게
주의: PFA는 알려진된 발암 물질, 증기 두건에서 처리. - DdH2O. 압력솥 (121 ° C)의 500 ml 87.8 g를 추가 하 여 3 M NaCl 솔루션을 준비 합니다.
- DdH2O. 압력솥 (121 ° C)의 100 ml 20.3 g를 추가 하 여 1 M MgCl2 솔루션을 준비 합니다.
- 1 M Tris pH 8.0 ddH2O. 조절 pH 8.0의 800 mL에서 녹이는 121.1 g 1 N HCl 몇 방울과 준비, 볼륨 1 L 압력솥 (121 ° C)를가지고. DdH2오의 1 M Tris pH 8.0에서 47.5 ml 2.5 mL를 diluting 하 여 50 mM Tris pH 8.0의 작업 솔루션을 준비
- 1 M Tris pH 9.5 ddH2O. 조절 pH 9.5 400 mL에 녹이는 60.6 g 1 N HCl 몇 방울과 준비, 500 mL와 오토 클레이 브 (121 ° C)에 볼륨을가지고.
- 3 M NaCl의 1-12 N HCl. 추가 16 mL 약 450 µ L로 DEPC 처리 ddH2O. 조절 pH 8.0의 130 ml Methylimidazole의 1.6 mL diluting 하 여 0.13 M 1 Methylimidazole pH 8.0을 준비 하 고 160 mL에 볼륨을가지고. 사용 하기 전에 신선한 확인 합니다.
주의: 1-Methylimidazole 점 막, 눈과 피부에 유해 하, 증기 두건에서 처리. - Diluting 176 µ L EDC의 0.13 M 1-Methylimidazole의 10 mL에 의해 0.16 M N-(3-Dimethylaminopropyl)-n ′-ethylcarbodiimide 염 산 염 (EDC)를 준비 합니다. 8.0 사용 하기 전에 12 N HCl. 확인 신선의 약 100 µ L로 pH를 조정 합니다.
주의: EDC는 점 막, 눈, 그리고 피부에 유해한, 증기 두건에서 처리. - 1 x PBS의 50 ml에서 30% H2O2 의 1.5 mL를 희석 하 여 1% H2O2 를 준비 합니다. 사용 하기 전에 신선한 확인 합니다.
-
준비 20 x SSC pH 7.0 175.3 g의 NaCl 및 나트륨 구 연산 염 (나3C6H5O7) ddH2O. 조정의 800 mL에서의 88.2 g을 용 해 하 여 pH 1의 몇 방울과 7.0 N HCl 1 L 압력솥 (121 ° C)를 볼륨을가지고.
- DdH2오 20 x SSC pH 7.0에서 180 mL의 20 mL를 희석 하 여 2 x SSC pH 7.0의 작업 솔루션을 준비
- DdH2오 20 x SSC pH 7.0에서 47.5 ml 2.5 mL를 희석 하 여 1 x SSC pH 7.0의 작업 솔루션을 준비
- DdH2오의 2 x SSC pH 7.0에서 45 mL의 5 mL을 diluting 하 여 0.2 x SSC pH 7.0의 작업 솔루션을 준비
- DEPC 처리 ddH2O. 만들어 사용 하기 전에 신선한 0.5 mL에 2 x microRNA 분 버퍼의 0.5 mL를 diluting 하 여 교 잡 솔루션 x 1을 준비 합니다.
- DdH2오 약 수의 5 mL을 250 mg을 추가 하 여 Levamisole의 200 m m 재고 솔루션을 준비 하 고-20 ° c.에 저장
- 9 ml PBST, 양 혈 청 1 mL를 희석 하 고 BSA의 0.1 g을 추가 하 여 5 (10% 양 serum/1% BSA/0.2 m m Levamisol) 단계에 대 한 차단 솔루션을 준비 합니다. 사용 하기 전에 10 μ Levamisole의 추가 합니다. 사용 하기 전에 신선한 확인 합니다.
- PBST의 9 mL 혈 청 염소의 1 mL를 희석 하 고 BSA의 0.1 g을 추가 하 여 단계 6 (10% 염소 serum/1% BSA) 차단 솔루션을 준비 합니다. 4 ° C에서 저장 하 고 1 주일 이내 사용.
- 3의 3.3 mL를 diluting 하 여 prestaining 솔루션 준비 M NaCl, 1 M MgCl2, 1 M Tris pH 9.5, 10 mL의 5 mL 100 µ L 트윈 20, ddH2O. 만들어 신선한 81.5 ml에서 Levamisole의 100 µ L의 사용 전에.
- 사용 하는 nitroblue tetrazolium (NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indoly 인산 (BCIP) 정제 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP) 제조업체의 지침에 따라 기판 솔루션의 20 mL를 준비 하. 20 μ Levamisole의 추가 합니다. 사용 하기 전에 신선한 고 빛 으로부터 보호.
- 4 g의 트리, 4.4 g의 NaCl 및 ddH2O. 압력솥 (121 ° C)의 500 mL에 KCl의 375 mg을 추가 하 여 KTBT 솔루션을 준비 합니다.
- 선택 사항: 1 x PBS의 50 mL에 DAPI 재고 솔루션 (1 mg/mL)의 50 μ diluting 하 여 DAPI 작업 솔루션 (1 μ g/mL)를 준비 합니다.
참고: 표준 솔루션 3 M NaCl, 1 M MgCl2, 1 M Tris HCl, nuclease 무료 ddH2O, 1 x PBS와 20 x SSC 또는 구매 될 수 있다. 이 프로토콜, 50 mL 유리 Coplin jar 또는 20 mL 폴 리 프로필 렌 슬라이드 우편물에 대 한 단지 사용 되었습니다.
2. 조직 준비
참고: 여기 사용 마우스 심장 섹션 했다 포 르 말린-고정/파라핀 끼워 넣어진 조직에서 예일 병 리 조직 서비스, 준비, 5 μ m에서 잘라내어 충전된 슬라이드에 위치.
-
조직 재입니다.
- 따뜻한 파라핀 눈 녹는 때까지 교 잡 오븐에서 10 분 동안 60 ° C에서 슬라이드.
- 상용 개간 에이전트 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에 슬라이드를 품 어 ( 재료의 표참조) 10 분, 두 번.
- 두 번, 2 분 50% 에탄올과 2 분 30% 에탄올 유리 Coplin jar 2 분, 100% 에탄올의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번, 뒤에 2 분 동안 90% 에탄올, 2 분, 70% 에탄올에에서 슬라이드를 품 어.
- DEPC 처리 ddH2O 5 분 동안 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에 슬라이드를 품 어.
- 포함 하는 5 분의 1 x PBS의 50 mL 유리 Coplin jar에 슬라이드를 품 어.
-
조직 드-proteinating입니다.
- 슬라이드 20 μ g/mL ProK 작업 솔루션, 교 잡 오븐에 15 분 동안 37 ° C에서 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에서 품 어.
주의: 아래의 소화 될 수 있습니다 가난한 또는 아무 신호 개발 동안-소화 배경 얼룩의 개발과 조직 저하 될 수 있습니다. 최적화는이 단계 (1-20 μ g/mL ProK, 5-20 분 보육, RT-37 ° C)에 대 한 필요할 수 있습니다. - RT에 5 분, 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.
- 슬라이드 20 μ g/mL ProK 작업 솔루션, 교 잡 오븐에 15 분 동안 37 ° C에서 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에서 품 어.
-
조직의 고정입니다.
- 소수 성 펜을 사용 하 여 각 슬라이드에 조직 발 수 원을 그립니다.
- 각 슬라이드의 길이를 4 %PFA 솔루션의 500 µ L을 적용 하 고 실시간에 10 분 동안 가로 슬라이드를 품 어
- RT에 5 분, 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.
- 워시 0.13 M 1-10 분, RT에 methylimidazole의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드.
- 각 슬라이드의 길이에 500 µ L 0.16 M EDC 솔루션의 적용 고 가로로 습도 챔버에 RT에 1 시간에 대 한 슬라이드를 품 어.
- 실시간에서 50 mM Tris pH 8.0의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin 항아리에 슬라이드를 씻어
- 린스에 RT, 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드.
참고: 두 PFA 및 EDC 고정 단계 미르 가교에 필요한 생략할 수 없습니다. 31
-
내 인 성 과산화 효소 블록입니다.
- 실시간에서 30 분 동안 1% H2O2 의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에 슬라이드를 품 어
- 린스에 RT, 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드.
3입니다. 교 잡
- 대상 온도까지 교 잡 솔루션 (슬라이드 당 500 µ L) 교 잡의 오븐에서 50 ° C에서 예 열, (10-15 분)에 도달.
- 교 잡 챔버 챔버의 하단에 필터 또는 휴지의 2 개를 놓고 종이 50 %formamide / 1 일로 준비 x SSC.
주의: Formamide은 점 막, 눈과 피부, 증기 두건에서 유일한 핸들에 유해한. - 각 슬라이드의 길이를 교 잡 솔루션의 200 µ L를 적용 합니다. 가로로 습도 챔버에 50 ° C에서 1-3 h에 대 한 슬라이드를 품 어.
- 1.5 mL 튜브에 250 µ L ofhybridization 솔루션 (최종 농도 50 nM)에서 0.5 µ L 재고 조사 (25 µ M)를 혼합 하 여 프로브 솔루션을 준비 합니다.
참고: 다른 miRNAs 표현 됩니다 서로 다른 수준에서 최적화 프로브 농도 관한이 단계 (1-50 nM), 아무 신호 나 높은 배경 개발을 피하기 위해 필요한 수 있습니다. - 각 슬라이드의 길이를 프로브 솔루션의 250 µ L을 적용 하 고 상단에는 RNase 무료 coverslip 장소. 거품의 형성을 하지 마십시오.
- 신중 하 게 교 잡 챔버 parafilm으로 밀봉 하 고 O/N 50 ° c.에서 품 어
참고: 교 잡 온도 각 프로브의 RNA 녹는 온도 (Tm) 약 30 ° C 설정 한다. 최적화 해야 합니다. 여기, 50 ° C 미르-182 교 잡/세척 온도로 사용 되, 그에 따라 조정 다른 프로브에 대 한.
4. 엄중 세척
- 2의 200 mL prewarm 대상 온도 (20-40 분)를 도달할 때까지 교 잡 오븐에서 50 ° C에서 x SSC.
- 슬라이드 2의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에 세척 50 ° c 5 분, 또는 coverslips는 느슨하게 때까지 x SSC.
- 슬라이드 2의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에 씻어 5 분, 두 번 RT에서 x SSC.
- 0.2의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어 RT 5 분에서 x SSC.
- 5 분에 대 한 실시간에 PBST의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin 항아리에 슬라이드를 씻어.
- 5 분에 대 한 RT에 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin 항아리에 슬라이드를 씻어.
참고: RNase 무료 조건의 사용은 RNA RNA 하이브리드 안정적인 것으로 간주 됩니다 때문에 더 이상 필요.
5. 파 항 체 검출
- 소수 성 펜을 사용 하 여 필요한 경우 다시 각 슬라이드에 조직 발 수 원을 그립니다.
- 각 슬라이드의 길이를 솔루션 차단의 500 µ L를 적용 합니다. 가로로 습도 챔버에 RT에서 30 분에 대 한 슬라이드를 품 어.
- 1.5 mL 튜브에 500 µ L ofblocking 솔루션 항 체 발굴의 0.5 μ diluting 하 여 발굴 항 체 솔루션 (1:1, 000)를 준비 합니다.
주의: 최적화가이 단계에 대 한 필요할 수 있습니다 (1: 500-1:2, 000). - 각 슬라이드의 길이를 발굴 항 체 솔루션의 500 µ L를 적용 합니다. 가로로 습도 챔버에 RT에 1 시간에 대 한 슬라이드를 품 어.
- 5 분, RT에 PBST의 50 mL를 포함 하는 것은 몇 번이 고 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.
- 워시 유리 Coplin jar RT 5 분에 대 한 솔루션을 두 번 prestaining의 50 mL를 포함 하는 슬라이드.
- 슬라이드 6-24 h, 빛 으로부터 보호에 대 한 37 ° C에 20 mL ofAP 기판 솔루션을 포함 하는 폴 리 프로필 렌 슬라이드 우편물 항아리에 품 어.
주의: 색상 개발 검사 되어야 한다 매 2 h. 최적화가이 단계에 대 한 필요할 수 있습니다. - RT 5 분, KTBT 솔루션 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.
- 5 분에 대 한 RT에 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 유리 Coplin 항아리에 슬라이드를 씻어.
6입니다. cTnT 항 체 검출
- 소수 성 펜을 사용 하 여 필요한 경우 다시 각 슬라이드에 조직 발 수 원을 그립니다.
- 각 슬라이드의 길이를 솔루션 차단의 500 µ L를 적용 합니다. 가로로 습도 챔버에 RT에 1 시간에 대 한 슬라이드를 품 어.
- 1.5 mL 튜브에 200 μ ofblocking 솔루션에서 cTnT 항 체의 2 μ diluting 하 여 cTnT 항 체 솔루션 (1: 100)를 준비 합니다.
- 각 슬라이드의 길이를 200 µ L cTnT 항 체 솔루션을 적용 합니다. 슬라이드를 품 어 습도 챔버에 4 ° C에서 가로로 O/N.
- 5 분, RT에 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 몇 번이 고 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.
- 1.5 mL 튜브에 250 μ ofblocking 솔루션 항 체 안티 rabbit 568의 0.5 μ diluting 하 여 안티 rabbit 568 항 체 솔루션 (1: 500)를 준비 합니다.
- 각 슬라이드의 길이를 반대로 rabbit 568 항 체 솔루션의 250 µ L를 적용 합니다. 가로로 습도 챔버에 RT에 1 시간에 대 한 슬라이드를 품 어.
- 5 분, RT에 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 몇 번이 고 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.
- 선택 사항: 각 슬라이드의 길이에 DAPI 작업 솔루션의 250 µ L을 적용 하 고 빛 으로부터 보호 하는 RT에 1 분 동안 가로 슬라이드를 품 어.
- 5 분, RT에 1 x PBS의 50 mL를 포함 하는 것은 두 번 유리 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.
7. 장착 및 이미징
- 장착 매체와 유리 커버 슬립의 2-3 방울과 슬라이드를 탑재 합니다. 빛 으로부터 보호 4 ° C에서 O/N, 평면, 건조를 슬라이드 수 있습니다.
- Epifluorescent 또는 confocal 현미경 검사 법을 진행 합니다.
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Representative Results
miRNA에 제자리 교 잡 출 격 miRNA와 U6-snRNA, 부정과 긍정적인 컨트롤을 각각 역임을 사용 하 여 마우스 심장 섹션에 최적화 되었다. 색상 개발의 부족에 의해 표시 됩니다 부정적인 얼룩 동안 파란색, 표시는 긍정적인 얼룩 (그림 1A-1B). 미르-182의 Cardiomyocyte 특정 식 제어 및 PlGF overexpressing 쥐에서 심장 섹션에서 평가 했다. ΑMHC 발기인 아래 PlGF transgene 들고 쥐 transgene 활성화26의 6 주 이내에 심장 비 대, 보조 증가 신생 개발. 우리 현장에서 교 잡 수행 하 고 컨트롤에 비해 PlGF 쥐의 마음에 있는 미르-182의 증가 식 (그림 2A-2 H), 블루 얼룩에 의해 표시 된. 확인 하려면 셀 유형을 표현 미르-182, 우리 cTnT 같은 섹션에 대 한 다음 immunostaining을 수행. 우리 미르-182 공동 cTnT 긍정적인 cardiomyocyte 셀으로 지역화로 핵, 제어 및 PlGF 마우스 심장 섹션에서 스테인드 DAPI 발견 (그림 2C-2 H), 얼룩 각각 파란색과 빨간색으로 표시 된. 이러한 이미지는 20 X 목적으로 했다.
그림 1: 부정과 긍정에 제자리 교 잡 얼룩. (A) 교 잡 제자리에서 출 격 miRNA에 대 한 (25 nM) 컨트롤 마우스 심장 섹션에서. (B) 교 잡 제자리에서 U6 snRNA에 대 한 (25 nM) 컨트롤 마우스 심장 섹션에서. 눈금 막대 100 μ m =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Cardiomyocyte 특정 표현의 제어 및 PlGF 마우스 마음에 미르-182. (A-B) 현장에서 교 잡 미르-182 PlGF 마우스 심장 섹션 및 제어에 대 한. (C-D) CTnT 제어 및 이전에 미르-182에 대 한 스테인드 PlGF 마우스 심장 섹션에 대 한 Immunostaining. (E-F) DAPI 이전에 미르-182에 대 한 스테인드 마우스 심장 섹션 제어 및 PlGF 핵 지역화에 대 한 counterstaining. (G-H) 미르-182 (딥 블루) cTnT (레드), DAPI (밝은 파란색) 제어 및 PlGF 마우스 심장 섹션 얼룩의 병합 된 이미지. 눈금 막대 = 50 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
miRNA 사본 검출 감도, 특이성 및 양적 힘에서 변화 하는 다른 기술을 통해 얻을 수 있습니다. 여기, 우리 미르 교 잡 제자리에 immunostaining와의 커플링을 보여 같은 심장 섹션에 미르와 단백질 분자의 식 레벨의 동시 평가 허용 하는 프로토콜을 설명 하 고. 우리는 먼저 파라핀 포함 심장 섹션에 제자리에서 교 잡 파 표시 된 LNA 미르 프로브를 수행 하는 방법을 보여줍니다. 다음, 우리는 cTnT 같은 섹션에 대 한 immunostaining를 수행 하는 방법을 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 결과 색상 및 형광 이미지를 병합 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 포 르 말린 고정 (4 ° C, O/N)에 대 한 최적화 되었습니다 / 파라핀 발굴 표시 된 LNA 미르 프로브 및 cTnT 사용 마우스 심장 조직, 임베디드. 추가 최적화를 다른 조직에 필요할 수 있습니다, 조사 또는 항 체 유형, 아래에 설명 된 대로.
RNase 무료 조건까지 이어질 교 잡, 프로브로 RNase 오염 심각이 실험의 결과 손상 시킬 수 있는 단계를 통해 신중 하 게 구현 되어야 합니다. 모든 솔루션 DEPC 처리 ddH2O, 여야 한다 그리고 모든 Coplin jar RNase 오염 제거 솔루션으로 취급 한다. 또한, 다음과 같은 고려 사항 다른 발굴 표시 된 LNA 미르 프로브를 작업할 때 계정에 메시지를 한다. 교 잡 온도 각 프로브의 녹는 온도 (Tm)에 따라 달라 집니다. 일반적으로 주어진된 RNA Tm 아래 또는 주어진된 DNA Tm 20 ° C 30 ° C 온도 프로브 교 잡에 대 한 사용 해야 합니다. 또한, 이상적인 프로브 농도 최적화 되어야 합니다. 그것은 일반적으로 1-50 nM 사이 속 인 다. 마지막으로, 하이브리드 솔루션을 포함 하는 프로브 수 있습니다가 열 될 어떤 이차 구조 변성을 5 분 동안 95 ° C에이 중요 한 경우. 중요 한 단계는 프로브의 특이성을 테스트를 처음으로 사용 하는 경우에 특히 부정적인 (스크램블된) 뿐만 아니라 (예: U6) 긍정적인 제어 조사, 실험 성공 (그림 2)를 포함 하입니다. Immunostaining 단계 동안 비슷한 컨트롤 (예를 들어 CD31 내 피 항 체)를 사용 해야 합니다.
교 잡 실험 현장에서 의 일반적인 문제 유물/배경 신호를 얼룩이 지기의 개발 이다. 방지 하거나 최소화 단계 얼룩 유물, 조직 특히 긴 외피 동안 모든 단계에 걸쳐 밖으로 건조 로부터 보호 되어야 한다. 교 잡 단계, 높은 온도 사용 하는 경우에 특히 및 챔버가 습의 사용 중 RNase 무료 coverslips와 슬라이드를 취재 하는 것이 좋습니다. 우리 또한 immunostaining 단계 동안 cTnT를 감지 하는 568 또는 594 fluorophore의 사용 또는 관심사의 단백질을 건의 한다. 이 종종 488 fluorophores 포름알데히드 조직 고정에 사용의 사용으로 발생 하는 모든 autofluorescence을 제거 합니다.
또 다른 변수를 주의 하는 것이 좋습니다 AP는 조직에 존재 특정 miRNA의 수준에 따라 달라 집니다 개발 얼룩의 기간입니다. AP 얼룩 진행 첫 번째 실험을 위해 매 2 시간을 확인 하는 것이 좋습니다. 추가 최적화 매개 변수 인큐베이션 (RT-37 ° C)의 온도 변화를 포함할 수 있습니다. 마지막으로, 배경 사실 미르 프로브 얼룩 전에 개발 하기 시작 하는 경우 또는 AP 솔루션 얼룩 블루-브라운 색상을 변경 하는 경우, 우리는 제안 PBST에서 슬라이드를 두 번, 세척 하 고 갓 만든된 한 얼룩 솔루션 교체.
마지막으로,이 프로토콜은 포 르 말린 고정/파라핀-임베디드 마우스 심장 조직에 대 한 최적화 되었습니다, 하지만 그것은 또는 처리 조직 (PFA 고정/10 월 포함) 및/또는 프로브 또는 항 체 종류의 사용에 대 한 적응 수 있습니다. 현장에서 교 잡 및 고려해 야 하는 immunostaining의 한계는 그들의 각각 epitopes, 동안 사용 된 높은 온도에서 후자 들의 가능한 파괴 때문에 바인딩할 여러 항 체의 실패 교 잡 그리고 엄중 단계 세척입니다. 현장에서 교 잡 및 immunostaining 기술을 더 제한 각각 미르 또는 단백질 분자의 매우 낮은 농도 검출 하기 위하여 이러한 기술의 힘을 가장 자주 참조 하십시오. 신호 증폭 키트 미르 또는 단백질 풍부 우려 때 발굴 또는 항 체 검출에 대 한 사용할 수 있습니다. 이러한 키트는 또한, miRNAs의 검출을 위한 형광 대안을 제공, 형광 immunostaining와 결합 하면 이미지 수집을 간소화할 수 있습니다. 실시간 PCR 등 서 부 럽 더 큰 감도 있는 다른 방법 또한 낮은 풍부한 문제를 해결 할 수 있다. 그러나, 교 잡/immunostaining 프로토콜 제자리에 반하는 이러한 기술을 미르/단백질 분자의 조직-특정 지역화에 어떠한 정보도 제공합니다.
요약, 우리는 같은 조직에 미르와 단백질 분자의 동시 탐지를 제공 하는 프로토콜을 설명 우리가 믿는 마우스 모델에 미르 연구에 유용한 도구가 될 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 아타 나 시오 스 Papangelis, 원고에 대 한 중요 한 의견에 대 한 감사 하 고 싶습니다. FM은 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회 (BBSRC;에 의해 지원 BB/M009424/1). IP는 미국 심장 협회 과학자 개발 그랜트 (17SDG33060002)에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | DEPC |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | PBS |
| Tween-20 | American Bioanalytical | AB02038 | non-ionic surfactant |
| Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma Aldrich | 3115879001 | ProK |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | PFA |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | S271 | NaCl |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | ThermoFisher | M33 | MgCl2 |
| Tris | Sigma Aldrich | T6066 | |
| Hydrochloric Acid Solution, 1 N | ThermoFisher | SA48 | HCl |
| Hydrochloric Acid Solution, 12 N | ThermoFisher | S25358 | HCl |
| 1-Methylimidazole | Sigma Aldrich | 336092 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | 39391 | EDC |
| Hydrogen peroxide solution H2O2 | Sigma Aldrich | 216763 | H2O2 |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804 | Sodium Citrate |
| miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) | Qiagen | 339450 | scramble miRNA/U6 snRNA |
| miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe | QIagen | YD00615701 | 5'-DIG and 3'-DIG labelled |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647 | BSA |
| NBT/BCIP Tablets | Sigma Aldrich | 11697471001 | NBT-BCIP |
| Potassium Chloride | ThermoFisher | P217 | KCl |
| DAPI solution (1mg/ml) | ThermoFisher | 62248 | DAPI |
| Glass coverslip | ThermoFisher | 12-545E | Glass coverslip |
| Plastic coverslip | Grace Bio-Labs | HS40 22mmX40mmX0.25mm | RNA-ase free plastic coverslip |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | DIG antibody |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | Pap pen |
| Anti-Cardiac Troponin T antibody | Abcam | ab92546 | cTnT antibody |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-11011 | anti-rabbit-568 antibody |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | mounting medium |
| Sheep serum | Sigma Aldrich | S3772 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Deionized Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | |
| Hybridization Oven | ThermoFisher | UVP HB-1000 Hybridizer |
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