Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Vävnadsspecifika miRNA uttryck profilering i mus hjärtat sektioner med In Situ -hybridisering

Published: September 15, 2018 doi: 10.3791/57920
Automatic Translation
1, 2, 3
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

Summary

Micro-RNAs (Mirna) är kort och mycket homologa RNA sekvenser, tjänstgör som post-transcriptional regulatorer av messenger RNA (mRNA). Nuvarande metoder för detektion av miRNA varierar i sensitivitet och specificitet. Vi beskriver ett protokoll som kombinerar i situ hybridisering och immunfärgning för samtidiga upptäckt av miRNA och protein molekyler på mus hjärtat vävnadssnitt.

Abstract

Micro-RNAs (Mirna) är enkelsträngat RNA avskrifter som binder till messenger RNA (mRNA) och hämmar deras översättning eller främja deras nedbrytning. Hittills har MicroRNA varit inblandade i ett stort antal biologiska och sjukdom processer, som signalerat behovet av tillförlitlig upptäckt metoder för miRNA avskrifter. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för digoxigenin-märkt (DIG) låst nukleinsyra (LNA) sond-baserade miRNA detektering, kombinerat med protein immunfärgning på mus hjärtat delar. Det första utfört vi en i situ hybridisering teknik använder sonden för att identifiera miRNA-182 uttryck i hjärtat sektioner från kontroll och hjärthypertrofi möss. Nästa, vi utfört immunfärgning för hjärt Troponin T (cTnT) protein, på samma avsnitt, att samtidig lokalisera miRNA-182 med hjärtmuskelcellen celler. Använder det här protokollet, kunde vi upptäcka miRNA-182 genom ett alkaliskt fosfatas baserat kolorimetriska analys och cTnT genom fluorescerande färgning. Detta protokoll kan användas för att detektera uttryck för någon miRNA av intresse genom gräva-märkt LNA sonder, och relevanta proteinuttryck på mus hjärtat vävnadssnitt.

Introduction

Micro-RNAs (Mirna) är kort (18 – 25 nukleotider), enkelsträngat, icke-kodande RNAs som fungerar som negativa regulatorer av genuttryck på post-transcriptional nivå genom att hämma budbärar-RNA (mRNA) översättning och/eller främja mRNA nedbrytning 1. MicroRNA transkriberas från introner eller exoner kodning eller icke-kodande gener och är klyvs i kärnan av DROSHA, till föregångare MicroRNA (pre-MicroRNA), som är kort stam-loop strukturer av 70 nukleotider2. Efter cytoplasmiska export, pre-MicroRNA är bearbetas vidare av DICER till mogen MicroRNA som spänner över 18 – 25 nukleotider3,4. Därefter införlivar RNA-inducerad ljuddämpningssystemet komplexet (RISC) dessa MicroRNA som enkelsträngat RNA, vilket möjliggör deras bindning till 3' oöversatta regionen (3'-UTR) i deras mål mRNA att undertrycka sin expression3,5 .

Inom de senaste tre decennierna, eftersom de identifierades först, har MicroRNA framkommit att master regulatorer av genuttryck, vars egna uttryck nivåer är väl kontrollerad6. Roller för MicroRNA har beskrivits i orgel utveckling7,8,9,10,11,12, underhåll av homeostas13,14 , liksom sjukdom sammanhang som inkluderar neurologiska15,16,17,18,19, kardiovaskulära20, autoimmuna tillstånd21 ,22, cancer23,24och andra25. Den ökande uppskattning för relevansen av miRNA uttrycksmönster har fört fram behovet av tillförlitlig upptäckt metoder för miRNA avskrifter. Sådana metoder inkluderar realtid PCR, microarrays, Northern Blotting, i situ hybridisering och andra, som varierar i känslighet, specificitet och kvantitativa makt, huvudsakligen på grund av att miRNA avskrifter består av korta och Mycket homologa sekvenser6.

Vi rapporterade nyligen en viktig roll för miRNA-182 i utvecklingen av den myokardiella hypertrofi26, ett villkor som beskriver den strukturella anpassningen av hjärtat som svar på förhöjda hemodynamiska krav27,28. Hjärthypertrofi kännetecknas av ökningen i den hjärtinfarkt massan, som om associerade med maladaptiv remodeling29, kan leda till ökad risk för hjärtsvikt, ett tillstånd som redovisning för 8,5% av alla dödsfall tillskrivas hjärt- sjukdom30.

Här beskriver vi våra protokoll som kombinerar i situ hybridisering med digoxigenin-märkt (DIG) låst nukleinsyra (LNA) sond och immunfärgning för samtidiga detektion av miRNA och protein molekyler på mus hjärtat vävnadssnitt, i våra modell av hjärthypertrofi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Mus hjärtat vävnadsprover för denna studie erhölls i enlighet med relevanta lagar och institutionella riktlinjer och godkändes av Yale University institutionella djur vård och användning kommittén.

1. lösningen förberedelse

  1. Förbereda RNase gratis ddH2O, genom att behandla 5 L ddH2O 5 ml 0,1% diethylpyrocarbonate (DEPC) över natten (O/N), vid rumstemperatur (RT). Autoklav (121 ° C) för att avaktivera DEPC. Användning DEPC-behandlad ddH2O för beredning av nedströms lösningar som anges.
    FÖRSIKTIGHET: DEPC är cancerframkallande, endast hantera i dragskåp.
  2. Bered 1 x fosfat buffrad saltlösning (PBS) genom upplösning 5 PBS tabletter i 1 L DEPC-behandlad ddH2O. autoklav (121 ° C).
  3. Förbereda 0,1% icke-joniskt rengöringsmedel/PBS (PBST) genom spädning av 1 mL av icke-joniskt rengöringsmedel per 1 L av 1 x PBS.
  4. Förbereda 90%, 70%, 50% och 30% etanol i DEPC-behandlad ddH2O.
  5. Förbereda en 10 mg/mL stamlösning av proteinas K (ProK) i DEPC-behandlad ddH2O. alikvot och förvaras vid-20 ° C. Förbereda en 20 μg/mL arbetslösning av ProK genom att späda 100 μL av ProK stamlösning i 50 mL DEPC-behandlad ddH2O. göra färska före användning.
  6. Förbered 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) genom att lägga till 2 g av PFA i 50 mL 1 x PBS. Värme vid 65 ° C med enstaka skakningar, tills upplöst. Delprov och förvaras vid-20 ° C.
    Försiktighet: PFA är cancerframkallande, endast hantera i dragskåp.
  7. Förbered en 3 M NaCl-lösning genom att lägga till 87,8 g 500 mL ddH2O. autoklav (121 ° C).
  8. Bered en 1 M MgCl2 genom att lägga till 20,3 g 100 mL ddH2O. autoklav (121 ° C).
  9. Förbereda 1 M Tris pH 8,0 av Proteinupplösande 121,1 g 800 mL ddH2O. Justera pH till 8.0 med några droppar 1 N HCl, föra volymen 1 L och autoklav (121 ° C). Förbereda en fungerande lösning av 50 mM Tris pH 8,0 genom att späda ut 2,5 mL 1 M Tris pH 8,0 i 47,5 mL ddH2O.
  10. Förbereda 1 M Tris pH 9,5 av Proteinupplösande 60,6 g 400 mL ddH2O. Justera pH till 9,5 med några droppar 1 N HCl, att föra volym 500 mL och autoklav (121 ° C).
  11. Förbereda 0,13 M 1-metylimidazol pH 8,0 genom att späda 1,6 mL av 1-metylimidazol till 130 mL DEPC-behandlad ddH2O. Justera pH till 8.0 med cirka 450 µL av 12 N HCl. Tillsätt 16 mL 3 M NaCl och ge volym till 160 mL. Gör färska före användning.
    Försiktighet: 1-metylimidazol är skadligt för slemhinnor, ögon och hud, endast hantera i dragskåp.
  12. Förbereda 0,16 M N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydroklorid (EDC) genom att späda 176 µL av EDC 10 ml av 0,13 M 1-metylimidazol. Justera pH till 8.0 med cirka 100 µL av 12 N HCl. göra färska före användning.
    FÖRSIKTIGHET: EDC är skadligt för slemhinnor, ögon och hud, endast hantera i dragskåp.
  13. Laga 1% H2O2 genom att späda ut 1,5 mL 30% H2O2 i 50 mL 1 x PBS. Gör färska före användning.
  14. Förbereda 20 x SSC pH 7,0 genom upplösning 175.3 g NaCl och 88,2 g natriumcitrat (Na3C6H5O7) i 800 mL ddH2O. Justera pH till 7,0 med några droppar 1 N HCl, föra volymen till 1 L och autoklav (121 ° C).
    1. Förbereda en fungerande lösning av 2 x SSC pH 7.0 genom att späda ut 20 mL av 20 x SSC pH 7.0 i 180 mL ddH2O.
    2. Förbereda en fungerande lösning av 1 x SSC pH 7.0 genom att späda ut 2,5 mL av 20 x SSC pH 7.0 i 47,5 mL ddH2O.
    3. Förbereda en fungerande lösning 0,2 x SSC pH 7.0 genom att späda ut 5 mL 2 x SSC pH 7.0 i 45 mL ddH2O.
  15. Laga 1 x hybridisering lösning genom att späda ut 0,5 mL 2 x microRNA ISH buffert i 0,5 mL DEPC-behandlad ddH2O. göra färska före användning.
  16. Förbereda 200 mM stamlösning av Levamisol genom att lägga till 250 mg till 5 mL ddH2O. alikvot och förvaras vid-20 ° C.
  17. Förbereda blockerande lösning för steg 5 (10% får serum/1% BSA/0,2 mM Levamisol) genom spädning av 1 mL får serum i 9 mL PBST, och lägga till 0,1 g av BSA. Tillsätt 10 μL av Levamisol innan du använder. Gör färska före användning.
  18. Förbereda blockerande lösning för steg 6 (10% get serum/1% BSA) genom spädning av 1 mL get serum i 9 mL PBST, och lägga till 0,1 g av BSA. Förvaras vid 4 ° C och Använd inom en vecka.
  19. Förbereda prestaining lösning genom att späda ut 3,3 mL 3 M NaCl, 5 mL 1 M MgCl2, 10 mL 1 M Tris pH 9,5, 100 µL av Tween-20, 100 µL av Levamisol i 81,5 mL ddH2O. göra färska före användning.
  20. Använda nitroblue tetrazolium (NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indoly fosfat (Beneluxkonventionen) tabletter att förbereda 20 mL alkalisk fosfatas (AP) substratlösning enligt tillverkarens anvisningar. Tillsätt 20 μL av Levamisol. Gör fräsch före användning och ljuskänsligt.
  21. Bered KTBT genom att lägga till 4 g av Tris, 4,4 g NaCl och 375 mg KCl i 500 mL ddH2O. autoklav (121 ° C).
  22. Valfritt: Förbereda en DAPI fungerande lösning (1 μg/mL) genom att späda 50 μL av DAPI stamlösning (1 mg/mL) i 50 mL 1 x PBS.
    Obs: Standard lösningar såsom 3 M NaCl, 1 M MgCl2, 1 M Tris-HCl, nuclease-fri ddH2O, 1 x PBS och 20 x SSC alternativt kan köpas. För detta protokoll, glasburkar i Coplin 50 mL eller 20 mL polypropylen bild mailer har burkar använts.

2. vävnad förberedelse

Obs: Avsnitten mus hjärtat används här var beredd av Yale patologi vävnad tjänster, från Formalin-fast/Paraffin-inbäddat vävnad, skär vid 5 μm och placerad på laddade bilder.

  1. Vävnaden rehydrering.
    1. Varma bilder vid 60 ° C i 10 min, i hybridisering ugnen tills paraffinet smälter synligt.
    2. Inkubera bilder i Coplin glasburk innehållande 50 mL av kommersiellt tillgängliga clearing agent (se Tabell för material) i 10 min, två gånger.
    3. Inkubera bilder i en Coplin-glasburk innehållande 50 mL 100% etanol i 2 min, två gånger, följt av 90% etanol i 2 min, 70% etanol i 2 min, två gånger, 50% etanol i 2 min och 30% etanol i 2 min.
    4. Inkubera bilder i Coplin glasburk innehållande 50 mL DEPC-behandlad ddH2O 5 min.
    5. Inkubera bilder i Coplin glasburk innehållande 50 mL 1 x PBS för 5 min.
  2. Vävnad de-proteinating.
    1. Odling av objektglas i Coplin glasburk innehållande 50 mL 20 μg/mL ProK fungerande lösning, vid 37 ° C i 15 min i ugnen hybridisering.
      FÖRSIKTIGHET: Bristande matsmältning kan resultera i dålig eller ingen signal utveckling, medan över matsmältning kan resultera i vävnad nedbrytning och utveckling av bakgrundsfärgning. Optimering kan krävas för det här steget (1 – 20 μg/mL ProK, 5 – 20 minuters inkubation, RT-37 ° C).
    2. Tvätta objektglasen i Coplin glasburk innehållande 50 mL 1 x PBS för 5 min, på RT, två gånger.
  3. Vävnaden fixering.
    1. Använd en hydrofoba penna för att rita en vattenavvisande cirkel runt vävnaden på varje bild.
    2. Gäller 500 µL 4% PFA lösning för längden på varje bild och odling av objektglas horisontellt för 10 min, vid RT.
    3. Tvätta objektglasen i Coplin glasburk innehållande 50 mL 1 x PBS för 5 min, på RT, två gånger.
    4. Tvätta objektglasen i Coplin glasburk innehållande 50 mL 0,13 M 1-metylimidazol i 10 min, på RT, två gånger.
    5. Gäller 500 µL 0,16 M EDC lösning för längden på varje bild och inkubera bilder horisontellt för 1 h på RT, i en fuktig kammare.
    6. Skölj glasen i Coplin glasburk innehållande 50 mL 50 mM Tris pH 8,0 vid RT.
    7. Skölj glasen i Coplin glasburk innehållande 50 mL 1 x PBS på RT, två gånger.
      Obs: Både PFA och EDC fixering steg krävs för miRNA crosslinking och bör inte uteslutas. 31
  4. Endogena peroxidas block.
    1. Odling av objektglas i Coplin glasburk innehållande 50 mL 1% H2O2 för 30 min vid RT.
    2. Skölj glasen i Coplin glasburk innehållande 50 mL 1 x PBS på RT, två gånger.

3. hybridisering

  1. Förvärma hybridisering lösning (500 µL per bild) vid 50 ° C i hybridisering ugnen, tills måltemperaturen, nås (10 – 15 min).
  2. Förbereda hybridisering kammaren genom att placera 2 bitar av filter eller mjukpapper i botten av kammaren och blöta papperet med 50% formamid/1 x SSC.
    Försiktighet: Formamid skadar slemhinnor, ögon och hud, endast handtag i i dragskåp.
  3. Gäller 200 µL hybridisering lösning för längden på varje bild. Odling av objektglas horisontellt för 1 – 3 h vid 50 ° C, i en fuktig kammare.
  4. Bered den sonden genom att blanda 0,5 µL lager sonden (25 µM) i 250 µL ofhybridization lösning (slutlig koncentration 50 nM) i en 1,5 mL tub.
    Obs: Olika MicroRNA uttrycks på olika nivåer, så optimering angående sonden koncentrationen kan krävas för det här steget (1 – 50 nM), att undvika ingen signal eller hög bakgrund utveckling.
  5. Gäller 250 µL sonden lösning för längden på varje bild och placera ett RNase gratis täckglas på toppen. Undvika att bildningen bubblor.
  6. Noggrant försegla hybridisering kammaren med parafilm och inkubera O/N vid 50 ° C.
    Obs: Hybridisering temperaturen bör ställas ca 30 ° C under RNA smälttemperatur (Tm) av varje sond. Optimering kan krävas. Här, 50 ° C används som hybridisering/tvätt temperaturen för miRNA-182, justera för olika sonder.

4. stringens tvättar

  1. Prewarm 200 mL 2 x SSC vid 50 ° C i hybridisering ugnen, tills måltemperaturen uppnås (20 – 40 min).
  2. Tvätta objektglasen i Coplin glasburk innehållande 50 mL 2 x SSC vid 50 ° C i 5 min, eller tills coverslips lossa.
  3. Tvätta objektglasen i Coplin glasburk innehållande 50 mL 2 x SSC på RT i 5 minuter två gånger.
  4. Tvätta objektglasen i Coplin glasburk innehållande 50 mL 0,2 x SSC på RT för 5 min.
  5. Tvätta objektglasen i Coplin glasburk innehållande 50 mL PBST på RT för 5 min.
  6. Tvätta objektglasen i Coplin glasburk innehållande 50 mL 1 x PBS på RT för 5 min.
    Obs: Användning av RNase-fria villkor behövs inte längre eftersom de RNA-RNA hybrider anses stabil.

5. gräva påvisande av antikroppar

  1. Använd en hydrofoba penna att åter dra en vattenavvisande cirkel runt vävnaden på varje bild om det behövs.
  2. Tillsätt 500 µL av blockerande lösning till längden på varje bild. Odling av objektglas horisontellt för 30 min vid RT, i en fuktig kammare.
  3. Bered den gräva antikropp (1:1, 000) genom att späda 0,5 μL av gräva antikropp i 500 µL ofblocking lösning i en 1,5 mL tub.
    FÖRSIKTIGHET: Optimering kan krävas för det här steget (1: 500 – 1:2, 000).
  4. Gäller 500 µL gräva antikropp lösning för längden på varje bild. Odling av objektglas horisontellt för 1 h på RT, i en fuktig kammare.
  5. Tvätta objektglasen i Coplin glasburk innehållande 50 mL PBST på RT för 5 min, trefalt.
  6. Tvätta objektglasen i Coplin glasburk innehållande 50 mL prestaining lösning på RT i 5 minuter två gånger.
  7. Odling av objektglas i en polypropylen bild mailer burk innehållande 20 mL ofAP substratlösningen vid 37 ° C, för 6 – 24 h, skyddas från ljus.
    Försiktighet: Färgutveckling bör kontrolleras varje 2 h. optimering kan krävas för det här steget.
  8. Tvätta objektglasen i Coplin glasburk innehållande 50 mL KTBT lösning på RT i 5 minuter två gånger.
  9. Tvätta objektglasen i Coplin glasburk innehållande 50 mL 1 x PBS på RT för 5 min.

6. cTnT påvisande av antikroppar

  1. Använd en hydrofoba penna att åter dra en vattenavvisande cirkel runt vävnaden på varje bild om det behövs.
  2. Tillsätt 500 µL av blockerande lösning till längden på varje bild. Odling av objektglas horisontellt för 1 h på RT, i en fuktig kammare.
  3. Förbereda cTnT antikropp lösningen (1: 100) genom att späda 2 μL av cTnT antikropp i 200 μL ofblocking lösning i en 1,5 mL tub.
  4. Gäller 200 µL cTnT antikropp lösning för längden på varje bild. Odling av objektglas horisontellt O/N vid 4 ° C, i en fuktig kammare.
  5. Tvätta objektglasen i Coplin glasburk innehållande 50 mL 1 x PBS på RT för 5 min, trefalt.
  6. Bered den anti-rabbit-568 antikropp (1: 500) genom att späda 0,5 μL av anti-rabbit-568 antikropp i 250 μL ofblocking lösning i en 1,5 mL tub.
  7. Gäller 250 µL anti-rabbit-568 antikropp lösning för längden på varje bild. Odling av objektglas horisontellt för 1 h på RT, i en fuktig kammare.
  8. Tvätta objektglasen i Coplin glasburk innehållande 50 mL 1 x PBS på RT för 5 min, trefalt.
  9. Valfritt: Applicera 250 µL av DAPI fungerande lösning till längden på varje bild, och odling av objektglas horisontellt för 1 min på RT, skyddas från ljus.
  10. Tvätta objektglasen i Coplin glasburk innehållande 50 mL 1 x PBS på RT i 5 minuter två gånger.

7. montering och Imaging

  1. Montera bilder med 2 – 3 droppar monteringsmedium och ett glas täckglas. Låt glasen torka platt, O/N, vid 4 ° C, skyddas från ljus.
  2. Fortsätt till epifluorescerande eller konfokalmikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

miRNA i situ hybridisering var optimerad på mus hjärtat sektioner med en rusning miRNA och U6-snRNA, som tjänade som negativa och positiva kontroller respektive. Positiv färgning indikeras i blått, medan negativa färgningen indikeras av avsaknaden av färgutveckling (figur 1A-1B). Hjärtmuskelcellen uttryck av miRNA-182 bedömdes i hjärtat sektioner från kontroll och PlGF överuttryck av möss. Möss bära den PlGF transgenens under en αMHC promotor utveckla hjärthypertrofi, sekundärt till ökad angiogenes, inom 6 veckor av transgenens aktiveringen26. Vi utförde i situ hybridisering och hittade ökat uttryck av miRNA-182 i hjärtan av PlGF möss, jämfört med kontroller (figur 2A-2 H), anges av den blå färgning. För att avgöra vilka celltyper express miRNA-182, utfört vi sedan immunfärgning för cTnT på samma avsnitt. Vi hittade miRNA-182 Co lokaliserade med cTnT-positiv hjärtmuskelcellen celler, liksom DAPI missfärgade kärnor, i både kontroll och PlGF mus hjärtat sektioner (figur 2 c-2 H), framgår av de röda och blå färgning respektive. Dessa bilder var med ett 20 X-objektiv.

Figure 1
Figur 1: Negativ och positiv i situ hybridisering färgning. (A) In situ hybridisering för rusning miRNA (25 nM) i kontroll mus hjärtat sektioner. (B) In situ hybridisering för U6-snRNA (25 nM) i kontroll mus hjärtat sektioner. Skalstapeln = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: hjärtmuskelcellen uttryck av miRNA-182 i kontroll och PlGF mus hjärtan. (A-B) In situ hybridisering för miRNA-182 i kontroll och PlGF mus hjärtat sektioner. (C-D) Immunfärgning för cTnT i kontroll och PlGF mus hjärtat avsnitt som tidigare har färgats för miRNA-182. (E-F) DAPI från för cellkärnelokalisering i kontroll och PlGF mus hjärtat sektioner som tidigare har färgats för miRNA-182. (G-H) Sammanslagna bilder av miRNA-182 (djupblå), cTnT (röd) och DAPI (ljusblå) färgning för kontroll och PlGF mus hjärtat sektioner. Skalstapeln = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

miRNA avskrift upptäckt kan uppnås genom olika tekniker som varierar i känslighet, specificitet och kvantitativa makt. Här visar vi kopplingen av miRNA i situ hybridisering med immunfärgning och beskriva ett protokoll som möjliggör samtidiga bedömningen av de uttryck av miRNA och protein molekyler, på avsnitten samma hjärta. Vi visar först hur du utför i situ hybridisering av gräva-märkt LNA miRNA sonder på paraffin inbäddade hjärtat sektioner. Därefter beskriver vi hur du utför immunfärgning för cTnT på samma avsnitt. Slutligen visar vi hur till gå ihop den resulterande färgen och fluorescerande bilder. Detta protokoll har optimerats för Formalin fast (4 ° C, O/N) / Paraffin inbäddade mus hjärtat vävnader, med användning av gräva-märkt LNA miRNA sonder och cTnT. Ytterligare optimering kan krävas för olika vävnader, sond eller antikropp typer, som beskrivs nedan.

RNase-fria villkor bör genomföras noggrant hela stegen som leder upp till probe hybridisering, som RNase kontaminering kan allvarligt äventyra resultatet av experimentet. Alla lösningar bör göras med DEPC-behandlad ddH2O, och alla Coplin burkar bör behandlas med ett RNase sanering lösning. Dessutom bör följande överväganden beaktas när du arbetar med olika gräva-märkt LNA miRNA sonder. Hybridisering temperaturen beror på smälttemperatur (Tm) av varje sond. Som en allmän regel, bör en temperatur som är 30 ° C under given RNA Tm eller 20 ° C under given DNA Tm användas för sonden hybridisering. Dessutom bör perfekt sonden koncentrationen optimeras. Det ligger oftast mellan 1 – 50 nM. Slutligen, sonden innehållande hybridisering lösning kan värmas upp till 95 ° C i 5 min att denaturera några sekundära konstruktioner, om detta är ett problem. Ett viktigt steg att testa specificiteten av en sond, är speciellt när de används för första gången att inkludera en negativ (äggröra) samt som positiv (till exempel U6) kontroll sond, för att säkerställa experimentella framgång (figur 2). Liknande kontroller (till exempel en CD31 endothelial antikropp) bör användas under immunfärgning steg.

Ett vanligt problem i situ hybridisering experiment är utvecklingen av färgning artefakt/bakgrund signal. För att undvika eller minimera artefakt färgning steg, bör vävnaden skyddas mot uttorkning under alla steg, särskilt under långa inkubationer. Vi rekommenderar som täcker bilderna med RNase-fri coverslips under steget hybridisering, särskilt när höga temperaturer används, och användningen av befuktning chambers. Vi föreslår också att användningen av en 568 eller 594 fluorophore att upptäcka cTnT eller proteinet av intresse under immunfärgning steg. Detta kommer att eliminera eventuella autofluorescens som ofta uppstår med användningen av 488 fluorophores används på formaldehyd fasta vävnader.

En annan variabel rekommenderar vi att uppmärksamma är varaktigheten av AP färgning utveckling, vilket beror på nivåerna av de specifika miRNA närvarande i vävnaden. Vi föreslår att kontrollera AP färgning progression varje 2 h, för det första experimentet. Ytterligare optimering kan omfatta ändra temperaturen för inkubation (RT-37 ° C)-parametern. Slutligen, om bakgrunden börjar utveckla innan sanna miRNA sonden färgningen, eller om AP färgning lösning ändrar färg till blå-brun, föreslår vi handtvättar bilderna i PBST, och ersätta färglösningen med en nybryggd.

Slutligen, även om detta protokoll har optimerats för Formalin-fast/Paraffin-inbäddat mus hjärtat vävnader, det kan anpassas för alternativt bearbetade vävnader (PFA fast ULT inbäddade) och/eller användning av olika sond eller antikropp. En begränsning av kombinerar i situ hybridisering och immunfärgning som bör övervägas är att flera antikroppar binder till sina respektive epitoper, på grund av möjliga förstörelsen av de sistnämnda som vid de höga temperaturer som används under den hybridisering och stringens tvätt steg. Ytterligare begränsningar både i situ hybridisering och immunfärgning tekniker hänvisar oftast till kraften i dessa tekniker för att upptäcka mycket låga koncentrationer av miRNA eller protein molekyler respektive. Signalerar förstärkning kit finns att använda för antingen gräva eller antikropp upptäckt när miRNA eller protein överflöd är ett bekymmer. Sådana Kit ger också ett fluorescens alternativ för detektion av MicroRNA, som, när den kombineras med fluorescerande immunfärgning kan förenkla bild förvärv. Alternativa metoder, såsom Real-Time PCR och Western Blotting som har större känslighet, kan också behandla låg överflöd frågor. Tvärtemot i situ hybridisering/immunfärgning protokoll ger dessa tekniker dock ingen information på vävnadsspecifika lokaliseringen av miRNA och protein molekyler.

Sammanfattningsvis beskriver vi ett protokoll som ger samtidig identifiering av miRNA och protein molekyler på samma vävnad, som vi tror kommer att vara ett ovärderligt verktyg i miRNA forskning om musmodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Athanasios Papangelis, för kritiska synpunkter på manuskriptet. FM stöds av bioteknik och biologiska Sciences Research Council (BBSRC; BB/M009424/1). IP stöds av amerikanska hjärtat Association vetenskapsman utveckling bidraget (17SDG33060002).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethylpyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 DEPC
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 PBS
Tween-20 American Bioanalytical AB02038 non-ionic surfactant
Histoclear National Diagnostics HS-200
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Sigma Aldrich 3115879001 ProK
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 PFA
Sodium Chloride ThermoFisher S271 NaCl
Magnesium Chloride Hexahydrate ThermoFisher M33 MgCl2
Tris Sigma Aldrich T6066
Hydrochloric Acid Solution, 1 N ThermoFisher SA48 HCl
Hydrochloric Acid Solution, 12 N ThermoFisher S25358 HCl
1-Methylimidazole Sigma Aldrich 336092
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich 39391 EDC
Hydrogen peroxide solution H2O2 Sigma Aldrich 216763 H2O2
Trisodium citrate dihydrate Sigma Aldrich S1804 Sodium Citrate
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) Qiagen 339450 scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe QIagen YD00615701 5'-DIG and 3'-DIG labelled
Levamisol hydrochloride Sigma Aldrich 31742
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647 BSA
NBT/BCIP Tablets Sigma Aldrich 11697471001 NBT-BCIP
Potassium Chloride ThermoFisher P217 KCl
DAPI solution (1mg/ml) ThermoFisher 62248 DAPI
Glass coverslip ThermoFisher 12-545E Glass coverslip
Plastic coverslip Grace Bio-Labs HS40 22mmX40mmX0.25mm RNA-ase free plastic coverslip
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma Aldrich 11093274910 DIG antibody
Hydrophobic barrier pen Vector Laboratories H-4000 Pap pen
Anti-Cardiac Troponin T antibody Abcam ab92546 cTnT antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 ThermoFisher A-11011 anti-rabbit-568 antibody
Dako Fluorescence Mounting Medium DAKO S3023 mounting medium
Sheep serum Sigma Aldrich S3772
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Deionized Formamide American Bioanalytical AB00600
Hybridization Oven ThermoFisher UVP HB-1000 Hybridizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  2. Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
  3. Hutvagner, G., Zamore, P. D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science. 297, 2056-2060 (2002).
  4. Krol, J., et al. Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design. Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).
  5. Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. Vertebrate microRNA genes. Science. 299, 1540 (2003).
  6. Tian, T., Wang, J., Zhou, X. A review: microRNA detection methods. Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).
  7. Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. MicroRNAs potentiate neural development. Neuron. 64, 303-309 (2009).
  8. Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).
  9. Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. Embryonic stem cell-specific MicroRNAs. Developmental cell. 5, 351-358 (2003).
  10. Kasper, D. M., et al. MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos. Developmental cell. 40, 552-565 (2017).
  11. Liu, N., Olson, E. N. MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development. Developmental cell. 18, 510-525 (2010).
  12. Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
  13. Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).
  14. Ying, W., et al. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity. Cell. 171, 372-384 (2017).
  15. Perkins, D. O., et al. microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder. Genome biology. 8, R27 (2007).
  16. Miller, B. H., et al. MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).
  17. Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion. Cell. 152, 262-275 (2013).
  18. Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research. Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).
  19. Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
  20. Ikeda, S., et al. Altered microRNA expression in human heart disease. Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).
  21. Mann, M., et al. An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses. Nature Communications. 8, 851 (2017).
  22. O'Connell, R. M., et al. MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development. Immunity. 33, 607-619 (2010).
  23. Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy. Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).
  24. He, L., et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature. 447, 1130-1134 (2007).
  25. Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
  26. Li, N., et al. miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart. Science Reports. 6, 21228 (2016).
  27. Meerson, F. Z. Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency. Circulation Research. 10, 250-258 (1962).
  28. Tardiff, J. C. Cardiac hypertrophy: stressing out the heart. Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).
  29. Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2. Circulation. 128, 388-400 (2013).
  30. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146-e603 (2017).
  31. Pena, J. T., et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nature Methods. 6, 139-141 (2009).

Tags

Genetik fråga 139 mikro-RNA uttryck profilering LNA sond i situ hybridisering immunfärgning hjärthypertrofi
Vävnadsspecifika miRNA uttryck profilering i mus hjärtat sektioner med <em>In Situ</em> -hybridisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I.… More

Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I. Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (139), e57920, doi:10.3791/57920 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter