Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Doku özgü miRNA ifade profil oluşturma In Situ hibridizasyon fareyle kalp bölümleri içinde

Published: September 15, 2018 doi: 10.3791/57920
Automatic Translation
1, 2, 3
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

Summary

Mikro-RNA'ların (miRNAs) haberci RNA (mRNA) çoğu düzenleyiciler hizmet veren kısa ve son derece homolog RNA dizileri vardır. Geçerli miRNA algılama yöntemleri duyarlılık ve özgüllük değişir. Situ hibridizasyon ve immunostaining eşzamanlı miRNA ve protein molekülleri fare kalp doku bölümlerinde algılanması için bir araya getiren bir protokolü açıklar.

Abstract

Mikro-RNA'ların (miRNAs) tek iplikçikli RNA transkript haberci RNA (mRNA) bağlamak ve onların çeviri inhibe veya onların yıkımı teşvik vardır. Bugüne kadar miRNAs içinde miRNA transkript güvenilir algılama yöntemleri ihtiyacını miktarlara hastalığı ve Biyolojik süreçler, çok sayıda karıştığı olmuştur. Burada, biz fare kalp bölümlerinde protein immunostaining ile birlikte digoxigenin etiketli (kazmak) kilitli nükleik asit (LNA) miRNA sonda tabanlı algılama için detaylı bir protokol tanımlamak. İlk olarak, situ hibridizasyon tekniği miRNA-182 ifadede denetim ve kalp hipertrofisi fareler kalp bölümleri tanımlamak için sonda kullanarak gerçekleştirilen. Daha sonra immunostaining kardiyak Troponin T (cTnT) protein, miRNA-182 cardiomyocyte hücrelerle birlikte yerelleştirmek için aynı bölümleri için gerçekleştirilen. Bu iletişim kuralını kullanan, biz Renkölçer tahlil ve floresan boyama yoluyla cTnT miRNA-182 alkalen fosfataz aracılığıyla göre tespit edebildik. Bu iletişim kuralı aracılığıyla kazmak etiketli LNA probları ilgi herhangi bir miRNA ifade ve fare kalp doku bölümlerinde ilgili protein ifade algılamak için kullanılabilir.

Introduction

Mikro-RNA'ların (miRNAs) çoğu kısa (18-25 nukleotid), gen ekspresyonu çoğu düzeyinde negatif düzenleyiciler olarak inhibe mesajcı RNA (mRNA) çeviri ve/veya mRNA yıkımı teşvik tarafından işlev tek iplikçikli, kodlamayan RNA'ların 1. miRNAs transkripsiyonu intron veya kodlama ekzonlar veya kodlamayan genler ve are i ciddi kısa sap-ilmik yapılar 70 nükleotit2habercisi miRNAs (pre-miRNAs), DROSHA tarafından çekirdeğine içinde. Sitoplazmik takip verme, pre-miRNAs daha da 18-25 nükleotit3,4span olgun miRNAs DICER tarafından işlenir. Daha sonra RNA-induced silencing kompleksi (RISC) bu miRNAs tek iplikçikli RNA'ların, onların ifade3,5 bastırmak sağlayan 3' çevrilmeyen bölgesi (3'-UTR) onların hedef mRNA'ların kendi bağlama için birleştirmek .

Bu yana ilk kez tespit, son üç yıl içinde kendi ifade yüzey are sıkı kontrol6gen ekspresyonu ana düzenleyiciler için miRNAs ortaya çıkmıştır. MiRNAs için rolleri organ gelişimi7,8,9,10,11,12', bakım homeostazı13,14 tarif var , yanı sıra nörolojik15,16,17,18,19, kardiyovasküler20, dahil hastalığı bağlamlarda otoimmün koşulları21 ,22, kanserler23,24ve diğerleri25. MiRNA ifade kalıplarının alaka için takdir artan ileri miRNA transkript güvenilir algılama yöntemleri ihtiyacını getirdi. Gerçek zamanlı PCR, microarrays, Kuzey kurutma, in situ hibridizasyon ve diğerleri, gerçeğini miRNA transkript kısa bir oluşmaktadır nedeniyle hangi duyarlılık, özgüllük ve nicel güç, ağırlıklı olarak farklı tür yöntemler içerir ve Son derece homolog dizileri6.

Biz son zamanlarda miRNA-182 miyokardiyal hipertrofisi26, kalp yükseltilmiş hemodinamik talepleri27,28yanıt olarak yapısal uyum açıklayan bir koşul geliştirilmesi için önemli bir rol bildirdi. Kalp hipertrofisi, uyumsuz remodeling29ile ilişkilendirirseniz riski kalp yetmezliği, tüm ölümlerin % 8.5 için kardiyovasküler atfedilebilecek muhasebe bir koşul için yol açabilir miyokardiyal kitle, artış ile karakterizedir hastalık30.

Burada, içinde bir digoxigenin etiketli (kazmak) kilitli nükleik asit (LNA) prob ve miRNA ve protein molekülleri fare kalp doku bölümlerinde, eşzamanlı tespiti için immunostaining in situ hibridizasyon birleştirir bizim protokol açıklamak bizim kalp hipertrofisi modeli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Fare kalp doku örnekleri bu çalışma için ilgili kanun ve kurumsal yönergelere uygun olarak elde edilmiştir ve Yale Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.

1. çözüm hazırlık

  1. RNase free GKD2O hazırlamak, GKD2O 5 L 5 mL % 0,1 diethylpyrocarbonate (DEPC) ile tedavi tarafından (O/N), gecede oda sıcaklığında (RT). DEPC devre dışı bırakmak için (121 ° C) basınçlı kap. Kullanım DEPC tedavi GKD2O hazırlanması için aşağı akım çözümleri gösterilir.
    Dikkat: DEPC bilinen bir kanserojen, sadece duman mahallede işlemek.
  2. 1 x fosfat tamponlu tuz (PBS) çözüm DEPC tedavi GKD2O. Otoklav (121 ° C) 1 L 5 PBS tablet çözülerek hazırlayın.
  3. %0,1 non-iyonik deterjan/PBS (PBST) 1 mL 1 x PBS 1 litre başına non-iyonik deterjan sulandrarak hazırlayın.
  4. %90, % 70, % 50 ve % 30 etanol DEPC tedavi GKD2O. hazırlamak
  5. Bir 10 mg/mL İndinavir K (ProK) hisse senedi çözüm DEPC tedavi GKD2O. Aliquot hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın 20 μg/mL çalışan bir çözüm ProK, 50 ml DEPC tedavi GKD2O. olun kullanmadan önce taze ProK hisse senedi çözeltinin 100 μL sulandrarak tarafından hazırlayın.
  6. %4 paraformaldehyde (PFA) 50 mL 1 x PBS PFA 2 g ekleyerek hazırlayın. Ara sıra sallayarak ile 65 ° c eriyene kadar ısı. Aliquot ve mağaza-20 ° C'de
    Dikkat: PFA bilinen bir kanserojen, sadece duman mahallede işlemek.
  7. 3 M NaCl çözüm GKD2O. Otoklav (121 ° C) 500 mL 87,8 g ekleyerek hazırlayın.
  8. 1 M MgCl2 çözüm GKD2O. Otoklav (121 ° C) 100 mL 20,3 g ekleyerek hazırlayın.
  9. 1 M Tris pH 8.0 GKD2O. ayarlama 8,0 pH 800 mL içinde eriterek 121.1 g 1 N HCl birkaç damla ile hazırlamak, 1 L ve Otoklav (121 ° C) ses getirmek. 50 mM Tris pH 8.0 çalışan bir çözüm 1 M Tris pH 8.0 47,5 mL GKD2O. 2.5 mL sulandrarak hazırlamak
  10. 1 M Tris pH 9,5 GKD2O. ayarlama pH 9,5 için 400 mL içinde eriterek 60,6 g 1 N HCl birkaç damla ile hazırlamak, 500 mL ve Otoklav (121 ° C) ses getirmek.
  11. 0.13 M 1-Methylimidazole pH 8.0 sulandrarak 1.6 mL 1-Methylimidazole DEPC tedavi GKD2O. ayarlama 8,0 pH 130 ml 12 N HCl. eklemek 16 mL yaklaşık 450 µL ile tarafından 3 M NaCl hazırlamak ve birim için 160 mL getir. Kullanmadan önce taze olun.
    Dikkat: 1-Methylimidazole müköz membranlar, gözleri ve cildi zararlı olduğunu, sadece duman mahallede ele.
  12. 0,16 M N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hidroklorid (EDC) sulandrarak 176 µL EDC, 0.13 M 1-Methylimidazole 10 mL için hazırlayın. 12 N HCl. olun taze kullanmadan önce yaklaşık 100 µL ile 8,0 pH ayarlayın.
    Dikkat: EDC müköz membranlar, gözleri ve cildi zararlı olduğunu, sadece duman mahallede ele.
  13. % 1 H2O2 1.5 mL 1 x PBS 50 ml % 30 H2O2 sulandrarak hazırlayın. Kullanmadan önce taze olun.
  14. 20 x SSC pH 7,0 NaCl ve GKD2O. ayarlama 800 ml sodyum sitrat (Na3C6H5O7) 88.2 g 175.3 g eriterek tarafından pH 7. 0 1 birkaç damla ile hazırlamak N HCl, 1 L ve Otoklav (121 ° C) birime getir.
    1. 20 x SSC pH 7,0 180 mL GKD2O. 20 mL sulandrarak çalışan bir çözüm 2 x SSC pH 7,0 hazırlamak
    2. 20 x SSC pH 7,0 47,5 mL GKD2O. 2.5 mL sulandrarak çalışan bir çözüm 1 x SSC pH 7,0 hazırlamak
    3. GKD2O. 2 x SSC pH 7,0 45 mL 5 mL sulandrarak 0.2 x SSC pH 7.0 çalışan bir çözüm hazırlamak
  15. 1 hibridizasyon çözüm x 2 x microRNA ISH arabelleği DEPC tedavi GKD2O. olun kullanmadan önce taze 0.5 ml 0.5 mL sulandrarak hazırlayın.
  16. GKD2O. Aliquot 5 mL 250 mg ekleyerek Levamisole 200 mM stok çözeltisi hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın
  17. Engelleme çözümü için adım 5 (% 10 koyun serum/1% BSA/0.2 mM Levamisol) koyun serum 9 ml PBST 1 mL sulandrarak ve BSA 0.1 g ekleyerek hazırlayın. Levamisole 10 μL kullanmadan önce ekleyin. Kullanmadan önce taze olun.
  18. Engelleme çözüm adım 6 (% 10 keçi serum/1% BSA) için 1 mL keçi serum PBST 9 ml sulandrarak ve BSA 0.1 g ekleme hazırlamak. 4 ° C'de depolayın ve bir hafta içinde kullanın.
  19. 3.3 mL 3 sulandrarak tarafından prestaining çözüm hazırlamak M NaCl, 1 M MgCl2, 1 M Tris pH 9,5, 10 mL 5 mL Tween-20, Levamisole GKD2O. yapmak taze 81.5 ml 100 µL 100 µL kullanmadan önce.
  20. Kullanmak nitroblue tetrazolium (20 mL üretici yönergelerine göre alkalin fosfataz (AP) substrat çözeltisi hazırlamak için NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indoly fosfat (BCIP) tablet. Levamisole 20 μL ekleyin. Kullanmadan önce taze olun ve ışıktan korumak.
  21. KTBT çözüm 4 g Tris, 4,4 g NaCl ve KCl 375 mg GKD2O. Otoklav (121 ° C) 500 ml ekleyerek hazırlayın.
  22. İsteğe bağlı: DAPI çalışan bir çözüm (1 μg/mL) DAPI hisse senedi çözüm (1 mg/mL) 1 x PBS 50 ml 50 μL sulandrarak hazırlayın.
    Not: Standart eriyik öyle aynı derecede 3 M NaCl, 1 M MgCl2, 1 M Tris-HCl, GKD nükleaz ücretsiz2O, 1 x PBS ve 20 x SSC alternatif olarak satın alınabilir. Bu iletişim kuralı, 50 mL Cam Coplin kavanoz veya 20 mL polipropilen slayt mailler için kavanoz kullanılmaktadır.

2. doku hazırlık

Not: burada kullanılan fare kalp bölümleri Formalin-sabit/parafin-gömülü dokudan Yale patoloji doku Hizmetleri tarafından hazırlanan, 5 mikron kesilmiş ve şarj edilmiş slaytlar üzerinde konumlandırılmış.

  1. Doku rehidrasyon.
    1. Slaytlar parafin gözle görülür eriyor kadar hibridizasyon fırında 10 dakika 60 ° C'de ısıtın.
    2. Piyasada bulunan Temizleme aracının 50 mL içeren bir Coplin cam slaytlar kuluçkaya ( Tablo malzemelerigörmek) 10 dakika, iki kez.
    3. İki kez, 2 min için % 50 Etanol ve % 30 etanol 2 min için slaytlar 50 mL % 100 etanol için 2 dk, iki kez içeren, ardından 2 min için % 90 etanol, % 70 etanol için 2 dk, bir Coplin cam kuluçkaya.
    4. DEPC tedavi GKD2O 5 min için 50 mL içeren bir Coplin cam slaytlar kuluçkaya.
    5. 50 mL 1 x PBS 5 min için içeren bir Coplin cam slaytlar kuluçkaya.
  2. Doku de-proteinating.
    1. 50 mL 20 μg/mL hibridizasyon fırında 15 dakika 37 ° C'de ProK çalışma çözüm içeren bir Coplin cam slaytlar kuluçkaya.
      Uyarı: aşırı sindirim doku bozulması ve arka plan boyama gelişmesine neden olabilir iken altında sindirim yoksul veya hiçbir sinyal gelişme neden olabilir. En iyi duruma getirme için bu adımı (μg 1-20/ProK, 5 – 20 dk kuluçka, mL RT-37 ° C) gerekli olabilir.
    2. Slaytlar 50 mL 1 x PBS, RT, 5 min için iki kez içeren bir Coplin cam yıkama.
  3. Doku fiksasyon.
    1. Her slaytta doku çevresinde su geçirmez bir daire çizmek için hidrofobik bir kalem kullanın.
    2. Her slayt uzunluğu 500 µL % 4 İngiltere'de yılın çözüm uygulamak ve slaytları yatay RT., 10 min için kuluçkaya
    3. Slaytlar 50 mL 1 x PBS, RT, 5 min için iki kez içeren bir Coplin cam yıkama.
    4. Slaytlar 0.13 M 1-methylimidazole, RT, 10 dk 50 mL iki kez içeren bir Coplin cam yıkama.
    5. Her slayt uzunluk için 0,16 M EDC çözeltinin 500 µL uygulamak ve slaytları yatay RT, bir oksijen odası, 1 h için kuluçkaya.
    6. 50 mL 50 mM Tris pH 8.0 RT. de içeren bir Coplin cam slaytları durulama
    7. Slaytları 50 mL 1 x PBS, RT, iki kez içeren bir cam Coplin kavanoza durulayın.
      Not: Hem İngiltere'de yılın ve EDC fiksasyon adımları miRNA crosslinking için gereklidir ve dikkate alınır. 31
  4. Endojen peroksidaz blok.
    1. Slaytlar için 30 dk RT. az % 1 H2O2 50 mL içeren bir Coplin cam kuluçkaya
    2. Slaytları 50 mL 1 x PBS, RT, iki kez içeren bir cam Coplin kavanoza durulayın.

3. hibridizasyon

  1. Hibridizasyon çözüm (slayt başına 500 µL) hedef sıcaklık kadar hibridizasyon fırında 50 ° c onceden, (10-15 dk) ulaştı.
  2. Filtre veya kağıt mendil 2 adet odası dibine yerleştirip kağıt % 50 formamide/1 ıslatma hibridizasyon odası hazırlamak x SSC.
    Dikkat: Formamide müköz membranlar, gözleri ve cildi, duman başlıklı tek kolu için zararlıdır.
  3. Hibridizasyon çözüm 200 µL her slayt uzunluk için geçerlidir. Slaytları yatay olarak 1-3 h bir oksijen odasında 50 ° c için kuluçkaya.
  4. Sonda çözüm 0.5 µL hisse senedi sonda (25 µM) karıştırarak 1,5 mL tüp içinde 250 µL ofhybridization çözüm (son konsantrasyonu 50 nM) hazırlayın.
    Not: en iyi duruma getirme ile ilgili soruşturma konsantrasyon için bu adımı (1-50 nM),-hiçbir sinyal veya yüksek arka plan geliştirme önlemek gerekli olabilir bu yüzden farklı düzeylerde farklı miRNAs ifade edilir.
  5. Her slayt uzunluğu 250 µL sonda çözüm uygulamak ve bir RNase free coverslip üstüne yerleştirin. Kabarcıklar oluşumunu önlemek.
  6. Dikkatle hibridizasyon odası ile parafilm mühür ve O/N 50 ° C'de kuluçkaya
    Not: Hibridizasyon sıcaklık yaklaşık 30 ° C RNA erime sıcaklığı her sonda (Tm) ayarlamanız gerekir. En iyi duruma getirme-ebilmek var olmak gerekli. Burada, 50 ° C miRNA-182 için hibridizasyon/yıkama sıcaklık kullanıldığında, buna göre ayarlamak için farklı sondalar.

4. sıkılık yıkar

  1. 2 200 mL prewarm 50 ° c fırında hedef sıcaklık (20-40 dk) ulaşılana kadar hibridizasyon, x SSC.
  2. Slaytları 2 50 mL içeren bir Coplin cam yıkama x SSC 50 ° c 5 dk ya kadar coverslips gevşetin.
  3. Slaytları 2 50 mL içeren bir Coplin cam yıkama RT 5 min, iki kez için adlı x SSC.
  4. Slaytlar 0.2 50 mL içeren bir Coplin cam yıkama x SSC, RT 5 min için.
  5. Slaytlar PBST RT, 50 mL 5 min için içeren bir Coplin cam yıkama.
  6. Slayt 1 x PBS RT, 50 mL 5 min için içeren bir Coplin cam yıkama.
    Not: kullanım koşulları RNase free artık RNA, RNA-RNA melez istikrarlı kabul edilir beri gerekli değildir.

5. kazmak antikor algılama

  1. Hidrofobik kalem doku su geçirmez bir çember her slaytta gerekirse yeniden çizmek için kullanın.
  2. Her slayt uzunluğu çözüm engelleme 500 µL uygulanır. RT, bir oksijen odası, 30 dk için yatay slaytlar kuluçkaya.
  3. KAZMAK antikor çözümü (1:1, 000) 0.5 μL sulandrarak kazmak antikor çözümde 500 µL ofblocking 1,5 mL Tüp, hazırlayın.
    Uyarı: En iyi duruma getirme için bu adım gerekli olabilir (1:500-1:2, 000).
  4. 500 µL kazmak antikor çözüm her slayt uzunluk için geçerlidir. RT, bir oksijen odası, 1 h için yatay slaytlar kuluçkaya.
  5. Slaytlar PBST RT, 50 mL 5 min için üç kez içeren bir Coplin cam yıkama.
  6. Slaytlar için 5 dk, RT, çözüm iki kez prestaining 50 mL içeren bir Coplin cam yıkama.
  7. 6-24 h, ışıktan korunan için 37 ° C'de 20 mL ofAP substrat çözeltisi içeren bir polipropilen slayt mailler kavanoz içindeki slaytları kuluçkaya.
    Dikkat: Renk geliştirme her 2 h. optimizasyonu için bu adım gerekli olabilir kontrol edilmelidir.
  8. Slaytlar iki kez 50 mL 5 dk, RT, KTBT çözeltisi içeren bir Coplin cam yıkama.
  9. Slayt 1 x PBS RT, 50 mL 5 min için içeren bir Coplin cam yıkama.

6. cTnT antikor algılama

  1. Hidrofobik kalem doku su geçirmez bir çember her slaytta gerekirse yeniden çizmek için kullanın.
  2. Her slayt uzunluğu çözüm engelleme 500 µL uygulanır. RT, bir oksijen odası, 1 h için yatay slaytlar kuluçkaya.
  3. 2 μL sulandrarak cTnT antikor çözümde 200 μL ofblocking 1,5 mL Tüp, cTnT antikor çözüm (1: 100) hazırlayın.
  4. 200 µL cTnT antikor çözüm her slayt uzunluk için geçerlidir. Slaytlar kuluçkaya yatay olarak O/N oksijen odasında 4 ° C'de.
  5. Slayt 1 x PBS RT, 50 mL 5 min için üç kez içeren bir Coplin cam yıkama.
  6. Rabbit-568 antikor çözüm (1:500) 0.5 μL sulandrarak rabbit-568 antikor çözümde 250 μL ofblocking 1,5 mL Tüp, hazırlayın.
  7. Rabbit-568 antikor çözüm 250 µL her slayt uzunluk için geçerlidir. RT, bir oksijen odası, 1 h için yatay slaytlar kuluçkaya.
  8. Slayt 1 x PBS RT, 50 mL 5 min için üç kez içeren bir Coplin cam yıkama.
  9. İsteğe bağlı: 250 µL DAPI çalışma çözüm her slayt uzunluğunu uygulanır ve slayt yatay RT, ışıktan korunan, 1 dk. için kuluçkaya.
  10. Slayt 1 x PBS RT, 50 mL 5 min için iki kez içeren bir Coplin cam yıkama.

7. montaj ve görüntüleme

  1. 2-3 damla montaj orta ve cam kapak notu ile slaytlar bağlayın. Düz, ışıktan korunan 4 ° C'de O/N, Kuru slayt izin.
  2. Epifluorescent veya confocal Mikroskopi için devam edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

miRNA in situ hibridizasyon kapış miRNA ve U6-snRNA, sırasıyla negatif ve pozitif denetimleri hizmet kullanarak fare kalp bölümlerde optimize edildi. Pozitif boyama belirtilir mavi, negatif boyama renk geliştirme eksikliği gösterilir iken (Şekil 1A-1B). MiRNA-182 Cardiomyocyte belirli ifade denetim ve PlGF overexpressing fareler kalp bölümleri değerlendirildi. Bir αMHC organizatörü altında PlGF transgene taşıyan fareler kalp hipertrofisi, artan angiogenez için ikincil transgene harekete geçirmek266 hafta içerisinde geliştirmek. Situ hibridizasyon gerçekleştirilen ve artan ifade miRNA-182 PlGF fareler, kontrollere göre kalplerin bulundu (Şekil 2A-2 H), mavi boyama tarafından belirtilen. Hangi hücre tipleri miRNA-182 hızlı belirlemek için biz sonra immunostaining aynı bölümlerinde cTnT için gerçekleştirilir. MiRNA-182 cTnT pozitif cardiomyocyte hücrelerle birlikte lokalize yanı sıra çekirdeği, denetim ve PlGF fare kalp bölümlerinde lekeli DAPI bulduk (Şekil 2C-2 H), kırmızı ve mavi sırasıyla boyama tarafından belirtilen. Bu görüntüler bir 20 X amacı ile vardı.

Figure 1
Resim 1: Negatif ve pozitif in situ hibridizasyon boyama. (A) In situ hibridizasyon kapış miRNA için (25 nM) denetim fare kalp bölümü içinde. (B) In situ hibridizasyon U6-snRNA için (25 nM) denetim fare kalp bölümü içinde. Ölçek çubuğu 100 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Cardiomyocyte belirli ifade miRNA-182 kontrolü ve PlGF fare kalpler. (A-B) İn situ hibridizasyon miRNA-182 denetim ve PlGF fare kalp bölümlerinde için. (C-D) Immunostaining denetim ve daha önce miRNA-182 için lekeli PlGF fare kalp bölümlerinde cTnT için. (E-F) DAPI kontrolü ve PlGF nükleer yerelleştirme için daha önce miRNA-182 için lekeli fare kalp bölümleri counterstaining. (G-H) MiRNA-182 (derin mavi), cTnT (kırmızı) ve kontrol ve PlGF fare kalp bölümler için boyama DAPI (açık mavi) birleştirilmiş görüntüleri. Ölçek çubuğu 50 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

miRNA transkript algılama duyarlılık, özgüllük ve nicel güç farklı farklı teknikleri ile elde edilebilir. Burada, biz miRNA in situ hibridizasyon immunostaining ile kaplin göstermek ve aynı kalp bölümlerinde miRNA ve protein molekülleri ifade düzeylerde eşzamanlı değerlendirilmesi için izin veren bir protokol açıklayın. Biz ilk kazmak etiketli LNA miRNA probları in situ hibridizasyon gömülü parafin kalp bölümler üzerinde gerçekleştirmek nasıl göstereceğim. Daha sonra aynı bölümlerinde cTnT için immunostaining nasıl açıklar. Son olarak, sonuçta elde edilen renk ve floresan görüntüleri birleştirmek nasıl gösterir. Bu iletişim kuralı için Formalin sabit (4 ° C, O/N) optimize edilmiş / parafin gömülü fare kalp dokuları, kazmak etiketli LNA miRNA probları ve cTnT kullanılarak. Daha fazla en iyi duruma getirme için farklı dokuların gerekli, soruşturma veya antikor türleri aşağıda açıklandığı şekilde.

RNase free koşulları dikkatle RNase kirlenme ağır denemenin sonucu olumsuz etkileyebilir hibridizasyon, soruşturma için uzanıyor adımları uygulanmalıdır. Tüm çözümler DEPC tedavi GKD2ile O yapılmalıdır ve tüm Coplin kavanoz RNase dekontaminasyon çözümünü ile tedavi edilmelidir. Buna ek olarak, aşağıdaki önemli noktalar farklı kazı etiketli LNA miRNA probları ile çalışırken dikkate alınmalıdır. Hibridizasyon sıcaklık her sonda erime sıcaklığı (Tm) üzerinde bağlıdır. Genel bir kural olarak, 30 ° c aşağıda verilen RNA Tm veya aşağıda verilen DNA Tm 20 ° C sıcaklık probu hibridizasyon için kullanılmalıdır. Ayrıca, ideal sonda konsantrasyon optimize edilmelidir. Genellikle 1-50 nM arasında yatıyor. Bu bir endişe ise son olarak, hibridizasyon solüsyon içeren sonda ile 95 ° C arasında herhangi bir ikincil yapılar denatüre 5 min için ısıtmalı. Bir sonda, özgüllük test etmek için önemli bir adım özellikle ilk defa kullanılan deneysel başarı (Şekil 2) sağlamak için bir negatif (karıştırılmış) de olabildiğince olumlu (örneğin U6) denetim sonda, eklemektir. Benzer denetimler (örneğin bir CD31 endotel antikor) immunostaining adımı sırasında kullanılmalıdır.

Situ hibridizasyon deneyleri'yaygın bir sorun yapı/arka plan sinyal boyama gelişmedir. Önlemek veya adımları boyama artifakı en aza indirmek için doku özellikle uzun incubations sırasında tüm adımları kurumasını üzerinden korunmalıdır. Özellikle yüksek sıcaklık kullanıldığında hibridizasyon adım ve odaları nemlendirme kullanımı sırasında slaytlar ile RNase free coverslips kapsayan tavsiye ediyoruz. Ayrıca immunostaining adımı sırasında faiz protein veya cTnT algılamaya 568 veya 594 fluorophore kullanımını öneriyoruz. Bu kez 488 fluorophores doku sabit formaldehit üzerinde kullanılan kullanımı ile doğar herhangi bir autofluorescence ortadan kaldırır.

Biz dikkat tavsiye başka bir AP boyama doku mevcut belirli miRNA düzeyleri üzerine bağlıdır geliştirme süresi değişkendir. Biz AP boyama ilerleme her 2 h, ilk deneme için kontrol öneririz. Daha fazla en iyi duruma getirme kuluçka (RT-37 ° C) parametre sıcaklığını değiştirme içerebilir. Son olarak, arka plan gerçek miRNA sonda boyama önce geliştirmeye başlar veya çözüm boyama AP mavi-kahverengi renk değiştirirse, slaytları iki kez içinde PBST yıkama ve boyama çözüm eski yerine koymak ile bir taze yapılmış bir öneririz.

Son olarak, her ne kadar bu iletişim kuralı Formalin-sabit/parafin-gömülü fare kalp dokuları için optimize edilmiş, alternatif olarak işlenmiş dokuları (PFA sabit/gömülü Ekim) ve/veya sonda veya antikor farklı kullanımı adapte olabilir. Situ hibridizasyon ve düşünülmesi gereken immunostaining birleştiren bir sınırlama nedeniyle ikinci olanlar sırasında kullanılan yüksek sıcaklıklarda olası imha onların anılan sıraya göre epitopları bağlamak için birkaç antikorların hatasıdır hibridizasyon ve sıkılık adımları yıkama. Situ hibridizasyon ve immunostaining teknikleri daha fazla sınırlamalar en sık miRNA veya protein molekülleri çok düşük konsantrasyonlarda sırasıyla algılamak için bu teknikleri gücüne bakın. MiRNA veya protein bereket bir endişe olduğunda sinyal güçlendirme kitleri kazmak veya antikor algılama için kullanılabilir. Böyle kitleri sağlamak aynı zamanda bir floresan alternatif miRNAs, tespiti için hangi, floresan immunostaining ile birleştiğinde resim alma basitleştirebilirsiniz. Gerçek zamanlı PCR ve Western blot büyük duyarlılık, olan gibi alternatif yöntemler de düşük bolluk sorunları gidermek olabilir. Ancak, in situ hibridizasyon/immunostaining Protokolü aksine, bu teknikleri miRNA/protein molekülleri doku özgü yerelleştirme üzerinde herhangi bir bilgi sağlar.

Özetlemek gerekirse, biz aynı doku üzerinde miRNA ve protein molekülleri eşzamanlı olarak algılanmasını sağlayan protokol tarif inandığımız miRNA araştırma fare modelleri çok değerli bir araç olacak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Athanasios Papangelis, el yazması kritik Yorumlar için teşekkür etmek istiyorum. FM Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC; tarafından desteklenen BB/M009424/1). IP Amerikan Kalp Derneği Bilim adamı kalkınma hibe tarafından (17SDG33060002) desteklenir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethylpyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 DEPC
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 PBS
Tween-20 American Bioanalytical AB02038 non-ionic surfactant
Histoclear National Diagnostics HS-200
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Sigma Aldrich 3115879001 ProK
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 PFA
Sodium Chloride ThermoFisher S271 NaCl
Magnesium Chloride Hexahydrate ThermoFisher M33 MgCl2
Tris Sigma Aldrich T6066
Hydrochloric Acid Solution, 1 N ThermoFisher SA48 HCl
Hydrochloric Acid Solution, 12 N ThermoFisher S25358 HCl
1-Methylimidazole Sigma Aldrich 336092
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich 39391 EDC
Hydrogen peroxide solution H2O2 Sigma Aldrich 216763 H2O2
Trisodium citrate dihydrate Sigma Aldrich S1804 Sodium Citrate
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) Qiagen 339450 scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe QIagen YD00615701 5'-DIG and 3'-DIG labelled
Levamisol hydrochloride Sigma Aldrich 31742
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647 BSA
NBT/BCIP Tablets Sigma Aldrich 11697471001 NBT-BCIP
Potassium Chloride ThermoFisher P217 KCl
DAPI solution (1mg/ml) ThermoFisher 62248 DAPI
Glass coverslip ThermoFisher 12-545E Glass coverslip
Plastic coverslip Grace Bio-Labs HS40 22mmX40mmX0.25mm RNA-ase free plastic coverslip
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma Aldrich 11093274910 DIG antibody
Hydrophobic barrier pen Vector Laboratories H-4000 Pap pen
Anti-Cardiac Troponin T antibody Abcam ab92546 cTnT antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 ThermoFisher A-11011 anti-rabbit-568 antibody
Dako Fluorescence Mounting Medium DAKO S3023 mounting medium
Sheep serum Sigma Aldrich S3772
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Deionized Formamide American Bioanalytical AB00600
Hybridization Oven ThermoFisher UVP HB-1000 Hybridizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  2. Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
  3. Hutvagner, G., Zamore, P. D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science. 297, 2056-2060 (2002).
  4. Krol, J., et al. Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design. Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).
  5. Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. Vertebrate microRNA genes. Science. 299, 1540 (2003).
  6. Tian, T., Wang, J., Zhou, X. A review: microRNA detection methods. Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).
  7. Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. MicroRNAs potentiate neural development. Neuron. 64, 303-309 (2009).
  8. Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).
  9. Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. Embryonic stem cell-specific MicroRNAs. Developmental cell. 5, 351-358 (2003).
  10. Kasper, D. M., et al. MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos. Developmental cell. 40, 552-565 (2017).
  11. Liu, N., Olson, E. N. MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development. Developmental cell. 18, 510-525 (2010).
  12. Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
  13. Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).
  14. Ying, W., et al. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity. Cell. 171, 372-384 (2017).
  15. Perkins, D. O., et al. microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder. Genome biology. 8, R27 (2007).
  16. Miller, B. H., et al. MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).
  17. Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion. Cell. 152, 262-275 (2013).
  18. Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research. Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).
  19. Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
  20. Ikeda, S., et al. Altered microRNA expression in human heart disease. Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).
  21. Mann, M., et al. An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses. Nature Communications. 8, 851 (2017).
  22. O'Connell, R. M., et al. MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development. Immunity. 33, 607-619 (2010).
  23. Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy. Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).
  24. He, L., et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature. 447, 1130-1134 (2007).
  25. Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
  26. Li, N., et al. miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart. Science Reports. 6, 21228 (2016).
  27. Meerson, F. Z. Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency. Circulation Research. 10, 250-258 (1962).
  28. Tardiff, J. C. Cardiac hypertrophy: stressing out the heart. Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).
  29. Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2. Circulation. 128, 388-400 (2013).
  30. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146-e603 (2017).
  31. Pena, J. T., et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nature Methods. 6, 139-141 (2009).

Tags

Genetik profil oluşturma LNA sonda in situ hibridizasyon immunostaining kalp hipertrofisi sorunu 139 Mikro-RNA ifade
Doku özgü miRNA ifade profil oluşturma <em>In Situ</em> hibridizasyon fareyle kalp bölümleri içinde
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I.… More

Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I. Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (139), e57920, doi:10.3791/57920 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter