Summary
Her presenterer vi en protokoll for å måle nasal potensielle forskjellen i mus. Testen kvantifiserer funksjon transmembrane ion transportører som cystisk fibrose transmembrane konduktans regulator og epithelial natrium kanalen. Det er verdifullt å evaluere effekten av romanen terapi for cystisk fibrose.
Abstract
Nasal potensielle forskjellen testen har blitt brukt i nesten tre tiår for å bistå i diagnostisering av cystisk fibrose (CF). Det har vist seg å være nyttig i tilfeller av dempes, oligo - eller mono-symptomatisk former for CF vanligvis diagnostisert senere i livet, og CF-relaterte lidelser som medfødt bilaterale fravær av vas deferens, idiopatisk kronisk pankreatitt, allergisk bronkopulmonal aspergillose og bronkiektasier. I både kliniske og prekliniske har testen blitt brukt som en biomarkør å kvantifisere Svar å målrettet strategier for jf Adapting testen til en mus er utfordrende og kan medføre en tilknyttet dødelighet. Dette dokumentet beskriver tilstrekkelig dybden av anestesi forpliktet til en nasal kateter i situ for kontinuerlig perfusjon. Den viser tiltak for å unngå broncho-aspirasjon av løsninger parfyme i nesen. Den beskriver også dyr omsorg på slutten av testen, inkludert administrasjon av en kombinasjon av motgift av bedøvende narkotika, fører til raskt snu anestesi med full gjenoppretting av dyrene. Representant data fra en CF og vill-type mus viser at testen diskriminerer mellom CF og ikke-CF. Helt, protokollen beskrevet her kan pålitelig målinger av funksjonell status for trans-epitelial klor og natrium transportører i spontant puste mus, samt flere tester i samme dyr samtidig redusere test-relaterte dødelighet.
Introduction
For nesten tre tiår, har elektriske potensielle forskjellen (PD) målinger blitt brukt til å evaluere funksjonell status transmembrane ion transportører uttrykt på nese mucosa, som representant for den distale airways1. Som en må dynamisk test2,3, nasal PD lar funksjonelle Disseksjon av cystisk fibrose Transmembrane konduktans Regulator (CFTR) og epithelial natrium kanal (ENaC) aktivitet, lokalisert begge på apikale membraner av epitelceller og utøve avgjørende roller i airway overflaten hydration. Den store klinisk anvendelsen av nese PD testen er å bistå i diagnostisering av CF, den vanligste dødelig genetisk lidelsen i kaukasiske populasjoner med en gjennomsnittlig forekomst av 1 av 2500 levendefødte i europeiske land. Testen har lenge vist seg nyttig i diagnostisering av dempes, oligo - eller mono-symptomatisk former for CF vanligvis diagnostisert senere i livet, og CF-relaterte lidelser som medfødt bilaterale fravær av vas deferens, idiopatisk kronisk pankreatitt, allergisk bronkopulmonal aspergillose og bronkiektasier4. Nylig clinometric evaluering av terapeutiske modulering av den grunnleggende CFTR feil5,6,7,8,9,10,11 ,,12,,13,,14,,15,,16 har gjort bruk av nese PD i kliniske forsøk av nye CF terapier. I innstillingen prekliniske har testen blitt tilpasset mus17 tillate undersøkelse av bioactivity nye CF mål terapi18,19,20,21. I mus er teknikken delikat, basert på arter anatomiske forskjeller i størrelse nese regionen mellom gnagere og mennesker, og hovedsakelig på den viktige rollen sensoriske innspill fra nasofacial regionen i gnagere. Det krever trent og dyktig operatører, dedikert utstyr og forsyninger.
CF er en multi systemisk lidelse av exocrine kjertler, i som kronisk luftveissykdom dominerer det kliniske bildet. Sykdommen er forårsaket av mutasjoner i genet koding syklisk adenosin monofosfat (cAMP)-regulert CFTR chloride kanal22. Hittil har mer enn 2000 CFTR mutasjoner vært identifisert23. De vanligste mutasjon24,25, funnet i nesten 90% av CF alleler, tilsvarer en sletting av fenylalanin i posisjon 508 polypeptid kjeden av protein (F508del-CFTR). CFTR protein er en rent ohmsk liten konduktans klorid kanal. Det er også betydelige bevis at CFTR regulerer andre transportmekanismer, spesielt ENaC26,27. Defekt elektrolytt transport, inkludert redusert CFTR-avhengige klorid konduktans og økt ENaC-avhengige natrium ledningsevne, er et kjennetegn på CF epithelia. Tidligere feilen gjenspeiles gjennom en redusert eller avskaffet repolarization svar på både elektrokjemiske gradient favoring klorid middelklasseinnbyggere og tillegg av isoprenaline (en β-adrenerge Agonistiske som øker intracellulær leiren) eller forskolin (en adenylate cyclase Agonistiske, ikke godkjent for klinisk bruk). Den siste feilen gjenspeiles av en basal hyperpolarization av nese mucosa (en mer negativ PD) og en økt respons på amilorid, et vanndrivende stoff som blokkerer ENaC28.
CF musen modeller er ofte brukt i CF forskning og har vært uvurderlig i å dissekere CF patologi. I dag, har minst femten modeller vært beskrevet29, hvorav tre er homozygous den mest klinisk relevante F508del mutasjon30,31,32. En av disse tre påkjenningen30, utviklet ved Erasmus University i Rotterdam, er brukt i nesten 20 år i Université catholique de Louvain (UCL) laboratoriet. Cftrtm1Eur modell30 har vist seg for å være svært nyttig å studere i multiorgan Patofysiologien ved CF sykdommen og å teste effekten av nye strategier18,19,20, 21. Mange problemer kan oppstå under eller tidlig etter (< 24 h) nasal PD testen i mus. I denne utredningen tilstrekkelig dybden av anestesi nødvendig for å holde en nasal kateter i situ for kontinuerlig perfusjon og tiltak for å unngå broncho-aspirasjon av løsninger parfyme i nesen er beskrevet. Dyr omsorg på slutten av testen er også beskrevet, inkludert administrasjon av en kombinasjon av motgift bedøvende stoffer, fører til raskt snu anestesi med fullstendig gjenoppretting av dyrene. Sammen kan disse prosedyrene pålitelig mål i spontant puste mus, redusert dødelighet, test og Gjenta testen i samme dyret. Representant data fra nese PD testen i en CF og vill-type mus vises og diskutert.
Murine nasal PD testprotokollen rapporteres i tre økter: vurdering og ledelse før, under og etter testen. For pre-test for vurdering og styring, er protokollen for utarbeidelsen av den doble lumen nasal kateter og løsninger brukes for kontinuerlig nasal perfusjon beskrevet i detalj. Under vurdering og ledelse deler av testen, er eksperimentelle oppsett og håndtering av musen minuttbasis dissekert. Til slutt, behandling av dyr på slutten av testen er beskrevet for å forbedre full dyr utvinning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studier og prosedyrer ble godkjent av den etiske komiteen for Forsøksdyrutvalget UCL (2017/UCL/MD/015) og med EU regelverket for dyr bruk i forskning (CEE n ° 86/609). Etterforskerne er kvalifisert for dyr eksperimentering etter direktivet 2010/63/EU av Europaparlamentet og Rådet for 22 September 2010 på beskyttelse av dyr som brukes til vitenskaplige formål.
1. pre test vurdering og ledelse
- Forberede den doble lumen nasal kateter.
Merk: En nasal kateter er laget som en dobbel lumen kapillær tube, en lumen brukes for kontinuerlig perfusjon av løsninger, og den andre som en måling kanal.- Varme opp den midtre delen av et stykke, ca 20 cm lang, av polyetylen rør (2.0 mm indre diameter, 3.0 mm ytre diameter; Figur 1 en) i flammen i en gass-brenner til det er mykt nok til å trekke (10-15 s).
- Trekk de to endene fra hverandre for å få en svært tynn kapillær slange av passende lengde (~ 15 cm) og ytre diameter (~0.1 mm) for nasal sonden (figur 1b).
- Rengjør og avfette to slike kapillærene med ren etanol, bli med dem med tape (figur 1c) og lim dem sammen med cyanoacrylate lim.
- Klippe bort overflødig lengden på sonder med et barberblad eller skalpell å oppnå en optimal lengde på dobbel lumen kateter på ca 8 cm (figur 1d).
- Injisere vann gjennom begge lumen å bekrefte at de er permeabel.
- Bruk et merke på 5 mm avstand fra spissen.
Merk: Sonden settes opp til merket i neseboret, slik at alle lengdemål gjøres på samme sted i nesehulen. - Lagre den doble lumen kateter i en tørr boks.
Merk: Det kan være brukt 6 - 10 ganger hvis riktig renset umiddelbart etter testen.
- Klargjør krem blandingen.
- Bland forsiktig elektrolytt krem og mettet 3 M KCl løsning i en 1:1 ratio (volum/volum), unngå dannelse av små luftbobler.
Merk: Krem blandingen brukes til å bygge elektrode broer for målingen og referansen Ag/AgCl elektroder, som vist i figur 1.
- Bland forsiktig elektrolytt krem og mettet 3 M KCl løsning i en 1:1 ratio (volum/volum), unngå dannelse av små luftbobler.
Figur 1 : Sonder med elektroder og broer. Figuren illustrerer polyetylen røret før (a) og etter oppvarming og trekke (b), tape med to kapillær deler (c) av den doble lumen kateter (d), silikon tube kontakter (e) og elektroder (f). For bildeskarphet, vært koblingene ikke fylt med krem bland. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Løsning etikett | Beskrivelse av løsningen |
| A | Basal bufret salt løsning |
| B | Flammehemmende bufret salt løsning |
| C | 10-2 M amilorid lagerløsning |
| D | 10-3 M forskolin lagerløsning |
Tabell 1: Lagerløsning for nasal PD testen i mus.
| Salt | mM | Molekylvekt | Finans |
| Natriumklorid (NaCl) | 135 | 58.44 | 7,889 |
| Veisalt dihydrate (CaCl2.2H2O) | 2,25 | 147 | 0.331 |
| Magnesium klorid hexahydrate (MgCl2.6H2O) | 1.2 | 203.3 | 0.244 |
| Dipotassium fosfat (K2HPO4) | 2.4 | 174.2 | 0.418 |
| Monopotassium fosfat (KH2PO4) | 0,4 | 136.1 | 0.054 |
Tabell 2: Sammensetningen av basale bufret salt løsning (lagerløsning A).
- Utarbeide løsninger.
- Forberede fire lager løsninger kreves for eksperimentell protokollen (tabell 1).
- Forberede den basale bufferløsning (lagerløsning A; Tabell 2) og klorfritt bufrede løsningen (lagerløsning B; Tabell 3) ved å blande salter i rent vann ved romtemperatur. Justere pH 7,4 (utvalg 7.0 – 7,6) bruker 1 N NaOH til å heve pH, 1 N HCl lavere pH. Sjekk osmolaritet løsningen (275 mOsm/L).
- Lagre i merket glassflasker på 4 ° C for inntil 3 måneder eller frosset i plastflasker i inntil 6 måneder.
- Forberede den 10-2 M amilorid løsningen (lagerløsning C) ved å legge til 26,6 mg amilorid hydroklorid 10 mL av rent vann. Varm blandingen i 5 til 10 minutter på 70 ° C. Amilorid er følsomme for lys, hold løsning C i en mørk beholder. Merk beholderen og lagre på 4 ° C for inntil 3 måneder.
- Forberede den 10-3 M forskolin løsningen (lagerløsning D) ved å legge 10 mg forskolin 24.36 mL av rent vann. Merk 0,1 mL dele forskolin lager løsningen og lagre på 20 ° C for inntil 6 måneder.
- Forberede fire lager løsninger kreves for eksperimentell protokollen (tabell 1).
- Forberede frisk løsninger A1, B1 og B2 (Tabell 4).
- Forberede frisk løsning A1 (basale salt bufferløsning pluss 10-4 M amilorid) ved å oppnå 10 mL av basale salt løsning (lagerløsning A) og legge til 0,1 mL 10-2 M amilorid løsning (lagerløsning C). Etiketten beholderen og bruk innen 24 timer av forberedelse.
- Forberede frisk løsning B1 (klorid bufret løsning pluss 10-4 M amilorid) ved å oppnå 10 mL av flammehemmende bufrede salt løsning (lagerløsning B) og legge til 0,1 mL 10-2 M amilorid løsning (lagerløsning C). Etiketten beholderen og bruk innen 24 timer etter forberedelse.
- Forberede frisk løsning B2 (flammehemmende bufrede salt løsning pluss 10-4 M amilorid og 10-5 M forskolin) ved å oppnå 10 mL av flammehemmende bufrede salt løsning (lagerløsning B) og legge til 0,1 mL 10-2 M amilorid løsning (lagerløsning C) og 0,1 mL 10-3 M forskolin løsning (lagerløsning D). Etiketten beholderen og bruk innen 2 timer med forberedelse.
| Salt | mM | Molekylvekt | Finans |
| Natrium gluconate (monosodium salt) | 135 | 218.1 | 29,444 |
| Kalsium gluconate (vannfri pulver) | 2.2 | 430.4 | 0.947 |
| Magnesium sulfat heptahydrate (MgCl2.6H2O) | 1.2 | 246.5 | 0.296 |
| Dipotassium fosfat (K2HPO4) | 2.4 | 174.2 | 0.418 |
| Monopotassium fosfat (KH2PO4) | 0,4 | 136.1 | 0.054 |
Tabell 3: Sammensetning av flammehemmende bufret løsning (lagerløsning B).
Figur 2 : Plasseringen av musen under perfusjon nasal mucosa. Figuren illustrerer varmeputen (a), voltmeter (b), referanse elektroden inn i subcutaneous plass i en baklem (c), den proksimale (d) og de distale (e) uttak av peristaltiske pumpen, den puten (f), og seng ark (g). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
2. vurdering og ledelse under testen
- Forberede det eksperimentelle oppsettet.
- For å hindre nedkjøling under og etter testen, bruk to oppvarming pads opprettholdt på fysiologiske temperaturer, en for måling oppsett (18,8 x 37,5 cm; Figur 2 en), og den andre (15.5 x 15.5 cm) i boksen der dyr plasseres for utvinning på slutten av testen.
- Slå på datamaskinen lastet med programvaren for datafangst koblet til den data minne høy inngangsimpedans (> 1012Ω) og høy oppløsning (0,1 mV) voltmeter (figur 2b).
- Koble til elektrodene til voltmeter. Koble den positive måle elektroden nasal kateter og negative referanse elektrode til kateter inn i subcutaneous plass i en hind lem, som vist i figur 2c.
- Dypp tips av elektrodene sammen i krem blandingen. Sjekk den innledende elektrode verdien. Avvise elektrodene Hvis verdien er større enn (±) 2 mV (ideelt 0 mV).
- Slå på peristaltiske pumpen og sette pumpen røret på plass, som vist i figur 2.
- Koble proksimale utløpet av pumpen røret til ampullen som inneholder den valgte løsningen for nasal perfusjon (figur 2d). Koble distale utløpet av pumpen røret til perfusjon lumen av nese kateter (figur 2e).
- Fyll en lumen av nese kateter med elektrolytt krem blandingen gjennom en 10 µL pipette tips. Tilpasse kateter til en silikon tube kontakt (figur 1e), fylle kontakten med krem bland og sett den positive elektroden i kontakten (figur 1f). Sjekk måle elektroden bro forskyvningsverdien. Avvise broer Hvis verdien er større enn (±) 2 mV (ideelt 0 mV).
- Fyll den andre lumen av nese kateter med fersk løsningen A1. Dypp spissen av den nese kateter i ampullen inneholder løsning A. omvendt retning av peristaltiske pumpen å fylle en lengde på nese kateter tilsvarer 10 s av perfusjon.
Merk: Dette gjør opptak basal PD verdier for 10 s før amilorid. Dypp spissen av den nese kateter i krem blandingen i kontakten til referanse elektroden (figur 1).
- Starte håndtering musen.
- Post musen vekt til å beregne nøyaktige dosen av bedøvelse å være injisert med intraperitoneal (ip) RV17.
- Bruker en 26G (0.45 x 10 mm) nål, injisere premedication intraperitoneally å fremme induksjon av anestesi: en fast dose av 50 µL av 5 mg/mL midazolam. Vent 5 min.
- Klargjør bedøvende blandingen (fentanyl, medetomidine, droperidol i siste konsentrasjoner 0,05, 0.40 og 20 mg/kg kropp vekt, og clonidine på fast dose av 0.375 µg) tillater optimal og stabil dybde bedøvelse (stadium III, plan 2)17 . Injisere volumet av bedøvende blanding intraperitoneally, og deretter injisere volumet av clonidine.
Merk: Etter 15 min musen skal sover og av bedøvelsen kan vare i minst 30 min. - Brett arket absorbere vev lage 3 cm bredt "pute" (figur 2f) som dekker øvre del av oppvarming pad (figur 2en) støtte for mus hodet.
- Dekke varmeputen med et ark med absorberende vev ('laken'; Figur 2 g). Plasser musen på ryggen på oppvarming pad. Tape lemmer og halen (figur 2).
- Sett inn referanse intravenøs kateter (figur 1g) i subcutaneous løpet av en baklem. Fjern nålen og tilpasse silikon tube kontakten (figur 1e, 2 c).
- Fyll kateter og kontakten med krem bland og sette negative elektroden i kontakten (figur 1f).
- Fikse kateter og elektroden med tape som nødvendig for å hindre enhver forskyvning. Etter plassering av referanse elektrode og broer, kontroller måle elektroden bro forskyvningsverdien igjen av dipping spissen av den nese kateter i elektrode krem blandingen i kontakten til IV kateter. Registrere stabil siste offset (ideelt sett mindre enn (±) 2 mV).
- Fikse mus ører med "mild" tape på oppvarming pad i en ledig plass mellom de to delene av absorberende vev ('puten' (figur 2f) og 'laken'; (Figur 2g)). Fastsette vibrissae (stiv Hårene vokser nær neseborene) uten å berøre øynene.
- For å absorbere væske fra munnhulen, flytte den tunge sidelengs (Figur 3et) og sett en spiss veke filter papir ('røret'; Figur 3 b) ca 1 cm inn i munnen. For å absorbere væske gå tom perfused nesebor, plass et andre filter papir ('lommetørkleet'; Figur 3 c) holdt på spissen av nesen.
- Kontroller positiv kontrollverdien epithelial potensialet ved å plassere av nese kateter i kontakt med innsiden av munnen.
Merk: Lesing bør være stabil og mellom -10 mV og -20 mV. - Holder det med fin tang og under god direkte belysning, delikat innføre nasal kateter i ett nesebor til 4 - 6 mm fra nesen tips.
Merk: Den nese PD kateter ligger i den midterste nasal concha der det gir maksimal stabil grunnlinjen PD verdi17,20. - 5 min etter injeksjon av bedøvende narkotika, skråstille forsiktig oppvarming pad ved ca 30° med dyr hodet nedover. Overvåke maksimal basale PD verdien.
- Når det er stabile over en periode på ca 30 s, start perfusing nasal mucosa, med en konstant hastighet på 10 µL / min, den bufrede 4 løsninger (A, A1, B1, B2) i rekkefølge. Perfuse første løsning (trinn 1.3.1.1) for 10 s og hver følgende løsning (trinn 1.4) i 5 minutter eller til en stabil verdi er nådd. Stopp perfusing forskolin (B2) når forbigående forskolin svaret starter går ned.
- Velg et 1 s intervall for registrering av data. Starte innspillingen data ved starter perfusjon. Viser data som en funksjon av tid på dataskjermen.
- Stopp datainnspilling på slutten av perfusjon løsning B2. Lagre data som en regnearkfil.
- Riktige data ved å trekke endelige forskyvningsverdien.
Figur 3 : Plasseringen av musen på varmeputen med nasal kateter og filter papirene i sted. Figuren illustrerer tungen sette sidelengs (a) rør (b) og lommetørkle (c). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3. etter test vurdering og ledelse
- Slipp museknappen fra oppvarming pad.
- Tørk musen nesen med 'laken' (figur 2g).
- Injiser intraperitoneally bedøvende antagonist mix består av en fast dose (4 µg) av nalokson, konkurransedyktig morfin antagonist og atipamezole, en medetomidine bestemt motgift (2 mg/kg kroppsvekt).
- Lå musen på de mindre varmeputen i boksen utvinning til full gjenoppretting, som er vanligvis observert etter 1-2 h.
Merk: I UCL laboratoriet, ca 10% dødelighet, hovedsakelig knyttet til bronchoaspiration av løsninger parfyme i nesehulen under testen er observert uansett kjønn eller genotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å illustrere de karakteristiske ion transport unormalt i CF, ble nasal PD målinger utført følger protokollen beskrevet ovenfor i en F508del-CF mus og en vill-type kontroll av FVB/129 genetisk bakgrunn fra Brussel kolonien Cftrtm1Eur mus30. Dette klinisk relevante modell, skjuler de vanligste og en av de mest alvorlige F508del-CFTR mutasjon23,24,25, er best tilgjengelige CF mus modell30,31, 32.
Representant nasal PD tracings, i en 4 - måned gamle kvinnelige mus homozygous for F508del-CF mutasjon og i en alder - og sex-matchet vill-type littermate, er vist i Figur 4. I de to første fasene av testen, ble funksjonell status for ENaC studert ved perfusing løsninger A og A1, den sistnevnte inneholder amilorid. Funksjonell status av CFTR (og alternative klorid transportører i fravær av forskolin) ble vurdert i de to siste fasene av testen når bidrag av ENaC var blokkert av amilorid.
F508del-CF musen, en hyperpolarized opprinnelig verdi (en mer negativ PDmax sammenlignet med vill-type mus verdien) sammen med en økt amilorid respons var observert; begge funnene gjenspeiler CFTR-assosiert ENaC hyperaktivitet. Mer konsekvent, en drastisk redusert repolarization svar på både en elektrokjemisk gradering gunstige klorid middelklasseinnbyggere og tillegg av forskolin, kalt her som totalt klorid svar, ble observert. Selv om omfanget av forskolin svaret i vill-type mus er liten (-3 mV), i CF, svaret er vanligvis avstumpet, konsekvent med CFTR tap-av-funksjonen.
Figur 4 -Representant nasal PD tracings. Representant nasal PD tracings fra en homozygous normal mus (A) og en mus homozygous for F508del-CFTR mutasjon (B) sammen med de enkelte verdiene hentes for nasal PD parametrene (C og D). PDmax: maksimal stabil grunnverdier. Amilorid svar: forskjellen mellom verdiene for nasal PD på slutten og begynnelsen av perfusjon nasal mucosa med basal bufret salt løsning som inneholder amilorid (løsning A1). Flammehemmende svar: forskjellen mellom verdiene for nasal PD på slutten og begynnelsen av perfusjon nasal mucosa med flammehemmende bufret salt løsning samt amilorid (løsning B1). Forskolin svar: forskjellen mellom verdiene for nasal PD på slutten og begynnelsen av perfusjon nasal mucosa med flammehemmende bufret salt løsning samt forskolin og amilorid (løsning B2). Total klorid svar: summen av de to siste parameterne innhentet under null-klorid perfusjon. Pilene angir endringer av løsninger parfyme i neseboret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Motgift av bedøvelse ble brukt på slutten av testene, dermed redusere varigheten av anestesi, som kan være opptil 45 min utover test ferdigstillelse. Som utvinning av dyrene skjedde uten ettervirkninger, ble de testet igjen etter en pause på syv dager, når den samme protokollen ble brukt. Det samme neseboret ble utforsket under begge testene. Eksempler på den andre testen og sammenkoblede forskjeller til hver individuelle nasal PD-parameter mellom de to testene er vist i figur 5. Som tidligere rapportert35var forskjellene mellom test nær null, spesielt for totalt klorid svar, reflekterer funksjonell status for CFTR-avhengige klorid transport, defekt i CF.
Figur 5 -Enkeltverdiene nasal PD parametere. Verdiene ble oppnådd i en andre test (t2) i en homozygous normal mus (A) og en mus homozygous av F508del-CFTR mutasjon (B) sammen med sammenkoblede forskjellene mellom andre og første test (t1) for hver parameter for tilsvarende. PDmax: maksimal stabil grunnverdier. Amilorid svar: forskjellen mellom verdiene for nasal PD på slutten og begynnelsen av perfusjon nasal mucosa med de basale bufret salt løsning som inneholder amilorid (løsning A1). Flammehemmende svar: forskjellen mellom verdiene for nasal PD på slutten og begynnelsen av perfusjon nasal mucosa med den klorfritt bufret salt løsning samt amilorid (løsning B1). Forskolin svar: differansen mellom verdiene i nasal PD på slutten og begynnelsen av perfusjon nasal mucosa med den klorfritt bufret salt løsning samt forskolin og amilorid (løsning B2). Total klorid svar: summen av de to siste parameterne innhentet under null-klorid perfusjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Løsning etikett | Beskrivelse av løsningen |
| A1 | Basal bufret salt løsning (A) pluss 10-4 M amilorid |
| B1 | Flammehemmende bufret salt løsning (B) pluss 10-4 M amilorid |
| B2 | Flammehemmende bufret salt løsning (B) pluss 10-4 M amilorid pluss 10-5 M forskolin |
Tabell 4: Liste over frisk løsninger for nasal PD testen i mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formålet med dette dokumentet er å beskrive en tilstrekkelig protokoll for å måle nasal PD under kontinuerlig perfusjon av løsninger i spontant puste mus for lang tid som kreves for å teste integriteten til ion transportører, hovedsakelig CFTR og ENaC. Alle trinn av protokollen har nøye blitt optimalisert for å sikre full dyr og god kvalitet og reproduserbar. I særdeleshet, kritisk trinn er ledelse og anestesi vurdering, og tilstrekkelig dyr posisjon under og etter testen.
Tidligere studier viste at flyet 2 stage III av bedøvende eksponering, som kan oppnås ved å bruke cocktail blandingen brukt her17, er forbundet med vanlige puste og fravær av negative inotrope effekt og på blink, pupillary og pedal uttak reflekser. På dette nivået av bedøvende dybde, kan nasal kateter holdes i situ for kontinuerlig perfusjon av nesehulen og som en bro av måle elektroden med god toleranse. Også var innsetting av kateter i subcutaneous plass, serverer som referanse elektrode, ikke fulgt av noen smertefulle reaksjon eller tegn på skadelig effekt. I Red, avgjørende rolle sanseinntrykk fra nasofacial regionen i kontroll av atferd vis-à-vis en ekstern plassering, inkludert en trussel, gjør tilstrekkelig dybdeskarphet anestesi utfordrende når opererer i nesehulen. Tåke i stedet for kontinuerlig nasal perfusjon er brukt for å utføre nasal PD test i noen mus studier33,34. Men fører denne metoden til ikke-pålitelige resultater, gjentatte fjerning og reinsertions av nese sonden. Som et spørsmål om faktum, på grunn av ikke-homogen distribusjon celletyper i musen nasal mucosa20er reposisjonering spissen av sonden på samme sted i neseboret avgjørende. Videre forsvinne Svar å endringer av løsninger, spesielt klorfritt løsninger, raskt når perfusjon avbrytes.
Broncho-aspirasjon av løsninger som fører til respirasjonsstans er en kritisk begrensning av prosedyren og er den viktigste årsaken til dødelighet av testen. Flere viktige tiltak sikte på hindre det, inkludert en dorsal liggesår posisjon av dyret, lett vippe den med hodet ned og absorberer overflødig væske fra de muntlige og nasal hulrom17. En rask og reversibel nivå av anestesi med fullstendig gjenoppretting av dyr er sikret ved å bruke motgift bedøvende narkotika på slutten av testen. Protokollen presenteres her kan pålitelig mål i spontant puste mus og Gjenta testen i samme dyret. Det påvirker antall mus kreves for å få statistisk signifikans35 og samsvar i 3R (erstatte, avgrense og redusere) regler for dyr bruk i eksperimentell prosedyrer36. Hos mennesker som mus, er laveste mellom-test variasjon funnet for totalt klorid svar, tyder på at det som den mest pålitelige nasal PD parameteren å oppdage effekten av nye CF strategier. I CF mus viste måling feil totale klorid svaret seg å være mindre enn ±1.7 mV35. Med andre ord, når evaluere bioactivity av en CFTR-korrigering stoffet i F508del-CF mus, forskjell totale klorid svar i fravær og i nærvær av behandling større enn 2 mV indikerer 95% sjanse for en narkotikarelaterte bedre effekt.
Data tolkning av representative tracings illustrerer evne til nasal PD testen å forskjellsbehandle CF og vill-type mus,18,,19,,20,,21,,35 og viser at F508del-CF Erasmus mus modell30 etterligner menneskelige nese mucosa forhold til den typiske kliniske ion transport abnormiteter. I dyr-modellen er imidlertid en gjenværende klorid konduktans synlig, som resulterer fra en gjenværende F508del-CFTR-funksjon eller et bidrag på alternative ikke-CFTR-avhengige klorid kanaler. Oversette resultatene fra CF forskning fra prekliniske i klinisk innstillinger innebærer håndtere flere store forskjeller mellom de to innstillingene. Musen CF fenotypen viser en dempes åndedretts syndrome. Fravær av flere terapier sammen med det faktum at musen modellen ligger privilegert forhold med hygienisk barrierer også bidra til forskjeller37. Protokollen beskrevet her viser en svært lav variasjon35 og det har blitt tilpasset gris38,39 og oppspore modeller40. I en tidligere studie, ble eksperimentelle protokollen endret av inkludert perfusjon musen nasal mucosa med en inhibitor av alternative klorid transportører, utforske mulige bidrag av ikke-CFTR-avhengige kalsium-aktivert klorid kanaler18. Testen er også brukt til å studere natrium transport i den β-ENaC overexpressing mus modell41, konstruert for å etterligne CF-lunge sykdom42. I fremtiden, ytterligere programmer av testen kan anses å studere andre transportører, som ATP12A, en CFTR-uavhengig H+-pump protein uttrykt menneskelig og gris men fraværende i musen airways43. Helt, protokollen beskrevet her kan pålitelig målinger av funksjonell status transepithelial klor og natrium transportører spontant puste mus, redusert dødelighet, test og flere tester i samme dyret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Prof J. Lebacq for kritisk redigering manuskriptet. Cftrtm1Eur (homozygous F508del-CFTR (FVB/129) mus ble utviklet av Erasmus MC, Rotterdam i Nederland, med støtte fra det europeiske fellesskap europeiske koordinering handling for forskning i cystisk fibrose EU FP6 LHHM-CT-2005-018932.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Portex polyethylene tube | Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL | Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD | to prepare capillary tubes for nasal probe |
| Electrode cream | Parker, Fairfield, NJ, USA | Redux cream | to build electrode bridges |
| Ag/AgCl electrodes | Biomedical, Clinton Township, MI, USA | JNS BNT131-1,0 | measuring and reference electrodes |
| amiloride hydrochloride | Sigma, St Louis, MI, USA | A7410 | to prepare perfusion solutions |
| forskolin | Sigma, St Louis, MI, USA | F6886 | to prepare perfusion solutions |
| Knick Portamess voltmeter | Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany | Portavo 904 pH | to measure potential difference |
| Paraly SW 112 Software | Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany | Paraly SW112 software | to capture potential difference data |
| midazolam | Mylan, Hoeilaart, Belgium | Dormicum 15mg/3ml | to serve as anaesthetic premedication |
| fentanyl | Janssen Cilag, Berchem, Belgium | Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| medetomidine | Orion Pharma, Espoo, Finland | Domitor 1 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| droperidol | Janssen Cilag, Berchem, Belgium | Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| clonidine | Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany | Catapressan 0.15 mg/ml, | to serve as anaesthetic medication |
| refernce IV catheter | Becton Dickinson, Sandy, UT, USA | 24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W | to build electrode bridges |
| forceps | Fine science Tools, Heidelberg, Germany | Dumont #5, Fine science Tools | to place the nasal catheter |
| naloxone | Braun Medical, Brussels, Belgium | Narcan, 0.4 mg/ml | to serve as anaesthetic antagonist |
| atipamezole | Zoetis, Bloomberg, Belgium | Antisedan, 5 mg/ml | to serve as a medetomedine specific antidote |
| Heating pads | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | 18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm | to avoid hypothermia during and after the test |
| Peristaltic pump P1 | GE Life Sciences, Uppsala, Sweden | 18111091 | to perfuse solutions in the mouse nose |
| cyanoacrylate glue | Loctite, Henkel, Düsseldorf, Germany | super glue 3 | to glue together two capillary tubes for nasal probe |
| NaCl | Sigma, St Louis, MI, USA | RES0926S-A7 | Pharma-Grade, USP |
| CaCl2.2H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | M7304 | Pharma-Grade, USP |
| MgCl2.6H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551128 | Pharma-Grade, USP |
| K2HPO4 | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551139 | Pharma-Grade, USP |
| Na gluconate | Sigma, St Louis, MI, USA | S2054 | Pharma-Grade, USP |
| Ca gluconate | Sigma, St Louis, MI, USA | C8231 | Pharma-Grade, USP |
| MgSO4.7H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | RES0089M-A7 | Pharma-Grade, USP |
| BD needle | Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA | BD 26G (0.45x10 mm) | intraperitoneal injection |
References
- Knowles, M., Gatzy, J., Boucher, R. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in cystic fibrosis. New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1495 (1981).
- Middleton, P. G., Geddes, D. M., Alton, E. F. W. Protocols for in vivo measurement of the ion transport defects in cystic fibrosis nasal epithelium. European Respiratory Journal. 7 (11), 2050-2056 (1994).
- Knowles, M. R., Paradiso, A. M., Boucher, R. C. In vivo nasal potential difference: techniques and protocols for assessing efficacy of gene transfer in cystic fibrosis. Human Gene Therapy. 6 (4), 445-455 (1995).
- Paranjape, S. M., Zeitlin, P. L. Atypical cystic fibrosis and CFTR-related disorders. Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 35 (3), 116-123 (2008).
- Wilschanski, M., et al. A pilot study of the effect of gentamicin on nasal potential difference measurements in CF patients carrying stop mutations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (3), Pt 1 860-865 (2000).
- Clancy, J. P., et al. Evidence that systemic gentamicin suppresses premature stop mutations in patients with CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163 (7), 1683-1692 (2001).
- Wilschanski, M., et al. Gentamicin-induced correction of CFTR function in patients with CF and CFTR stop mutations. New England Journal of Medicine. 349 (15), 1433-1441 (2003).
- Sermet-Gaudelus, I., et al. In vitro prediction of stop-codon suppression by intravenous gentamicin in patients with CF: a pilot study. BMC Medicine. 5, 5 (2007).
- Clancy, J. P., et al. No detectable improvements in CF transmembrane conductance regulator by nasal aminoglycosides in patients with CF with stop mutations. American Journal of Respiratory and Cell Molecular Biology. 37 (1), 57-66 (2007).
- Kerem, E., et al. Effectiveness of PTC124 treatment of CF caused by nonsensemutations: a prospective phase II trial. Lancet. 372 (9640), 719-727 (2008).
- Sermet-Gaudelus, I., et al. Ataluren (PTC124) induces CF transmembrane conductance regulator protein expression and activity in children with nonsense mutation CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (10), 1262-1272 (2010).
- Wilschanski, M., et al. Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 38 (1), 59-69 (2011).
- Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with CF and the G551D-CFTR mutation. New England Journal of Medicine. 363 (21), 1991-2003 (2010).
- Clancy, J. P., et al. Results of a phase IIa study of VX-809, an investigational CFTR corrector compound, in subjects with cystic fibrosis homozygous for the F508del-CFTR mutation. Thorax. 67 (1), 12-18 (2012).
- Leonard, A., Lebecque, P., Dingemanse, J., Leal, T. A randomized placebo-controlled trial of miglustat in cystic fibrosis based on nasal potential difference. Journal of Cystic Fibrosis. 11 (3), 231-236 (2012).
- De Boeck, K., et al. CFTR biomarkers: time for promotion to surrogate end-point. European Respiratory Journal. 41, 203-216 (2013).
- Leal, T., et al. Successful protocol of anaesthesia for measuring transepithelial nasal potential difference in spontaneously breathing mice. Laboratory Animals. 40 (1), 43-52 (2006).
- Lubamba, B., et al. Preclinical evidence that sildenafil and vardenafil activate chloride transport in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (5), 506-515 (2008).
- Lubamba, B., et al. Airway delivery of low-dose miglustat normalizes nasal potential difference in F508del cystic fibrosis mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (11), 1022-1028 (2009).
- Lubamba, B., et al. Inhaled PDE5 inhibitors restore chloride transport in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 37 (1), 72-78 (2011).
- Vidovic, D., et al. rAAV-CFTRΔR Rescues the Cystic Fibrosis Phenotype in Human Intestinal Organoids and Cystic Fibrosis Mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 288-298 (2016).
- Stutts, M. J., et al. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269 (5225), 847-850 (1995).
- Lubamba, B., Dhooghe, B., Noel, S., Leal, T. Cystic fibrosis: insight into CFTR pathophysiology and pharmacotherapy. Clinical Biochemistry. 45 (15), 1132-1144 (2012).
- Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4925), 1066-1073 (1989).
- Stutts, M. J., Rossier, B. C., Boucher, R. C. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inverts protein kinase A-mediated regulation of epithelial sodium channel single channel kinetics. Journal of Biological Chemistry. 272 (22), 14037-14040 (1997).
- Ismailov, I. I., et al. Regulation of epithelial sodium channels by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biological Chemistry. 271 (9), 4725-4732 (1996).
- Althaus, M. ENaC inhibitors and airway re-hydration in cystic fibrosis: state of the art. Current Molecular Pharmacology. 6 (1), 3-12 (2013).
- Wilke, M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, Suppl 2 152-171 (2011).
- Van Doorninck, J. H., et al. A mouse model for the cystic fibrosis delta F508 mutation. The EMBO Journal. 14 (18), 4403-4411 (1995).
- Colledge, W. H., et al. Generation and characterization of a delta F508 cystic fibrosis mouse model. Nature Genetics. 10 (4), 445-452 (1995).
- Zeiher, B. G., et al. A mouse model for the delta F508 allele of cystic fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 96 (4), 2051-2064 (1995).
- Ghosal, S., Taylor, C. J., McGray, J. Modification of the nasal membrane potential difference with inhaled amiloride and loperamide in the cystic fibrosis (CF) mouse. Thorax. 51 (12), 1229-1232 (1996).
- Ghosal, S., Taylor, C. J., Colledge, W. H., Ratcliff, R., Evans, M. J. Sodium channel blockers and uridine triphosphate: effects on nasal potential difference in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 15 (1), 146-150 (2000).
- Leonard, A., et al. Comparative Variability of Nasal Potential Difference Measurements in Human and Mice. Open Journal of Respiratory Disease. 2, 43-56 (2012).
- Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch's 3Rs then and now: the need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
- Pritchett-Corning, K. R., et al. AALAS/FELASA Working Group on Health Monitoring of rodents for animal transfer. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 633-640 (2014).
- Salinas, D. B., et al. CFTR involvement in nasal potential differences in mice and pigs studied using a thiazolidinone CFTR inhibitor. American Journal of Physiology. Lung Cell Molecular Physiology. 287 (5), 936-943 (2004).
- Fisher, J. T., et al. Comparative processing and function of human and ferret cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Journal of Biological Chemistry. 287 (26), 21673-21685 (2012).
- Kaza, N., et al. Use of ferrets for electrophysiologic monitoring of ion transport. PLoS One. 12 (10), 0186984 (2017).
- Leal, T., Beka, M., Panin, N., Mall, M. A., Noel, S. Nasal potential difference in βENaC-overexpressing mouse reveals pH-sensitive channel hyperactivity and shift of subunits stoichiometry. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (S1), 72 (2017).
- Mall, M., Grubb, B. R., Harkema, J. R., O'Neal, W. K., Boucher, R. C. Increased airway epithelial Na+ absorption produces cystic fibrosis-like lung disease in mice. Nature Medicine. 10 (5), 487-493 (2004).
- Shah, V. S., et al. Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice. Science. 351 (6272), 503-507 (2016).
