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Genetics

टिशू-विशिष्ट miRNA में अभिव्यक्ति की रूपरेखा माउस दिल वर्गों में प्रयोग सीटू संकरण

Published: September 15, 2018 doi: 10.3791/57920
Automatic Translation
1, 2, 3
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

Summary

सूक्ष्म RNAs (miRNAs) छोटे और अत्यधिक मुताबिक़ आरएनए अनुक्रम, दूत RNAs (mRNAs) के बाद transcriptional नियामकों के रूप में सेवारत हैं । वर्तमान miRNA डिटेक्शन पद्धतियां संवेदनशीलता और विशिष्टता में बदलती हैं । हम एक प्रोटोकॉल है कि सीटू संकरण और माउस दिल ऊतक वर्गों पर miRNA और प्रोटीन अणुओं का समवर्ती पता लगाने के लिए immunostaining में जोड़ती है का वर्णन ।

Abstract

माइक्रो-RNAs (miRNAs) एकल-असहाय आरएनए टेप हैं जो दूत RNAs (mRNAs) को बाँधते हैं और उनके अनुवाद को बाधित करते हैं या उनके क्षरण को बढ़ावा देते हैं. तिथि करने के लिए, miRNAs जैविक और रोग प्रक्रियाओं है, जो miRNA टेप के विश्वसनीय पता लगाने के तरीकों की आवश्यकता का प्रतीक है की एक बड़ी संख्या में फंसाया गया है । यहां, हम digoxigenin के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन-लेबल (खुदाई) न्यूक्लिक एसिड बंद (LNA) जांच आधारित miRNA का पता लगाने, माउस दिल वर्गों पर प्रोटीन immunostaining के साथ संयुक्त । सबसे पहले, हम नियंत्रण और हृदय अतिवृद्धि चूहों से हृदय वर्गों में miRNA-१८२ अभिव्यक्ति की पहचान करने के लिए जांच का उपयोग कर सीटू संकरण तकनीक में एक प्रदर्शन किया । अगले, हम कार्डियक ट्रोपोनिन टी (cTnT) प्रोटीन के लिए immunostaining प्रदर्शन किया, एक ही वर्गों पर, सह करने के लिए miRNA-१८२ cardiomyocyte कोशिकाओं के साथ स्थानीयकृत । इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, हम एक alkaline फॉस्फेट आधारित वर्णमिति परख के माध्यम से miRNA-१८२ का पता लगाने में सक्षम थे, और फ्लोरोसेंट धुंधला के माध्यम से cTnT । इस प्रोटोकॉल के लिए खुदाई के माध्यम से ब्याज की किसी भी miRNA की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लेबल LNA जांच, और माउस दिल ऊतक वर्गों पर प्रासंगिक प्रोटीन अभिव्यक्ति ।

Introduction

माइक्रो-RNAs (miRNAs) लघु (18 – 25 न्यूक्लियोटाइड), एकल-कतरा, गैर-कोडिंग RNAs है जो दूत आरएनए (transcriptional) अनुवाद को बाधित करके mRNA स्तर पर जीन अभिव्यक्ति के नकारात्मक नियामकों के रूप में कार्य करता है या mRNA क्षरण को बढ़ावा देता है 1. miRNAs introns या कोडिंग या गैर कोडिंग जीन के exons से लिखित और DROSHA द्वारा नाभिक में सट रहे हैं, के प्रणेता miRNAs (पूर्व miRNAs), जो कम स्टेम ७० न्यूक्लियोटाइड2के पाश संरचनाओं हैं । cytoplasmic निर्यात के बाद, पूर्व miRNAs आगे परिपक्व miRNAs में DICER द्वारा संसाधित कर रहे है कि अवधि 18-25 न्यूक्लियोटाइड3,4। इसके बाद, आरएनए-प्रेरित मुंह बंद करने कॉम्प्लेक्स (RISC) को इन miRNAs को एकल-असहाय RNAs के रूप में शामिल किया गया है, जो उनके लक्ष्य UTR के 3 ' अनअनुवादित क्षेत्र (3 '-mRNAs) को उनकी अभिव्यक्ति को दबाने के लिए बाइंडिंग के लिए अनुमति देता है3,5 .

पिछले तीन दशकों के भीतर, क्योंकि वे पहली बार पहचाने गए थे, miRNAs जीन अभिव्यक्ति, जिनकी अपनी अभिव्यक्ति का स्तर कसकर6नियंत्रित कर रहे है के मास्टर नियामकों के लिए उभरा है । miRNAs के लिए भूमिकाएं अंग विकास में वर्णित किया गया है7,8,9,10,11,12, homeostasis के रखरखाव13,14 , साथ हीरोग संदर्भों कि स्नायविक15,16,17,18,19, हृदय20, स्व-प्रतिरक्षित शर्तों21 शामिल ,22, कैंसर23,24, और अंय25। miRNA अभिव्यक्ति पैटर्न की प्रासंगिकता के लिए बढ़ती सराहना आगे miRNA टेप के विश्वसनीय पता लगाने के तरीकों के लिए की जरूरत है लाया है । इस तरह के तरीकों में वास्तविक समय पीसीआर, microarrays, उत्तरी सोख्ता, सीटू संकरण और दूसरों में , जो संवेदनशीलता, विशिष्टता, और मात्रात्मक शक्ति में बदलती हैं, मुख्य रूप से तथ्य यह है कि miRNA टेप लघु और शामिल है के कारण अति मुताबिक़ जुगाड़6.

हम हाल ही में रोधगलन अतिवृद्धि26के विकास में miRNA-१८२ के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका की रिपोर्ट, एक ऊंचा hemodynamic मांगों के जवाब में दिल के संरचनात्मक अनुकूलन का वर्णन शर्त27,28। कार्डिएक अतिवृद्धि रोधगलन, जो, अगर maladaptive के साथ जुड़े29remodeling, दिल की विफलता के लिए बढ़ा जोखिम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं में वृद्धि की विशेषता है, सभी हृदय के लिए विशेषता मृत्यु का ८.५% के लिए एक स्थिति लेखांकन रोग३०.

यहां, हम अपने प्रोटोकॉल का वर्णन है कि एक digoxigenin के साथ सीटू संकरण में जोड़ती है लेबल (खुदाई) न्यूक्लिक एसिड (LNA) जांच और immunostaining के समवर्ती का पता लगाने के लिए miRNA और माउस दिल ऊतक वर्गों पर प्रोटीन अणुओं को बंद कर दिया, में हमारे कार्डियक अतिवृद्धि का मॉडल ।

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Protocol

इस अध्ययन के लिए माउस हार्ट टिशू के नमूने संबंधित कानूनों और संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुपालन में प्राप्त किए गए थे और येल विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे ।

1. समाधान तैयारी

  1. RNase मुक्त ddH2हे, ddH2o के 5 एल के इलाज के द्वारा ०.१% diethylpyrocarbonate (DEPC) रातोंरात (o/N), कमरे के तापमान (आरटी) में 5 मिलीलीटर तैयार । आटोक्लेव (१२१ ° c) DEPC को निष्क्रिय करने के लिए । संकेत के रूप में बहाव समाधान की तैयारी के लिए DEPC-इलाज ddH2हे का उपयोग करें ।
    चेतावनी: DEPC एक ज्ञात यलो है, केवल धुएं डाकू में संभाल ।
  2. DEPC-इलाज ddH2ओ आटोक्लेव (१२१ डिग्री सेल्सियस) के 1 एल में 5 पंजाबियों गोलियाँ भंग करके 1x फास्फेट बफर खारा (पंजाब) समाधान तैयार.
  3. ०.१% गैर ईओण डिटर्जेंट/कमजोर द्वारा (PBST) 1 गैर की मिलीलीटर-ईओण पंजाब के 1 एल प्रति
  4. तैयार ९०%, ७०%, ५०% और DEPC में 30% इथेनॉल-इलाज ddH2ओ ।
  5. Proteinase K (ProK) के DEPC-इलाज ddH2ओ. Aliquot और स्टोर में-20 डिग्री सेल्सियस में 10 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान तैयार करें । एक 20 μg/एमएल कमजोर द्वारा ProK के समाधान कार्य तैयार १०० μL ProK स्टॉक समाधान के ५० मिलीलीटर में DEPC-स्वास्थ्यकर्मी ddH2ओ. उपयोग करने से पहले ताजा करें ।
  6. 1x पंजाबस के ५० मिलीलीटर में 2 ग्राम पीएफए जोड़कर 4% paraformaldehyde (पीएफए) तैयार करें । ६५ ° c पर गर्मी सामयिक झटकों के साथ, जब तक भंग । Aliquot और-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    चेतावनी: पीएफए एक ज्ञात यलो है, केवल धुएं डाकू में संभाल ।
  7. ddH2ओ. आटोक्लेव (१२१ डिग्री सेल्सियस) के ५०० मिलीलीटर के लिए ८७.८ जी जोड़कर एक 3 मीटर NaCl समाधान तैयार करें ।
  8. ddH2ओ. आटोक्लेव (१२१ डिग्री सेल्सियस) के १०० मिलीलीटर के लिए २०.३ जी जोड़कर एक 1 मीटर MgCl2 समाधान तैयार करें ।
  9. ddH2ओ के ८०० मिलीलीटर में १२१.१ ग्राम को भंग करके 1 मीटर Tris पीएच ८.० तैयार करें । 1 एन एचसीएल की कुछ बूंदों के साथ पीएच को ८.० पर एडजस्ट कर लें, वॉल्यूम को 1 L और आटोक्लेव (१२१ डिग्री सेल्सियस) पर लाएं । ddH2ओ के ४७.५ एमएल में 1 मीटर Tris पीएच ८.० के कमजोर २.५ एमएल द्वारा ५० एमएम Tris पीएच ८.० का वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करें ।
  10. ddH2ओ के ४०० मिलीलीटर में ६०.६ ग्राम को भंग करके 1 मीटर Tris नं० ९.५ तैयार करें । 1 एन एचसीएल की कुछ बूंदों के साथ पीएच को ९.५ पर एडजस्ट कर लें, वॉल्यूम को ५०० एमएल और आटोक्लेव (१२१ डिग्री सेल्सियस) पर लाएं ।
  11. तैयार ०.१३ एम 1-Methylimidazole नं० ८.० द्वारा कमजोर १.६ मिलीलीटर की 1-Methylimidazole से १३० मिलीलीटर की DEPC-स्वास्थ्यकर्मी ddH2ओ. 12 एन एचसीएल के लगभग ८.० µ एल के साथ पीएच को ४५० से समायोजित करें । 3 एम NaCl के 16 मिलीलीटर जोड़ें और मात्रा को १६० मिलीलीटर में लाएं । उपयोग करने से पहले ताजा बनाओ ।
    चेतावनी: 1-Methylimidazole श्लेष्मा झिल्ली, आंखें, और त्वचा के लिए हानिकारक है, केवल धुएं डाकू में संभाल ।
  12. तैयार ०.१६ एम एन-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide हाइडरोक्लॉराइड (edc) द्वारा कमजोर १७६ µ एल edc के ०.१३ एम 1-Methylimidazole के 10 मिलीलीटर । 12 एन एचसीएल के लगभग १०० µ एल के साथ ८.० करने के लिए पीएच समायोजित करें । उपयोग करने से पहले ताज़ा करें ।
    चेतावनी: EDC श्लेष्मा झिल्ली, आंखें, और त्वचा के लिए हानिकारक है, केवल धुएं डाकू में संभाल ।
  13. 1x पंजाबस के ५० मिलीलीटर में 30% एच 2 ओ 2 की कमजोर१.५ एमएल द्वारा 1% एच2ओ2 तैयार करें । उपयोग करने से पहले ताजा बनाओ ।
  14. ddH2ओ के ८०० मिलीलीटर में NaCl के १७५.३ ग्राम और सोडियम साइट्रेट के ८८.२ ग्राम (एनए3सी6एच5ओ7) भंग करके 20x एसएससी पीएच ७.० तैयार करें । 1 N HCl की कुछ बूंदों के साथ ७.० करने के लिए पीएच समायोजित करें, 1 एल और आटोक्लेव (१२१ डिग्री सेल्सियस) के लिए मात्रा लाने के लिए ।
    1. 2x एसएससी पीएच ७.० के एक काम समाधान तैयार कमजोर द्वारा 20 मिलीलीटर 20x एसएससी पीएच ७.० के १८० मिलीलीटर में ddH2हे ।
    2. 1x एसएससी पीएच ७.० के एक काम समाधान तैयार कमजोर द्वारा २.५ एमएल 20x एसएससी पीएच ७.० के ४७.५ मिलीलीटर में ddH2हे ।
    3. कमजोर द्वारा 0.2 x ssc ph ७.० का एक काम समाधान तैयार करें 5 2x एसएससी पीएच ७.० के ४५ मिलीलीटर में ddH2ओ के 4 मिलीलीटर ।
  15. कमजोर द्वारा 1x संकरण समाधान तैयार करें ०.५ 2x microRNA ISH बफर के ०.५ मिलीलीटर में DEPC-इलाज ddH2ओ का उपयोग करने से पहले ताजा बनाओ ।
  16. ddH2ओ. Aliquot के 5 मिलीलीटर और-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए २५० मिलीग्राम जोड़कर Levamisole के २०० mM शेयर समाधान तैयार करें ।
  17. चरण 5 के लिए ब्लॉकिंग समाधान तैयार करें (10% भेड़ सीरम/1% BSA/0.2 mM Levamisol) कमजोर द्वारा 9 मिलीलीटर PBST में भेड़ सीरम की 1 मिलीलीटर, और जोड़ने के ०.१ g BSA । उपयोग करने से पहले Levamisole के 10 μL जोड़ें । उपयोग करने से पहले ताजा बनाओ ।
  18. चरण 6 के लिए ब्लॉकिंग समाधान तैयार करें (10% बकरी सीरम/1% BSA) कमजोर द्वारा PBST के 9 मिलीलीटर में बकरी सीरम के 1 मिलीलीटर, और जोड़ने ०.१ जी BSA की । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर और एक सप्ताह के भीतर का उपयोग करें ।
  19. कमजोर ३.३ एमएल 3 एम NaCl, 1 एम MgCl2के 5 मिलीलीटर, 1 मीटर Tris पीएच ९.५, १०० µ एल के बीच के-20, १०० µ एल के Levamisole के 4 मिलीलीटर के द्वारा पूर्व समाधान तैयार करें ddH2ओ के ८१.५ एमएल में 6. प्रयोग करने से पहले ताजा कर लें ।
  20. का प्रयोग करें nitroblue tetrazolium (एनबीटी)/5-bromo-4-chloro-3-indoly फॉस्फेट (BCIP) गोलियों के निर्माता के निर्देशों के अनुसार alkaline फॉस्फेट (एपी) सब्सट्रेट समाधान के 20 मिलीलीटर तैयार करने के लिए । Levamisole के 20 μL जोड़ें । उपयोग करने से पहले ताजा बनाओ और प्रकाश से रक्षा करना ।
  21. Tris के 4 जी, NaCl के ४.४ ग्राम और ३७५ मिलीग्राम ddH2ओ. आटोक्लेव (१२१ डिग्री सेल्सियस) के ५०० मिलीलीटर में KCl के KTBT समाधान तैयार करें ।
  22. वैकल्पिक: एक DAPI काम समाधान तैयार करें (1 μg/एमएल) कमजोर ५० μL द्वारा DAPI स्टॉक समाधान (1 मिलीग्राम/एमएल) 1x पंजाब के ५० मिलीलीटर में ।
    नोट: 3 एम NaCl, 1 एम MgCl2, 1 एम Tris-एचसीएल, nuclease-फ्री ddH2ओ, 1x पंजाबस और 20x एसएससी जैसे मानक समाधानों को वैकल्पिक रूप से खरीदा जा सकता है । इस प्रोटोकॉल के लिए ५० मिलीलीटर ग् Coplin जार या 20 एमएल के स् लाइड मेलर जार का इस् तेमाल किया गया है ।

2. टिशू वडा

नोट: यहां इस्तेमाल किया माउस दिल वर्गों येल पैथोलॉजी ऊतक सेवाओं द्वारा तैयार किया गया था, Formalin-फिक्स्ड/आयल-एंबेडेड ऊतक, 5 माइक्रोन पर कटौती और आरोप लगाया स्लाइड पर तैनात से ।

  1. ऊतक निर्जलीकरण ।
    1. 10 मिनट के लिए ६० ° c पर स्लाइड गर्म, संकरण ओवन में जब तक तेल दिख रहा है पिघलने ।
    2. एक गिलास Coplin जार में स्लाइडिंग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध समाशोधन एजेंट के ५० मिलीलीटर ( सामग्री की तालिकादेखें) 10 मिनट के लिए, दो बार ।
    3. एक गिलास Coplin 2 मिनट के लिए १००% इथेनॉल के ५० मिलीलीटर युक्त जार में स्लाइड, दो बार, 2 मिनट के लिए ९०% इथेनॉल, 2 मिनट के लिए ७०% इथेनॉल के बाद, दो बार, 2 मिनट के लिए ५०% इथेनॉल और 2 मिनट के लिए 30% इथेनॉल के बाद ।
    4. 5 मिनट के लिए DEPC-इलाज ddH2ओ की ५० मिलीलीटर युक्त एक गिलास Coplin जार में स्लाइड की मशीन ।
    5. 5 मिनट के लिए 1x पंजाबियों की ५० मिलीलीटर युक्त एक गिलास Coplin जार में स्लाइड की मशीन ।
  2. टिशू डे-proteinating ।
    1. संकरण ओवन में 15 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस से कम 20 μg/एमएल ProK काम समाधान के ५० मिलीलीटर युक्त एक गिलास Coplin जार में स्लाइडिंग ।
      चेतावनी: के तहत पाचन गरीब या कोई संकेत विकास में परिणाम हो सकता है, जबकि अधिक पाचन ऊतक क्षरण और पृष्ठभूमि धुंधला के विकास में परिणाम हो सकता है । इस चरण (1 – 20 μg/एमएल ProK, 5 – 20 मिन मशीन, आरटी-३७ ° c) के लिए ऑप्टिमाइज़ेशन की आवश्यकता हो सकती है ।
    2. आरटी में 5 मिनट, दो बार के लिए 1x पंजाब के ५० मिलीलीटर युक्त एक गिलास Coplin जार में स्लाइड धो लो ।
  3. ऊतक निर्धारण ।
    1. प्रत्येक स्लाइड पर ऊतक के चारों ओर एक पानी से बचाने वाली क्रीम सर्कल आकर्षित करने के लिए एक hydrophobic पेन का उपयोग करें ।
    2. लागू करें ५०० µ l के 4% पीएफए प्रत्येक स्लाइड की लंबाई के लिए समाधान और 10 मिनट के लिए क्षैतिज रूप से स्लाइड, आरटी पर ।
    3. आरटी में 5 मिनट, दो बार के लिए 1x पंजाब के ५० मिलीलीटर युक्त एक गिलास Coplin जार में स्लाइड धो लो ।
    4. एक गिलास Coplin जार में स्लाइड धो ०.१३ एम 1 की ५० मिलीलीटर-methylimidazole 10 मिनट के लिए, आरटी में, दो बार ।
    5. ०.१६ मीटर EDC समाधान के प्रत्येक स्लाइड की लंबाई के लिए ५०० µ लागू करें और एक humidified कक्ष में, आरटी पर 1 घंटे के लिए क्षैतिज गर्मी स्लाइड ।
    6. आरटी में ५० मिमी Tris पीएच ८.० की ५० मिलीलीटर युक्त एक गिलास Coplin जार में स्लाइड कुल्ला ।
    7. आर टी, दो बार में 1x पंजाबियों की ५० मिलीलीटर युक्त एक गिलास Coplin जार में स्लाइड कुल्ला ।
      नोट: miRNA crosslinking के लिए पीएफए और EDC निर्धारण चरण दोनों की आवश्यकता होती है और इसे छोड़ा नहीं जाना चाहिए । 31
  4. अंतर्जात peroxidase ब्लॉक.
    1. आरटी में 30 मिनट के लिए 1% एच2ओ2 के ५० मिलीलीटर युक्त एक गिलास Coplin जार में स्लाइड ।
    2. आर टी, दो बार में 1x पंजाबियों की ५० मिलीलीटर युक्त एक गिलास Coplin जार में स्लाइड कुल्ला ।

3. संकरण

  1. कचौरी संकरण सॉल्यूशन (५०० µ l प्रति स्लाइड) से ५० डिग्री सेल्सियस पर संकरण ओवन में, लक्ष्य तापमान तक, (१०-१५ मिनट) तक पहुँच जाता है ।
  2. चैंबर के तल में फिल्टर या टिशू पेपर के 2 टुकड़े रखकर संकरण चैंबर तैयार करने और ५०% formamide/1x एसएससी के साथ कागज गीला ।
    चेतावनी: Formamide श्लेष्मा झिल्ली, आंखों और त्वचा के लिए हानिकारक है, केवल धुएं हुड में संभाल ।
  3. प्रत्येक स्लाइड की लंबाई के लिए संकरण समाधान के २०० µ l लागू करें । एक humidified चैंबर में ५० डिग्री सेल्सियस पर 1-3 घंटे के लिए क्षैतिज स्लाइडिंग ।
  4. ०.५ µ l शेयर जांच (25 µ m) में २५० µ l ofhybridization सॉल्यूशन (अंतिम एकाग्रता ५० एनएम) एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में मिलाकर जांच समाधान तैयार करें ।
    नोट: अलग miRNAs विभिंन स्तरों पर व्यक्त कर रहे हैं, तो जांच एकाग्रता के बारे में अनुकूलन इस कदम के लिए आवश्यक हो सकता है (1-50 एनएम), कोई संकेत या उच्च पृष्ठभूमि विकास से बचने के लिए ।
  5. प्रत्येक स्लाइड की लंबाई के लिए जांच समाधान के २५० µ एल लागू करें और शीर्ष पर एक RNase मुक्त coverslip जगह है । बुलबुले के गठन से बचें ।
  6. ५० डिग्री सेल्सियस पर ध्यान से संकरण चैंबर सील parafilm और मशीन ओ/
    नोट: संकरण तापमान प्रत्येक जांच की आरएनए पिघलने तापमान (Tm) के नीचे लगभग 30 डिग्री सेल्सियस सेट किया जाना चाहिए । अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है । यहां, ५० ° c miRNA-१८२ के लिए संकरण/धो तापमान के रूप में प्रयोग किया जाता है, अलग जांच के लिए तदनुसार समायोजित ।

4. Stringency बहाकर

  1. संकरण ओवन में ५० डिग्री सेल्सियस पर 2x एसएससी के गर्म २०० मिलीलीटर, जब तक लक्ष्य तापमान (20-40 मिनट) तक पहुंच गया है ।
  2. 5 मिनट के लिए ५० डिग्री सेल्सियस पर 2x एसएससी की ५० मिलीलीटर युक्त एक गिलास Coplin जार में स्लाइड धो लें, या coverslips ढीला जब तक ।
  3. 5 मिनट, दो बार के लिए RT पर 2x एसएससी की ५० मिलीलीटर युक्त एक गिलास Coplin जार में स्लाइड धो लें ।
  4. 5 मिनट के लिए RT पर 0.2 x एसएससी की ५० मिलीलीटर युक्त एक गिलास Coplin जार में स्लाइड धो लें ।
  5. 5 मिनट के लिए RT पर PBST की ५० मिलीलीटर युक्त एक गिलास Coplin जार में स्लाइड धो लें ।
  6. 5 मिनट के लिए RT पर 1x पंजाबियों की ५० मिलीलीटर युक्त एक गिलास Coplin जार में स्लाइड धो लें ।
    नोट: आरएनए-आरएनए संकर स्थिर माना जाता है के बाद से RNase-मुक्त स्थितियों का उपयोग अब आवश्यक नहीं है ।

5. डीआईजी एंटीबॉडी डिटेक्शन

  1. यदि आवश्यक हो तो प्रत्येक स्लाइड पर ऊतक के आसपास एक पानी से बचाने वाली क्रीम सर्कल फिर से आकर्षित करने के लिए एक hydrophobic पेन का उपयोग करें ।
  2. प्रत्येक स्लाइड की लंबाई के लिए अवरोध समाधान के ५०० µ l लागू करें । एक humidified कक्ष में आरटी पर 30 मिनट के लिए क्षैतिज स्लाइड की मशीन ।
  3. खोदो एंटीबॉडी समाधान (1:1000) द्वारा कमजोर ०.५ μL खुदाई एंटीबॉडी में ५०० µ एल ofblocking समाधान में एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब ।
    चेतावनी: ऑप्टिमाइज़ेशन इस चरण के लिए आवश्यक हो सकता है (1:500 – 1:2000) ।
  4. प्रत्येक स्लाइड की लंबाई के लिए खोदो एंटीबॉडी समाधान के ५०० µ l लागू करें । एक humidified कक्ष में, आरटी पर 1 एच के लिए क्षैतिज स्लाइड की मशीन ।
  5. 5 मिनट, तीन बार के लिए RT पर PBST की ५० मिलीलीटर युक्त एक गिलास Coplin जार में स्लाइड धो लें ।
  6. एक गिलास Coplin जार में स्लाइड धो 5 मिनट, दो बार के लिए आर टी पर समाधान के दाग के ५० मिलीलीटर युक्त ।
  7. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिलीलीटर ofAP सब्सट्रेट समाधान युक्त एक के रूप में स्लाइड मेलर जार में स्लाइड की मशीन, 6 के लिए-24 एच, प्रकाश से सुरक्षित ।
    चेतावनी: रंग विकास की जांच की जानी चाहिए हर 2 एच अनुकूलन इस कदम के लिए आवश्यक हो सकता है ।
  8. 5 मिनट, दो बार के लिए RT पर KTBT समाधान की ५० मिलीलीटर युक्त एक गिलास Coplin जार में स्लाइड धो लें ।
  9. 5 मिनट के लिए RT पर 1x पंजाबियों की ५० मिलीलीटर युक्त एक गिलास Coplin जार में स्लाइड धो लें ।

6. cTnT एंटीबॉडी डिटेक्शन

  1. यदि आवश्यक हो तो प्रत्येक स्लाइड पर ऊतक के आसपास एक पानी से बचाने वाली क्रीम सर्कल फिर से आकर्षित करने के लिए एक hydrophobic पेन का उपयोग करें ।
  2. प्रत्येक स्लाइड की लंबाई के लिए अवरोध समाधान के ५०० µ l लागू करें । एक humidified कक्ष में, आरटी पर 1 एच के लिए क्षैतिज स्लाइड की मशीन ।
  3. तैयार cTnT एंटीबॉडी समाधान (1:100) द्वारा कमजोर 2 μL की cTnT एंटीबॉडी में २०० μL ofblocking सॉल्यूशन एक १.५ एमएल ट्यूब में ।
  4. प्रत्येक स्लाइड की लंबाई के लिए cTnT एंटीबॉडी समाधान के २०० µ l को लागू करें । एक humidified कक्ष में 4 ° c पर स्लाइड क्षैतिज रूप से ओ/
  5. 5 मिनट के लिए आरटी में 1x पंजाबियों की ५० मिलीलीटर युक्त एक गिलास Coplin जार में स्लाइड धो लो, तीन बार ।
  6. एंटी-खरगोश-५६८ एंटीबॉडी समाधान (1:500) को कमजोर ०.५ μL द्वारा एंटी-खरगोश-५६८ एंटीबॉडी में २५० μL ofblocking सॉल्यूशन में एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में तैयार करें ।
  7. प्रत्येक स्लाइड की लंबाई के लिए एंटी-खरगोश-५६८ एंटीबॉडी समाधान के २५० µ l को लागू करें । एक humidified कक्ष में, आरटी पर 1 एच के लिए क्षैतिज स्लाइड की मशीन ।
  8. 5 मिनट के लिए आरटी में 1x पंजाबियों की ५० मिलीलीटर युक्त एक गिलास Coplin जार में स्लाइड धो लो, तीन बार ।
  9. वैकल्पिक: प्रत्येक स्लाइड की लंबाई के लिए DAPI काम समाधान के २५० µ एल लागू करें, और आरटी पर 1 मिनट के लिए क्षैतिज स्लाइडिंग, प्रकाश से सुरक्षित ।
  10. 5 मिनट, दो बार के लिए RT पर 1x पंजाबियों की ५० मिलीलीटर युक्त एक गिलास Coplin जार में स्लाइड धो लें ।

7. बढ़ते और इमेजिंग

  1. माउंट बढ़ते माध्यम के 2-3 बूंदें और एक गिलास कवर स्लिप के साथ स्लाइड । स्लाइड को प्रकाश से सुरक्षित 4 ° c पर, समतल, O/
  2. epifluorescent या फोकल माइक्रोस्कोपी करने के लिए आगे बढ़ें ।

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Representative Results

सीटू संकरण में miRNA एक हाथापाई miRNA और U6-snRNA, जो क्रमशः नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य का उपयोग कर माउस दिल वर्गों पर अनुकूलित किया गया था । सकारात्मक धुंधला नीला में संकेत दिया है, जबकि नकारात्मक धुंधला रंग विकास (आंकड़ा 1a-1 बी) की कमी से संकेत मिलता है । miRNA-१८२ के Cardiomyocyte विशिष्ट अभिव्यक्ति नियंत्रण और PlGF चूहों को व्यक्त करने से हृदय वर्गों में मूल्यांकन किया गया था । एक αMHC प्रवर्तक के तहत PlGF transgene ले जाने वाले चूहों कार्डियक अतिवृद्धि का विकास, angiogenesis के 6 सप्ताह के भीतर वृद्धि हुई transgene के लिए,26सक्रियण । हम सीटू संकरण में प्रदर्शन किया और PlGF चूहों के दिलों में miRNA-१८२ की वृद्धि की अभिव्यक्ति पाया, नियंत्रण की तुलना में (चित्रा 2a-2H), नीले दाग से संकेत दिया. जो सेल प्रकार एक्सप्रेस miRNA-१८२ निर्धारित करने के लिए, हम तो cTnT के लिए एक ही वर्गों पर immunostaining प्रदर्शन किया । हमने पाया miRNA-१८२ सह cTnT-सकारात्मक cardiomyocyte कोशिकाओं के साथ स्थानीयकृत, साथ ही साथ DAPI सना हुआ नाभिक, दोनों नियंत्रण और PlGF माउस दिल वर्गों में (चित्रा 2c2H), क्रमशः लाल और नीले दाग से संकेत दिया । ये छवियां एक 20X उद्देश्य के साथ थे ।

Figure 1
चित्र 1: सीटू संकरण धुंधला में नकारात्मक और सकारात्मक । (A) नियंत्रण माउस हृदय अनुभागों में हाथापाई miRNA (25 एनएम) के लिए सीटू संकरण में । (ख) नियंत्रण माउस हृदय अनुभागों में U6-snRNA (२५ एनएम) के लिए सीटू संकरण में . स्केल बार = १०० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Cardiomyocyte miRNA के विशिष्ट अभिव्यक्ति-१८२ नियंत्रण और PlGF माउस दिल में । (A-B) सीटू संकरण में miRNA-१८२ के लिए कंट्रोल और PlGF माउस हार्ट सेक्शन में है । (सी-डी) नियंत्रण और PlGF माउस दिल वर्गों है कि पहले miRNA के लिए दाग दिया गया है में cTnT के लिए Immunostaining-१८२ । (E-F) DAPI नियंत्रण और PlGF माउस दिल वर्गों है कि पहले miRNA के लिए दाग दिया गया है में परमाणु स्थानीयकरण के लिए counterstaining-१८२ । (जी-एच) miRNA-१८२ (डीप ब्लू), cTnT (लाल) और DAPI (हल्के नीले रंग) के विलय छवियों नियंत्रण और PlGF माउस दिल वर्गों के लिए धुंधला । स्केल बार = ५० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

miRNA प्रतिलिपि का पता लगाने विभिंन तकनीकों है कि संवेदनशीलता, विशिष्टता और मात्रात्मक शक्ति में भिंनता के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है । यहां, हम immunostaining के साथ सीटू संकरण में miRNA के युग्मन प्रदर्शन और एक प्रोटोकॉल है कि miRNA और प्रोटीन अणुओं की अभिव्यक्ति के स्तर के समवर्ती आकलन के लिए अनुमति देता है का वर्णन है, एक ही दिल वर्गों पर । हम पहले दिखाएं कैसे खुदाई की सीटू संकरण में प्रदर्शन करने के लिए-LNA आयल एंबेडेड दिल वर्गों पर miRNA जांच लेबल । अगला, हम वर्णन कैसे एक ही वर्गों पर cTnT के लिए immunostaining करने के लिए । अंत में, हम प्रदर्शित कैसे परिणामी रंग और फ्लोरोसेंट छवियों को विलय करने के लिए । इस प्रोटोकॉल तय Formalin के लिए अनुकूलित किया गया है (4 ° c, O//Paraffin एंबेडेड माउस दिल के ऊतकों, खुदाई के उपयोग के साथ-लेबल LNA miRNA जांच और cTnT । अतिरिक्त अनुकूलन विभिंन ऊतकों, जांच या एंटीबॉडी प्रकार के लिए आवश्यक हो सकता है, के रूप में नीचे उल्लिखित ।

RNase-मुक्त स्थितियों सावधानी से जांच संकरण करने के लिए नेतृत्व में कदम भर में लागू किया जाना चाहिए, के रूप में RNase संक्रमण गंभीर रूप से प्रयोग के परिणाम समझौता कर सकते हैं । सभी समाधान DEPC-इलाज ddH2ओ के साथ किया जाना चाहिए, और सभी Coplin जार एक RNase संक्रमण समाधान के साथ इलाज किया जाना चाहिए । इसके अतिरिक्त, निंनलिखित बातों को ध्यान में रखा जाना चाहिए जब विभिंन खोदो-लेबल LNA miRNA जांच के साथ काम कर रहे । संकरण तापमान प्रत्येक जांच के पिघलने तापमान (Tm) पर निर्भर करता है । एक सामान्य नियम के रूप में, दिया गया आरएनए टीएम नीचे 30 डिग्री सेल्सियस या दिए गए डीएनए टीएम नीचे 20 डिग्री सेल्सियस है कि एक तापमान जांच संकरण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । इसके अलावा, आदर्श जांच एकाग्रता अनुकूलित किया जाना चाहिए । यह आमतौर पर 1 के बीच है-50 एनएम । अंत में, संकरण समाधान युक्त जांच किसी भी माध्यमिक संरचनाओं स्वभाव करने के लिए 5 मिनट के लिए ९५ ° c करने के लिए गरम किया जा सकता है, अगर यह एक चिंता का विषय है । एक महत्वपूर्ण कदम जांच की विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए, खासकर जब पहली बार के लिए इस्तेमाल किया, एक नकारात्मक शामिल है (तले) के रूप में अच्छी तरह के रूप में सकारात्मक (उदाहरण के लिए U6) नियंत्रण जांच, प्रयोगात्मक सफलता सुनिश्चित करने के लिए (चित्रा 2) । समान नियंत्रण (उदाहरण के लिए एक CD31 endothelial एंटीबॉडी) immunostaining चरण के दौरान उपयोग किया जाना चाहिए ।

में एक आम समस्या सीटू संकरण प्रयोगों धुंधला विरूपण साक्ष्य/पृष्ठभूमि संकेत का विकास है । से बचने या विरूपण साक्ष्य धुंधला कदम कम करना, ऊतक सभी चरणों में बाहर सुखाने से संरक्षित किया जाना चाहिए, विशेष रूप से लंबी गर्मी के दौरान । हम संकरण चरण के दौरान RNase मुक्त coverslips के साथ स्लाइड को कवर करने की अनुशंसा करते हैं, विशेष रूप से जब उच्च तापमान का उपयोग किया जाता है, और humidifying कक्षों का उपयोग. हम भी immunostaining कदम के दौरान cTnT या ब्याज की प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक ५६८ या ५९४ fluorophore के उपयोग का सुझाव देते हैं । यह किसी भी autofluorescence कि अक्सर ४८८ के उपयोग के साथ उठता है खत्म हो जाएगा fluorophores formaldehyde तय ऊतकों पर इस्तेमाल किया ।

एक और चर हम ध्यान देने की सिफारिश की अवधि एपी धुंधला विकास, जो विशिष्ट ऊतक में मौजूद miRNA के स्तर पर निर्भर करता है । हम पहले प्रयोग के लिए हर 2 ज, एपी धुंधला प्रगति की जांच का सुझाव देते हैं । इसके अलावा अनुकूलन गर्मी (आरटी-३७ डिग्री सेल्सियस) पैरामीटर के तापमान में परिवर्तन शामिल हो सकते हैं । अंत में, अगर पृष्ठभूमि के लिए सच miRNA जांच धुंधला से पहले विकसित करने के लिए शुरू होता है, या यदि एपी धुंधला समाधान नीले रंग के लिए, ब्राउन, हम PBST में स्लाइड धोने का सुझाव दो बार, और एक हौसले से एक बना के साथ धुंधला समाधान की जगह ।

अंत में, हालांकि इस प्रोटोकॉल Formalin के लिए अनुकूलित किया गया है-फिक्स्ड/आयल-एंबेडेड माउस दिल के ऊतकों, यह वैकल्पिक रूप से संसाधित ऊतकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (पीएफए फिक्स्ड/ सीटू संकरण और immunostaining है कि विचार किया जाना चाहिए में संयोजन की एक सीमा कई एंटीबॉडी की विफलता के लिए अपने संबंधित epitopes को बांध, उच्च के दौरान इस्तेमाल किया तापमान पर उत्तरार्द्ध लोगों के संभावित विनाश के कारण है संकरण और stringency धुलाई के स्टेप्स । सीटू संकरण और immunostaining तकनीकों में दोनों की आगे की सीमाएं सबसे अधिक बार क्रमशः miRNA या प्रोटीन अणुओं के बहुत कम सांद्रता का पता लगाने के लिए इन तकनीकों की शक्ति का उल्लेख है । संकेत प्रवर्धन किट या तो खुदाई या एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए उपयोग करने के लिए उपलब्ध है जब miRNA या प्रोटीन बहुतायत एक चिंता का विषय है । इस तरह के किट भी miRNAs, जो, जब फ्लोरोसेंट immunostaining के साथ युग्मित छवि अधिग्रहण को सरल कर सकते है का पता लगाने के लिए एक प्रतिदीप्ति विकल्प प्रदान करते हैं । वैकल्पिक तरीकों, जैसे वास्तविक समय पीसीआर और पश्चिमी सोख्ता है कि अधिक से अधिक संवेदनशीलता है, भी कम बहुतायत मुद्दों का पता कर सकते हैं । हालांकि, इसके विपरीत में सीटू संकरण/immunostaining प्रोटोकॉल, इन तकनीकों miRNA/प्रोटीन अणुओं के ऊतक विशिष्ट स्थानीयकरण पर कोई जानकारी प्रदान करते हैं ।

संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, हम एक प्रोटोकॉल है कि एक ही ऊतक है, जो हम miRNA अनुसंधान में माउस मॉडल पर एक अमूल्य उपकरण होगा विश्वास पर एक साथ miRNA और प्रोटीन अणुओं का पता लगाने प्रदान करता है का वर्णन ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि पर महत्वपूर्ण टिप्पणी के लिए Athanasios Papangelis, शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । एफएम जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित है (BBSRC; BB/M009424/ आईपी अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन वैज्ञानिक विकास अनुदान (17SDG33060002) द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethylpyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 DEPC
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 PBS
Tween-20 American Bioanalytical AB02038 non-ionic surfactant
Histoclear National Diagnostics HS-200
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Sigma Aldrich 3115879001 ProK
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 PFA
Sodium Chloride ThermoFisher S271 NaCl
Magnesium Chloride Hexahydrate ThermoFisher M33 MgCl2
Tris Sigma Aldrich T6066
Hydrochloric Acid Solution, 1 N ThermoFisher SA48 HCl
Hydrochloric Acid Solution, 12 N ThermoFisher S25358 HCl
1-Methylimidazole Sigma Aldrich 336092
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich 39391 EDC
Hydrogen peroxide solution H2O2 Sigma Aldrich 216763 H2O2
Trisodium citrate dihydrate Sigma Aldrich S1804 Sodium Citrate
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) Qiagen 339450 scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe QIagen YD00615701 5'-DIG and 3'-DIG labelled
Levamisol hydrochloride Sigma Aldrich 31742
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647 BSA
NBT/BCIP Tablets Sigma Aldrich 11697471001 NBT-BCIP
Potassium Chloride ThermoFisher P217 KCl
DAPI solution (1mg/ml) ThermoFisher 62248 DAPI
Glass coverslip ThermoFisher 12-545E Glass coverslip
Plastic coverslip Grace Bio-Labs HS40 22mmX40mmX0.25mm RNA-ase free plastic coverslip
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma Aldrich 11093274910 DIG antibody
Hydrophobic barrier pen Vector Laboratories H-4000 Pap pen
Anti-Cardiac Troponin T antibody Abcam ab92546 cTnT antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 ThermoFisher A-11011 anti-rabbit-568 antibody
Dako Fluorescence Mounting Medium DAKO S3023 mounting medium
Sheep serum Sigma Aldrich S3772
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Deionized Formamide American Bioanalytical AB00600
Hybridization Oven ThermoFisher UVP HB-1000 Hybridizer

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References

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आनुवंशिकी अंक १३९ सूक्ष्म आरएनए अभिव्यक्ति profile LNA जांच सीटू संकरण immunostaining कार्डियक अतिवृद्धि में
टिशू-विशिष्ट miRNA में अभिव्यक्ति की रूपरेखा माउस दिल वर्गों में प्रयोग <em>सीटू</em> संकरण
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Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I.… More

Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I. Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (139), e57920, doi:10.3791/57920 (2018).

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