Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Weefsel-specifieke miRNA expressie profilering in muis hart secties gebruiken In Situ hybridisatie

Published: September 15, 2018 doi: 10.3791/57920
Automatic Translation
1, 2, 3
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

Summary

Micro-RNAs (miRNAs) zijn korte en zeer homologe RNA-sequenties, post-transcriptional regulatoren van messenger RNAs (mRNAs) bijeenkomen. Huidige miRNA detectiemethoden verschillen in gevoeligheid en specificiteit. We beschrijven een protocol dat in situ hybridisatie en immunokleuring voor gelijktijdige detectie van miRNA en eiwit moleculen op muis hart weefselsecties combineert.

Abstract

Micro-RNAs (miRNAs) zijn single-stranded RNA afschriften die binden aan messenger RNAs (mRNAs) en hun vertaling remmen of bevorderen van hun afbraak. Tot op heden zijn miRNAs betrokken bij een groot aantal biologische en ziekte processen, die de behoefte aan betrouwbare detectiemethoden van miRNA afschriften heeft aangegeven. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor heksenkruid-label (DIG) vergrendeld Nucleic Acid (LNA) sonde gebaseerde miRNA detectie, gecombineerd met eiwit immunokleuring op muis hart secties. Voor het eerst, we een in situ hybridisatie techniek met behulp van de sonde te identificeren van miRNA-182 expressie in hart secties van controle en hypertrofie van het hart muizen uitgevoerd. Vervolgens hebben we uitgevoerd immunokleuring voor cardiale troponine T (cTnT) eiwit, op dezelfde baanvakken, mede lokaliseren miRNA-182 met de cardiomyocyte cellen. Met behulp van dit protocol, waren wij kundig voor speurder miRNA-182 via een alkalische fosfatase gebaseerd colorimetrische bepaling, en cTnT door middel van fluorescerende vlekken. Dit protocol kan worden gebruikt om de uitdrukking van een miRNA van belang door DIG-geëtiketteerden LNA sondes, en relevante eiwit expressie op muis hart weefselsecties te detecteren.

Introduction

Micro-RNAs (miRNAs) zijn korte (18-25 nucleotiden), single-stranded, noncoding RNAs die als negatieve regelgevers van genexpressie op post-transcriptional niveau functioneren door remming van de boodschapper-RNA (mRNA) vertaling en/of bevordering van de aantasting van het mRNA 1. miRNAs zijn transcriptie van introns of exons van codering of noncoding genen en zijn in de nucleus door DROSHA, aan de voorloper van miRNAs (pre-miRNAs), die korte stam-lus structuren van 70 nucleotiden2gekloofd. Na cytoplasmatische exporteren, pre-miRNAs zijn verder verwerkt door DICER tot volwassen miRNAs die zich uitstrekken van 18-25 nucleotiden3,4. Vervolgens neemt het RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC) deze miRNAs als single-stranded RNAs, die het mogelijk voor hun binding aan de 3' niet-vertaalde regio (3'-UTR) van hun doel mRNAs maakt te onderdrukken hun expression3,5 .

Binnen de laatste drie decennia, aangezien ze voor het eerst werden geïdentificeerd, miRNAs opgedoken aan meester regelgevers van genexpressie, wiens eigen expressie niveaus strak gecontroleerde6 zijn. Rollen voor miRNAs zijn beschreven in orgel ontwikkeling7,8,9,10,11,12, onderhoud van homeostase13,14 , evenals ziekte contexten waarin neurologische15,16,17,18,19, cardiovasculaire20, auto-immune voorwaarden21 ,22, kankers23,24, e.a.25. De toenemende appreciatie voor de relevantie van miRNA expressiepatronen heeft de behoefte aan betrouwbare detectiemethoden van miRNA afschriften naar voren gebracht. Dergelijke methoden omvatten Real Time PCR, microarrays, het noordelijke bevlekken, in situ hybridisatie en anderen, die in de gevoeligheid, specificiteit en kwantitatieve macht, overwegend verschillen wijten aan het feit dat de miRNA Transcripten bestaan uit korte en zeer homologe reeksen6.

Onlangs meldden wij een belangrijke rol voor miRNA-182 in de ontwikkeling van de myocardiale hypertrofie26, een aandoening met een beschrijving van de structurele aanpassing van het hart in reactie op verhoogde hemodynamische eisen27,28. Hypertrofie van het hart wordt gekenmerkt door de toename van de myocardiale massa, die indien gekoppeld maladaptieve remodelleert29, kan leiden tot verhoogd risico op hartfalen, een aandoening die goed voor 8,5% van alle sterfgevallen toe te schrijven aan cardiovasculaire ziekte30.

Hier beschrijven we onze protocol dat in situ hybridisatie combineert met een heksenkruid-label (DIG) vergrendeld Nucleic Acid (LNA) sonde en immunokleuring voor de gelijktijdige detectie van miRNA en eiwit moleculen op muis hart weefselsecties, in onze model voor hypertrofie van het hart.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Muis hart weefselmonsters voor deze studie werden verkregen met inachtneming van de relevante wetten en institutionele richtsnoeren en door Yale University institutionele Animal Care en gebruik Comité zijn goedgekeurd.

1. oplossing voorbereiding

  1. RNase gratis ddH2O voor te bereiden, door de behandeling van 5 L van ddH2O met 5 mL 0,1% diethylpyrocarbonate (DEPC) 's nachts (O/N), bij kamertemperatuur (RT). Autoclaaf (121 ° C) om te schakelen van de DEPC. Gebruik DEPC-behandelde ddH2O voor de bereiding van downstream oplossingen als aangegeven.
    Let op: DEPC is een bekend carcinogeen, alleen behandelen in de zuurkast.
  2. Bereid 1 x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing door ontbinding 5 PBS tabletten in 1 L DEPC-behandelde ddH2O. autoclaaf (121 ° C).
  3. 0,1% niet-ionogene wasmiddel/PBS (PBST) bereid door verdunning van 1 mL van de niet-ionogene wasmiddel per 1 L 1 x PBS.
  4. Bereiden van 90%, 70%, 50% en 30% ethanol in DEPC-behandelde ddH2O.
  5. Bereiden van een 10 mg/mL stockoplossing van proteïnase K (ProK) in DEPC-behandelde ddH2O. Aliquot en opgeslagen bij-20 ° C. Een 20 μg/mL werkoplossing van ProK door verdunnen 100 μl van de stockoplossing ProK in 50 mL DEPC-behandelde ddH2O. Make vóór gebruik vers bereiden.
  6. Bereiden 4% paraformaldehyde (PFA) door toevoeging van 2 g PFA in 50 mL 1 x PBS. Verwarm bij 65 ° C, met af en toe schudden, totdat opgelost. Aliquot en winkel bij-20 ° C.
    Let op: PFA is een bekend carcinogeen, alleen behandelen in de zuurkast.
  7. Bereid een NaCl-oplossing van 3 M door 87.8 g toe te voegen aan 500 mL ddH2O. autoclaaf (121 ° C).
  8. Bereid een 1 M MgCl2 -oplossing door het toevoegen van 20.3 g tot 100 mL van ddH2O. autoclaaf (121 ° C).
  9. 1 M Tris pH 8,0 door oplossen 121.1 g in 800 mL ddH2O. aanpassen de pH ten slotte op 8.0 met een paar druppels 1 N HCl voor te bereiden, zodat het volume 1 L en autoclaaf (121 ° C). Een werkoplossing van 50 mM Tris pH 8,0 bereiden door verder verdunnen van 2.5 mL 1 M Tris pH 8.0 in 47,5 mL ddH2O.
  10. 1 M Tris pH 9.5 door oplossen 60,6 g in 400 mL zuiver ddH2O. Adjust pH 9,5 met een paar druppels 1 N HCl voor te bereiden, zodat het volume 500 mL en autoclaaf (121 ° C).
  11. Bereiden van 0.13 M 1-Methylimidazole pH 8,0 door verdunnen 1.6 mL 1-Methylimidazole tot 130 mL van DEPC-behandelde ddH2O. aanpassen de pH ten slotte op 8.0 met ongeveer 450 µL van 12 N HCl. Voeg 16 mL van 3 M NaCl en breng het volume aan 160 mL. Verse vóór gebruik maken
    Let op: 1-Methylimidazole is schadelijk voor de slijmvliezen, ogen en huid, alleen behandelen in de zuurkast.
  12. 0.16 M N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) bereid door verdunnen 176 µL van EDC tot 10 mL van 0.13 M 1-Methylimidazole. Breng de pH op 8.0 met ongeveer 100 µL van 12 N HCl. Maak verse vóór gebruik.
    Let op: EDC is schadelijk voor de slijmvliezen, ogen en huid, alleen behandelen in de zuurkast.
  13. 1% H2O2 bereid door verdunning van 1,5 mL van 30% H2O2 in 50 mL 1 x PBS. Verse vóór gebruik maken
  14. Bereiden van 20 x SSC pH 7.0 door het oplossen van 175.3 g NaCl en 88,2 g Natriumcitraat (Na3C6H5O7) in 800 mL ddH2O. Adjust pH 7.0 met een paar druppels van 1 N HCl, zodat het volume aan 1 L en autoclaaf (121 ° C).
    1. Een werkoplossing van 2 x SSC pH 7.0 bereiden door verder verdunnen van 20 mL 20 x SSC pH 7.0 in 180 mL ddH2O.
    2. Een werkoplossing van 1 x SSC pH 7.0 bereiden door verder verdunnen van 2.5 mL 20 mL van x SSC pH 7.0 in 47,5 van ddH2O.
    3. Een werkoplossing van 0.2 x SSC pH 7.0 bereid door verdunning van 5 mL 2 x SSC pH 7.0 in 45 mL ddH2O.
  15. 1 x kruising oplossing door verder verdunnen van 0,5 mL voor 2 x microRNA ISH buffer in 0,5 mL DEPC-behandelde ddH2O. Make vóór gebruik vers bereiden.
  16. Bereiden van 200 mM stockoplossing van Levamisole door toevoeging van 250 mg 5 ml van ddH2O. Aliquot en opgeslagen bij-20 ° C.
  17. Blokkerende oplossing voorbereiden door stap 5 (10% schapen serum/1% BSA/0,2 mM Levamisol) door verdunnen 1 mL serum van de schapen in 9 mL PBST en het toevoegen van 0,1 g van BSA. Voeg toe 10 μL van Levamisole alvorens te gebruiken. Verse vóór gebruik maken
  18. Blokkerende oplossing voorbereiden door stap 6 (10% geit serum/1% BSA) door 1 mL geit serum in PBST 9 mL verdunnen en het toevoegen van 0,1 g van BSA. Bewaren bij 4 ° C en gebruiken binnen een week.
  19. Bereid door verdunning van 3,3 mL 3-prestaining oplossing M NaCl, 5 mL van de 1 M MgCl2, 10 mL van de 1 M Tris pH 9.5, 100 µL van Tween-20, 100 µL van Levamisole in 81,5 mL ddH2O. Make verse voordat gebruiken.
  20. Gebruik nitroblue tetrazolium (NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indoly fosfaat (BVIE) tabletten te bereiden 20 mL alkalische fosfatase (AP) substraat oplossing volgens de instructies van de fabrikant. Voeg toe 20 μL van Levamisole. Verse vóór gebruik maken en beschermen tegen licht.
  21. Bereid KTBT oplossing door toevoeging van 4 g van Tris, 4.4 g NaCl en KCl 375 mg in 500 mL ddH2O. autoclaaf (121 ° C).
  22. Optioneel: Bereid een werkoplossing DAPI (1 μg/mL) door verdunnen 50 μl van DAPI stockoplossing (1 mg/mL) in 50 mL 1 x PBS.
    Opmerking: Standaard oplossingen zoals 3 M NaCl, 1 M MgCl2, 1 M Tris-HCl, nuclease-Free ddH2O, 1 x PBS en 20 x SSC als alternatief kunnen worden aangeschaft. Voor dit protocol, 50 mL glazen Coplin potten of 20 mL polypropyleen dia mailer zijn potten gebruikt.

2. de weefsels voorbereiding

Opmerking: De muis hart secties gebruikt hier waren bereid door Yale pathologie weefsel diensten, van formaline-vaste/paraffine-ingebedde weefsel, gesneden op 5 μm en op geladen dia's geplaatst.

  1. Weefsel rehydratie.
    1. Warm de dia's bij 60 ° C gedurende 10 min, in de kruising oven tot paraffine is zichtbaar smelten.
    2. Incubeer de dia's in een glazen Coplin pot met 50 mL verkrijgbare clearing agent (Zie Tabel van materialen) gedurende 10 minuten, tweemaal.
    3. Incubeer de dia's in een glazen Coplin pot met 50 mL 100% ethanol gedurende 2 minuten, tweemaal, gevolgd door 90% ethanol voor 2 min, 70% ethanol gedurende 2 minuten, tweemaal, 50% ethanol gedurende 2 minuten en 30% ethanol gedurende 2 minuten.
    4. Incubeer de dia's in een glazen Coplin pot met 50 mL DEPC-behandelde ddH2O voor 5 min.
    5. Incubeer de dia's in een glazen Coplin pot met 50 mL 1 x PBS voor 5 min.
  2. Weefsel de-proteinating.
    1. Incubeer dia's in een glazen Coplin pot met 50 mL 20 μg/mL werkoplossing ProK, bij 37 ° C gedurende 15 min. in de oven van hybridisatie.
      Let op: Onder spijsvertering kan resulteren in slechte of geen signaal ontwikkeling, terwijl overmatige spijsvertering in de aantasting van het weefsel en ontwikkeling van achtergrondkleuring resulteren kan. Optimalisatie kan worden verlangd voor deze stap (1 – 20 μg/mL ProK, 5 – 20 min incubatie, RT-37 ° C).
    2. De dia's in een glazen Coplin pot met 50 mL 1 x PBS voor 5 min, op RT, twee keer wassen.
  3. Weefsel fixatie.
    1. Gebruik een hydrofobe pen om te tekenen van een waterafstotende cirkel rond het weefsel op elke dia.
    2. Toepassing 500 µL van 4% PFA-oplossing op de lengte van elke dia en incubeer dia's horizontaal voor 10 min, op RT.
    3. De dia's in een glazen Coplin pot met 50 mL 1 x PBS voor 5 min, op RT, twee keer wassen.
    4. De dia's in een glazen Coplin pot met 50 mL 0.13 M 1-methylimidazole voor 10 min, op RT, twee keer wassen.
    5. Breng de lengte van elke dia 500 µL 0.16 M EDG-oplossing en dia's horizontaal voor 1 h op RT, in een bevochtigde kamer uit te broeden.
    6. Spoel de dia's in een glazen Coplin pot met 50 mL 50 mM Tris pH 8.0 op RT.
    7. Spoel de dia's in een glazen Coplin pot met 50 mL 1 x PBS op RT, tweemaal.
      Opmerking: Zowel PFA en EDC fixatie stappen zijn nodig voor de miRNA crosslinking en moeten niet worden weggelaten. 31
  4. Endogene peroxidase blok.
    1. Incubeer dia's in een glazen Coplin pot met 50 mL 1% H2O2 gedurende 30 minuten op RT.
    2. Spoel de dia's in een glazen Coplin pot met 50 mL 1 x PBS op RT, tweemaal.

3. de kruising

  1. Verwarm de kruising oplossing (500 µL per dia) bij 50 ° C in de oven van hybridisatie, totdat de temperatuur van de doelgroep, wordt bereikt (10-15 min).
  2. Bereiden de hybridisatie kamer door 2 stuks van filter of papieren zakdoekje in de bodem van de kamer en bevochtiging van het papier met 50% formamide/1 x SSC.
    Let op: Formamide is schadelijk voor de slijmvliezen, ogen en huid, enige greep in de zuurkast.
  3. Breng 200 µL van hybridisatie oplossing aan de lengte van elke dia. Incubeer dia's horizontaal voor 1 – 3 h bij 50 ° C, in een bevochtigde kamer.
  4. Bereid de oplossing van de sonde door het mengen van 0,5 µL voorraad sonde (25 µM) in 250 µL ofhybridization oplossing (eindconcentratie van 50 nM) in een 1,5 mL-buis.
    Opmerking: Andere miRNAs worden uitgedrukt op verschillende niveaus, zodat optimalisatie met betrekking tot de concentratie van de sonde verlangd voor deze stap (1-50 nM) worden kan, niet geen signaal of hoge achtergrond ontwikkeling.
  5. Breng 250 µL sonde oplossing aan de lengte van elke dia en plaats een RNase gratis dekglaasje aan op bovenkant. De vorming van luchtbellen vermijden.
  6. Zorgvuldig de hybridisatie kamer met parafilm zegel en O/N Incubeer bij 50 ° C.
    Opmerking: De kruising temperatuur moet worden ingesteld ongeveer 30 ° C beneden de RNA-smelttemperatuur (Tm) van elke sonde. Optimalisatie kan worden verlangd. Hier, 50 ° C wordt gebruikt als de temperatuur van de kruising/afwas voor miRNA-182, dienovereenkomstig aan te passen voor verschillende sondes.

4. striktheid wast

  1. Prewarm 200 mL voor 2 x SSC bij 50 ° C in de oven van hybridisatie, totdat de temperatuur van de doelgroep wordt bereikt (20-40 min).
  2. Wassen van de dia's in een glazen Coplin pot met 50 mL 2 x SSC bij 50 ° C gedurende 5 minuten of totdat de coverslips los.
  3. Wassen van de dia's in een glazen Coplin pot met 50 mL 2 x SSC op RT gedurende 5 minuten, tweemaal.
  4. Wassen van de dia's in een glazen Coplin pot met 50 mL 0,2 x SSC op RT gedurende 5 minuten.
  5. De dia's in een glazen Coplin pot met 50 mL PBST op RT gedurende 5 minuten wassen.
  6. De dia's in een glazen Coplin pot met 50 mL 1 x PBS op RT gedurende 5 minuten wassen.
    Opmerking: Gebruik van RNase-vrij voorwaarden is niet meer nodig aangezien de RNA-RNA-hybriden als stabiel worden beschouwd.

5. graven van de opsporing van antilichamen

  1. Gebruik een hydrofobe pen opnieuw een waterafstotende om cirkel te tekenen rond het weefsel op elke dia indien nodig.
  2. Toepassing 500 µL van het blokkeren van de oplossing aan de lengte van elke dia. Incubeer dia's horizontaal voor 30 min op RT, in een bevochtigde kamer.
  3. Bereid de DIG antilichaam-oplossing (1:1, 000) door verdunnen 0,5 μL van DIG antilichaam in 500 µL ofblocking oplossing in een 1,5 mL-buis.
    Let op: Optimalisatie kan worden verlangd voor deze stap (1:500-1:2, 000).
  4. Breng de lengte van elke dia 500 µL van DIG antilichaam oplossing. Incubeer dia's horizontaal voor 1 h op RT, in een bevochtigde kamer.
  5. De dia's in een glazen Coplin pot met 50 mL PBST op RT voor 5 min, driemaal wassen.
  6. De dia's in een glazen Coplin pot met 50 mL prestaining oplossing bij RT gedurende 5 minuten, twee keer wassen.
  7. Incubeer dia's in een polypropyleen dia mailer pot met 20 mL kredietporte substraat oplossing bij 37 ° C, voor 6-24 h, beschermd tegen licht.
    Let op: Kleur ontwikkeling moet worden gecontroleerd dat elke 2 h. optimalisatie kan worden verlangd voor deze stap.
  8. De dia's in een glazen Coplin pot met 50 mL van KTBT-oplossing bij RT gedurende 5 minuten, twee keer wassen.
  9. De dia's in een glazen Coplin pot met 50 mL 1 x PBS op RT gedurende 5 minuten wassen.

6. cTnT antistofdetectie

  1. Gebruik een hydrofobe pen opnieuw een waterafstotende om cirkel te tekenen rond het weefsel op elke dia indien nodig.
  2. Toepassing 500 µL van het blokkeren van de oplossing aan de lengte van elke dia. Incubeer dia's horizontaal voor 1 h op RT, in een bevochtigde kamer.
  3. De cTnT antilichaam oplossing (1:100) bereid door verdunnen 2 μL van cTnT antilichaam in 200 μl ofblocking oplossing in een buis 1,5 mL.
  4. Breng 200 µL cTnT antilichaam oplossing aan de lengte van elke dia. Incubeer dia's horizontaal O/N bij 4 ° C, in een bevochtigde kamer.
  5. De dia's in een glazen Coplin pot met 50 mL 1 x PBS op RT voor 5 min, driemaal wassen.
  6. De anti-rabbit-568 antilichaam-oplossing (1:500) bereid door verdunnen 0,5 μL van anti-rabbit-568 antilichaam in 250 μL ofblocking oplossing in een buis 1,5 mL.
  7. Breng de lengte van elke dia 250 µL van anti-rabbit-568 antilichaam oplossing. Incubeer dia's horizontaal voor 1 h op RT, in een bevochtigde kamer.
  8. De dia's in een glazen Coplin pot met 50 mL 1 x PBS op RT voor 5 min, driemaal wassen.
  9. Optioneel: 250 µL van de DAPI werkoplossing van toepassing op de lengte van elke dia en incubeer dia's horizontaal voor 1 min op RT, beschermd tegen licht.
  10. De dia's in een glazen Coplin pot met 50 mL 1 x PBS op RT gedurende 5 minuten, twee keer wassen.

7. montage en beeldvorming

  1. Monteer de dia's met 2-3 druppels van montage medium en een glas cover slip. Laat de dia's te drogen, O/N, bij 4 ° C, beschermd tegen licht.
  2. Ga door naar epifluorescerende of confocale microscopie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

miRNA in situ hybridisatie is geoptimaliseerd op muis hart secties met een scramble miRNA en U6-snRNA, die als negatieve en positieve controles respectievelijk diende. Positieve kleuring wordt aangegeven in het blauw, terwijl de negatieve kleuring wordt aangegeven door het gebrek aan ontwikkeling van de kleur (figuur 1A-1B). De specifieke expressie cardiomyocyte van miRNA-182 evalueerden in hart secties van controle- en PlGF overexpressing muizen. De uitvoering van de PlGF transgenic onder een αMHC promotor muizen ontwikkelen hypertrofie van het hart, ondergeschikt aan grotere angiogenese, binnen 6 weken na transgenic activering26. Wij uitgevoerd in situ hybridisatie en verhoogde expressie van miRNA-182 gevonden in de harten van PlGF muizen, in vergelijking met besturingselementen (figuur 2A-2 H), aangegeven door de blauwe kleuring. Om te bepalen welke celtypen express miRNA-182, we vervolgens uitgevoerd immunokleuring voor cTnT op dezelfde baanvakken. We vonden miRNA-182 mede gelokaliseerd met de cTnT-positieve cardiomyocyte cellen, evenals de DAPI gekleurd kernen, in zowel de controle en de PlGF muis hart secties (figuur 2C-2 H), aangegeven door de rode en blauw respectievelijk kleuring. Deze beelden waren met een 20 X doelstelling.

Figure 1
Figuur 1: Negatieve en positieve in situ hybridisatie kleuring. (A) In situ hybridisatie voor scramble miRNA (25 nM) in controle muis hart secties. (B) In situ hybridisatie voor U6-snRNA (25 nM) in controle muis hart secties. Schaal bar = 100 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: de specifieke expressie Cardiomyocyte van miRNA-182 in controle en PlGF muis harten. (A-B) In situ hybridisatie voor miRNA-182 in controle en PlGF muis hart secties. (C-D) Immunokleuring voor cTnT in controle en PlGF muis hart secties die hebben al eerder gekleurd voor miRNA-182. (E-F) DAPI counterstaining voor nucleaire localisatie in controle en PlGF muis hart secties die hebben al eerder gekleurd voor miRNA-182. (G-H) Samengevoegde afbeeldingen van miRNA-182 (diep blauwe), cTnT (rood) en DAPI (lichtblauw) kleuring voor de controle en PlGF muis hart secties. Schaal bar = 50 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

miRNA transcript detectie kan worden bereikt door middel van verschillende technieken die in de gevoeligheid, specificiteit en kwantitatieve macht verschillen. Hier tonen we de koppeling van miRNA in situ hybridisatie met immunokleuring en beschrijven een protocol waarmee voor gelijktijdige beoordeling van de niveaus van de expressie van miRNA en eiwit moleculen, op de dezelfde baanvakken van het hart. Eerst laten we zien hoe u kunt uitvoeren in situ hybridisatie aan DIG-geëtiketteerden LNA miRNA sondes op paraffine ingesloten hart secties. Vervolgens beschrijven we het uitvoeren van immunokleuring voor cTnT op dezelfde baanvakken. Tot slot laten we zien hoe de resulterende kleur en fluorescerende afbeeldingen samenvoegen. Dit protocol is geoptimaliseerd voor formaline vaste (4 ° C, O/N) / paraffine ingebedde muis hart weefsels, met het gebruik van DIG-geëtiketteerden LNA miRNA sondes en cTnT. Verdere optimalisatie kan worden vereist voor verschillende weefsels, sonde of antilichaam bestandstypen, zoals hieronder beschreven.

RNase-vrij voorwaarden moeten zorgvuldig worden ingevoerd in het geheel van de stappen die voorafgaan aan de sonde hybridisatie, zoals RNase besmetting kan de uitkomst van het experiment ernstig in gevaar brengen. Alle oplossingen moeten worden gemaakt met DEPC behandelde ddH2O en alle Coplin potten moeten worden behandeld met een RNase decontaminatie oplossing. Bovendien moeten de volgende overwegingen rekening worden gehouden bij het werken met verschillende DIG-geëtiketteerden LNA miRNA sondes. De kruising temperatuur is afhankelijk van de smelttemperatuur (Tm) van elke sonde. Als algemene regel, een temperatuur die is 30 ° C onder de gegeven RNA Tm of 20 ° C onder de gegeven DNA Tm dient voor sonde hybridisatie. Bovendien, de ideale sonde concentratie moet worden geoptimaliseerd. Het ligt meestal tussen de 1 – 50 nM. Tot slot, de sonde met hybridisatie oplossing kan worden verwarmd tot 95 ° C gedurende 5 min te denatureren een secondaire structuren, als dat een probleem. Een belangrijke stap voor het testen van de specificiteit van een sonde, is vooral wanneer gebruikt voor de eerste keer, te nemen een negatieve (gecodeerde) zo goed als positief (bijvoorbeeld U6) controle sonde, om te zorgen voor experimentele succes (Figuur 2). Soortgelijke besturingselementen (bijvoorbeeld een CD31 endothelial antilichaam) moeten worden gebruikt tijdens de stap van immunokleuring.

Een veelvoorkomend probleem in de in situ hybridisatie experimenten is de ontwikkeling van de kleuring van artefact/achtergrond signaal. Om te vermijden of te minimaliseren artefact kleuring stappen, moet het weefsel worden beschermd tegen uitdrogen in alle stappen, vooral tijdens lange incubations. Het is raadzaam om die betrekking hebben op de dia's met RNase-gratis coverslips tijdens de stap van hybridisatie, vooral wanneer hoge temperaturen worden gebruikt, en het gebruik van het bevochtigen van de kamers. Wij stellen ook voor het gebruik van een 568 of 594 fluorophore te detecteren van cTnT of de proteïne van belang tijdens de stap van immunokleuring. Dit zal een einde maken aan elke autofluorescence die vaak met het gebruik van 488 fluorophores gebruikt op formaldehyde vaste weefsels ontstaat.

Een andere variabele die is raadzaam aandacht te besteden aan is de duur van AP kleuring van ontwikkeling, die afhangt van het niveau van de specifieke miRNA aanwezig in het weefsel. Wij suggereren checking AP kleuring progressie elke 2 h, voor het eerste experiment. Verdere optimalisatie kan inhouden dat de temperatuur van de incubatie (RT-37 ° C) met de parameter wordt gewijzigd. Tot slot, als achtergrond begint te ontwikkelen voor de ware miRNA sonde kleuring, of als de AP kleurstofoplossing verandert van kleur tot blauw-bruin raden, we wassen van de dia's in PBST tweemaal, en de kleurstofoplossing vervangen door een versgemaakte.

Tot slot, hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor formaline-vaste/paraffine-ingebedde muis hart weefsels, het kan worden aangepast voor alternatief verwerkte weefsels (PFA vaste/OCT ingesloten) en/of het gebruik van de verschillende typen van de sonde of antilichaam. Een beperking van de combinatie van in situ hybridisatie en immunokleuring die u moet overwegen is het falen van verschillende antilichamen binden aan hun respectieve epitopes, vanwege de mogelijke vernietiging van de laatste die bij de hoge temperaturen gebruikt tijdens de kruising en striktheid wassen stappen. Verdere beperkingen van zowel in situ hybridisatie en immunokleuring technieken verwijzen meestal naar de kracht van deze technieken te detecteren van zeer lage concentraties van miRNA of eiwit moleculen respectievelijk. Signaal versterking kits zijn beschikbaar om te gebruiken voor DIG of antilichaam detectie wanneer miRNA of eiwit overvloed een bron van zorg is. Dergelijke kits bieden tevens een fluorescentie-alternatief voor de detectie van miRNAs, die wanneer gekoppeld aan fluorescerende immunokleuring Beeldacquisitie kunt vereenvoudigen. Alternatieve methoden, zoals Real-Time PCR en het westelijke bevlekken die grotere gevoeligheid, kunnen ook lage overvloed kwesties. Echter, in tegenstelling tot in situ hybridisatie/immunokleuring protocol, deze technieken geen informatie verstrekken over de weefsel-specifieke lokalisatie van de miRNA/eiwitmolecules.

Om samen te vatten, beschrijven we een protocol dat gelijktijdige detectie van miRNA en eiwit moleculen op de dezelfde weefsel biedt, die naar onze mening een waardevol instrument in miRNA onderzoek naar Muismodellen zal worden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij wil Athanasios Papangelis, dank voor kritische opmerkingen over het manuscript. FM wordt ondersteund door de biotechnologie en de biologische Sciences Research Council (BBSRC; BB/M009424/1). IP wordt ondersteund door de American Heart Association wetenschapper ontwikkeling Grant (17SDG33060002).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethylpyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 DEPC
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 PBS
Tween-20 American Bioanalytical AB02038 non-ionic surfactant
Histoclear National Diagnostics HS-200
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Sigma Aldrich 3115879001 ProK
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 PFA
Sodium Chloride ThermoFisher S271 NaCl
Magnesium Chloride Hexahydrate ThermoFisher M33 MgCl2
Tris Sigma Aldrich T6066
Hydrochloric Acid Solution, 1 N ThermoFisher SA48 HCl
Hydrochloric Acid Solution, 12 N ThermoFisher S25358 HCl
1-Methylimidazole Sigma Aldrich 336092
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich 39391 EDC
Hydrogen peroxide solution H2O2 Sigma Aldrich 216763 H2O2
Trisodium citrate dihydrate Sigma Aldrich S1804 Sodium Citrate
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) Qiagen 339450 scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe QIagen YD00615701 5'-DIG and 3'-DIG labelled
Levamisol hydrochloride Sigma Aldrich 31742
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647 BSA
NBT/BCIP Tablets Sigma Aldrich 11697471001 NBT-BCIP
Potassium Chloride ThermoFisher P217 KCl
DAPI solution (1mg/ml) ThermoFisher 62248 DAPI
Glass coverslip ThermoFisher 12-545E Glass coverslip
Plastic coverslip Grace Bio-Labs HS40 22mmX40mmX0.25mm RNA-ase free plastic coverslip
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma Aldrich 11093274910 DIG antibody
Hydrophobic barrier pen Vector Laboratories H-4000 Pap pen
Anti-Cardiac Troponin T antibody Abcam ab92546 cTnT antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 ThermoFisher A-11011 anti-rabbit-568 antibody
Dako Fluorescence Mounting Medium DAKO S3023 mounting medium
Sheep serum Sigma Aldrich S3772
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Deionized Formamide American Bioanalytical AB00600
Hybridization Oven ThermoFisher UVP HB-1000 Hybridizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  2. Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
  3. Hutvagner, G., Zamore, P. D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science. 297, 2056-2060 (2002).
  4. Krol, J., et al. Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design. Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).
  5. Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. Vertebrate microRNA genes. Science. 299, 1540 (2003).
  6. Tian, T., Wang, J., Zhou, X. A review: microRNA detection methods. Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).
  7. Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. MicroRNAs potentiate neural development. Neuron. 64, 303-309 (2009).
  8. Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).
  9. Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. Embryonic stem cell-specific MicroRNAs. Developmental cell. 5, 351-358 (2003).
  10. Kasper, D. M., et al. MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos. Developmental cell. 40, 552-565 (2017).
  11. Liu, N., Olson, E. N. MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development. Developmental cell. 18, 510-525 (2010).
  12. Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
  13. Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).
  14. Ying, W., et al. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity. Cell. 171, 372-384 (2017).
  15. Perkins, D. O., et al. microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder. Genome biology. 8, R27 (2007).
  16. Miller, B. H., et al. MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).
  17. Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion. Cell. 152, 262-275 (2013).
  18. Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research. Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).
  19. Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
  20. Ikeda, S., et al. Altered microRNA expression in human heart disease. Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).
  21. Mann, M., et al. An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses. Nature Communications. 8, 851 (2017).
  22. O'Connell, R. M., et al. MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development. Immunity. 33, 607-619 (2010).
  23. Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy. Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).
  24. He, L., et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature. 447, 1130-1134 (2007).
  25. Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
  26. Li, N., et al. miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart. Science Reports. 6, 21228 (2016).
  27. Meerson, F. Z. Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency. Circulation Research. 10, 250-258 (1962).
  28. Tardiff, J. C. Cardiac hypertrophy: stressing out the heart. Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).
  29. Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2. Circulation. 128, 388-400 (2013).
  30. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146-e603 (2017).
  31. Pena, J. T., et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nature Methods. 6, 139-141 (2009).

Tags

Genetica kwestie 139 micro-RNA expressie profilering LNA sonde in situ hybridisatie immunokleuring hypertrofie van het hart
Weefsel-specifieke miRNA expressie profilering in muis hart secties gebruiken <em>In Situ</em> hybridisatie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I.… More

Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I. Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (139), e57920, doi:10.3791/57920 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter