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Genetics

Tissu-spécifique miRNA, profilage de l’Expression à l’aide de la souris coeur Sections en hybridation in Situ

Published: September 15, 2018 doi: 10.3791/57920
Automatic Translation
1, 2, 3
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

Summary

micro-ARN (miARN) est des séquences d’ARN courts et très homologues, agissant comme organismes de réglementation post-transcriptionnelle des ARN messagers (ARNm). Les méthodes actuelles de détection de miRNA varient dans la sensibilité et la spécificité. Les auteurs décrivent un protocole qui combine l’hybridation in situ et immunostaining pour la détection simultanée de miRNA et protéine molécules sur des sections de tissu cardiaque souris.

Abstract

micro-ARN (miARN) est des transcriptions d’ARN simple brin qui se lient à des ARN messagers (ARNm) et inhibent leur traduction ou promouvoir leur dégradation. A ce jour, les miARN ont été impliqués dans un grand nombre de processus biologiques et la maladie, qui a signifié la nécessité pour les méthodes de détection fiable des transcriptions de miRNA. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour digoxigénine marqués (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) miRNA basée sur sonde détection, combiné avec la protéine immunostaining sur des sections de coeur de souris. Tout d’abord, nous avons réalisé une technique hybridation in situ à l’aide de la sonde pour identifier l’expression miRNA-182 dans les sections de centre de contrôle et de la souris de l’hypertrophie cardiaque. Ensuite, nous avons effectué immunostaining cardiaque protéine troponine T (cTnT), sur les mêmes sections, de localiser co miRNA-182 avec les cellules cardiomyocytes. Utilisant ce protocole, nous avons pu détecter miRNA-182 à travers une phosphatase alcaline selon Dosage colorimétrique et cTnT par coloration fluorescente. Ce protocole peut être utilisé pour détecter l’expression de n’importe quel miRNA d’intérêt au moyen de sondes LNA creuser-étiqueté et expression de la protéine pertinentes sur des sections de tissu cardiaque souris.

Introduction

micro-ARN (miARN) est courts (18 – 25 nucléotides), ARN monocaténaire, non codantes qui fonctionnent comme des régulateurs négatifs de l’expression des gènes au niveau post-transcriptionnel à inhiber la traduction de l’ARN messager (ARNm) et/ou promotion de dégradation de l’ARNm 1. miARN est transcrits d’introns ou des exons du codage ou non codantes des gènes et sont clivés dans le noyau par DROSHA, à précurseur miARN (pré-miARN), qui sont des structures de tige-boucle courte de 70 nucléotides2. Suite cytoplasmique à l’exportation, les pré-miARN est transformés par DICER en miARN matures qui s’étendent sur 18 – 25 nucléotides3,4. Par la suite, le complexe silencieux RNA-induced (RISC) intègre ces miARN comme ARN simple brin, qui permet leur liaison à la région 3' non traduite (3'-UTR) de leurs ARNm cible pour réprimer leur expression3,5 .

Dans les trois dernières décennies, puisqu’ils ont été d’abord identifiés, miARN ont émergé à maîtres régulateurs de l’expression des gènes, dont les niveaux d’expression sont étroitement contrôlé6. Rôles des miARN ont été décrits à l’orgue développement7,8,9,10,11,12, maintien de l’homéostasie du13,14 , ainsi que des contextes maladie qui incluent neurologiques15,16,17,18,19, cardiovasculaires20, maladies auto-immunes21 ,22et autres cancers23,2425. L’intérêt croissant pour la pertinence des modèles d’expression de miRNA a avancé la nécessité de méthodes de détection fiable des transcriptions de miRNA. Ces méthodes incluent PCR en temps réel, microarrays, Northern blot, hybridation in situ et autres, qui varient dans la sensibilité, la spécificité et la puissance quantitative, principalement dû au fait que miRNA transcriptions sont constituées de courtes et des séquences très homologues6.

Nous avons récemment rapporté un rôle important pour miRNA-182 dans le développement de l’hypertrophie myocardique26, une condition qui décrit l’adaptation structurelle du coeur en réponse aux demandes hémodynamiques élevé27,28. L’hypertrophie cardiaque se caractérise par l’augmentation de la masse myocardique, qui, si associé à retouche inadaptés29, peut conduire à un risque accru d’insuffisance cardiaque, une condition représentaient 8,5 % du total des décès attribuables aux cardiovasculaire 30de la maladie.

Nous décrivons ici notre protocole qui combine hybridation in situ avec une sonde (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) et les immuno-coloration pour la détection simultanée de miRNA et protéine molécules sur des sections de tissu de coeur de souris, digoxigénine marquée dans notre modèle de l’hypertrophie cardiaque.

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Protocol

Échantillons de tissu de coeur de souris pour cette étude ont été obtenus en conformité avec les lois et directives institutionnelles et ont été approuvés par le Comité d’utilisation et de Yale University Institutional Animal Care.

1. préparation de la solution

  1. Préparer la RNase ddH gratuit2O, en traitant les 5 L de ddH2O 5 ml de diéthylpyrocarbonate de 0,1 % (DEPC) pendant la nuit (O/N), à température ambiante (RT). Autoclave (121 ° C) pour désactiver le CPDE. Utilisation traitée DEPC ddH2O pour la préparation de solutions en aval comme indiqué.
    ATTENTION : DEPC est un cancérigène connu, seulement manipuler sous la hotte.
  2. Préparer 1 solution Saline tamponnée au Phosphate (PBS) de x en dissolvant 5 comprimés de PBS dans 1 L de ddH traitée DEPC2O. Autoclave (121 ° C).
  3. Préparer un détergent non ionique de 0,1 % / PBS (PBST) en diluant 1 mL de détergent non ionique pour 1 L de PBS 1 x.
  4. Préparer les 90 %, 70 %, 50 % et 30 % d’éthanol dans ddH traitée DEPC2O.
  5. Préparer un 10 mg/mL solution de protéinase K (ProK) dans ddH traitée DEPC2O. aliquote et conserver à-20 ° C. Préparer une solution de travail 20 μg/mL de ProK en diluant 100 μL de solution mère ProK dans 50 mL de ddH traitée DEPC2O. Make frais avant utilisation.
  6. Préparer 4 % paraformaldéhyde (PFA) en ajoutant 2 g de l’IFP dans 50 mL de PBS 1 x. Chauffer à 65 ° C sous agitation occasionnels, jusqu'à la dissolution. Aliquote et conserver à-20 ° C.
    ATTENTION : PFA est un cancérigène connu, seulement manipuler sous la hotte.
  7. Préparer une solution de NaCl à 3 M en ajoutant 87,8 g pour 500 mL de ddH2O. Autoclave (121 ° C).
  8. Préparer une solution 1 M de MgCl2 en ajoutant 20,3 g dans 100 mL de ddH2O. Autoclave (121 ° C).
  9. Préparer 1 M Tris pH 8.0 par dissolution 121,1 g dans 800 mL de ddH2O. ajuster le pH à 8.0 avec quelques gouttes de 1 N HCl, porter le volume à 1 L et autoclave (121 ° C). Préparer une solution de 50 mM Tris pH 8.0 en diluant 2,5 mL de 1 M Tris pH 8.0 à 47,5 mL de ddH2O.
  10. Préparer 1 M Tris pH 9,5 par dissolution 60,6 g dans 400 mL de ddH2O. ajuster le pH à 9,5 avec quelques gouttes de 1 N HCl, porter le volume à 500 mL et autoclave (121 ° C).
  11. Préparer 0,13 M 1-méthylimidazole pH 8.0 par dilution 1,6 mL de 1-méthylimidazole à 130 mL de ddH traitée DEPC2O. ajuster le pH à 8.0 avec environ 450 µL de 12 N HCl. Ajouter 16 mL de NaCl 3 M et porter le volume à 160 mL. Faire des frais avant utilisation.
    ATTENTION : 1-méthylimidazole est nocif pour la peau, des yeux et des muqueuses, seulement manipuler sous la hotte.
  12. Préparer le chlorhydrate de 0,16 M N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide (EDC) en diluant 176 µL d’EDC à 10 mL de 0,13 M 1-méthylimidazole. Ajuster le pH à 8,0 avec environ 100 µL de 12 N HCl. faire frais avant utilisation.
    ATTENTION : EDC est nocif pour la peau, des yeux et des muqueuses, seulement manipuler sous la hotte.
  13. Préparer 1 % H2O2 en diluant 1,5 mL 30 % H2O2 dans 50 mL de solution 1 PBS x. Faire des frais avant utilisation.
  14. Préparer 20 x SSC pH 7.0 en dissolvant 175,3 g de NaCl et 88,2 g de citrate de sodium (Na3C6H5O7) à 800 mL de ddH2O. ajuster le pH à 7.0 avec quelques gouttes de 1 N HCl, porter le volume à 1 L et autoclave (121 ° C).
    1. Préparer une solution de travail de 2 x SSC pH 7.0 en diluer 20 mL de 20 x SSC pH 7.0 à 180 mL de ddH2O.
    2. Préparer une solution de 1 x SSC pH 7.0 en diluant 2,5 mL de 20 x SSC pH 7.0 à 47,5 mL de ddH2O.
    3. Préparer une solution de 0,2 x SSC pH 7.0 en diluant 5 mL 2 x SSC pH 7.0 dans 45 ml de ddH2O.
  15. Préparer 1 x solution d’hybridation en diluant 0,5 mL de tampon ISH x microRNA 2 dans 0,5 mL de ddH traitée DEPC2O. Make frais avant utilisation.
  16. Préparer la solution mère de 200 mM de Levamisole en ajoutant 250 mg pour 5 mL de ddH2O. aliquote et conserver à-20 ° C.
  17. Préparer la solution de saturation pour l’étape 5 (10 % moutons serum/1% BSA/0,2 mM Levamisol) en diluer 1 mL de sérum de moutons dans 9 mL PBST et en ajoutant 0,1 g de BSA. Ajouter 10 μL de Levamisole avant d’utiliser. Faire des frais avant utilisation.
  18. Préparez-la solution blocage étape 6 (10 % chèvre serum/1% BSA) diluer 1 mL de sérum de chèvre dans 9 mL de PBST et l’ajout de 0,1 g de BSA. Conserver à 4 ° C et utiliser dans une semaine.
  19. Préparer une solution prestaining en diluant 3,3 mL de 3 M de NaCl 5 mL 1 M MgCl2, 10 mL de 1 M Tris pH 9.5, 100 µL de Tween-20, 100 µL de Levamisole en mL 81,5 ddH2O. Make fraîches avant leur utilisation.
  20. Utilisez le nitrobleu de tétrazolium (comprimés de phosphate (CBPI) NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indoly pour préparer les 20 mL de solution de substrat de Phosphatase alcaline (PA) selon les instructions du fabricant. Ajouter 20 μL de Levamisole. Faire des frais avant de l’utiliser et protéger de la lumière.
  21. Préparer la solution de KTBT en ajoutant 4 g de Tris, 4,4 g de NaCl et 375 mg de KCl dans 500 mL de ddH2O. Autoclave (121 ° C).
  22. Facultatif : Préparer une solution de travail DAPI (1 μg/mL) en diluant 50 μL de la solution DAPI (1 mg/mL) dans 50 mL de PBS 1 x.
    Remarque : Des solutions standards tels que NaCl 3 M, 1 M MgCl2, 1 M Tris-HCl, exempte de nucléase ddH2O, 1 x PBS et 20 x SSC peuvent être achetés par ailleurs. Pour ce protocole, les pots de 50 mL verre Coplin ou les mailer diapositive polypropylène 20 mL pots ont été utilisés.

2. préparation du tissu

Remarque : Les sections de coeur de souris utilisées ici ont été préparées par Yale pathologie tissulaire Services, du formol-fixe/paraffine tissu, couper à 5 μm et positionnées diapositives chargées.

  1. Réhydratation des tissus.
    1. Réchauffer les diapositives à 60 ° C pendant 10 min, au four jusqu'à ce que la paraffine est visiblement fonte hybridation.
    2. Incuber les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL d’agent de compensation disponible dans le commerce (voir Table des matières) pendant 10 minutes, deux fois.
    3. Incuber les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL d’éthanol à 100 % pendant 2 min, deux fois, suivie de l’éthanol à 90 % pendant 2 min, éthanol à 70 % pendant 2 min, deux fois, éthanol à 50 % pendant 2 min et 30 % éthanol pendant 2 min.
    4. Incuber les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de ddH traitée DEPC2O pendant 5 min.
    5. Incuber les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de PBS 1 x pendant 5 min.
  2. Tissu de-proteinating.
    1. Incuber les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de 20 μg/mL de solution de travail ProK, à 37 ° C pendant 15 min dans le four de l’hybridation.
      ATTENTION : Sous digestion peut entraîner à pauvres ou aucun aménagement de signal, tandis que la digestion excessive peut entraîner la dégradation des tissus et le développement de la coloration de fond. Optimisation peut-être être nécessaire pour cette étape (1 – 20 μg/mL ProK, 5 – 20 min d’incubation, RT-37 ° C).
    2. Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de PBS 1 x pendant 5 min, à la droite, deux fois.
  3. Fixation du tissu.
    1. Utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner un cercle hydrofuge autour du tissu sur chaque diapositive.
    2. Appliquer 500 µL de solution PFA de 4 % à la durée de chaque diapositive et incuber les lames horizontalement pendant 10 min, à température ambiante.
    3. Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de PBS 1 x pendant 5 min, à la droite, deux fois.
    4. Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de 0,13 M 1-méthylimidazole pendant 10 min, à la droite, deux fois.
    5. Appliquez 500 µL de solution d’EDC de 0,16 M à la longueur de la lame et incuber les lames horizontalement pendant 1 h à RT, dans une chambre humidifiée.
    6. Rincer les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de 50 mM Tris pH 8.0 à température ambiante.
    7. Rincer les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de PBS 1 x à la droite, deux fois.
      Remarque : Les étapes de fixation PFA et EDC sont requis pour la réticulation de miRNA et ne devraient pas être omises. 31
  4. Bloc de peroxydase endogène.
    1. Incuber les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL 1 % H2O2 pendant 30 min à température ambiante.
    2. Rincer les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de PBS 1 x à la droite, deux fois.

3. l’hybridation

  1. Le préchauffage de solution d’hybridation (500 µL par lame) à 50 ° C dans le four de l’hybridation, jusqu'à ce que la température de la cible, est atteinte (10 à 15 min).
  2. Préparer la chambre de l’hybridation en plaçant 2 morceaux de filtre ou de papier de soie dans le fond de la chambre et de mouiller le papier avec 50 % formamide/1 x SSC.
    ATTENTION : Le Formamide est nocif pour la peau, seule poignée sous la hotte, des yeux et des muqueuses.
  3. Appliquer 200 µL de solution d’hybridation à la longueur de la lame. Incuber les lames horizontalement pendant 1 à 3 h à 50 ° C, dans une chambre humidifiée.
  4. Préparer la solution de la sonde en mélangeant sonde stock de 0,5 µL (25 µM) dans 250 µL de solution d’ofhybridization (concentration finale 50 nM) dans un tube de 1,5 mL.
    Remarque : Différents miARN est exprimées à différents niveaux, donc optimisation concernant la concentration de la sonde peut être requise pour cette étape (1 à 50 nM), afin de n’éviter aucun signal ou développement de fond élevé.
  5. Appliquer 250 µL de solution de la sonde à la longueur de la lame et placer une lamelle couvre-objet gratuit RNase sur le dessus. Éviter la formation de bulles.
  6. Bien sceller la chambre hybridation avec parafilm et incuber O/N à 50 ° C.
    Remarque : La température d’hybridation doit être réglée entre 30 ° C au-dessous de la température de fusion de RNA (Tm) de chaque sonde. Optimisation peut être exigée. Ici, 50 ° C est utilisée comme la température d’hybridation/cycle de lavage pour miRNA-182, ajuster en fonction des différentes sondes.

4. rigueur lavages

  1. Préchauffer à 200 mL de 2 x SSC à 50 ° C dans le four de l’hybridation, jusqu'à ce que la température de consigne est atteinte (20 à 40 min).
  2. Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de 2 x SSC à 50 ° C pendant 5 min, ou jusqu'à ce que les lamelles desserrer.
  3. Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de 2 x SSC à RT pendant 5 minutes, deux fois.
  4. Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de 0,2 x SSC à RT pendant 5 min.
  5. Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de PBST RT pendant 5 min.
  6. Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de PBS 1 x à ta pendant 5 min.
    Remarque : Utilisation de conditions sans RNase n’est plus nécessaire puisque les hybrides ARN-ARN sont considérées comme stables.

5. creuser la détection des anticorps

  1. Utilisez un stylo hydrophobe pour re-dessiner un cercle hydrofuge autour du tissu sur chaque diapositive, si nécessaire.
  2. Déposer 500 µL de bloquant la solution à la longueur de la lame. Incuber les lames horizontalement pendant 30 min à la droite, dans une chambre humidifiée.
  3. Préparer la solution d’anticorps DIG (1:1, 000) en dilution 0,5 μL d’anticorps DIG dans 500 µL de solution d’ofblocking dans un tube de 1,5 mL.
    ATTENTION : L’optimisation peut être requise pour cette étape (1/500 – 1:2, 000).
  4. Appliquer 500 µL de solution d’anticorps de creuser à la longueur de la lame. Incuber les lames horizontalement pendant 1 h à RT, dans une chambre humidifiée.
  5. Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de PBST RT pendant 5 min, trois fois.
  6. Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de prestaining solution à ta pendant 5 minutes, deux fois.
  7. Incuber les lames dans un bocal de mailer polypropylène diapositive contenant 20 mL de solution de substrat ofAP à 37 ° C, pendant 6 à 24 h, abri de la lumière.
    ATTENTION : Développement de la couleur doit être vérifié que chaque 2 h. optimisation peuvent être nécessaires pour cette étape.
  8. Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de solution KTBT à RT pendant 5 minutes, deux fois.
  9. Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de PBS 1 x à ta pendant 5 min.

6. cTnT détection d’anticorps

  1. Utilisez un stylo hydrophobe pour re-dessiner un cercle hydrofuge autour du tissu sur chaque diapositive, si nécessaire.
  2. Déposer 500 µL de bloquant la solution à la longueur de la lame. Incuber les lames horizontalement pendant 1 h à RT, dans une chambre humidifiée.
  3. Préparer la solution d’anticorps cTnT (1/100) en diluant 2 μL d’anticorps cTnT en solution d’ofblocking 200 μL dans un tube de 1,5 mL.
  4. Appliquer 200 µL de solution d’anticorps cTnT à la longueur de la lame. Incuber les lames horizontalement O/N à 4 ° C, dans une chambre humidifiée.
  5. Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de PBS 1 x à ta pendant 5 min, trois fois.
  6. Préparer la solution d’anticorps anti-rabbit-568 (1/500) en dilution 0,5 μL d’anticorps anti-rabbit-568 dans la solution d’ofblocking 250 μL dans un tube de 1,5 mL.
  7. Appliquer 250 µL de solution d’anticorps anti-rabbit-568 à la longueur de la lame. Incuber les lames horizontalement pendant 1 h à RT, dans une chambre humidifiée.
  8. Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de PBS 1 x à ta pendant 5 min, trois fois.
  9. En option : Appliquer 250 µL de solution de travail DAPI à la longueur de la lame et incuber les lames horizontalement pendant 1 min à ta, abri de la lumière.
  10. Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de PBS 1 x à ta pendant 5 minutes, deux fois.

7. montage et imagerie

  1. Monter les lames avec 2 à 3 gouttes de milieu de montage et une lamelle de verre. Laisser les lames sécher à plat, O/N, à 4 ° C, abri de la lumière.
  2. Passez à épifluorescence ou microscopie confocale.

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Representative Results

hybridation de miRNA in situ a été optimisée sur des sections de coeur de souris à l’aide d’un scramble miRNA et U6-snRNA, qui ont servi de témoins positifs et négatifs respectivement. Une coloration positive est indiquée en bleu, tandis que la coloration négative est indiquée par le manque de développement de la couleur (Figure 1 a-1 b). Cardiomyocyte expression spécifique de miRNA-182 a été évaluée dans des sections de coeur de contrôle et de la souris surexprimant PlGF. Les souris portant le transgène PlGF sous un promoteur αMHC développent une hypertrophie cardiaque, consécutive à l’angiogenèse accrue, dans les 6 semaines du transgène activation26. Nous avons effectué de hybridation in situ et trouve une expression accrue de miRNA-182 dans les cœurs des souris PlGF, comparées aux témoins (Figure 2 a-2 H), indiqué par la coloration bleue. Pour déterminer quels types de cellules expriment miRNA-182, nous avons réalisé ensuite immunostaining pour cTnT sur les mêmes sections. Nous avons trouvé miRNA-182 localisée conjointement avec les cellules cardiomyocytes cTnT positifs, ainsi que DAPI teinté de noyaux, dans les sections de cœur pour le souris PlGF et contrôle (Figure 2-2 H), indiqué par le rouge et le bleu de respectivement. Ces images ont été avec un objectif 20 X.

Figure 1
Figure 1 : Négatifs et positifs en situ hybridation coloration. Hybridation In situ (A) pour miRNA scramble (25 nM) dans les sections de contrôle souris coeur. Hybridation In situ (B) pour les U6-snRNA (25 nM) dans les sections de contrôle souris coeur. Echelle = 100 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Cardiomyocyte expression spécifique de miRNA-182 en contrôle et PlGF souris coeurs. (A-B) Hybridation in situ pour miRNA-182 au contrôle et aux Articles de coeur PlGF souris. (C-D) Immunomarquage pour cTnT en contrôle et PlGF souris coeur sections qui ont été précédemment colorées pour miRNA-182. (E-F) DAPI contre-coloration pour localisation nucléaire au contrôle et au PlGF sections de coeur de souris qui ont été précédemment colorées pour miRNA-182. (G.-h.) Fusion d’images de miRNA-182 (bleu profond), cTnT (rouge) et DAPI (bleu clair) de coloration pour le contrôle et les sections de coeur PlGF souris. Echelle = 50 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

détection de transcription de miRNA est possible par le biais de différentes techniques qui varient dans la sensibilité, de spécificité et de puissance quantitative. Ici, nous démontrons l’accouplement de miRNA hybridation in situ avec immunostaining et décrire un protocole qui permet pour évaluer les niveaux d’expression des molécules de miRNA et protéine, sur les mêmes sections de coeur simultanée. Tout d’abord, nous montrons comment faire une hybridation in situ de creuser-étiquetée LNA miRNA sondes à sections de cœur de paraffine incorporé. Ensuite, nous décrivons comment exécuter immunostaining pour cTnT sur les mêmes sections. Finalement, nous démontrons comment fusionner la couleur résultante et les images fluorescentes. Ce protocole a été optimisé pour le formol fixe (4 ° C, O/N) / paraffine embedded tissus de souris de cœur, avec l’utilisation de sondes de miRNA LNA creuser-étiquetés et cTnT. Optimisation supplémentaire peut être requise pour les différents tissus, sonde ou types d’anticorps, comme indiqué ci-dessous.

Conditions sans RNase devraient être appliquées avec précaution dans les étapes qui conduisent à la sonde d’hybridation, comme la contamination de la RNase peut compromettre sérieusement le résultat de l’expérience. Toutes les solutions doivent être faites et traitée DEPC ddH2O, et tous les pots de Coplin devraient être traités avec une solution de décontamination de RNase. En outre, les considérations suivantes devraient tenir compte lorsque vous travaillez avec différentes sondes de miRNA LNA creuser-étiquetés. La température d’hybridation dépend de la température de fusion (Tm) de chaque sonde. En règle générale, une température de 30 ° c au-dessous de la Tm RNA donnée ou à 20 ° C au-dessous de la Tm d’ADN donnée devrait servir pour l’hybridation de la sonde. En outre, la concentration de sonde idéale doit être optimisée. Il se situe généralement entre 1 à 50 nM. Enfin, la sonde contenant la solution d’hybridation peut être chauffée à 95 ° C pendant 5 min dénaturer les structures secondaires, s’il s’agit d’un sujet de préoccupation. Une étape importante pour tester la spécificité d’une sonde, surtout lorsqu’il est utilisé pour la première fois, doit inclure une négatif (crypté) ainsi comme positive (par exemple U6) sonde de contrôle, afin d’assurer la réussite expérimentale (Figure 2). Contrôles similaires (par exemple un anticorps endothélial CD31) doivent être utilisés lors de l’étape d’immunomarquage.

Un problème courant dans les expériences d’hybridation in situ est le développement de signal d’artefact/fond de coloration. Pour éviter ou minimiser les artéfacts étapes de coloration, les tissus doivent être protégés ne se dessèchent pas dans toutes les étapes, plus précisément au cours de longues incubations. Nous vous recommandons couvrant les lames avec des lamelles de RNase-libre au cours de l’étape d’hybridation, particulièrement lorsqu’on utilise des températures élevées et l’utilisation des chambres d’humidification. Nous suggérons également l’utilisation d’un fluorophore 568 ou 594 pour détecter cTnT ou la protéine d’intérêt durant l’étape d’immunomarquage. Cela permettra d’éliminer toute autofluorescence qui se produit souvent avec l’utilisation de 488 fluorophores utilisés sur le formaldéhyde tissu fixé.

Une autre variable, à que nous vous recommandons de prêter attention est la durée d’AP coloration de développement, qui dépend des niveaux de la miRNA spécifique présent dans le tissu. Nous vous recommandons de vérifier la progression de coloration AP toutes les 2 h, pour la première expérience. Optimisation peut-être inclure des changement de température du paramètre d’incubation (RT-37 ° C). Enfin, si le fond commence à se développer avant la coloration de sonde de miRNA vrai ou si l’AP coloration solution change de couleur au bleu-brun, nous suggérons de laver les lames dans le PBST deux fois et remplacer la solution colorante par un fraîchement préparés.

Enfin, bien que ce protocole a été optimisé pour les tissus cardiaques formaline-fixes/paraffine souris, il peut être adapté pour tissus alternativement transformés (PFA fixe/OCT incorporé) et/ou de l’utilisation des différents types de sonde ou de l’anticorps. Une limitation de la combinaison de hybridation in situ et immunostaining que l'on devrait considérer est l’échec de plusieurs anticorps à lier leurs épitopes respectifs, en raison de la destruction possible de ceux aux températures élevées utilisées au cours de ce dernier l’hybridation et la rigueur étapes de lavage. Des restrictions supplémentaires de techniques d’immunohistochimie et hybridation in situ voir plus souvent à la puissance de ces techniques pour détecter de très faibles concentrations de molécules miRNA ou protéine respectivement. Kits d’amplification de signal peuvent être utilisés pour creuser ou anticorps de détection lorsque abondance miRNA ou protéine est une source de préoccupation. Ces kits offrent également une alternative de fluorescence pour la détection des miARN, qui, lorsqu’il est couplé avec l’immunomarquage fluorescent peut simplifier d’acquisition d’images. Des méthodes alternatives, telles que la PCR en temps réel et Western Blotting qui ont une plus grande sensibilité, peuvent également résoudre les problèmes de faible abondance. Cependant, contrairement à protocole in situ hybridation/immunomarquage, ces techniques fournissent pas d’information sur la localisation de tissu-spécifique des molécules miRNA/protéine.

En résumé, les auteurs décrivent un protocole qui permet la détection simultanée des molécules miRNA et protéines sur le même tissu, qui selon nous sera un outil précieux dans la recherche de miRNA sur modèles murins.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Athanasios Papangelis, des observations critiques sur le manuscrit. FM est pris en charge par le Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC ; BB/M009424/1). IP est pris en charge par l’American Heart Association scientifique Development Grant (17SDG33060002).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethylpyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 DEPC
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 PBS
Tween-20 American Bioanalytical AB02038 non-ionic surfactant
Histoclear National Diagnostics HS-200
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Sigma Aldrich 3115879001 ProK
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 PFA
Sodium Chloride ThermoFisher S271 NaCl
Magnesium Chloride Hexahydrate ThermoFisher M33 MgCl2
Tris Sigma Aldrich T6066
Hydrochloric Acid Solution, 1 N ThermoFisher SA48 HCl
Hydrochloric Acid Solution, 12 N ThermoFisher S25358 HCl
1-Methylimidazole Sigma Aldrich 336092
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich 39391 EDC
Hydrogen peroxide solution H2O2 Sigma Aldrich 216763 H2O2
Trisodium citrate dihydrate Sigma Aldrich S1804 Sodium Citrate
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) Qiagen 339450 scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe QIagen YD00615701 5'-DIG and 3'-DIG labelled
Levamisol hydrochloride Sigma Aldrich 31742
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647 BSA
NBT/BCIP Tablets Sigma Aldrich 11697471001 NBT-BCIP
Potassium Chloride ThermoFisher P217 KCl
DAPI solution (1mg/ml) ThermoFisher 62248 DAPI
Glass coverslip ThermoFisher 12-545E Glass coverslip
Plastic coverslip Grace Bio-Labs HS40 22mmX40mmX0.25mm RNA-ase free plastic coverslip
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma Aldrich 11093274910 DIG antibody
Hydrophobic barrier pen Vector Laboratories H-4000 Pap pen
Anti-Cardiac Troponin T antibody Abcam ab92546 cTnT antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 ThermoFisher A-11011 anti-rabbit-568 antibody
Dako Fluorescence Mounting Medium DAKO S3023 mounting medium
Sheep serum Sigma Aldrich S3772
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Deionized Formamide American Bioanalytical AB00600
Hybridization Oven ThermoFisher UVP HB-1000 Hybridizer

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References

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Génétique expression de micro-ARN numéro 139 profilage sonde LNA immunohistochimie hybridation in situ hypertrophie cardiaque
Tissu-spécifique miRNA, profilage de l’Expression à l’aide de la souris coeur Sections en hybridation in <em>Situ</em>
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Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I.… More

Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I. Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (139), e57920, doi:10.3791/57920 (2018).

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